Phương pháp nghiên cứu dược liệu PDF

# PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU Chương trình Đào tạo Dược sĩ Đại học ĐỊNH HƯỚNG: KHOA HỌC DƯỢC PGS. TS. Trần Hùng Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh – 10/2022 ## CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DƯỢC LIỆU ### Nội dung - I. Lịch sử - II. Đại cương về các phương pháp sắc ký - III...

# PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU Chương trình Đào tạo Dược sĩ Đại học ĐỊNH HƯỚNG: KHOA HỌC DƯỢC PGS. TS. Trần Hùng Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh – 10/2022 ## CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DƯỢC LIỆU ### Nội dung - I. Lịch sử - II. Đại cương về các phương pháp sắc ký - III. Sắc ký phẳng - IV. Sắc ký cột - V. Các bước phân lập các hợp chất tự nhiên ### I. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN - 1903: M. Tswets Chromatography ### LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN - 1931: Kuhn – Lederer – Winterstein – điều chế carotenoid trên cột - 1938: Izmailov – Schreiber: Sắc ký lớp mỏng (Al₂O₃) - 1938: Taylor, Urey: SK trao đổi ion - 1941: Martin và Synge - Lý thuyết về sắc ký phân bố - 1944: Sắc ký giấy (và sắc ký khí sau này) - 1949: Meinhart và Hall – Dùng chất kết dính - 1951: Kirchner và Miller – Sắc ký dải, acid silicic, khai triển lên - 1952: Jame, Martin: Sắc ký khí - lỏng - 1954: Reitsema – dùng bản sắc ký. - 1959: Flodin, Porath: Sắc ký lọc gel - 1958: E. Stahl - Sắc ký lớp mỏng, dùng Si gel với CaSO₄, dày 0,25mm, chuẩn hóa sắc ký lớp mỏng. - 1965: Merck Co. – Bản tráng sẵn - Si gel 60 A° - 1965: Horváth: HPLC - 1968: Anfinsen: Sắc ký ái lực - 1973: Halpaap: HPTLC (5-6µm) - 1980: Halpaap – Sắc ký lớp mỏng pha đảo - 1990: Guttman: Sắc ký trên chip ## II. ĐẠI CƯƠNG VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ### 1. Các khái niệm cơ bản - 1.1. Định nghĩa - 1.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ### 2. Cơ sở của quá trình phân tách sắc ký #### 2.1 Các cơ chế cơ bản của quá trình sắc ký - 2.1.1. Sự hấp phụ - 2.1.2. Sự phân bố - 2.1.3. Rây phân tử - 2.1.4. Trao đổi ion - 2.1.5. Ái lực hóa học - 2.1.6. Điện di - 2.2. Các phương pháp khai triển sắc ký - 2.3. Pha tĩnh trong sắc ký - 2.4. Pha động trong sắc ký ### 3. Phân loại các phương pháp sắc ký ### ĐỊNH NGHĨA Sắc ký là một phương pháp phân tách lý – hóa trong đó các chất được tách ra khỏi một hỗn hợp dựa trên sự phân bố liên tục của chúng giữa 2 pha, một pha không chuyển động (pha tĩnh) và một pha chuyển động (pha động), dịch chuyển qua pha tĩnh theo một phương xác định. - Các chất khác nhau tách ra khỏi hỗn hợp do khả năng “phân bố” khác nhau của chúng giữa 2 pha. - Tốc độ dịch chuyển của các chất trên pha tĩnh phụ thuộc vào “ái lực” của chúng với pha tĩnh và pha động. - Mẫu thử chịu sự tác động của cả pha động và pha tĩnh. **Hình minh họa:** **Cát nhẹ** **Cát nặng** **Dòng nước** **Đáy sông** ### NGUYÊN TẮC CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ - Các yếu tố chính quyết định đến sự dịch chuyển của mẫu thử là: - Bản chất của mẫu thử - Bản chất của pha tĩnh - Bản chất và vận tốc di chuyển của pha động. - Nhiệt độ của hệ thống. - Quãng đường phải đi của mẫu thử... - Những phân tử có tính chất giống nhau (hình dạng, kích thước phân tử, đặc tính vật lý, cấu trúc hóa học) sẽ dịch chuyển cùng với nhau tạo nên các vết/băng/đỉnh hấp thu riêng biệt trên sắc đồ. - Thời gian – t (hay quãng đường – I) di chuyển của 1 thành phần trong mẫu thử trên pha tĩnh phụ thuộc vào “ái lực” của nó đối với pha tĩnh. - Ái lực lớn - chất di chuyển chậm/thời gian di chuyển càng dài và ngược lại. **Hình minh họa:** **Tương tác giữa 3 thành phần** **Công thức:** $H = \frac{l}{N}$, $N = 16(\frac{t_R}{w})^2$ Trong đó: - l là chiều dài cột - N là số đĩa lý thuyết - t_R là thời gian lưu - w là độ rộng băng hấp thu - Nồng độ của chất trong các vết/băng trên sắc đồ - Lý tưởng nhất là – đồng nhất ở mọi vị trí. - Trên thực tế, nồng độ của chất trong vết/băng sắc ký là một phân bố hình chuông (phân bố Gauss). - Vết/băng càng hẹp, quá trình tách càng tốt. - Quá trình làm dãn rộng các băng các chất tách trên sắc đồ làm giảm khả năng tách của hệ thống sắc ký **Hình minh họa:** - Các yếu tố làm giãn rộng vết/băng sắc ký: - Quá trình khuyếch tán (tốc độ dòng) - Thời gian cân bằng pha (tốc độ dòng) - Độ đồng nhất của pha tĩnh - Quá tải (Lượng mẫu, mật độ pha tĩnh) **Hình minh họa:** **Mobile phase** **Stationary phase** **Direction of travel** **Direction of elution** ### Các khái niệm cơ bản - **Sắc ký đồ:** là bản sắc ký phẳng sau khi đã được triển khai và phát hiện bằng phương pháp thích hợp **Hình minh họa:** - **Sắc ký đồ:** là biểu đồ biều diễn cường độ hấp thu của các băng chất được tách ra trong quá tình sắc ký theo thời gian hay theo quãng đường di chuyển của pha động. **Hình minh họa:** - **Rf:** tỉ số giữa quãng đường mà chất thử di chuyển so với quãng đường dung môi di chuyển (tính từ điểm xuất phát của mẫu thử) trên 1 sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng. **Công thức:** $Rf = \frac{a}{b}$ - **Rf_X:** tỉ số giữa quãng đường mà chất thử di chuyển so với quãng đường mà chất đối chiếu (X) di chuyển trên 1 sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng. - **Thời gian lưu (t_R, R_T):** thời gian mà chất thử di chuyển hết chiều dài pha tĩnh (ra khỏi cột sắc ký mở) trong quá trình sắc ký. - **Thể tích lưu (V_R):** Thể tích dung môi cần thiết để cho chất thử di chuyển hết chiều dài pha tĩnh **Hình minh họa:** ### 2. CƠ SỞ CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ #### 2.1. Các cơ chế cơ bản của quá trình sắc ký - Sự hấp phụ - Sự phân bố - Rây phân tử - Trao đổi ion - Ái lực hóa học - Điện di ### Sự hấp phụ - Hấp phụ đẳng nhiệt là hiện tượng một chất khí, hay một chất hòa tan trong dung dịch được làm giàu trên bề mặt của một pha rắn. - Bề mặt hấp phụ đóng vai trò quan trọng trong quá trình hấp phụ. - Quá trình cân bằng hấp phụ phụ thuộc vào: - Bản chất của chất hấp phụ - Bản chất của chất được hấp phụ - Diện tích bề mặt của chất hấp phụ - Nồng độ chất hấp phụ, - Khả năng tiếp xúc của chất được hấp phụ và chất hấp phụ - Nhiệt độ, áp suất... của hệ thống - Trong sắc ký, quá trình hấp phụ, giải hấp xảy ra liên tục giữa pha động và pha tĩnh dọc theo suốt chiều dài pha tĩnh. - “Ái lực” của chất phân tích sẽ quyết định tốc độ di chuyển của nó trên pha tĩnh. Sự khác biệt này làm cho các chất được tách riêng ra khỏi hỗn hợp. - Chất có ái lực càng lớn với pha tĩnh di chuyển càng chậm (Rf thấp, thời gian lưu lớn). - Khả năng hấp phụ trên Si gel (thứ tự giảm dần) - Hợp chất hữu cơ có các nhóm: - Carboxyl, amino, hydroxyl, nitro, cyanid, thiol, và các nhóm thế phân cực khác. - Keton, aldehyd, ester, ether, các halogenocarbon - Các gốc phenyl (1-3) - Các nối đôi - Các hydrocarbon mạch dài, vòng - Các dẫn chất perflourocarbon. ### Sự phân bố - Phân bố là hiện tượng một chất tan được hòa tan vào 2 chất lỏng không đồng tan được cho tiếp xúc với nhau. - Tỉ lệ nồng độ của chất tan ở trong 2 dung môi ở trạng thái cân bằng được gọi là hệ số phân bố (k). **Hình minh họa:** - Trong sắc ký phân bố, các chất trong hỗn hợp mẫu thử được phân bố liên tục giữa 2 pha. Một pha lỏng không không di động đóng vai trò của pha tĩnh. - Các chất có k khác nhau trong hỗn hợp sẽ được tách ra khi dịch chuyển dọc theo pha tĩnh này. Ak càng lớn, các chất càng tách xa nhau. Khi 2 chất có Ak = 0 thì chúng không thể tách khỏi nhau theo cơ chế này. - Pha tĩnh trong sắc ký phân bố: - Một “chất lỏng” được “gắn” trên 1 giá mang tĩnh: sắc ký phân bố, sắc ký lỏng - Một pha lỏng thực sự được giữ cố định (hay “di chuyển” ngược chiều với “pha động”): Sắc ký phân bố ngược dòng (Counter-current chromatography- CCC) ### Rây phân tử - Rây phân tử là quá trình một chất tan trong dung dịch bị lưu giữ lại trên pha tĩnh với mức độ khác nhau, chủ yếu bởi kích thước của chúng. - Khả năng này có được là do các xoang có kích thước khá lớn của pha tĩnh. - Các chất có kích thước phân tử nhỏ có thể khuyếch tán dễ dàng vào các xoang nên quãng đường di chuyển của chúng dài hơn → thời gian lưu lớn hơn. - Các chất có kích thước phân tử lớn không khuyếch tán vào được các xoang nên chỉ di chuyển bên ngoài bề mặt các hạt của pha tĩnh, quãng đường di chuyển ngắn hơn → thời gian lưu ngắn. - Pha tĩnh cho pha tĩnh rây phân tử có thể là vô cơ hay hữu cơ, tự nhiên hay tổng hợp. - Các sản phẩm thông thường nhất cho sắc ký cột là các sepharose và các dẫn chất của nó (Sephadex®). - Hình dạng phân tử, dung môi cũng ảnh hưởng tới khả năng di chuyển của các chất. ### Trao đổi ion - Trao đổi ion trong sắc ký là quá trình liên kết và giải phóng ra khỏi liên kết của các chất với một chất khác dưới dạng pha tĩnh bằng các liên kết ion. - Các chất bị giữ lại một cách cạnh tranh trên pha tĩnh (quá trình sắc ký) là do độ mạnh của các liên kết của chúng quyết định. - Chất có liên kết mạnh sẽ lưu giữ lâu hơn, di chuyển chậm hơn. - Phương pháp thường dùng trong trao đổi ion là phương pháp thế chỗ hay phân tích tuyến (khử khoáng cho nước) - Các chất trao đổi ion có thể được chia thành: - Chất trao đổi cation (cationit) - Chất trao đổi ation (anionit) - Chất trao đổi ion (cation, anion) mạnh - Chất trao đổi ion (cation, anion) yếu - Các chất trao đổi ion có thể là các hợp chất vô cơ hay hữu cơ, tự nhiên hay tổng hợp. - Các chất trao đổi ion thông thường nhất là các nhựa trao đổi ion tổng hợp trên nền polystyren. ### Ái lực hóa học - Sắc ký ái lực là sự phân tách các chất dựa vào ái lực hóa học của chúng với pha tĩnh. - Các phản ứng - kháng nguyên-kháng thể - Kết hợp với các receptor... - Là phương pháp chọn lọc - Thường dùng trong hóa học các chất polymer (trong proteomic, metabolomic...) ### Điện di - Là quá trình các chất di chuyển trong dung dịch dưới tác dụng của điện trường - Tốc độ di chuyển của các chất trong điện trường phụ thuộc vào: - Điện tích của phân tử - Kích thước phân tử - Độ lớn của điện trường - Môi trường... - Các phương pháp điện di bao gồm: - Điện di trên mặt phẳng: dùng cho các polymer sinh học - Điện di mao quản: Áp dụng cho các chất chuyển hóa bậc 2 phân tử nhỏ #### 2.2. Các phương pháp khai triển sắc ký - **Phân tích tuyến:** **Hình minh họa:** - **Phân tích thế chỗ:** **Hình minh họa** - **Phân tích rửa giải:** **Hình minh họa** #### 2.3. PHA TĨNH TRONG SẮC KÝ - Pha thuận - Hấp phụ - Phân bố - Pha đảo - Phân bố - Rây phân tử - Trao đổi ion - Pha tĩnh liên kết - Phân bố - Hấp phụ - Trao đổi ion - Bất đối ### Silica gel - Là acid polysilicic dưới dạng vô định hình, có tính acid nhẹ. - Là pha tĩnh và giá mang thông dụng nhất hiện nay. **Hình minh họa:** - Là chất hấp phụ phân cực, pha thuận. - Được sử dụng rất rộng rãi trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột cổ điển. - Khả năng hấp phụ của Si gel phụ thuộc nhiều vào: - Kích thước tiểu phân - Cấu trúc: vô định hình - Cấu trúc xốp với các xoang - Số lượng nhóm silanol trên bề mặt - Lượng nước giữ trong thành phần pha tĩnh - Khả năng hấp phụ của Si gel tương đối lớn, có thể xảy ra quá trình hấp phụ không thuận nghịch, đặc biệt với các chất phân cực (các hợp chất phenol...). - Việc hoạt hóa (sấy loại nước) làm tăng khả năng hấp phụ của Si gel. - Nhiệt độ hoạt hóa thường là 110°C - 120°C - Không sấy hoạt hóa quá 200°C → bất hoạt không phục hồi. - Các bản SKLM tráng sẵn thường không cần hoạt hóa - Lượng nước cao, sử dụng dung môi có nước làm cho Si gel có thêm cơ chế phân bố, nhiều trường hợp trở thành cơ chế chính. - Kích thước hạt của Si gel thay đổi tùy theo mục đích sử dụng (2 – 200μm). - Diện tích bề mặt riêng: 80-200 m²/g - Silica gel sắc ký lớp mỏng: - Dạng bột rời (5-30µm) - Dạng tráng sẵn - Bản tráng sẵn HPTLC (2-15µm) - Silica gel sắc ký cột: - Cỡ hạt nhỏ (15-40 μm) - Cỡ hạt trung bình (40 - 63 µm) - Cỡ hạt thô (63-200 μm) - Si gel cũng có nhiều trung tâm xúc tác → cần lưu ý. - Phân tách tốt cho các chất có độ phân cực yếu tới trung bình. - Dùng làm giá mang cho pha tĩnh lỏng, pha liên kết - Được thêm các chất phụ gia - Các loại Si gel thông dụng: H, G, F₂₅₄ - Được tẩm các chất làm thay đổi tính chất, tính chọn lọc của silica gel: - Tẩm các pha tĩnh lỏng - Tẩm các chất tạo phức (AgNO₃, boric v.v...) ### Nhôm oxyd - Là oxid nhôm ngậm nước (Al₂O₃. nH₂O) - Kích thước hạt thường thô hơn so với silica gel - Là chất hấp phụ phân cực - Có ba loại Alumina trên thị trường - Loại trung tính: A1-OH + -Al-O- - Loại acid: -A1-OH - Loại base: -Al-O- - Có ái lực rất mạnh với các chất phân cực, đặc biệt là các OH phenol, nhiều khi không giải hấp được. - Phân tách tốt cho các chất có độ phân cực yếu tới trung bình. - Khả năng hấp phụ phụ thuộc vào lượng nước có trong thành phần. - Dùng cho SKLM, SKC. - Mức độ sử dụng ít hơn nhiều so với si gel ### Pha tĩnh lỏng trên giá mang rắn - Các chất lỏng được tẩm lên → cơ chế tác dụng là phân bố - Các chất lỏng tẩm lên thường là từ phân cực yếu tới trung bình: - Paraffin - Silicon - PEG - Giá mang có thể là silica, thủy tinh... - Thường dùng trong sắc ký khí (cột nhồi, cột mao quản) - Có thể dùng trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký phân tích - Ngày nay ít dùng trong các phương pháp sắc ký khác ### Silica gel liên kết - Tạo được các pha tĩnh khác nhau về cơ chế và mức độ tác động - Pha đảo - RP-2, RP-8, RP-18 - Pha thuận (-CN) - Trao đổi ion (COOH, NH₂) - Áp dụng nhiều trong HPLC **Hình minh họa:** ### Sephadex - Là pha tĩnh có cấu trúc căn bản là polysachrarid: dextran, agarose có thêm các liên kết chéo để tạo các mạng 3 chiều - Sản phẩm thông dụng nhất cho SKC các hợp chất tự nhiên là Sephadex: - Sephadex G (25, 50, 75 v.v...) - Sephadex LH-20 - Cũng có các loại pha tĩnh rây phân tử vô cơ, tổng hợp. - Sắc ký Loại cỡ - Sắc ký rây phân tử (Molecular sieve) - Sắc ký lọc gel (Gel fitration) - Sắc ký thấm gel (Gel permeation) ### Pha tĩnh ái lực **Hình minh họa:** ### Pha tĩnh tổng hợp - Nền tảng là polystyren - Pha tĩnh cho sắc ký pha đảo - Diaion HP-20 - Các polystyren - Pha tĩnh cho trao đổi ion - Cationid mạnh/yếu - Anionit mạnh/yếu - Pha tĩnh cho rây phân tử ### Các pha tĩnh khác - Cellulose - Polyamid - Dẫn xuất cellulose (DEAE) - Kieselguhr (Diatomite) - Than hoạt - Carbon graphit hóa - Magne silicat... **Hình minh họa:** #### 2.4. PHA ĐỘNG TRONG SẮC KÝ RỬA GIẢI - Là yếu tố quan trọng trong quá trình sắc ký - Trong sắc ký lỏng rất ít khi pha động là 1 dung môi - Thường pha động là 1 hỗn hợp 2 hay nhiều hơn 2 thành phần được gọi là hệ dung môi. - Các dung môi thành phần thường là các dung môi thông thường trong phòng thí nghiệm. - Để cải thiện khả năng tách của hỗn hợp, 1 lượng nhỏ kiềm, acid ... có thể được thêm vào hệ dung môi - Độ tinh khiết của dung môi: Cần để có 1 kết quả tốt, lặp lại - Để đánh giá khả năng rửa giải của 1 dung môi người ta thường dùng khái niệm “độ phân cực” của dung môi. - Độ phân cực của dung môi được dự đoán bằng moment lưỡng cực, hằng số điện môi, thực nghiệm v.v... **Hình minh họa:** - Để so sánh và phân biệt 2 dung môi trong 1 hệ dung môi, người ta phân biệt: - Dung môi mạnh: là dung môi có ái lực mạnh với chất phân tách, làm cho chất phân tách di chuyển nhanh hơn. - Dung môi yếu: là dung môi có ái lực với chất phân tách không mạnh bằng dung môi mạnh. - Dung môi mạnh hay yếu là xét trên 1 hệ cụ thể - Với sắc ký pha thuận: dung môi phân cực mạnh là dung môi mạnh - Với sắc ký pha đảo: dung môi ít phân cực hơn là dung môi mạnh. - Khi viết 1 hệ dung môi, thông thường người ta viết: - Dung môi yếu trước – Dung môi mạnh sau - Tỉ lệ của các dung môi (dung môi yếu:dung môi mạnh) - Sắc ký pha thuận: - n-hexan – ethyl acetat (8:2) - chloroform – aceton (75:25) - Sắc ký pha đảo: - nước – methanol (80:20) - nước – acetonitril (45:55) - Yêu cầu cho 1 dung môi sắc ký tốt - Hòa tan tốt mẫu thử - Không phản ứng với mẫu thử - Linh động, độ nhớt thấp - Nhiệt độ sôi không quá thấp, không quá cao - Không có mùi khó chịu - An toàn, không độc hại, - Rẻ tiền, dễ kiếm - Thân thiện với môi trường ### Lựa chọn dung môi cho sắc ký - Quy tắc chung (Sắc ký pha thuận) - Mẫu thử kém phân cực: hệ dung môi kém phân cực - Mẫu thử phân cực: hệ dung môi phân cực - Hệ dung môi càng đơn giản càng tốt (2 thành phần) - Hệ dung môi càng “trung tính” càng tốt - Khi không thành công → thay đổi tỉ lệ – thành phần pha động → thay đổi pha tĩnh, cơ chế tách. - Thực nghiệm - Triển khai thử 1 hệ - Đánh giá kết quả - Thay đổi - Thử lại ## 3. PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Phân loại theo: - Pha động - Thể chất: Lỏng, khí, lỏng tới hạn - Lực tạo nên chuyển động của pha tĩnh: Mao dẫn, Thuỷ tĩnh, chênh lệch áp suất (dương, âm) - Pha tĩnh - Thể chất: Rắn, lỏng - Hình dạng: Mặt phẳng, cột (thường, mao quản) - Cơ chế của quá trình phân tách (phân bố giữa 2 pha) - Hấp phụ - Phân bố - Loại cỡ - Ái lực - (Điện trường) - Cách thức phân tách - Thay thê - Rửa giải **Hình minh họa:** ## III. SẮC KÝ PHẲNG Sắc ký phẳng (Planar chromatography) - Sắc ký lớp mỏng (TLC) – sắc ký lớp dày (Prep-TLC) - Sắc ký giấy (PC) - Sắc ký phẳng ly tâm (RPC) - Sắc ký lỏng áp suất trên (OPLC) ### SẮC KÝ LỚP MỎNG - Bình sắc ký - Bản sắc ký - Dung môi - Mẫu thử - Chấm sắc ký - Triển khai sắc ký - Phát hiện - Ghi nhận kết quả - Các sự cố và cách khắc phục #### Bình sắc ký: - Yêu cầu: - Trơ với dung môi - Kín - Dễ quan sát - Cấu tạo: - Thường là hình khối dẹp - Có hay không có máng dung môi - Thể tích nhỏ - Các loại bình sắc ký - Bình sắc ký thông thường (Bình N) - Bình sắc ký hẹp (Bình S) **Hình minh họa:** - Bão hòa hơi dung môi trong bình - Vai trò - Hệ dung môi không phân lớp: Dùng hệ dung môi - Hệ dung môi phân lớp (dùng lớp giàu nước) - Thêm các thành phần khác (kiềm bay hơi) khi cần **Hình minh họa:** #### Bản sắc ký: - Bản sắc ký tự tráng - Bản thủy tinh kích thước thay đổi (20 x 20, 10 x 20, 5 x 20, 7,5 x 20, 3 x 10, 2,5 x 7,5 cm) - Cách tráng: - Tráng bằng tay - Tráng bằng thiết bị tráng sk. - Hoạt hóa: 110 – 120°C / 1–2 giờ (ảnh hưởng lên khả năng tách) - Thêm các chất phụ gia: - Kiềm (NaOH, КОН), - Dung dịch đệm - AgNO₃, a. boric... #### Bản sắc ký tráng sẵn - Kích thước: 200 x 200 x 0,2 mm - Đế: Nhôm, thủy tinh, plastic - Pha tĩnh: Si gel (F₂₅₄), Alumina, Cellulose, Polyamid, Pha đảo - Các kỹ thuật khác - HPTLC #### Dung môi cho SKLM - Sử dụng loại tinh khiết - Pha khi dùng - Tỉ lệ chính xác - Càng đơn giản càng tốt (2 thành phần) **Hình minh họa:** - Nguyên tắc chọn hệ dung môi: - Chất phân tích kém phân cực: hdm có độ phân cực kém – trung bình - Chất phân tích phân cực trung bình: Hdm phân cực trung bình – mạnh - Chất phân tích phân cực mạnh: chọn hdm phân cực mạnh có nước, acid hay kiềm - Chọn 2 dung môi ở 2 nhóm kế cận nhau hoặc không quá gần nhau trong một nhóm. **Hình minh họa:** - Nguyên tắc tìm hệ dung môi cho sắc ký lớp mỏng: - Chọn 1 hệ dung môi theo nguyên tắc trên + Kinh nghiệm - Tiến hành sắc ký – đánh giá kết quả: - Hỗn hợp tách tương đối tốt: thay đổi tỉ lệ dung môi - Các chất dịch chuyển nhưng tách không tốt: thay đổi thành phần - đổi 1 dung môi khác trong số 2 dung môi. - Hỗn hợp bị đẩy lên quá cao, không tách tốt: thay 1 hdm khác kém phân cực hơn - Hỗn hợp gần như không di chuyển: thay 1 hdm khác phân cực hơn.. #### Mẫu thử - Mẫu thử càng “sạch” kết quả càng tốt, càng lặp lại. - Mẫu thử nên được hòa trong dm: - hòa tan tốt, - kém phân cực - độ nhớt thấp, dễ bay hơi nhất có thể. - Nồng độ mẫu thử vừa phải, không quá loãng, quá đặc. #### Đưa mẫu thử lên bản mỏng - Phương pháp chấm sk - Chấm điểm - Chấm vạch - Yêu cầu - Kích thước - Nồng độ - Tránh hư hỏng các chất - Thiết bị - Mao quản - Thiết bị chấm **Hình minh họa:** #### Triển khai sắc ký - Cách thức triển khai - Dưới lên - Trên xuống - Nằm ngang - Yêu cầu - Dung môi đủ, khai triển đều - Khí quyển bão hòa - Đánh dấu mức dung môi - Các cách thức khai triển đặc biệt - Khai triển lặp lại - Khai triển vòng tròn #### Phát hiện sắc ký - Quan sát màu - Ánh sáng thường - UV 254 và 365 nm - Các thuốc thử phát hiện - Yêu cầu - Nhạy - Đặc hiệu/chung - Dễ sử dụng, bảo quản lâu - Các thuốc thử chung - Hơi lod - Vanillin – sulfuric - Anisaldehyd – sulfuric - Các thuốc thử đặc hiệu - Vết bền - Ít độc hại - Acid sulfuric đã - KMnO₄ - ... **Hình minh họa:** - Các thuốc thử đặc hiệu - Thuốc thử polyphenol - Thuốc thử alkaloid - Thuốc thử flavonoid - Thuốc thử anthraquinon - Thuốc thử saponin... - Phun thuốc thử - Phun bằng các dụng cụ phun mù - Nhúng thuốc thử #### Ghi nhận kết quả - Bảo quản bản mỏng - Chụp hình/scan - Sử dụng thiết bị scan chuyên dụng - Các thông số ghi nhận - Pha tĩnh, bề dày lớp mỏng, pha động sử dụng - Tuyến dung môi, quãng đường khai triển - Số lượng các vết - Rf hay Rx của các vết - Màu sắc các vết dưới những điều kiện phát hiện - Các điểm đặc biệt khác #### Thế nào là một sắc ký đồ tốt **Hình minh họa:** #### Sự cố và cách khắc phục - Không tách vết - Bị đẩy lên quá cao - Nằm ở khoảng giữa bản mỏng - Không hay gần như không chạy lên khỏi vết chấm - Vết tách nhưng không tốt - Vết chạy xéo - Tuyến dung môi bị lệch - Kết quả sắc ký không lặp lại, không ổn định - Vết kéo dài, kéo đuôi - Vết không đều, các vết phía trên có hình ngọn đuốc - ... **Hình minh họa:** ### Sắc ký lớp mỏng điều chế Sắc ký lớp mỏng chế hóa, sắc ký lớp dày - Pha tĩnh: như sắc ký lớp mỏng - Bề dày pha tĩnh: 0,5 – 1 mm hay hơn - Mẫu thử: 100mg - Đưa mẫu lên bản mỏng: vạch liên tục - Phát hiện: - Phương pháp không làm hư mẫu – đánh dấu các vết - Phun thuốc thử 2 mép bản sắc ký → đánh dấu các vết - Tách các chất: cạo băng mẫu, giải hấp **Hình minh họa:**