Génétique Moléculaire-Chapitres II,III et IV.pdf

Dogme central de la biologie moléculaire Chapitre II: La réplication et réparation de l’ADN Chapitre III: La transcription des gènes Chapitre IV: La traduction Pr Bouchra CHEBLI 1  Dogme central de la biolo...

Dogme central de la biologie moléculaire Chapitre II: La réplication et réparation de l’ADN Chapitre III: La transcription des gènes Chapitre IV: La traduction Pr Bouchra CHEBLI 1  Dogme central de la biologie moléculaire Le dogme central de la biologie cellulaire établit la liaison qui existe entre le matériel génétique contenu dans la cellule et les protéines que cette cellule synthétise Le passage du gène à la protéine se fait en deux étapes ADN correspondant au gène est copié sur un brin d'ARN, que l'on appelle ARN messager c'est la transcription. Puis ce brin d'ARNm est à son tour recopié, mais dans un langage différent, celui des acides aminés, pour donner la séquence correspondant à la protéine synthétisée, c'est la traduction. La séquence polypeptidique ainsi constituée prend alors une forme spatiale qui lui est spécifique pour devenir à proprement parler la protéine 2  La réplication de l’ADN La réplication est l’ensemble des processus qui aboutissent à la duplication du matériel génétique d’une cellule avant son entrée en mitose. Elle se déroule lors de la phase S du cycle cellulaire Avant qu’une cellule se divise, il faut que son ADN se réplique exactement de sorte que la cellule puisse transmettre des copies identiques de ses gènes à chacune des cellules filles. Le processus de réplication de l’ADN établit l’équilibre entre le besoin de rapidité et le besoin de précision. 3  La réplication de l’ADN Pendant la réplication de l’ADN, une molécule d’ADN est copiée en deux molécules filles, et ce suivant les règles établies par Watson et Crick : Antiparallélisme Complémentarité des deux brins 4  La réplication de l’ADN Les trois principales théories de la réplication de l’ADN Théorie conservatrice: La molécule mère reste intacte et la molécule fille est constituée de deux nouveaux brins. Théorie semi-conservatrice: Chacune des nouvelles molécules est constituée d’un brin mère et un d’un brin fille. Théorie dispersive: La molécule est constituée au hasard de portions mères et de portions filles. 5  La réplication de l’ADN La découverte de la structure de l’ADN pose le problème de la réplication du matériel génétique lors de la division cellulaire. La compréhension du mécanisme de la réplication fait un pas décisif avec l’expérience de Meselson et Stahl (1958). 6 Expérience de Meselson et Stahl 7  La réplication de l’ADN Résultats de l’expérience de Meselson et Stahl Les deux brins du DNA parental au cours de la réplication servent chacun de modèle (matrice) pour la synthèse d’un nouveau brin. De cette façon les deux brins, au lieu de rester ensemble à chaque synthèse (réplication conservative), se séparent toujours à chaque cycle (réplication semi conservative) A la première génération un brin de chaque double hélice provient de la cellule mère. A la deuxième génération, il n’existe plus que deux brins de DNA de la cellule mère pour quatre doubles hélices, etc... 8  La réplication de l’ADN Caractéristiques de la réplication Elle est couplée au cycle cellulaire Une cellule qui se divise doit répliquer son ADN; S’effectue au cours de la phase S Chaque cellule fille hérite d’une copie d’ADN identique; Bidirectionnelle : les deux brins d’ADN sont déroulés dans deux directions opposées et servent de matrices. Semi discontinue : avec la synthèse d’un brin précoce et d’un brin tardif. Modèle possible de réplication Modèle semi conservatif (Watson, Crick) : Chaque molécule contient un brin parent et un nouveau brin 9  La réplication de l’ADN Caractéristiques de la réplication Polarisée comme l’ADN ( sens 5’-- 3’) et nécessite: Une matrice, une polymérase, des amorces, des dNTPs La polymérase n’ajoute les nucléotides qu’à une extrémité 3’-OH La matrice est lue sens 3’--5’ car la polymérase copie dans le sens 5’—3’ Vitesse de réplication de l’ADN Réplication est une réaction rapide: – Bactéries: 1000 pb /sec/Chromosome E. Coli fait 4,4Mb et répliqué en 42 min – Le génome humain fait 3200 Mb, répliqué en 8 heures, il faut au moins 30 000 fourches de réplication Elle doit être parfaitement fidèle Cette fidélité repose sur la complémentarité des bases. 10  La réplication de l’ADN Caractéristiques de la réplication Chez les procaryotes , l’origine de la réplication (séquences riche en AT) est souvent unique et la réplication procède dans les deux orientations à partir de ce point 11  La réplication de l’ADN Caractéristiques de la réplication Chez les eucaryotes, la réplication a lieu à partir de plusieurs origines de réplication (fourches). 400 origines de réplications réparties parmi les 16 chromosomes chez la levure. Chez l’humain, on estime à plus de 30 000 le nombre de fourches de réplications simultanées. 12  La réplication de l’ADN Les éléments nécessaires à la réplication ADN matrice Enzymes Nucléotides: les 4 désoxyribonucléosides 5'- triphosphate: dATP, dGTP, dTTP, dCTP → apportent également l’énergie nécessaire pour la réplication Cations bivalents Mg2+ sont indispensables à la synthèse d’ADN (optimisent l’activité de l’ADN polymérase) 13  La réplication de l’ADN Enzymes de la réplication : 14  La réplication de l’ADN LES ADN POLYMERASES Les ADN polymérases : sont les enzymes fondamentales a la réplication. Elle catalyse la polymérisation de l'ADN à partir des nucléotides, les désoxy-ribonucléotides 5’ triphosphate L’activité polymérase se fait dans le sens 5’--3’ en catalysant la réaction phosphodiester entre un groupement OH en fin de chaîne nucléotidique et le groupement triphosphate en 5’ d’un nucléotide libre. 15  La réplication de l’ADN L'ADN POLYMERASE Elle nécessite une amorce L’ADN Pol ne synthétise pas l’ADN de novo mais permet un allongement d’une amorce (séquence d’acide nucléique) OKAZAKI a montré que cette amorce est un petit ARN qui sera ensuite détruit et la brèche comblée par un ADN polymérase Peut posséder une activité exonucléasique 3’--5’ Cette activité permet d’éliminer le dernier nucléotide incorporé s’il n’est pas correct Les mammifères possèdent différentes polymérases 16 Elles sont de 3 types (I, II et III) pour les procaryotes et les ADN polymérases eucaryotes de 5 types (α, β, δ, ε et γ). Chez les procaryotes : l’ARN polymérase I élimine l’amorce d’ARN grâce a une activité exonucléase, l’ARN polymérase II est impliquée dans la réparation de l’ADN, et l’ARN polymérase III catalyse la synthèse de l’ADN de 5’ vers 3’. Chez les eucaryotes : l’ADN polymérase α qui dispose d’une activité primase complète, est responsable de l’initiation de la synthèse d’ADN. L’ADN est répliqué par les ADN polymérases α et δ : α synthétise le brin tardif et δ synthétise le brin précoce. L’ADN polymérase ε est impliqué dans la réparation de l’ADN et l’ADN polymérase γ réplique l’ADN mitochondriale. β supprime l’ARN amorce et assure la synthèse et la réparation de l’ARN amorce. 17  La réplication de l’ADN Hélicase Déroulent et séparent les deux brins d'ADN, ceci conduit à une structure en Y, appelée fourche de réplication 18  La réplication de l’ADN Enzymes de la réplication : Protéine SSB (Single Strand Binding) : Maintenir la séparation des deux brins d’ADN Topoisomérases : sont des enzymes qui contrôlent la structure topologique de l’ADN – Permettent le passage de l'ADN d'un état super enroulé, provoqué par la progression de la fourche de réplication, à des formes isomères de moindre tension. Primase: il s’agit d’une ARN polymérase ADN-dépendante. Elle synthétise une amorce de nucléotides d’ARN avec une séquence de bases complémentaire à la matrice d’ADN. L’ADN polymérase ne peut fonctionner que si une extrémité 3’OH est disponible pour catalyser la formation d’un lien phosphodiester. 19  La réplication de l’ADN Primase: Le bout 3’OH est fourni par une enzyme appelée ADN primase ou ARN polymérase ADN-dépendante. L’ADN primase synthétise une courte (10 nt) amorce d’ARN complémentaire au gabarit d’ADN; L’ADN polI replacera plus tard cette amorce d’ARN par de l’ADN. 20  La réplication de l’ADN Ligase: Les amorces sont hydrolysées par une RNAse. La lacune est comblée par une ADN Pol. La ligase effectue la soudure du brin d'ADN entre deux fragments adjacents. Elle catalyse la formation des liaisons phosphate entre les nucléotides 21  La réplication de l’ADN Différentes étapes de la réplication Déroulement de la double hélice par l’ADN Hélicase Stabilisation sous forme simple brin par les protéines SSB Synthèse d’amorces ARN par la primase Synthèse du brin complémentaire par l’ADN polymérase III Destruction des amorces ARN et réparation des lacunes par l’ADN polymérase I Ligation des fragments d’ADN synthétisés par la ligase 22  La réplication de l’ADN La réplication se fait en trois grandes étapes : 1. Initiation 2. Elongation 3. Terminaison 23  La réplication de l’ADN 1-initiation : SITE D'INITIATION DE LA REPLICATION: Ori Chez les procaryotes: une seule origine de réplication Chez les eucaryotes: plusieurs origines de réplication, Le réplicon est une séquence d'ADN qui réplique à partir de la même origine Ori. Chez l’homme, on estime le nombre de réplicons à 30 000. 24 25  La réplication de l’ADN Formation des bulles de réplication La réplication est initiée en de multiples sites: Origines de réplication, Au niveau de chaque origine de réplication, un réplicon se développe. Des hélicases séparent les brins parents: Fourches de réplication Elles progressent dans les deux sens en déplaçant les nucléosomes, Après le passage du réplicon les nucléosomes se reforment. Les brins séparés sont stabilisés par RPA « Replication Protein A » ou SSP Synthèse des amorces fournissant les extrémités 3’OH Hybrides ARN/ADN, complémentaires des brins parents Synthétisées dans le sens 5’--3’ par l’ADN Primase La réplication se fait dans le sens 5’ 3’ donc, au niveau d’une fourche: – Un brin sera synthétisé dans le sens de la fourche: brin direct – L’autre brin sera synthétisé en sens opposé (de 3’ a 5’) sous forme de petits fragments appelés : fragments d’Okasaki : brin tardif 26  La réplication de l’ADN 2-Élongation: deux nouveaux brins d’ADN sont assemblés en utilisant l’ADN parental comme matrice. Les dNTPs correctement appariés sont reliés un à un à l’extrémité 3’-OH des amorces Liaisons 3’-5’ phosphodiester par les ADN polymérases δ et ε Synthèse du brin direct continue à partir d’une amorce unique Synthèse du brin tardif par fragments discontinus (Okazaki, 200pb) et les amorces produites au fur et à mesure de l’avancée de la fourche 27 Synthèse du brin direct, brin précoce ou avancé (primaire) : Répliqué sans interruption (5’ à 3’) Il suit la direction de la fourche de réplication Plus vite Synthèse du brin tardif ou retardé(secondaire) : Se fait comme pour la synthèse du brin direct, exception faite qu’une ADN primase synthétise régulièrement une amorce d’ARN; Répliqué dans la direction (3’ à 5’) Il ne suit pas la direction de la fourche de réplication Plus lente Fabrique les fragments qui s’appelant les Fragments d’Okazaki 28 29 30 Finalement, l’enzyme ligase vient pour lier les fragments d’Okazaki ensemble. 31 32 Tableau récapitulatif des principales polymérases procaryotes (il existe d’autres polymérases : Pol IV etV) 33 Chez les eucaryotes 34 35  La réplication de l’ADN 3. Terminaison: La terminaison correspond à l’arrêt de la réplication lorsque deux fourches de réplication se rencontrent ou lorsqu’une fourche rencontre un signal de terminaison de la réplication. Amorces dégradées (RNAseH1 et FEN1), brèches comblées (polymérase δ/ε) et les fragments sont reliés par l’ADN ligase) Le processus de réplication est terminé et les nouvelles molécules d’ADN, composées chacune d’un brin d’ADN parental et d’un brin d’ADN fils, se reforment en hélices. 36  Sommaire 1. Hélicase ouvre la double hélice d’ADN pour former une bulle de réplication. 2. Les protéines fixatrices se lient aux brins parentaux pour leurs garder séparé 3. Les primases fabriquent des amorces d’ARN sur les brins parentaux 4. Les ADN polymérases utilisent les amorces comme les points de départ. Elles ajoutent les nucléotides d’ADN aux amorces et construisent les nouveaux brins. 1. Brin principal: Le brin qui est construit sans interruption dans la direction de la fourche. 2. Brin secondaire: Le brin qui est construit lentement et en petits morceaux s’appellent les fragments d’Okazaki. 3.ADN polymérase I enlève les amorces d’ARN et leurs remplace avec des nucléotides d’ADN 4. Ligase colle/attache les fragments d’Okazaki ensemble 37  La réplication de l’ADN Réplication des extrémités télomériques chez les eucaryotes Télomères: séquences répétitives se trouvent à l’extrémité des chromosomes L’ADN télomérique: est formé par des répétitions très régulières, en tandem), d’un motif simple de 5 à 8 paires de bases riches en guanine (TTAGGG) qui se traduit par la constitution de boucles, de tiges ou de structures à quatre brins, très stables. Le fragment 5’ se termine normalement. En *1+, le fragment 3’ se recourbe en épingle. Les guanines se combinent entre elles par une modification de leur configuration des sucres associés. L’extrémité est ainsi protégée de la dégradation par les DNAses. 38  La réplication de l’ADN La réplication des télomères A l’extrémité 5’ du brin fils de chaque chromatide, la dégradation de l’amorce ARN/ADN la plus distale laisse persister une brèche Si elle n’est pas comblée, – Raccourcissement progressif des télomères à chaque division – Lorsque ce raccourcissement atteint un seuil critique, la cellule arrête de se diviser et devient sénescente. Le nombre de divisions qu’une cellule effectue est limité (limite de Hayflick) et est lié à la longueur de ses télomères. 39 40  Le brin précoce est répliqué jusqu'au bout du brin matrice (complètement répliqué) Le brin retardé n'est pas répliqué jusqu'au bout 41 42 Elle nécessite une enzyme appelée télomérase: – Possède une activité de type reverse transcriptase (Synthèse d’ADN à partir d’ARN) – Et un ARN matrice complémentaire à des répétitions télomériques La télomérase va s’apparier au brin parent et l’allonger – Une amorce plus distale pourra s’apparier au brin parent allongé – La brèche du brin fils sera comblée (polymérase δ/ε et ligase) 43  La réplication de l’ADN Le raccourcissement progressif des télomères des cellules somatiques s'avérerait être une cause possible de la sénescence et préviendrait le cancer. Quand le télomère devient court, il ne joue plus son rôle protecteur: – La cellule interprète ceci comme une corruption de son ADN – Sénescence et stopper sa croissance – peuvent aussi provoquer une fusion de deux chromosomes non réparable et conduit à une apoptose de la cellule Plusieurs maladies du vieillissement: Progéria caractérisée par un vieillissement très précoce et provoquée par un raccourcissement télomérique excessif, les organes se détériorent d'autant plus que leurs cellules constitutives meurent ou entrent en sénescence. 44  L’activité du gène qui code la télomérase est directement liée à la longévité de la vie et au cancer Les cellules cancéreuses qui évite le mécanisme naturel de l’apoptose démontre une activité accrue de la télomérase 45  Réplication de l’ADN mitochondrial la réplication de l'ADN mitochondrial circulaire n’est pas limitée à la phase S du cycle cellulaire. Elle utilise deux origines de réplication : une pour chaque brin. et fait intervenir une structure intermédiaire à 3 brins L’ADN polymérase Gamma est responsable de la réplication de l‘ADN mitochondriale la réplication de l'ADN mitochondriale est contrôlée par des gènes nucléaires et fait intervenir de nombreux facteurs protéiques 46 47 48  Réparation de l'ADN L’information génétique d’une cellule peut subir de nombreuses altérations (mutations) lors de la réplication et sous l’action d’agents mutagènes. Ces mutations peuvent avoir comme conséquences : la mort cellulaire une maladie génétique chez la descendance ou le déclenchement d’un processus de cancérisation. Les systèmes de réparation de l’ADN jouent un rôle essentiel pour nous protéger contre ces événements. La réparation de l’ADN peut se faire au cours de la réplication pour assurer sa fidélité. La différence entre le brin parental et le brin néoformé se fait grâce à la différence de méthylation des cytosines. La réparation de l’ADN se fait également après la réplication (post réplicative) pour corriger les dommages causés à l’ADN par différents agents. 49 Réparation de l'ADN lors de la réplication Fidélité de la réplication Elle est très grande, chez la bactérie, la fréquence des erreurs est une erreur toutes les 10 10 bases. Cette précision est attribuée à: Le principe de complémentarité entre les bases Le contrôle de la lecture de l’ADN Pol par son activité exonucléasique Les mécanismes de réparation de l’ADN 50 Réparation de l'ADN lors de la réplication Trois mécanismes agissant séquentiellement: 1-La sélection des bases complémentaires de la matrice Assurée par le site actif des ADN polymérases α et δ/ε 2-L’activité de correction d’épreuve (proofreading) Uniquement assurée par l’ADN polymérase δ/ε et Pol polymérase γ qui réplique l’ADN mitochondrial. - La polymérase α ne possède pas ces activités: les amorces synthétisées seront dégradées et peuvent contenir des erreurs - La correction d’épreuve est liée à l’activité 3’-5’ exonucléasique 51 Réparation de l'ADN lors de la réplication 3-Le système MMR (Mutation MisMatchRepair) En biologie moléculaire, la réparation des mésappariements ADN ou DNA MisMatch repair (abrégé en MMR, pour MisMatch Repair) Système de reconnaissance et de réparation des défauts d'appariements de l'ADN. Assure la correction des erreurs échappant à la polymérase 52  Ce système constitue la deuxième ligne de défense contre les erreurs de réplication. La première est la relecture du brin nouvellement synthétisé par l'ADN polymérase elle-même. Ce mécanisme partagé par les Eucaryotes et les Procaryotes. Il est essentiel pour maintenir l'intégrité de l'information génétique contenue dans le génome au cours des multiples divisions cellulaires. Procaryotes: constitué de trois protéines formant des homodimères (MutS reconnait la lésion et recrute MutL qui active MutH qui est une endonucléase) Eucaryotes: le système s’est diversifié: On connait 6 homologues de MutS (MSH1 à MSH6), 4 homologues de MutL (MLH1, MLH3, PMS1, PMS2) mais pas d’homologue de MutH 53 -Mut S reconnaît le mésappariement -Fixation de Mut L qui stabilise -Mut H repère un site méthylé proche de la mutation -Excision puis réparation 54 Réparation de l'ADN lors de la réplication Fidélité de la réplication La réplication du génome (6.109nt) se fait ~ sans erreur: Sélection bases: Laisse échapper 1 erreur tous les 105nt Proofreading: En corrige 99%. Il reste 1 erreur tous les 107nt Système MMR: En corrige 99,9%. Il reste 1 erreur tous les 1010nt. 55  Réparation de l’ADN en dehors de la période de réplication Outre leurs erreurs de réplication, les mutations sont parfois le résultats de détériorations de l’ADN provoquées par des agents mutagènes divers: radiations ionisantes et certaines substances chimiques. 56  Réparation de l’ADN en dehors de la période de réplication 1. La réparation directe de la lésion (photolyase pour les dimères de thymine 2. La réparation par excision de base ou base excision repair (BER), 3. La réparation par excision de nucléotides nucleotide excision repair (NER), 57  La photolyase est une enzyme qui répare certains des dommages causés dans l'ADN par les ultraviolets et en particulier les dimères de thymine ou plus généralement de pyrimidine. Ce mécanisme très rapide (de l'ordre de la pico seconde) est encore mal connu Elle n'est pas présente chez les mammifères placentaires, et donc chez l'homme. La réparation par excision de base (ou BER pour Base excision repair en anglais). Ce mécanisme est présent chez les procaryotes et les eucaryotes et essentiellement impliqué dans les réparations de mutations endogènes jusqu’à 4 nucléotides. Une telle lésion est réparée par simple élimination de la base, suivi du clivage du désoxyribose, et se termine par une nouvelle synthèse d'ADN intact remplaçant le nucléotide endommagé. Réalisé par une N-glycosylase, endonucléase 3’-5’, l’ADN-polymérase I et l’ADN-ligase. 58 59 60 Réparation de l’ADN en dehors de la période de réplication La réparation par excision de nucléotides ou NER (pour nucleotide excision repair) est un des systèmes naturels permettant - dans une certaine mesure - la réparation de l'ADN dégradé (par exemple par une exposition aux ultraviolets ou à la radioactivité). Ce système permet de corriger principalement les lésions étendues ou qui déforment de manière importante l'ADN. Il freine le vieillissement de l'organisme, limite les mutations délétères et le risque d'apparition de tumeurs et cancer. Il prend en compte une endonucléase 3’-5’, l’ADN-polymérase I et l’ADN-ligase. Le système NER correspond au mécanisme de réparation par les UV (UVr). Le complexe UVrA, B, C, D reconnaît les distorsions de l’ADN. 61 Réparation de l’ADN en dehors de la période de réplication 62  Transcription et traduction Mécanisme de production des protéines 63  Transcription C’est la synthèse d’un ARN dont la structure primaire reproduit celle du brin sens du gène par une enzyme ARN polymérase ADN dépendante Au niveau d’un gène (Unité fonctionnelle), le brin anti-sens c’est le brin qui transcrit qui sert de matrice et le brin sens est son brin complémentaire. Seul l’ADN des gènes est transcrit Chez les eucaryotes, la chromatine doit être dans une conformation « active », obtenue en particulier grâce à des modifications des histones. 64  Les ARNm Les ARNm sont très majoritaires et seuls vont être traduits en protéines. Propriétés communes aux ARNm des procaryotes et des eucaryotes: – Structure mono caténaire simple brin 5′--AUGCUUAG --3′ – Capacité de se lier aux ribosomes pour former les polysomes – Polarité de la molécule: les ARNm se lient dans le sens 5′→3′ – Ont deux séquences non codantes en 5' et 3‘ Propriétés propres aux ARNm eucaryotes – Synthèse sous forme d'un précurseur: Premessager, hnARN, ARNm immature – Une stabilité et une durée de vie plus longue – Diversité et hétérogénéité. 65 66 ARN polymérase ARN polymérase comprend: Un noyau ou core-enzyme fait de 4 chaînes polypeptidiques: 2 α, β et β’. Le core-enzyme seul peut copier un brin d’ADN en ARN. Le facteur sigma σ: a un rôle dans l’initiation de la transcription. En son absence, la transcription se fait de façon imprécise. La polymérase se fixe au promoteur par l'intermédiaire de la sous-unité sigma. Cette dernière quitte le complexe polymérasique dès que la transcription est initiée. 67 Structure de l’ARN polymérase d’E.coli 68 Les ARN polymerases eucaryotes Les ARN polymerases eucaryotes Trois enzymes ARN polymérases catalysent les réactions de transcription chez les eucaryotes – ARN pol I ARNr – ARN pol II ARNm et Sn ARN – ARN pol III ARNt et ARNr 5S Les ARN polymérases eucaryotes ne nécessitent pas de facteur sigma σ Elles assurent la transcription mais aussi la séparation des deux brins de l’ADN 69  La transcription Caractéristiques de la transcription La synthèse d’ ARN utilise le principe de complémentarité des bases L’enzyme ARN polymérase Utilise le brin anti-sens comme matrice, lu dans le sens 3’-5’ Polymérisation dans le sens 5’-3’ Relie les rNTPs qui y sont appariés Ne nécessite pas d’amorce 70  La transcription La transcription commence en un point précis de l'ADN et se termine en un point également précis, l'espace entre les deux constitue une unité de transcription Unité de transcription qui est délimitée par : – le site d’initiation de la transcription: tsp (transcription startpoint) – le site de terminaison: le terminateur (t). Le promoteur: situé en amont de l’unité de transcription Par convention, – +1: le 1er nucléotide à partir duquel la transcription démarre – -1: pour le nucléotide qui précède une numérotation négative en amont du tsp: -1,-2,..,-10, une numérotation positive en aval du tsp: +1,+2,…,+10, 71  La transcription Les étapes de la transcription 1-l'initiation reconnaissance du début de l'unité de transcription 2-l'élongation polymérisation de la chaine d'ARNm 3-la terminaison nécessite la reconnaissance de la région de terminaison 72  La transcription 1-l'initiation L ’ARN polymérase reconnaît une séquence localisée en 5 ’ du gène : le promoteur qui contient des motifs particuliers. La fixation du complexe ARN polymérase entraîne l’ouverture de la double hélice La reconnaissance du promoteur implique de nombreux facteurs protéiques – Procaryotes : facteurs sigma – Eucaryotes : nombreux facteurs de transcription spécifiques des différentes ARN polymérases : ARNpol II (TFIIA-H), ARN pol I (TAFs), ARN pol III (TFIIIA-C) La fixation de l’ARN polymérase est conditionnée par la séquence d’intervention des facteurs de transcription 73  La transcription Le complexe complet [ARN polymérase-‐facteurs de transcription -‐Séquence ADN du promoteur] est appelé. complexe de pre-initiation de la transcription (PIC). Ce complexe assure: – Le chargement précis de l'ARN polymérase II (PolII) sur le bon site de démarrage de la transcription – La déshybridation (ouverture) de l'ADN au niveau du promoteur – Le relarguage de Pol II du promoteur 74 La transcription 75 76 a) Promoteurs procaryotes Les promoteurs bactériens sont caractérisés par la présence de deux séquences consensus : la région -35 et la boite de Pribnow. 77 b) Promoteurs eucaryotes 78 Les éléments conservés du promoteur sont :les séquences consensus : – Le point d’origine de l’initiation O: adénine encadrée de pyrimidines – Une séquence nommée TATA Box située à la position -25 environ, entre les séquences riches en GC (peut être absente chez certains promoteurs) – Séquence nommé CAAT Box située entre la position -70 et -80, cette séquence augmente l’efficacité du promoteur – La séquence GGGCGG ou GC Box à la position -90 et qui règle la transcription. 79 80  Ces promoteurs sont mal reconnus par l'ARN Pol. Leur reconnaissance spécifique nécessite très souvent des séquences supplémentaires permettant d'activer ces promoteurs : on parle de séquence enhancer, ou les inhiber : les séquences silencer 81  La transcription 2-l'élongation polymérisation de la chaine d'ARNm La transcription se fait dans le sens 5 3' ce qui signifie qu'elle s'agrandit en 3'. 82  La transcription 3-la terminaison nécessite la reconnaissance de la région de terminaison Cette terminaison de transcription se produit en des régions appelées "sites terminateurs". – d'une façon générale, les terminateurs eucaryotes sont caractérisés par la présence d'une suite de "T" sur le brin sens, on les appelle "T - rum" 83  La transcription ARN pré messager (ARN immature ou transcrit primitif) qui correspond à la copie fidèle d’un brin d’ADN en ARN (exons et introns compris) Quelles sont les modifications que subit l’ARNpm? Modifications post-Transcriptionnelle 84 Modifications post-Transcriptionnelle chez les eucaryotes 85  le capping Elle consiste en la fixation d’un «chapeau» ou «cap» à l’extrémité 5′ de l’ARNm. Ce chapeau est un nucléotide : l'acide guanilique méthylé sur l'azote en position 7 de la guanine. Cette fixation est de type 5′-5′triphosphate. – La présence du cap est indispensable à la traduction ultérieure de l’ARNm. Rôle de la coiffe: 1-Aide la cellule à différencier l’ARNm des autres types d’ARN 2-Se lie à une protéine (CBC) pour l’exportation de l’ARNm vers le cytoplasme 86  la polyadénylation Elle consiste à rajouter une suite d'adénine au niveau de l'extrémité 3' des ARNm. Cette suite constituera la "queue poly A" caractéristique de tous les ARNm eucaryotes. 87 Epissage 88 Le splicing des ARN messagers: Le pré-ARNm subira des excisions-épissages (Splicing) pour donner l’ARNm: – L’excision :la coupure et éliminations des introns – L’ épissage :la réunion des exons qui vont être soudés Site donneur: GU; situé à l'extrémité 5' de l'intron Site accepteur: AG; situé au niveau de la jonction 3’intron–5’exon Site de branchement du lasso: généralement PyNPyPyPuAPy; (A du branchement); située peu avant l'extrémité 3' de l'intron (environ -30 nt). 89  L’épissage est réalisé par le spliceosome: – complexe formé de ribonucléoprotéines – qui se place au niveau de l’intron à éliminer: Les ribonucléoprotéines (spliceosome) assurent la reconnaissance des sites d’épissage Contient plusieurs types de ribonucléoprotéiques: SnRNP("Small nuclear RiboNucleoProtein): des protéines associées à des petits ARN nucléaires("small nuclear RNA" -snRNA) riches en uracile (U1, U2, U4, U5 et U6) 1 snRNP= 1 snRNA+ 10-20 polypeptides 90 Epissage 91 Épissage alternatif L’épissage alternatif est un processus qui permet, à partir d’une séquence génomique unique, de produire plusieurs ARN messagers correspondant à des protéines distinctes. 92  Certaines cellules des follicules thyroïdiens sécrètent deux protéines : la calcitonine et la CGRP (Calcitonine Gene Regulated Peptide). Ces deux protéines sont déterminées par le même gène (Calc-1). L’ARN pré-messager résultant de la transcription du gène Calc-1 est constitué de: 6 exons et 5 introns 93 94  Le génome humain compte entre 20 000 et 30 000 gènes L’ADN est organisé en gènes. L’ensemble des gènes forme le génome d’un organisme. La discipline qui a comme champ d’action l’étude des gènes est appelée génomique La plupart des gènes codent pour des protéines. L’ensemble des protéines exprimées par un organisme est appelé son protéome Le protéome humain compte plus de 100 000 protéines, selon les auteurs La discipline qui a comme champ d’action l’étude des protéines est appelée protéomique 95  Le génome humain compte entre 20 000 et 30 000 gènes L’ADN est organisé en gènes. L’ensemble des gènes forme le génome d’un organisme. La discipline qui a comme champ d’action l’étude des gènes est appelée génomique La plupart des gènes codent pour des protéines. L’ensemble des protéines exprimées par un organisme est appelé son protéome Le protéome humain compte plus de 100 000 protéines, selon les auteurs La discipline qui a comme champ d’action l’étude des protéines est appelée protéomique 96  L’ARN messager est prêt à servir de matrice pour synthétiser les protéines 97  Traduction Introduction La traduction permet de convertir l'information génétique contenue dans une séquence nucléotidique d'un ARNm en une séquence d'Acides Aminés qui formera un polypeptide. A la suite de cette traduction, le polypeptide néosynthétisé subira un certain nombre de modifications qui conduiront à la formation d'une protéine fonctionnelle. =Synthèse, à partir d'un ARNm, , d'une protéine. ARNm ----traduction----> polypeptide ----maturation----> protéine fonctionnelle Protéines peuvent être : Cytoplasmique Sécrétées à l’extérieur de la cellule Exprimées aux surfaces membranaires ou dans les organites cellulaires 98  Traduction Les composants du système de traduction. La traduction d'un ARNm en protéine nécessite 3 composants principaux : 1. l'ARNm : matrice, c'est lui qui porte l'information génétique 2. les ribosomes : lecteur de l'information 3. les ARNt : font la relation entre les codons et les acides aminés correspondants. = molécules qui transportent les acides aminés du cytoplasme au ribosome où ils sont assemblés en protéine. Aminoacyl-ARNtsynthétase: Enzyme qui assure la liaison aa-ARNt correspondant 99  Traduction 1) La matrice (l'ARNm) Un ARNm peut être décomposé en X régions : une région leader en 5' (appelée "capping" chez les eucaryotes) : elle est non codante, donc non traduite. un codon initiateur AUG : c'est le premier acide aminé (donc toujours Methionine) une région codante (suite de codons) un codon non sens (ou codon STOP) : détermine la fin de la traduction une queue en 3' (polyadénylée chez les eucaryotes): elle est non codante, donc non traduite 100 2) Les ribosomes -Chez les Eucaryotes, ils sont libres ou associés à la membrane nucléaire ou à la membrane du RER. -constitués d’ARNr+ des protéines -structurés sous forme de 2 sous-unités Les ribosomes procaryotes: 70S -petite sous-unité 30S constituée d’un ARNr 16S + 21 protéines -grande sous-unité 50S constituée des ARNr 23S et 5S + 34 protéines Les ribosomes eucaryotes: 80S -petite sous-unité 40S constituée d’un ARNr 18S + 33 protéines. -grande sous-unité 60S constituée des ARNr 5S, 5.8S et 28S + 49 protéines 101  Les petites sous-unités des ribosomes possèdent des sites de fixation : – De la séquence de l'ARNm en cours de décodage – Des ARNt qui apportent l'acide aminé à incorporer au peptide en cours de synthèse, – Des facteurs protéiques nécessaires à la traduction. Les grandes sous-unités des ribosomes : – Site catalytique qui synthétise la liaison peptidique reliant les acides aminés au sein de la protéine. 102 Le ribosome comporte des sites spécifiques : Site A: site Acide-aminé ou Accepteur → fixation des acides aminés Site P: site Peptidique ou Donneur → fixation de f-Met Site E: site Exit → sortie de l’ARN de transfert. 103 3. Les ARNt ont une structure secondaire en forme de trèfle à 3 feuilles et une structure tertiaire en forme de L à l’envers Chaque ARNt est caractérisé par son anticodon Un ARNt ne transporte pas n'importe quel acide aminé: ça dépend de l'anticodon Exemple: – ARNtAAA transporte toujours l'acide aminé PHE ARNtGAU transporte toujours l'acide aminé LEU L'acide aminé est attaché au bon ARNt par l'enzyme aminoacyl-ARNt synthétase 104 105 Le déchiffrage du code 1. Règles fondamentales le code est constitué de triplets de nucléotides : 1 triplet = 1 CODON il existe 64 codons possibles (4*4*4), codant 20 acides aminés différents : le code est dégénéré chaque codon ne désigne qu'un seul acide aminé : le code n'est pas ambigu le même code génétique est utilisé chez tous les êtres vivants : le code est universel 2. Codons STOP Sur les 64 codons, 61 ont une correspondance en acides aminés. Les 3 codons qui n'ont pas de correspondances en acides aminés (UAA ; UAG ; UGA) sont des codons STOP (aussi appelés codons non sens) : ils arrêtent la traduction de l'ARN. 3. Codons d'initiation Comment le système choisit-il le bon cadre de lecture ? Il commence toujours par le même codon de départ de traduction : le codon d'initiation = AUG (Méthionine). 4. Dégénérescence du code La dégénérescence du code varie selon les acides aminés : leucine (Leu) : 6 codons différents thréonine (Thr) : 4 codons différents Triptophane (Trp), Méthionine (Met) : 1 seul codon 106  Traduction Elle s’opère en 3 étapes: 1-Initiation 2-Elongation 3-Terminaison Elle implique plus de composants protéiques et quelques étapes plus complexes 107  Traduction 1-Initiation 108  Traduction 2-Elongation 109  Traduction 3-Terminaison 110 111