Microbiología - Resumen de la Unidad Temática 1 (PDF)

UNIDAD TEMÁTICA 1: Microbiología. ¿Qué es la microbiología en general? Decimos que es una rama de la biología qué se dedica al estudio de los microorganismos que tienen tamaño muy pequeño no perceptible claramente a simple vista. Convencionalmente se establece que aquellos organismos que tienen menos de 1 milímetro pertenecen al objeto de Estudio de la microbiología. Es lo que normalmente denominamos microorganismos. Breve pasaje sobre los aspectos históricos más relevantes del desarrollo de la microbiología. Este apartado es para tener una idea de cómo el conocimiento científico fue modificado a través de los propios investigadores y a la vez fue modificado por la aparición o creación de diferentes instrumentos que facilitan o mejoran la observación del mundo que nos rodea y generan conocimientos diferentes por lo que se considera que las verdades no son únicas y no son permanentes, sino que van evolucionando. El conocimiento de la existencia de los microorganismos se pudo poner en manifiesto a través de la aparición del primer microscopio. Quien realizó el primer microscopio fue Anthony Van Leeuwenhoek, él era un comerciante holandés que como hobby tenía la preparación de lentes de muy buena calidad y a través de ellos observaba cosas que tenían vida, que les dio el nombre de animaliculos. Esas observaciones fueron documentadas tanto en escritos como en dibujos. De esta manera quiso transmitir lo que observaba. Estos descubrimientos tardaron en llegar porque estaban escritos en holandés y se debieron pasar a los demás idiomas para que llegaran a todos los investigadores. El descubrimiento de los microorganismos reavivó la vieja disputa que ya existía entre investigadores del campo de la biología porque al aparecer, se vuelve analizar si esos seres vivos o los seres vivos en general se originan a través de material inerte o de otros organismos preexistentes. Esta disputa entre la teoría que se llamaba generación espontánea (autogénesis) vs Generación a partir de semillas presentes en el aire (biogénesis) tuvo un resurgimiento. Los investigadores que más se destacaron por sus trabajos y condujeron a descartar la teoría de la generación espontánea fueron Lazzaro Spallanzani y Luis Pasteur. Este último particularmente, era un investigador incansable y con mucho carácter por lo cual tendía a ser muy demente en la defensa de sus teorías y sus escritos lo que contribuyó a que fueran consideradas sus ideas de que la vida partía de vida preexistente y no de materia Inerte. Una de las personas más importantes en la microbiología fue Luis Pasteur que tiene varios trabajos en distintos campos. Estos trabajos se originaron a partir de consultas que él tenía de diferentes industrias, por ejemplo, la industria de fabricación del vino. Sus descubrimientos fueron muy importantes para la época. También estableció cuáles eran los microorganismos normales en los procesos de transformación del alcohol y todo lo relacionado a este tipo de trabajo. TRANSFORMACIÓN DE LA MATERIA ORGÁNICA. VACUNA PARA LA RABIA (PROCEDIMIENTOS DE LA VACUNACIÓN – INMUNOLOGIA) Además, el descubrimiento por parte de Berkeley en una enfermedad denominada “Mildiu de la papa” siempre estaba presente un tipo de microorganismo que era un hongo, revivió la idea de que los microorganismos están vinculados a la existencia de enfermedades. También trajo la idea de que la presencia de los microorganismos está asociada a distintas enfermedades. Robert Koch dedicó toda su vida a la relación entre los microorganismos y las enfermedades. Uno de sus trabajos más importantes fue la generación de ciertos criterios en 1876 para cualquier investigador que trataba de establecer qué microorganismos eran causa de una determinada enfermedad y los pasos que debía seguir. A estos 1 criterios se los denomina postulados de Koch. Aún hoy se utilizan estos pasos para determinar los microorganismos causantes de enfermedades. También, tenemos que tener en cuenta que sus ayudantes tuvieron una importancia fundamental. Postulados de Koch: - El microorganismo debe estar presente en todos los casos de la enfermedad. - El microorganismo debe ser aislado del huésped enfermo y obtenerse en cultivo puro. - La enfermedad debe reproducirse cuando en cultivo puro se inocula en un huésped susceptible sano. - El microorganismo debe ser reaislado del huésped inoculado experimentalmente. Por ejemplo, la Cancrosis en los Citrus es una enfermedad producida por una bacteria. En el caso del primer postulado tenemos que tener en cuenta que en el Citrus siempre debe estar presente el microorganismo que genera esta enfermedad (Cancrosis) A partir de su huésped o citrus que está enfermo de cancrosis se debe aislar la bacteria que provoca esa enfermedad. (Segundo postulado). Aislar quiere decir que del conjunto de microorganismos presentes sobre el citrus debe obtenerse un cultivo de únicamente esa bacteria. Eso es lo que se denomina un cultivo puro. Para el tercer postulado, se puede ejemplificar como cuando tomó la bacteria que previamente aislé en el paso anterior y lo inoculó sobre un citrus sano que es susceptible a contraer esta enfermedad, este debe reproducir la misma enfermedad (O sea la cancrosis del citrus). En cuanto al cuarto postulado una vez que yo tengo la enfermedad en el otro huésped yo lo que puedo hacer es re aislar la bacteria nuevamente. Quedaron formadas dos escuelas de investigación microbiológica asociadas a las enfermedades Una de ellas fue la escuela francesa liderada por Pasteur que se dedicó a estudiar experimentalmente los procesos infecciosos y las reacciones de defensa frente a las infecciones. Otra de las escuelas fue la escuela alemana liderada por Koch que se centró en el aislamiento, cultivo y caracterización de las infecciones en humanos llegando a descubrir los agentes causantes de la tuberculosis, el cólera, la neumonía, entre otros. Existen otros investigadores que se dedicaron a aquellos microorganismos que cambiaban la materia orgánica del suelo (Como agentes geoquímicos). En este campo podemos nombrar a Winogradsky que estudió la asimilación autotrófica del dióxido de carbono en estudios con bacterias nitrificantes y la vida en ausencia de oxígeno. Beijerink se desempeñó en los microorganismos en ciclos biológicos de la materia en el suelo. SIGUIENDO LOS PASOS DE PASTEUR. APORTES DE LAS TRANSFORMACIONES DEL SUELO MEDIANTE LOS MICROORGANISMOS Dada la gran cantidad de conocimientos que se fueron acumulando a lo largo de la historia se puede organizar el estudio en sub disciplinas de acuerdo a según distintos aspectos: - Según el grupo taxonómico que estudia: bacteriología, virología, micología, etcétera. - Según el problema planteado: microbiología médica, industrial, agrícola, ecología microbiana, etcétera. - Según el ambiente en el que se desarrolla: microbiología acuática, del suelo, del aire, de la leche, etcétera. UNIDAD TEMÁTICA 2: Metabolismo microbiano productor de energía. ¿Qué es el metabolismo de la célula? Recordando lo visto en materia anteriores se puede decir que el metabolismo de la célula es un conjunto de reacciones químicas que se dan dentro de la célula destinadas algunas a la obtención de energía (Catabolismo) y otras a la formación de compuestos celulares (anabolismo). En la figura podemos ver qué rol cumple el ATP como agente acoplador de las rutas anabólicas y catabólicas. 2 A lo largo de un proceso catabólico tenemos diferentes reacciones donde un microorganismo obtiene energía a través de un compuesto como la glucosa, ciertos productos de ese metabolismo y ATP. En química orgánica y biológica se pueden ver procesos como la Glucólisis y el proceso respiratorio donde el ATP es utilizado en las diversas rutas biosintéticas (cuando las células deben incorporar nutrientes desde el exterior provocando un gasto energético). Estos nutrientes que se depositan en el interior celular pueden ser unidos y formar Intermediarios biosinteticos (los aminoácidos). A su vez estos aminoácidos pueden formar diferentes biopolímeros (proteínas) y los pasos para llevarlos a cabo necesitan un gasto de energía. Esta energía proviene de la energía liberada por el catabolismo y almacenada en el ATP. Diferentes catabolismos que son característicos del mundo microbiano. Respiración La glucosa a través de la vía glucolítica se transforma en ácido pirúvico. En algunas de las reacciones se libera suficiente energía como para la síntesis de ATP. Esta forma de obtener ATP se denomina fosforilación a nivel de sustrato. El ácido pirúvico formado a través del glucólisis transformado en acetil coenzima A entra al ciclo de krebs. En este ciclo también hay formación de ATP a través de la fosforilación a nivel sustrato, pero también hay generación de NADH tanto en glucólisis como en los pasos del ciclo de krebs. También en el ciclo de krebs existe generación de FADH. Estos compuestos se reoxidan en la cadena Citocromica y también en los distintos pasos se puede liberar suficiente energía para que se pueda sintetizar el ATP. La forma de sintetización del ATP se denomina fosforilación oxidativa y por cada NADH formado se sintetizan 3 ATP mientras que por cada FADH 2 ATP. Como resultado final de la glucolisis, por cada molécula de glucosa se liberan ATP, NADH, CO2 Y H2O. Obtención de energía en el proceso respiratorio Se dice en general que se producen 36 ATP por cada molécula de glucosa que se respira. En algunas bibliografías obtenemos que se produce 38 ATP por cada molécula de glucosa. Este valor es cierto en células procariotas ya que al no tener compartimentalización todos los procesos se cumplen en el mismo lugar de la célula. Resumiendo, la respiración podemos definir que es un proceso catabólico en el cual el donador de electrones en el proceso catabólico es un compuesto orgánico, como por ejemplo la glucosa se produce dióxido de carbono y ATP donde el aceptor final de electrones del proceso es el oxígeno molecular que se transforma en agua. Fermentación. La característica general o común a todos los procesos fermentativos es que tanto los donadores como los aceptores de electrones son compuestos orgánicos. Por ejemplo, la fermentación Homoláctica se produce en la leche, en los silos, etcétera. A manera de ejemplo la fermentación en la figura se encuentra muy reducida y partimos de una glucolisis hasta la formación de ácido pirúvico en el cual se gasta ATP y el paso de formación de ácido pirúvico a ácido láctico es el producto final de esta fermentación. En este proceso existe una reoxidación de NAD y se genera una proporción reducida de ATP porque el mismo se encuentra asociado solamente al proceso de fosforilación a nivel de sustrato. 3 Los NAD deben reoxidarse dentro de la cadena ya que no hay una cadena transportadora de electrones en este catabolismo. Ejemplos de otras vías fermentativas. Sintetizando podemos decir que la fermentación es un proceso catabólico en el cual los dadores de electrones y los aceptores de electrones son compuestos orgánicos como por ej. La glucosa y el ácido láctico. En este proceso se genera ATP por un solo mecanismo que es la fosforilación a nivel de sustrato. El rendimiento energético de la fermentación es mucho menor que el proceso respiratorio en el cual se producen por ejemplo en el caso de la fermentación homoláctica 2 ATP por glucosa metabolizada. Lo que caracteriza a la fermentación es que hay un equilibrio redox interno, ya que no hay reoxidación a través del proceso de fosforilación oxidativa. Existe un bajo rendimiento porque los productos quedan parcialmente oxidados no totalmente oxidados (como en la respiración). Hay formación y expresión de productos reducidos de fermentación en cantidades moleculares en comparación a las cantidades iniciales. Y, por último, los potenciales de reducción entre el donador inicial y el aceptor final son pequeños. Los microorganismos que obtienen la energía por procesos fermentativos son los anaerobios estrictos y facultativos. En general, los organismos facultativos cambian su modo de metabolismo productor de energía cuando son expuestos al aire. Aunque existe un grupo de microorganismos (bacterias del ácido láctico) a las que el oxígeno no les modifica el metabolismo productor de energía, prosiguiendo con la fermentación aun cuando crecen con aire. Microorganismos Coliformes: muchos de ellos ocasionan enfermedades. Son muy importantes a la hora de analizar la calidad o seguridad de alimentos (de agua o de leche). Presentan vías (producen ácidos, gases y en los butanodiolica, butanodiol). La presencia de los mismos se puede determinar en un medio de cultivo haciéndolos crecer y por su actividad se puede determinar si hay presencia de ácidos. Cuando hay presencia de ácidos, se puede visualizar el indicador de color (por baja de pH) y a la vez, en el tubo invertido se forma una burbuja que indica que en el proceso el microorganismo forma algún tipo de gas CO2 o O2 4 La bacteria se utiliza en los ojos de los quesos. El microorganismo genera este proceso fermentativo, el ácido propionico aumenta y genera ese ojo más grande. La presencia del ácido propionico es el que le da el picante al queso. (gruyere por ejemplo.) La fermentación homoláctica ocurre en algunos grupos de bacterias como las bacterias del ácido láctico, mientras que la fermentación alcohólica es propia de algunos hongos, especialmente del tipo de las levaduras. Respiración anaeróbica (Es muy importante y nos interesa porque es el causante de determinados procesos en el suelo) Lo que caracteriza a la respiración anaeróbica es que la glucosa pasa ácido pirúvico y luego al Ciclo de Krebs. El poder reductor que se va generando se oxida y entra a la cadena de transporte de electrones. A diferencia de lo que ocurre en una respiración aeróbica, donde entran en una cadena completa y los electrones se entregan al oxígeno molecular. En este caso el oxígeno no está presente o no es utilizado por el microorganismo entonces, se utiliza un aceptor alternativo para los electrones. Nosotros vamos a utilizar los nitratos y los sulfatos, pero hay otros aceptores (que son los que más nos interesan desde el punto de vista Agronómico). - Respiración anaeróbica utilizando nitrato: en la cadena de transporte de electrones a nivel del citocromo B se acopla a este aceptor alternativo de electrones y produce la reducción de este nitrato hasta nitrógeno molecular. La consecuencia es que la cadena de transporte de electrones se acorta y, por lo tanto, el rendimiento energético por cada NADH reducido es menor a 3. Viendo el total del proceso la respiración anaeróbica a través del nitrato produce 16 ATP por cada molécula de glucosa que se respira anaeróbicamente. - Este proceso es siempre un modo alternativo de metabolismo respiratorio productor de energía para crecer en ausencia de o2 5 Desnitrificacion: forman nitrógeno gaseoso. El óxido nitroso genera el efecto invernadero, el manejo de que no haya tanta desnitrificacion para que no haya tanto NO Utilización de sulfatos (sulfatoreduccion) y carbonatos como aceptores de electrones: La facultad de utilizar sulfatos o carbonatos como aceptores de electrones es una facultad restringida a pocos géneros de bacterias. Todas son anaeróbicas estrictas y no es un modo alternativo de metabolismo RESPIRACION ANAEROBIA. HAY UNA PARTE DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES HASTA EL CITOCROMO b Resumiendo, la respiración anaeróbica es un proceso catabólico donde el donador de electrones es un compuesto orgánico y el acepto también es un compuesto inorgánico distinto al O2. Nutrición microbiana Existe una relación entre la célula del microorganismo y su medio exterior. Desde el medio exterior la célula va a tomar nutrientes para realizar diferentes procesos (para su desarrollo y crecimiento). Los nutrientes le sirven a la célula para por un lado, para producir ATP vía catabólica y para la biosíntesis de compuestos que generan parte de la célula como por ejemplo las proteínas y también para ello va a necesitar nutrientes para concluir estos componentes celulares. Pero no solamente el ATP se gasta a través de las biosíntesis de diversos compuestos también se consume en otros procesos, cuando deben transportarse cosas a través de la membrana, eliminar productos de desecho o también para realizar trabajo mecánico. MEDIO DE CULTIVO: Conjunto de sustancias nutritivas y condiciones determinadas que permiten el crecimiento y multiplicación de un microorganismo o grupo de microorganismos. Para su preparación en laboratorio (construcción artificial) deben contener los nutrientes necesarios para que los organismos puedan desarrollorse. Las células microbianas tienen entre un 80% a 90% de su peso en agua por lo que este es un nutriente principal. Los demás nutrientes que requiere la célula son muchos, pero hay algunos que se requieren en mayores cantidades (macronutrientes: H, O, C, N, F, S) y otros se requieren en menor proporción (micronutrientes: K, Mg, Ca; Fe; Mn, Co, Cu, Mo, Zn). Listado de los nutrientes más importantes que requieren los microorganismos para su desarrollo y crecimiento. Y en general el rol que cumplen dentro de la célula. Los microorganismos difieren en la forma química en la que deben proporcionarse los siguientes elementos: C, N, S, O. 6 Donde pueden obtener los nutrientes los distintos tipos de microorganismos. Carbono: - Fuente inorgánica: dióxido de carbono La energía necesaria para reducir el CO2 a C de compuestos celulares deriva de la energía lumínica o de la oxidación - Fuente orgánica: compuestos sencillos (la glucosa) o compuestos más complejos (celulosa). Aminoácidos (que además de ser una fuente de carbono puede ser una fuente de nitrógeno o de azufre). Además de obtener el C de los compuestos orgánicos, también les aportan la energía necesaria para el metabolismo celular. Fuentes de nitrógeno. - Fuentes inorgánicas: amonio y nitrato. En medios de cultivo se pueden utilizar sales como por ejemplo la de nitrato de potasio o sulfato de amonio Los únicos organismos que son capaces de utilizar nitrógeno gaseoso son bacterias. Estas bacterias son las denominadas Diazotrofas (se encuentra el Rhizobium sp. y Azotobacter sp). La característica es que poseen un sistema enzimático (nitrogenasa) que les permite Utilizar esta fuente de nitrógeno, lo que no está presente en ninguna célula eucariota - Fuentes orgánicas: aminoácidos, peptonas. Fuentes de azufre: - Fuentes inorgánicas: sulfatos y sulfuros. En general se utilizan sales con estos iones. - Fuentes orgánicas: peptonas, aminoácidos (Cistina, cisteína y metionina). Factores de crecimiento. Estos factores nosotros los vamos a tener en cuenta cuando queremos hacer crecer algún microorganismo. Son Compuestos orgánicos donde el microorganismo no va a poder sintetizar a partir de la fuente de carbono más sencilla dependiendo del microorganismo, el mismo va a requerir más o menos factores de crecimiento. En general podemos decir que los organismos más evolucionados son aquellos que dependen de la provisión de factores de crecimiento de fuentes más complejas de carbono y los organismos más antiguos son aquellos que requieren de menores factores de crecimiento, además, se encuentra en sí mismo la capacidad de sintetizarlos. Los compuestos orgánicos que no pueden sintetizarse a partir de fuentes de C más sencillas, estos compuestos deben ser entonces suministrados como nutrientes: - Aminoácidos: para constituir proteínas. - Purinas y piridiminas: para construir ácidos nucleicos. - Vitaminas: para compuestos orgánicos que forman encimas. Estos son requeridos en muy pequeñas cantidades y a menudo, en los medios de cultivo, se agregan al incorporar extracto de levadura. Los factores de crecimiento son moléculas orgánicas específicas que, en muy pequeña cantidad, algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen función plástica (no son sillares de macromoléculas) ni sirven como fuente de energía Funciones del oxígeno en la nutrición. El O es un componente celular y es proporcionado por el H2O en gran cantidad. Sin embargo, muchos microorganismos necesitan O2 para poder vivir. Estos microorganismos dependen de la respiración aeróbica para sus requerimientos energéticos y ocupan el O2 como aceptor terminal de electrones. Estos organismos son los aerobios estrictos (Mycobacterium tuberculosis). Otros organismos son inhibidos en su desarrollo por acción del O2 y a estos se los llama anaerobios estrictos (Clostridium, Propionibacterium). Otros microorganismos son capaces de crecer tanto en presencia como en ausencia de O2. Estos son anaerobios facultativos, que a su vez pueden ser de dos tipos: -aquellos que tienen un tipo productor de energía exclusivamente fermentativo, pero no es afectado por la presencia de O2. (Alguna bibliografía la denomina anaerobios aerotolerantes, y son la bacteria del ácido láctico). 7 -otros pueden pasar de un metabolismo respiratorio (en presencia de O2) a uno de tipo fermentativo (cuando no tienen O2) o de respiración anaeróbica. Ejemplo de esto son las bacterias Coliformes: Escherichia coli, Aerobacter aerógenes, Klebsiella sp, etc. Otros: Pseudomonas sp, Bacillus sp, Alcaligenes sp. Por otra parte, están los microorganismos microaerofílicos, que son aquellos que poseen enzimas que se inactivan en condiciones de alta disponibilidad de O2, y sólo pueden actuar con bajas presiones de este elemento. Azospirillum sp es un ejemplo de microorganismo microaerofílico, ya que tiene la capacidad de fijar N2 (por poseer la enzima Nitrogenasa) sólo cuando está en un ambiente con baja tensión de O2. Categorías nutricionales. Una forma sencilla de clasificar los organismos se basa en la naturaleza de la fuente de energía y fuente principal de C. Con respecto a la fuente de energía: - fotótrofos: capaces de usar la luz como fuente de energía. - quimiótrofos: usan una fuente de energía química. Según la fuente de C: - autótrofos: utilizan CO2. - heterótrofos: utilizan una fuente orgánica de C. Las categorías nutricionales según estos criterios quedan organizadas así: - Fotoautótrofos: incluye algunos microorganismos fotosintéticos (vegetales superiores); dentro de los cuales tenemos algas, bacterias fotosintéticas (Cianobacterias). - Fotoheterótrofos: incluye algunas de las bacterias rojas y verdes (son fotosintéticas, pero no productoras de O2 y al H lo obtienen de compuestos de SH2 o de H2). No ocupan CO2 sino compuestos orgánicos. - Quimioautótrofos: oxidan compuestos inorgánicos (NH3, NO2, H2, SH2, etc.) Por ej., las bacterias nitrificantes que transforman el NH3 a NO2- y luego a NO3-. En esta reacción se libera energía, que la bacteria utiliza para captar el CO2 como fuente carbonada. Dentro de bacterias nitrificantes tenemos: Nitrosomonas europea, Nitrobacter winogradsky. Quimioheterótrofos: en estos tanto la energía como el C pueden obtenerse del metabolismo de un mismo sustrato orgánico. Serían microorganismos similares a los animales dónde se encuentran la mayoría de los microorganismos. Por ejemplo, Pseudomonas, los bacilos. Son aquellos que utilizan algún proceso para la obtención de energía y obtienen carbono orgánico. Por ej., glucosa que aporta energía (ATP) y los esqueletos carbonados a partir de los intermediarios del ciclo de Krebs. Tabla 3. Clasificación de los microorganismos en base a sus categorías nutricionales. REQUERIMIENTOS DE ENERGÍA FOTÓTROFOS QUIMIÓTROFOS Utilizan la energía Utilizan energía química luminosa AUTÓTROFOS Utilizan C inorgánico FOTOAUTÓTROFOS QUIMIOAUTÓTROFOS cianobacterias bacterias nitrificantes HETERÓTROFOS FOTOHETERÓTROFOS QUIMIOHETERÓTROFOS Usan C orgánico Bacterias verdes y rojas la mayoría de las bacterias (simbiontes, parásitas, saprófitas) UNIDAD TEMÁTICA 3: Crecimiento Microbiano. Crecimiento Bacteriano Introducción 8 En un sistema biológico se define al crecimiento como el aumento ordenado de las estructuras y los constituyentes celulares de un organismo. Según ello, el aumento de la masa celular producido por acumulación de productos de reserva (glucógeno, poliβhidroxibutirato) no constituyen crecimiento. Se puede considerar como crecimiento al incremento de células individuales, por un lado, y por otro lado se puede considerar al crecimiento del número de células (proliferación de la población). En lo que se refiere al crecimiento de células individuales, este consiste en el aumento del tamaño y peso de las células que precede a la división celular. Esta división trae aparejada un aumento en el número de células (proliferación de la población). Las bacterias se dividen por fisión binaria, a través de la cual una célula madre al alcanzar un determinado volumen se divide dando dos células hijas. El proceso de fisión binaria consiste en la autoduplicación del material hereditario seguido de la repartición en las dos células hijas, las que se separan por estrangulamiento de la membrana celular y formación de la pared celular (Fig. 1). Fig. 1. División binaria de células procariotas. 1 El cromosoma circular está unido a un punto de la membrana plasmática 2 El cromosoma se duplica. Las dos copias están fijas a la membrana en puntos cercanos 3 La célula se alarga, se agrega nueva membrana plasmática entre los puntos de unión 4 La membrana plasmática crece hacia el interior 5 La célula original se ha dividido en dos células hijas. La imagen corresponde al corte transversal de una célula procariota durante la fisión binaria en una etapa similar a la fase 4 descrita. Basado en el concepto que una célula se divide dando dos células hijas, y éstas a su vez se vuelven a dividir dando dos células cada una de ellas, se presenta en el siguiente cuadro la proliferación de una población de células a partir de una sola, con un tiempo de generación de 30 minutos. Al graficar en un sistema de coordenadas el tiempo (abscisas) y el número de células (ordenadas) se obtiene una gráfica como la que se muestra en el siguiente esquema: 2500 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4 5 6 tiempo (hs) 9 Fig. 2. Velocidades de proliferación en escala aritmética. Como se observa en la gráfica la curva aumenta su pendiente. Frecuentemente es útil transformar los datos de número de células a su logaritmo decimal (ó graficar el número de células versus el tiempo transcurrido en una gráfica semilogarítmica). Se obtiene así una gráfica en la que la relación es lineal. 10000 1000 100 10 1 0 1 2 3 4 5 6 tiempo (hs) Fig. 3. Velocidades de proliferación en escala logarítmica. Se conoce como tiempo de duplicación generacional al tiempo en que tarda una población en duplicar su número. Ésta última gráfica permite fácilmente encontrar el tiempo de duplicación para la población estudiada. Es frecuente que a partir de mediciones de crecimiento a intervalos conocidos y graficando estos datos se calcule el tiempo de duplicación de una población. Los tiempos de duplicación varían según el microorganismo del que se trate. Por ejemplo: Eschericha coli 0,35 hs Rhizobium meliloti 1,8 hs Nitrobacter sp aproximadamente 20 hs El estudio gráfico del crecimiento es muy útil, pero a veces es conveniente conocer la expresión matemática que representa este crecimiento exponencial χ = χ0. ℮ µ (t – to). Donde: χ: número de células o masa microbiana al tiempo t χ0: número de células o masa microbiana en el momento inicial (t0) µ: constante que da idea de la velocidad instantánea del crecimiento t-t0: tiempo transcurrido entre la medición inicial y la final Ciclo normal del crecimiento Las poblaciones microbianas raramente mantienen un crecimiento exponencial prolongado. Si ello ocurriera en poco tiempo la tierra estaría tapada de una masa microbiana mayor que la de la tierra misma. El crecimiento está normalmente limitado por el agotamiento de nutrientes o por la acumulación de productos del mismo metabolismo microbiano, que les son tóxicos a la población. La consecuencia es que el crecimiento al cabo de un cierto tiempo llega a disminuir hasta detenerse. En la figura 4 se presenta la gráfica de una curva típica de crecimiento bacteriana. Como se puede observar, en la gráfica se ha relacionado el tiempo transcurrido con el logaritmo del número de células bacterianas. Cuando se realiza este tipo de gráficas se obtiene una línea recta, sin embargo, en esta sólo un sector (fase exponencial) corresponde a una recta. Es posible distinguir cuatro fases: Fase de latencia o de retardo Fase exponencial Fase estacionaria Fase de muerte En la fase de latencia existe un aparente reposo en el que las células sintetizan las enzimas necesarias para la actividad metabólica que deben llevar adelante. 10 Cuando se hacen mediciones del número de células en distintos tiempos dentro de esta fase, el valor no cambia sustancialmente. En cambio, interiormente las células trabajan activamente adaptando el equipo enzimático al medio de cultivo. La bacteria se prepara para hacer uso de los nutrientes que este medio le aporta, por lo tanto, es la fase de adaptación al medio, con aumento de la masa celular pero no del número de células. La edad del inóculo va a influir en el tiempo de latencia en el medio fresco debido a la acumulación de materiales tóxicos y a la falta de nutrientes esenciales dentro de la célula durante el crecimiento anterior. En general, los inóculos viejos alargan la fase de latencia. Fig. 4 Curva de proliferación típica de una población bacteriana Pasado este período, el cultivo entra en la denominada fase de crecimiento exponencial, donde la velocidad de crecimiento es máxima. La velocidad de crecimiento que alcanza un cultivo, depende del tipo de microorganismo que se trate y diversos factores ambientales como son la temperatura, el pH, oxigenación, etc. La velocidad de crecimiento comenzará a disminuir hasta hacerse nula cuando alcance la fase estacionaria, ya que cambios en la composición y concentración de nutrientes entre el cultivo del inóculo y el medio fresco pueden desencadenar el control y la regulación de la actividad enzimática. Esta fase se presenta por agotamiento del suministro de algún nutriente esencial o por acumulación de productos metabólicos que sean tóxicos. También puede ser por la disminución de la oxigenación o cambios en las condiciones de pH del medio de cultivo (acidificación o alcalinización): En esta fase se equilibran el número de células nuevas con el número de células que mueren. Por último, el cultivo entra en la fase de muerte, en la que el número de células que mueren se va haciendo mayor. La pendiente de esta fase puede ser más o menos pronunciada de acuerdo al tipo de microorganismo de que se trate. Suelen presentarse pendientes menos bruscas cuando el microorganismo presenta alguna forma de resistencia (esporas, glicocalix). 11 A: azul; B: rojo; C: gris Crecimiento en sistemas cerrados. El crecimiento en sistemas cerrados es el que se utiliza habitualmente. Ocurre en un volumen fijo de medio de cultivo que es modificado a partir de los productos de los microorganismos. En este caso no hay aporte nuevo de nutrientes ni es posible eliminar productos de desecho del cultivo. Se observa una curva de crecimiento típica que se divide en varias fases (las que estuvimos viendo). Crecimiento en sistemas abiertos. El crecimiento en sistemas abiertos en los que se utilizan en las Industrias o en los lugares en el que se producen inoculantes. El volumen es constante y continuamente se incorpora el medio de cultivo fresco y a una velocidad constante se retira medio de cultivo usado, que contiene sustancias de desecho. Este medio se renueva y su composición no cambia a través del tiempo lo que permite mantener el crecimiento de una población de forma indefinida una vez alcanzado el equilibrio. Se controlan dos parámetros: - La densidad de población variando la concentración de nutrientes limitantes - La velocidad de crecimiento ajustando el flujo de salida. EN EL CASO DE QUE QUIERA UTILIZAR MENOS TIEMPO, EN INDUSTRIA SE UTILIZA UN FERMENTADOR CHICO Y DESPUÉS PASA AL FERMENTADOR GRANDE PARA EVITAR EL PERIODO DE LATENCIA Si quisiéramos construir o realizar la Gráfica de crecimiento de una población a través del tiempo deberíamos conocer qué método de medición del crecimiento tendríamos disponible para poder construirla. El crecimiento microbiano se mide a través de cambios sucesivos no sólo en el número de las células sino también en el aumento de la masa de las mismas. Existen varios métodos para estimar el número de células o la masa de las mismas. Métodos de medición del crecimiento 12 El crecimiento se evalúa haciendo mediciones sucesivas en tiempos determinados de la población en estudio. En cada momento se evalúa cual es la población en ese instante. Existen diversas formas de evaluar una población bacteriana. a. Conteo microscópico directo Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología, ya que consiste en contar con un microscopio la cantidad de células presentes en un volumen determinado. Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos (cámara de Petroff Hauser, cámara de Neubaver – Fig. 5-). Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados. La muestra puede utilizarse tal cual, (leche, o cultivos puros en medio líquido), o puede prepararse una dilución. Fig. 5 Cámara de Neubaver Para hacer el conteo se procede de la siguiente manera. Si se posee una cámara dividida en 25 cuadrados. El área de los 25 cuadrados es conocida, como también el volumen de muestra que esta área admite. Contando el número de bacterias presentes en los cuadrados (o algunos de ellos) se puede conocer cuánto hay en volumen conocido. Suponiendo 50 bacterias en 25 cuadrados, y sabiendo que los 25 cuadrados corresponden a 0,02 mm3. 50 bacterias _______ 0,02 mm3 x = _______ 1000 mm3 (1 cm3) x = 2.500.000 bact./mL = 2,5.106 bact./mL Ventajas del método Desventajas del método Es rápido La cantidad de muestra analizada es poca Los frotis se pueden guardar Provoca cansancio del operador Las exigencias de equipo son mínimas Sólo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000/ mL. Se pueden observar las diferentes morfologías Es difícil distinguir los microorganismos de las partículas de los microorganismos. de muestra Una inadecuada distribución de la muestra sobre la Es empleado para recuento de poblaciones superficie del portaobjetos puede ocasionar serios microbianas errores de suelo Es difícil diferenciar los microorganismos viables de los no viables b. Conteo de células viables El método se basa en la consideración que el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias. 13 Este método puede hacerse con medios sólidos o líquidos. El método más frecuentemente empleado es el conteo en placas (medios sólidos) formando colonias. Por lo tanto, se determinan por este método sólo las células microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmósfera, temperatura). Para ello se siembra una cantidad conocida de la suspensión bacteriana cuyo número se desea conocer. En un medio sólido cada bacteria se multiplicará formando una colonia visible a simple vista que puede ser contada. Como las colonias pueden originarse tanto de una célula como de un grupo de células, se utiliza el término: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.), y esto puede constituir una desventaja ya que si dos bacterias no se separan darán una sola colonia, subestimando de esta forma el número de microorganismos en la suspensión. Además, a los efectos de que todas las células que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del método sean menores, se establece que las condiciones óptimas de conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias. Sí obtenemos más de 300 unidades formadoras de colonias puede ser que subestimemos el recuento ya que los microorganismos no pudieron haber crecido por falta de nutrientes, falta de espacio, competencia entre las unidades formadoras de colonias, etcétera. Que pudieron inhibir el crecimiento microbiano. Si obtenemos menos de 30 unidades formadoras de colonias no debería contar aquellas placas que tienen menos de 30 unidades formadoras de colonias porque no serían representativas estadísticamente hablando Algunas bacterias son difíciles de contar en medios sólidos (Nitritadores) y se requiere de conteos en medios líquidos. Para ello se recurre a la técnica de determinación del número más probable (NMP) de microorganismos. Se basa en la determinación de la presencia o ausencia de un determinado tipo de microorganismo (en función de que crezcan o de que produzcan determinada reacción en el medio o no), en diferentes cantidades de muestra. Para poder determinar el NMP de microorganismo se debe diluir hasta tener una densidad que sea menor a 1 célula por cada mililitro de diluyente. Por ejemplo, para hacer diluciones hasta obtener 3 células en 5 ml se siembra 1 ml en cada uno de 5 tubos con medio líquido adecuado, esperando que en 3 tubos haya crecimiento de microorganismos y en 2 no (si las células no se distribuyen 1 en cada ml se pueden obtener otros resultados: 2 positivos y 3 negativos, o 1 positivo y 4 negativos). Los resultados posibles son al azar. La interpretación de los resultados, se hace en base a una distribución estadística, y en general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos, teniendo en cuenta la dilución en la se observa proliferación de microorganismos. Este método se emplea recuentos microbianos de Nitratadores por la dificultad que presentan para ser visualizadas las colonias en medios sólidos. También es útil para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por gramo, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas. Se prefiere además este método cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecación, etc.). Medición de la densidad bacteriana Es una técnica en la que se mide la masa de microorganismos en una suspensión. Para ello se utiliza un espectrofotómetro y se mide la cantidad de luz que atraviesa en una suspensión de microorganismos, en comparación con un blanco que es el medio esterilizado y sin sembrar. Cuanto mayor es el número de células en suspensión, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio. Para relacionar la transmitancia con a la densidad bacteriana se requiere de hacer curvas patrón de densidad conocidas. A= k x W A: Absorbancia k: constante W: masa celular Otros métodos de recuento 14 Determinación de ATP: Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Se considera que la proporción de ATP encontrado en una muestra es proporcional con la presencia de células vivas Recuento electrónico: Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan de electrodos que miden la resistencia eléctrica del sistema. Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es forzado a pasar desde un compartimiento al otro a través del pequeño conducto. Cuando pasa un microorganismo, la resistencia al pasaje de una corriente eléctrica se incrementa debido a que la conductividad de la célula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos y contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. No pueden medirse soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de más de una célula en un breve período de tiempo va a ser tomado como una célula más grande, y es común la obstrucción del orificio por microorganismos muy grandes. UNIDAD TEMÁTICA 4: Ecología Microbiana El ambiente afecta las actividades de los microorganismos a través de factores físicos, químicos y biológicos. Conocerlos implica interpretar su distribución en la naturaleza y permite idear métodos para controlar los microorganismos indeseables. Factores físicos y químicos que afectan a los microorganismos a) Temperatura Es un factor fundamental que actúa sobre los organismos vivos aumentando, por un lado, la velocidad de las reacciones metabólicas y el crecimiento; y más allá de ciertos límites, actúa inactivando proteínas, ADN, ARN, etc. Según ello existe para cada microorganismo una temperatura mínima por debajo de la cual no hay crecimiento, una temperatura óptima en la cual el crecimiento es máximo, y una temperatura máxima por encima de la cual no hay crecimiento posible (Fig.1). La temperatura máxima es generalmente solo unos grados mayores que la temperatura óptima. Fig. 1 Influencia de la temperatura sobre la actividad microbiana Los microorganismos son muy variables en cuanto a las temperaturas a las que pueden crecer pudiendo ser estas desde –12ºC a más de 100ºC, aunque un mismo microorganismo no puede soportar estos rangos (Fig. 2). 15 Fig.2 Velocidad de crecimiento vs. Temperatura para cuatro microorganismos Generalmente el rango de temperatura a la que vive un microorganismo es de 30 ºC a 40 ºC, aunque hay bacterias cuyo margen es de 10 ºC y otras de 50 ºC. Los microorganismos se pueden agrupar de acuerdo a la temperatura a las cuales se desarrollan en: Microorganismos de ambientes fríos: los microorganismos que crecen a temperaturas bajas se denominan psicrófilos o criófilos. Se caracterizan porque su sistema enzimático y membranas celulares les permiten vivir a bajas temperaturas. Existen psicrófilos obligados cuya temperatura óptima es de 15 ºC o menos y pueden crecer a 0 ºC, y los psicrófilos facultativos cuya temperatura óptima es de 25 ºC a 30 ºC pero pueden crecer a 0 ºC. Los psicrófilos obligados son microorganismos que crecen en los hielos de zonas polares (Ej. algas), mientras que los psicrófilos facultativos tienen una distribución más amplia (hay varios géneros de hongos, algas, protozoos que tienen miembros de este tipo). Los alimentos albergan a menudo microorganismos psicrófilos facultativos que le producen deterioro (Ej. carne en el congelador). Cuanto más baja es la temperatura más lento es el desarrollo microbiano. Existe un límite mínimo por debajo del cual la reproducción es imposible. A temperaturas de menos 30 ºC el crecimiento celular se detiene, pero siguen lentamente algunas reacciones enzimáticas. Probablemente sean los menos 140 ºC recién el límite por debajo del cual no haya reacciones químicas. Estas temperaturas se logran en nitrógeno líquido. La congelación impide el crecimiento, pero no asegura la muerte de los microorganismos por lo que no puede ser usado para esterilización. La congelación afecta las células, especialmente por el daño físico de los cristales que se forman. Cuando las células se congelan rápidamente se forman pequeños cristales y se mantiene mayor viabilidad celular, más aún cuando se utilizan ciertas sustancias que disminuyen el efecto congelante (glicerol). Microorganismos de ambientes cálidos: los microorganismos que tiene su óptimo de desarrollo de 25 ºC a 40 ºC se llaman mesófilos y se pueden encontrar en el suelo, plantas, animales. Por ejemplo, Escherichia coli cuya temperatura óptima es 39 ºC. La temperatura mínima de los mesófilos raramente es menor a 10 ºC. Microorganismos de ambientes con altas temperaturas: los microorganismos termófilos son aquellos que crecen a temperaturas mayores de 45 ºC a 50 ºC. Existen suelos que pueden alcanzar estas temperaturas, gran cantidad de abonos verdes que están en pilas de compostaje, ambientes naturales (aguas termales) que poseen altas temperaturas. Las bacterias de los géneros Bacillus, Clostridium, Methanobacterium, etc. que viven entre 55 ºC y 70 ºC son representantes de este grupo. Los microorganismos termófilos suelen causar problemas en los alimentos envasados, debido a que las temperaturas de pasteurización a veces son óptimas para su desarrollo. Según lo expuesto, se presenta en el siguiente gráfico algunos rangos de temperaturas de crecimiento para diversos microorganismos. Fig. 3. Clasificación de los organismos según el rango de temperatura de crecimiento 16 Se ha comprobado que las proteínas de los termófilos permanecen estables a temperaturas en la que la de los mesófilos se desnaturalizan. La adaptación de los microorganismos a distintas temperaturas también se debe a los lípidos que los componen, por ejemplo, a nivel de membrana celular. Los adaptados a bajas temperaturas tienen gran cantidad de ácidos grasos insaturados que permanecen líquidos y estables a bajas temperaturas. Por el contrario, los adaptados a temperaturas altas tienen gran proporción de ácidos grasos saturados que los hacen menos sensibles a las altas temperaturas ya que éstos permanecen estables a altas temperaturas. Cabe destacar que la fluidez de los lípidos a bajas temperaturas es mayor si están compuestos por ácidos grasos insaturados, y el funcionamiento de la membrana está dado por la fluidez de ésta. Entre los eucariotas no hay microorganismos que crezcan a más de 60 ºC. Se cree que es debido a las membranas de las organelas que son especialmente sensibles. Tampoco hay procariotas fotosintéticos que vivan a más de 70 ºC. Su sistema fotosintético (membranas tilacoideas) es sensible a las temperaturas elevadas. b) Agua y su actividad La disponibilidad del agua es uno de los factores más importantes que afecta el crecimiento de los microorganismos en sus ambientes naturales, ya que ésta constituye entre el 80 y 90% de su peso. La disponibilidad no depende solamente del contenido de agua, sino que es función de la cantidad de solutos presentes en una solución determinada y de la fuerza con que está retenida en los distintos materiales sólidos. El parámetro que mide la disponibilidad de agua es la actividad de agua (Aw), que es la relación entre la presión de vapor del agua del aire sobre una sustancia o solución, dividida por la presión de vapor del agua pura a la misma temperatura. La Aw se expresa como fracción de la unidad. Por ejemplo: 50% de HR = 0,50 Aw. La Aw está afectada por dos factores: la concentración de solutos en la solución, conocido como efecto osmótico y la adsorción a superficies, denominado efecto matricial. La influencia de ambos factores depende del ambiente en el que se desarrollen los microorganismos. Así el efecto osmótico es el de mayor importancia en ambientes acuáticos o sustancias como la leche, mientras que el efecto matricial tiene mayor peso en materiales sólidos como madera o alimentos. En un ambiente como el suelo influyen ambos factores, aunque el efecto de los solutos disueltos en la solución (efecto osmótico) sea menor en relación a la fuerza con que el agua es retenida por los materiales sólidos (efecto matricial). (Fig. 4). La actividad del agua afecta el desarrollo de los microorganismos. Una Fig. 4. Componentes del suelo baja Aw (por adición de soluto o alta adsorción), obliga al microorganismo a realizar trabajo para extraer agua de la solución. Esto trae aparejado una disminución del crecimiento ya que se gasta energía en incorporar nutrientes a la célula (transporte activo). Si la concentración de soluto aumenta en el medio externo (hipertónico) el agua tiende a salir de la célula y para contrarrestarlo incorpora soluto al interior gastando energía. Hay microorganismos que están más preparados para ello. Los valores mínimos de Aw para ciertos microorganismos varían: Organismos Especie Aw Escherichia coli 0,935 a 0,960 Bacterias Staphilococcus aureus 0,900 Halobacterium halococcus 0,75 Hongos Xeromyces bisporus 0,60 (el de menor actividad) Levaduras Sacharomyces rouxii 0,60 (el de menor actividad) El crecimiento microbiano es imposible con Aw suficientemente bajos, por lo que se pueden preservar ciertos materiales por desecación o aumento excesivo del efecto osmótico (dulces, charque -carne salada-, pescado salado), aunque muchos microorganismos pueden sobrevivir a la desecación (Fig. 5). Crecimiento 17 Actividad Agua, Aw Fig. 5. Velocidad de crecimiento versus actividad agua para diferentes clases de procariotas. a) tasa de crecimiento de microorganismos como Escherichia coli o Pseudomonas sp (no halófito) b) tasa de crecimiento de una bacteria halotolerante como Staphylococcus aureus c) corresponde al crecimiento de un halófito extremo como Halobacterium sp. c) pH El grado de acidez o alcalinidad de una solución es el pH, definido como el menos logaritmo de la concentración de H+ (pH = –log [H+]). Cada organismo tiene un rango de pH dentro del cual se puede desarrollar adecuadamente. Generalmente los microorganismos crecen entre pH que varían entre 5 y 9. Los hongos y levaduras crecen a pH que varían entre 5 y 6, y la mayoría de las bacterias prefieren pH 7 a levemente alcalino (aproximadamente 8). Según el rango de pH del medio en el cual se desarrollan pueden dividirse en neutrófilos, acidófilos y basófilos (acalófilos) (Fig. 6). basófilos Natronobacterium Fig. 6. Esquema de distribución de preferencias de pH de algunas bacterias Los microorganismos modifican los valores de pH del medio a través de su actividad. Por ejemplo, los que producen fermentación láctica descienden el pH por acción del ácido láctico que producen. En los medios de cultivo, para que no produzcan descensos bruscos de pH que inhiba el desarrollo microbiano, se les agregan sustancias reguladoras (tampón o buffer) que tienen la propiedad de mantener el pH constante. La acidificación natural de los materiales provocada por los microorganismos suele emplearse como forma de conservación de los mismos. Por ejemplo: la leche fermentada (yogurt) permite aumentar el período de conservación de la leche. Se beneficia el desarrollo del ácido lactico (fermentación homoláctica) que provocan una disminución del pH, produciendo la coagulación de la caseína e impidiendo el desarrollo de otros microorganismos presentes en la leche común, cuyo desarrollo provocaría el deterioro del producto Conservación del repollo (chucrut) Conservación de forrajes en los silos d) Oxigenación Los microorganismos son afectados por la presencia o ausencia de O2 de manera diferente. AMBIENTE EFECTO DEL O2 Oxidativo Reductor Aerobios estrictos Crec. (+) Crec. (-) Necesario Anaerobios facultativos a. Respiran (con O2) y Crec. (+) Crec. (+) No es necesario, pero beneficia Fermentan (sin O2) b. Fermentan (con o sin O2) Crec. (+) Crec. (+) No es necesario aerotolerantes Crecen mejor sin O2 Anaerobios estrictos Crec. (-) Crec. (+) Provoca muerte 18 Microaerófilos Crec. (+) si el Crec. (+) si el nivel Necesario pero a presiones nivel no es muy no es muy bajo menores que la atmosférica alto e) Radiación Se define como la transmisión de una fuente de energía de un lugar a otro a través del aire o espacio exterior, incluyen ondas hertzianas (sin efecto biológico), los rayos infrarrojos (producen calentamiento), la luz visible (380 a 720 nm de longitud de onda (Fig. 7). Estas últimas tienen importancia por el efecto como fuente energética para los microorganismos fotosintetizadores como las algas o como inductor a la reproducción sexual en los hongos. Fig. 7 Espectro de radiación electromagnética La radiación ultravioleta (200 a 380 nm) tiene efecto perjudicial para los microorganismos. Las radiaciones de menor longitud de onda son las radiaciones ionizantes (rayos X, gamma, cósmicos). Ionizan el agua y otras sustancias con efecto negativo sobre los microorganismos. La radiación UV y las radiaciones ionizantes se emplean para el control de microorganismos Factores Bióticos a) Relaciones con otros microorganismos El saprofitismo se puede observar en gran parte de los microorganismos que viven en el suelo ya que la mayoría de estos viven sobre la materia orgánica en descomposición. Primeramente, hacen una digestión extracelular de la materia orgánica y luego absorben nutrientes a través de la membrana celular. Como ejemplo se puede citar al grupo de organismos denominado celulolíticos, que con enzimas extracelulares digieren la celulosa hasta compuestos que luego son incorporados a la célula y siguen degradándose sirviendo como fuente de energía y carbono para los microorganismos. El sinergismo es una relación en la cual los grupos de microorganismos tienen un efecto mayor actuando juntos, que los efectos sumados cuando ambos grupos actúan por separado. Como ejemplo se puede tomar la relación sinérgica que se establece entre los microorganismos que se emplean en la elaboración del yogurt, en donde Streptococcus salivarius subsp. thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus fermentan la lactosa produciendo ácido láctico y provocando la coagulación de la caseína; así la acidificación producida es mayor cuando actúan juntos que cuando actúan por separado. Streptococcus salivarius subsp. thermophilus produce ácido fórmico que estimula a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus el cual produce aminoácidos y péptidos que tienen una acción benéfica sobre el primero. La simbiosis es la asociación de microorganismos en los cuales ambos salen beneficiados. Un ejemplo de esto se produce en el rumen en donde existen numerosos microorganismos en asociación simbiótica con los animales confiriéndole propiedades especiales (Fig. 9) Fig. 9 Esquema de los estómagos del rumiante a la izquierda y vista de protozoos del rumen a la derecha 19 Beneficios del animal superior al microorganismo Beneficios del microorganismo al animal superior Temperatura constante (37 ºC). Digestión de la celulosa: la hidrólisis de la celulosa Alta humedad. por las enzimas extracelulares de los Condiciones anaeróbicas. microorganismos, les permite a los rumiantes Continúo aporte de sustrato a través del alimento aprovechar este nutriente. Los microorganismos masticado. también degradan almidón y carbohidratos solubles. Suministro de gran cantidad de saliva con buffer La fermentación de los HdeC tiene como productos (CO3HNa) que neutraliza los ácidos provocados por finales ácidos grasos volátiles (acético, butírico y la fermentación. propiónico), CO2 y metano. Eliminación de los productos finales. Éstos aportan energía al animal. Agitación constante que provoca mejor crecimiento microbiano. Elaboración de proteínas: los microorganismos del rumen sintetizan aminoácidos y proteínas de alto valor biológico que luego son usados por los animales cuando el contenido ruminal, incluidos los microorganismos, pasa a los estómagos subsiguientes. Esto permite suministrar N no proteico a los rumiantes y así sustituir parte de la proteína de la dieta. El N no proteico se transforma así en proteína de alto valor biológico en los microorganismos del rumen, que luego son digeridos junto con el resto del alimento en el cuajar. Vitaminas: los rumiantes adultos no necesitan que se les aporte vitaminas en la dieta ya que éstas son elaboradas por los microorganismos ruminales y aprovechadas cuando son digeridas en el cuajar. Dentro de las vitaminas hidrosolubles se pueden citar: tiamina, niacina, ác. pantoténico, piridoxina, riboflavina, biotina, ác. fólico, Vit. B12. Entre las liposolubles: vitamina K. 20 Cuando uno de los organismos es beneficiado por los productos de excreción de otro que no es dañado se da la relación de comensalismo. Un ejemplo de este tipo de relación se da entre los microorganismos fijadores de N de vida libre y los microorganismos descomponedores anaeróbicos de la celulosa. Los descomponedores de la celulosa liberan como productos metabólicos compuestos carbonados de cadena corta (etanol, ác. acético, succinico, propiónico) que sirven como fuente de alimento a los fijadores libre de N (Azotobacter, Derxia, Beijerinckia) que no causan ningún daño a los celulolíticos. Si en una relación uno de los organismos es beneficiado y el otro es dañado, es un caso de parasitismo. La virulencia es la capacidad relativa de un parásito de causar una enfermedad, y está dada por dos aspectos: Capacidad de invasión al huésped (penetración y multiplicación en el huésped) Toxigenicidad: los microorganismos poseen compuestos celulares o productos metabólicos que pueden lesionar los tejidos del huésped. Estos compuestos son las toxinas que pueden ser de dos tipos: endotoxinas y exotoxinas. Las endotoxinas se dan generalmente en bacterias Gram (-) y son parte de su pared celular (lipopolisacáridos). Son liberadas por lisis celular. Ejemplos de microorganismos con endotoxinas: Salmonella typhi (agente causal de la fiebre tifoidea) Salmonella paratyphi (agente causal de la fiebre paratifoidea) Shigella disenteriae (agente causal de la disentería bacteriana) Las exotoxinas son liberadas por los microorganismos pudiendo trasladarse desde el foco de infección a distintas partes del cuerpo. Estas toxinas son muy potentes. Los microorganismos productores de exotoxinas son principalmente bacterias Gram (+). Ejemplos de microorganismo con exotoxinas: Clostridium botulinum (agente causal del botulismo) Clostridium tetani (agente causal de tétanos) Corynebacterium diphtheriae (agente causal de la difteria) Antibiosis es la relación entre microorganismos en la cual uno produce sustancias que son tóxicas para el otro (antibióticos). Los principales microorganismos productores de antibióticos son: Hongos de los géneros Penicillum y Aspergillus. Bacterias del género Bacillus. Actinomycetes (bacterias). UNIDAD TEMÁTICA 5: Taxonomía Bacteriana La taxonomía tiene por objetivo dar un ordenamiento a las unidades taxonómicas básicas (Esas unidades taxonómicas básicas son las especies). El objetivo de la taxonomía se aplica a todas las especies, pero nosotros vamos a hacer énfasis en la taxonomía bacteriana. La definición de una especie está basada en la capacidad de reproducirse y dejar descendencia fértil esta limitación para llamar especie no se puede aplicar a las bacterias porque se dividen por fisión binaria. Por lo tanto, no hay reproducción cruzada como lo presente en la definición de especie. Especie bacteriana Es un conjunto de poblaciones clónales que presentan un elevado grado de similitud fenotípica entre sí que a su vez difieren de otros conjuntos de poblaciones clónales. Esta definición de especie se podría simplificar como un conjunto de microorganismos que han sido desarrollados a partir de una única cepa (célula parental). Ese conjunto de bacterias que a la vez para constituir una única cepa va estar estrechamente vinculado desde lo fenotípico, pero a la vez difiere de los otros microorganismos. POBLACION CLONAL: LA DESCENDENCIA DE UNA BACTERIA ES UNA CEPA O UNA POBLACION CLONAL. A una especie se lo nombra a través de dos nombres: - El primero denomina el género - El segundo es el epíteto específico (Y ambos en conjunto constituyen la denominación de la cepa) Para caracterizar una especie bacteriana tendremos que hacer un análisis de cómo está constituido la totalidad del genotipo - Ideal: caracterización completa del genotipo 21 - Real: caracterización parcial del fenotipo Manual Bergey de bacteriología - volumen 1 bacterias gram negativa de importancia médica industrial - volumen 2 bacteria gram positiva importancia médica e industrial - volumen 3 bacterias gram negativas restantes - volumen 4 actinomicetos y bacterias relacionadas El Manual Bergey agrupa a las bacterias por sus características principalmente las tintorescas (gram positiva y gram negativa). A su vez también hay caracterizaciones morfológicas, fisiológicas, bioquímicas que van a ir separando géneros y especies. Cuando nosotros utilizamos este manual estamos haciendo una identificación. Diferencia entre clasificación e identificación entre microorganismos o bacterias en particular - Clasificación teoría y proceso de ordenamiento en grupos de los organismos sobre la base de propiedades compartidas - Identificación determinación de A qué especie pertenece mediante la caracterización del organismo Identificación utilizando herramientas de la taxonomía clásica Basada en caracterización morfológica, fisiológica y bioquímica Requiere de aislamiento y cultivo de microorganismos (es lo primero que nosotros debemos realizar para hacer una identificación). El microorganismo se va a aislar, se va a separar de su medio natural en un cultivo puro y luego recién vamos a poder realizar y la identificación. Herramientas que se utilizan para realizar una clasificación teniendo en cuenta la taxonomía clásica Caracterizan a la bacteria por su morfología y características fisiológicas (p.e. temperatura, pH optimo, agrupamientos, estructuras y demás) Coloración Gram. Lo primero que haríamos al identificar sería una coloración Gram. Coloración de gram Negativo: se observan bacilos aislados de color rosado (coloración dada por la safranina). Coloración de gram Positivo: se observan cocos agrupados en estafilos (estafilococos) de color violeta, típico de una coloración de Gram (+). Se puede aprovechar para clasificar al microorganismo según su forma, si presenta o no agrupamientos (en los cocos que pueden formar estreptococos). También, si tienen alguna forma especial (aunque a veces hay que hacer otras coloraciones) pero se puede identificar si la bactería puede formar esporas, la ubicación de estas esporas así como también, si pueden formar cápsulas. 22 Para la identificación de bacterias se tienen que hacer pruebas tanto bioquímicas como fisiológicas que en general se aplican para la identificación de coliformes. Pruebas bioquímicas y fisiológicas A menudo entre las coliformes existen algunas que se encuentran asociadas al intestino y otras que no lo están asociados. Una de las diferenciaciones es por su capacidad metabólica. Las bacterias asociadas al intestino presentan un tipo de fermentación ácido mixta mientras aquellas que no están asociadas al intestino producen una fermentación de tipo butilenglicolica. - Rojo de metilo: detecta si el microorganismo evaluado produce gran cantidad de ácido. Principio: fermentadores ácido-mixtos que producen una descenso de pH por debajo de 4,3. Se agrega el indicador Rojo de Metilo al medio de cultivo, luego de la incubación. Si ocurre un descenso de pH por debajo de 5, se produce un viraje al color rojo y la prueba se considera (+) determinando la existencia de coliformes intestinales. Resultados (-) se observan por lo general de color amarillo. Se utiliza para diferenciar Escherichia sp. (+) de Enterobacter sp. o Klebsiella sp.(-) - Voges Proskauer: detecta si el microorganismo evaluado produce 2-3 butanodiol. Principio: producción de 2 – 3 butanodiol (fermentadores butanodiólicos). Reactivo: -naftol. Resultados: reacción color rojo que nos indicaría la presencia de coliformes no fecales (+) reacción color amarillo (-) Se utiliza: para separar bacterias de los géneros Klebsiella y Enterobacter (+) de Escherichia (-). - Catalasa: la presencia de está enzima le permite al microorganismo desdoblar el peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. Principio: propiedad de la enzima catalasa de descomponer el peróxido de hidrógeno (H2O2). Se añade al cultivo unas gotas de H2O2 para observar la formación de burbujas. La observación de burbujas (tubo +) indica la presencia de la catalasa. Se utiliza para diferenciar los géneros Bacillus (+) de Clostridium (-), Stresptococcus (-) de Staphylococcus (+) - Sistemas comerciales: Existen sistemas comerciales que permiten la rápida identificación de una bacteria en base a la capacidad de utilización de determinados sustratos, presencia de determinadas enzimas, etc. Puedo identificar de qué microorganismos se trata teniendo en cuenta si ha usado determinado sustrato. Técnica serológica 23 Utilización in vitro de las reacciones antígeno-anticuerpo para la identificación de un microorganismo ya sea virus bacteria u hongo. Estas técnicas no corresponden a la taxonomía clásica. Pero son técnicas identificatorias. Animales de sangre caliente generan anticuerpos para atacar al antígeno. La posibilidad de que un anticuerpo ataque a un solo virus es lo que se utiliza en taxonomía. Frente a la aparición de virus, bacterias u hongos (antígenos) se generan los anticuerpos que nos protegen de los antígenos. Utilizando el anticuerpo puedo determinar el antígeno - Placas de inmunodifusión: Si tenemos soja y queremos saber si sus nódulos fueron causados por una cepa específica se utilizan esas placas. En donde se encuentra el antisuero se coloca el anticuerpo contra la cepa e109. En las celdas testigo colocamos una cepa de referencia (e109). En los antígenos vamos a colocar los diferentes módulos. Teniendo la cepa y su anticuerpo se va a generar una banda de precipitación que identifica que la cepa y el anticuerpo han reaccionado. Asimismo podríamos concluir que aquellos organismos que forman la banda de precipitación van a contener la cepa e109. - Test de ELISA: Consiste en la identificación de un organismo. Se coloca este organismo a identificar de manera adherida en el fondo de una cuba. También, se va a colocar un anticuerpo que está unido a una enzima y se procede con un lavado. Si hubo un reconocimiento entre bacteria y anticuerpo en el lavado no se va a arrastrar el anticuerpo. Entonces, cuando se coloca un sustrato que es incoloro si está presente la enzima el sustrato va pasar a producto y este producto va a ser coloreado (+). Concluyendo que la cepa es la e109. Si observamos que el sustrato no cambia de color quiere decir que no va a estar presente la enzima o no va a estar presente el anticuerpo (-) - Anticuerpos fluorescentes: técnica que se usa para imágenes microscópicas normalmente el microorganismo se puede poner en un portaobjeto. La ventaja de este método es poder utilizar microorganismos sin aislar y aun así vamos a poder detectar si hay la presencia de una determinada cepa de microorganismos. En este caso, poseemos un anticuerpo al cual se agrega a los cuerpos fluorescentes. Primero, se reconoce el microorganismo y el anticuerpo. Luego, en el lavado el anticuerpo se va a quedar pegado, si esto no ocurre se va a arrastrar y la observación microscópica va a ser distinta a la esperada (en el microscopio fluorescente no vamos a poder ver esta fluorescencia). Taxonomía genética Aplicaciones de la biología molecular a la identificación bacteriana La caracterización se basa en la información contenida en el genoma. No se trata de observar las características fenológicas si no, la secuencia de sus ácidos nucleicos. - Composición de bases del ADN Observa que proporción de guanina - citosina hacia el total de bases del ADN. En un organismo determinado. En general en células eucariotas esta proporción no es muy variable sí lo es en células procariotas. Esta técnica en sí no sirve para la identificación pero sirve para descartar ciertas cosas al comparar dos organismos. Por ejemplo dos organismos no van a ser parecidos la composición de bases no es similar 24 - Técnicas basadas: En la hibridación del ADN y ARN. Si se puede lograr una hibridación del 100% puedo asegurar que los microorganismos son los mismos. Si la hibridación es menor podríamos decir que el microorganismo pertenece al mismo género o familia. Cuanto menor sea ese porcentaje más alejados van a estar estos microorganismos porque deben compartir gran cantidad de pares de bases para estar cerca en su evolución Amplificación de sectores del ADN por ejemplo PCR. Esta técnica consiste en copiar muchas veces un sector específico y luego se compara ese sector entre una serie de aislamientos que nos estaría interesando. Se puede trabajar con un número muy grande de aislamientos y disminuirlos a dos o tres haciendo un trabajo más sencillo. Entonces lo que hacemos es comparar los diferentes aislamientos contra un testigo que es la bacteria que nosotros queremos determinar. Secuenciación de ácidos nucleicos Consiste en la determinación del ordenamiento de los nucleótidos. Se trata del análisis de las secuencias en bases de datos a través de un secuenciador para poder ubicar nuestra cepa de acuerdo a como es la secuencia en el árbol filogenético del conjunto de bacterias conocidas. Esta técnica es la más exacta pero no se utiliza tanto ya que se necesita de un secuenciador que es un elemento muy caro Sintetizando: Si identificamos microorganismos utilizando herramientas de taxonomía genética→ Analizamos parte o toda la carga genética del microorganismo Complemento Teórico Práctico Identificación de Bacterias El trabajo en microbiología se basa en el estudio de poblaciones microbianas debido a la dificultad en la manipulación y la limitada información que se puede obtener a partir de los individuos microbianos. Los pasos que se siguen para determinar la identidad de un microorganismo es la IDENTIFICACIÓN. Un microorganismo se identifica adecuadamente cuando se encuentra que la descripción de una especie es idéntica a las características observadas en dicho microorganismo. La unidad taxonómica de clasificación que comúnmente se utiliza es la especie. Esta categoría sistemática se define como el conjunto de poblaciones clonales1 de elevada similitud fenotípica2 que a su vez difieren de otras poblaciones clonales. Una característica de los microorganismos es que en un corto período de tiempo ocurren considerables aumentos de las poblaciones, lo que determina que se puedan establecer cambios genéticos que adquieren continuidad. Ello hace problemático diferenciar especies sobre la base de un pequeño número de caracteres. La esencia de la identificación la integran dos clases de operaciones: Aislamiento, que es el tipo de siembra que permite la separación de microorganismos a partir de una población mixta (constituida por más de una clase de microorganismos). Cultivo, que es el crecimiento de la población microbiana en ambientes artificiales (medios de cultivo), bajo condiciones de laboratorio. Estas operaciones son las mismas independientemente de los microorganismos con los que se trabaje. Para comenzar la identificación se parte de un cultivo puro3, lo que previamente ha implicado el aislamiento del microorganismo a partir de una población microbiana natural mixta (leche, suelo, etc.). Para obtener un cultivo puro se utilizan técnicas como el enriquecimiento selectivo y la siembra en placas. El aislamiento para la obtención de un cultivo puro por métodos de siembra en placa implica la separación e inmovilización de las células individuales sobre un medio nutritivo solidificado con agar. Cada viable da origen, al crecer, a una colonia cuya transferencia puede hacerse fácilmente con ansa. La siembra en estría para la purificación de cultivos es el método empleado. El inóculo4 tomado con el ansa se va agotando progresivamente con cada sucesiva estría. Así las estrías iniciales proporcionan un crecimiento confluente y a lo largo de las últimas estrías se van desarrollando colonias aisladas. Pero, si toma material de una de estas colonias y se transfiere a un medio apropiado a esto no se le puede denominar un cultivo puro, ya que por cada colonia visible en la primera placa puede haber células de otros microorganismos que quedaron depositadas en el agar y no lograron dar un crecimiento macroscópico a pesar que son viables. Por lo tanto nunca se debe tomar la colonia de la primera placa para preparar un cultivo puro, 25 sino que a partir de esta se hace una segunda siembra denominada purificación. Si todas las colonias de esta segunda placa resultan idénticas, una colonia bien aislada puede utilizarse para establecer un cultivo puro. Es necesario que una vez que se logró el aislamiento se mantenga al microorganismo y a su descendencia en un ambiente artificial que impida el acceso de otros microorganismos. Este ambiente se puede crear en la caja de petri o en el tubo de ensayo. Obtenido el cultivo puro es posible hacer la identificación del microorganismo utilizando los caracteres morfológicos y bioquímicos y fisiológicos. Lo ideal sería una descripción completa de su fenotipo (expresión de los caracteres), o mejor aún por su genotipo (información genética). Como metodología habitual se utilizan criterios de fácil determinación como los morfológicos, por su practicidad. Algunos de ellos son forma, tamaño, movilidad, reproducción, tinción a colorantes especiales como la de Gram, presencia o ausencia de estructuras como esporas, cápsulas y flagelos, crecimiento en medios geleficados en los que se puede observar forma, tamaño, color y aspecto de las colonias producidas. Sin embargo este criterio ofrece elementos de juicio insuficientes para la caracterización definitiva y por lo tanto se tienen en cuenta otros criterios como son los mecanismos fisiológicos y bioquímicos, entre los cuales se incluyen información sobre crecimiento, muerte y supervivencia en diferentes condiciones de cultivo (temperatura de crecimiento, pH, concentración de sales, etc.), ausencia o presencia de enzimas (catalasa, amilasa, etc.), como toman, utilizan y /o almacenan la energía. 1 Un clon es una población de células bacterianas derivadas del crecimiento de una sola célula parental convenientemente aislada. 2 Fenotipo es el conjunto de caracteres hereditarios que se expresan, mientras que se conoce como genotipo a toda la información contenida en el genoma de los individuos de una determinada especie, y que no necesariamente siempre se expresa. 3 Cultivo que contiene una sola clase de microorganismos. 4 Material microbiano utilizado para sembrar. UNIDAD TEMÁTICA 6: Genética microbiana Aspectos básicos de la genética microbiana El genoma bacteriano está compuesto por un único cromosoma de ADN circular cerrado. Además poseen estructuras denominadas plásmidos constituidas también por ADN, que se encuentran en número variable en la célula bacteriana. Las bacterias se multiplican mediante un proceso denominado “fisión binaria“por el cual, previa duplicación del cromosoma bacteriano, se produce una estrangulación del protoplasma de modo que se originan dos células idénticas (o clones) con un cromosoma cada una y una cantidad similar de plásmidos. Esta forma de “reproducción asexual” no produce cambios en el genoma. Como consecuencia todos los organismos de una colonia bacteriana son genéticamente idénticos a la célula que les dio origen (célula progenitora). Sin embargo la variabilidad genética también se presenta en las bacterias, aunque en una proporción muy baja. El genoma bacteriano puede sufrir variaciones debido a procesos denominados mutaciones, mediante los cuales se origina un cambio heredable en la secuencia de bases del ADN. Estos cambios son pequeños pero suficientes para generar individuos genéticamente diferentes a sus células progenitoras. La variación en la constitución genética se puede dar por dos procesos: la mutación y la recombinación genética. La mutación origina un cambio heredable en la secuencia de bases del ADN bacteriano, mientras que la 26 recombinación genética involucra la transferencia de ADN entre una bacteria donadora y otra receptora y la integración del material transferido al genoma de la bacteria receptora. Mutaciones Durante la replicación del genoma bacteriano, a veces ocurren cambios, ya sea en forma espontánea o artificial. Estos cambios heredables en la secuencia de bases del ADN, se denominan mutaciones. El organismo resultante de una mutación tendrá una constitución genética diferente a la de la cepa progenitora y se denomina “cepa mutante”. Las mutaciones pueden implicar solamente el cambio en un solo par de bases en el ADN de la célula o pueden producir un cambio que se extiende a un cierto número de pares de bases o hasta genes completos. El cambio en el genoma bacteriano puede modificar, o no, la apariencia o funcionalidad de la cepa mutante respecto de su progenitora. En la mayoría de los casos las mutaciones producen individuos que no pueden adaptarse y desaparecen. Una mutación puede tener efectos diferentes según cómo se produzca. Por ejemplo: - La sustitución de una base por otra en la cadena de ADN, no significa necesariamente un cambio en el aminoácido que codifica dicha porción del genoma y por lo tanto no producirá ningún cambio en la apariencia o funcionalidad de la bacteria. Este tipo de mutaciones se denominan “mutaciones silenciosas” - Las mutaciones producidas por deleciones o inserciones de fragmentos de ADN pueden afectar la capacidad de formar una proteína y por lo tanto producir una alteración en la apariencia o funcionalidad de la célula. Las mutaciones se dan en forma espontánea con una frecuencia muy baja. Normalmente una de cada 108 células de una población contiene una mutación detectable en un gen determinado. Sin embargo esta frecuencia puede aumentar notablemente por acción de agentes denominados mutágenos o mutagénicos. Estos agentes pueden ser químicos, físicos o biológicos. Los mutágenos químicos son sustancias semejantes a las bases púricas o pirimidínicas y las reemplazan originando el cambio en la secuencia de ADN. Dentro de los mutágenos físicos se encuentran las radiaciones ionizantes (rayos x, rayos gamma y cósmicos) y las no ionizantes (radiación ultravioleta). Intercambio y recombinación genética El intercambio genético entre procariontes se realiza a través de la transferencia de una porción del genoma de una célula donadora a otra receptora. No es un paso obligado para completar el ciclo biológico del organismo, sino más bien un proceso ocasional que ocurre por tres mecanismos diferentes: transformación, transducción y conjugación. En el caso de la transformación se libera ADN de las células al medio circundante y las células receptoras lo incorporan tomándolo de esta disolución. En la transducción se transfiere ADN de una célula procariótica a otra como consecuencia de la formación de un virión defectuoso de un bacteriófago, en el cual parte o todo su complemento normal de ADN se sustituye por ADN bacteriano (ADN de la célula donadora). Cuando este fago defectuoso se fija a otra célula bacteriana (célula receptora) y le introduce este ADN, se produce el intercambio genético. La conjugación implica un intercambio genético entre dos células que se hallan en contacto directo, mediante un proceso que, en todos los casos conocidos, está codificado por genes situados en plásmidos. Habitualmente por este proceso sólo es transferido el propio plásmido desde la célula donadora a la receptora, pero a veces se transfieren también genes del cromosoma bacteriano. Transformación En el proceso de transformación se libera ADN de las bacterias (células donadoras) al medio circundante y las células receptoras lo incorporan de esta disolución. Las células que poseen la capacidad de ser “transformadas”, es decir, que pueden incorporar el ADN que se encuentra en su ambiente, se denominan células o bacterias competentes. 27 En un gran número de bacterias, la entrada al estado competente está codificada por el cromosoma bacteriano y está marcada por ciertas condiciones ambientales. Estas bacterias son capaces de sufrir una transformación natural. Otras bacterias sólo pueden hacerse competentes mediante una serie de tratamientos artificiales (por ejemplo: exposición a altas concentraciones de cationes divalentes). Tales mecanismos de transformación se denominan transformación artificial. La transformación está mediada por alrededor de 12 proteínas, que le permiten a las células absorber ADN bicatenario en distintos sitios de su superficie externa y cortarlo en fragmentos más pequeños por acción de enzimas unidas a la superficie de la bacteria. Luego una cadena del fragmento es digerida por una enzima nucleasa, la otra penetra en la célula unida a una proteína de unión al ADN específica. El ADN sólo se integrará al cromosoma de la bacteria receptora si es homólogo, originando un individuo genéticamente diferente. Transducción En ocasiones ocurren fallos durante el desarrollo intracelular de ciertos bacteriófagos y se producen viriones defectuosos denominados partículas transductoras. Estas partículas contienen ADN del genoma bacteriano reemplazando una parte o todo el complemento normal de ADN del fago, pero su cápside es la que determina la capacidad de adherirse a una célula bacteriana sensible e inyectar el ADN en su interior. De esta forma, la partícula transductora puede introducir ADN bacteriano de la célula en la que se desarrolló en otra célula sensible, dando como resultado la transferencia de material genético entre las dos células. Existen dos tipos de transducción: Transducción generalizada: está determinada por el intercambio de cualquier gen bacteriano. Transducción especializada: solamente determina el intercambio de un número limitado de genes específicos. La mayoría de los fagos transductores es capaz de realizar solamente uno de estos tipos de transducción, pero un número limitado puede realizar ambos. Conjugación La conjugación es un proceso mediante el cual se transfiere material genético desde una bacteria donadora hacia una receptora. Este mecanismo implica un contacto real entre ambas células, de modo que el ADN pasa de una hacia la otra sin tomar contacto con el medio circundante. La transferencia genética por conjugación está codificada por los genes de un plásmido, denominado plásmido F, siendo esa su única función conocida hasta el momento. En otras palabras, este plásmido codifica su propia transferencia hacia células que carecen de él y por eso se denomina plásmido conjugativo. Las células que poseen el plásmido F se denominan células F+ y las que carecen de él células F-. Cuando se mezclan células F+ y F-, la transferencia del plásmido F ocurre con una frecuencia elevada. Normalmente sólo se transfiere el plásmido, pero también pueden ser transferidos genes cromosómicos, aunque con una frecuencia considerablemente más baja. Esto se debe en parte a la presencia en un cultivo F+ de células denominadas Hfr (high frecuency recombination = alta frecuencia de recombinación) en las que el plásmido F y el cromosoma bacteriano han quedado integrados formando una gran molécula circular única. 28 Plásmidos Son elementos genéticos constituidos por ADN (circular, cerrado, de doble cadena) que se reproducen en forma autónoma y no están unidos al cromosoma bacteriano. Pueden ser transferidos de célula a célula por el mecanismo de conjugación o se pueden integrar al cromosoma y replicarse en forma conjunta. Los plásmidos pueden contener una variedad de genes como por ejemplo: genes que controlan la producción de toxinas o que dan resistencia antibióticos, metales pesados y otros compuestos inhibidores, genes capaces de metabolizar herbicidas, etc. También poseen genes que permiten el contacto célula a célula, alterando la superficie celular y facilitando la transferencia. Si la transferencia es la del propio plásmido, éste se denomina plásmido conjugativo. Mecanismo de transferencia de ADN durante la conjugación: Primero se realiza la síntesis de ADN: una de las cadenas de ADN del plásmido se deriva de la célula donadora y la otra es recién sintetizada en la receptora (por complementariedad de bases) durante el proceso de transferencia. Cuando el factor F no está integrado al cromosoma, se comporta como un plásmido conjugativo, las células que poseen este factor no integrado se llaman F+ (o células macho) y las células que pueden actuar como receptores de F+ se llaman F- (o células hembra). Estas F- no poseen el plásmido del factor F. Concluida la conjugación, el resultado son dos células F+, por lo que la receptora se ha convertido en una futura donadora (de F+ a F-) y podrá transferir el plásmido F a otras receptoras. Implicancias agronómicas Los mecanismos explicados anteriormente tienen implicancias en el área de la investigación y además tienen aplicaciones agronómicas. La resistencia a antibióticos se puede originar como una mutación de algunas bacterias que sobrevivieron al agregado de estas sustancias, pero la transferencia de esa resistencia a las demás bacterias se da muy rápidamente, ¿cómo es que pasa ésto? La forma en la que se transfieren estas resistencias es a través de los plásmidos, por conjugación, y no es que todas las bacterias resistentes hayan experimentado la misma mutación (que las transformó en resistentes). Otro ejemplo se ve en los rizobios utilizados para la inoculación de Leguminosas. Se pueden dar, por el proceso de mutación, cambios en su estructura genética teniendo como resultado por ejemplo la pérdida de la capacidad de fijación de Nitrógeno (N) atmosférico: ha ocurrido en Estados Unidos el caso de que al inocular semillas del cultivo de soja con cepas muy “agresivas” de rizobios (es decir que tienen alta capacidad de nodular), llegado determinado momento las mismas perdieron la capacidad de fijar N pero no la de nodular, por lo que estos nódulos se volvieron parásitos del cultivo de soja, ya que estaban recibiendo nutrientes provenientes del cultivo, pero a cambio no estaban aportando N. Glosario - Bacteriófago: virus que infecta a alguna bacteria. - Clon: población de individuos derivados por reproducción asexual de un solo antecesor. 29 - Delección: tipo de mutación que implica la eliminación de un segmento de ADN. - Fisión binaria: tipo de reproducción asexual de la que resultan descendientes genéticamente idénticos a su único progenitor. - Gen: unidad de herencia en un cromosoma; secuencia de nucleótidos en la molécula de ADN que desempeña una función específica, tal como codificar una molécula de ARN o un polipéptido. - Herencia: transmisión de características del o de los progenitores a los hijos. - Inserción: tipo de mutación en la cual ocurre la introducción de un nuevo segmento de ADN dentro de una secuencia ya existente. - Virus temperado: virus que al infectar al huésped no necesariamente causa lisis (ruptura), sino que puede llegar a integrarse en el material genético del huésped. UNIDAD TEMÁTICA 7: Esterilización Esterilización se define como la destrucción o eliminación de cualquier forma de vida y por lo tanto comprende aquellos tratamientos que dejan al objeto tratado libre de todo organismo vivo. Los métodos de esterilización se pueden clasificar de acuerdo al agente que se emplee (físico o químico) para eliminar los microorganismos. Limpieza y acondicionamiento del material a esterilizar Los instrumentos y materiales que se emplean en un laboratorio de Microbiología Agrícola comprenden: -Material de vidrio: tubos de ensayo, erlenmeyers, vasos de precipitado, placas de Petri, etc. (Figura 1) -Instrumentos de metal: ansas, espátulas, etc. (Figura 1) -Otros: medios de cultivo, soluciones termolábiles (ej: aminoácidos, antibióticos, etc.), guantes de látex, papel de filtro. Estos materiales, deben ser tratados con precaución para evitar accidentes, roturas o derramamientos. Antes de esterilizar cualquier objeto, este se debe limpiar y acondicionar de manera adecuada. Si bien en el curso Microbiología Agrícola no se trabaja con microorganismos patógenos, el material sucio debe tratarse con precaución y ante la menor sospecha de presencia de patógenos se debe desinfectar antes de lavar. El material de vidrio se debe colocar en recipientes adecuados para su desinfección y posterior limpieza procediendo de la siguiente manera: L I M P I E Z A: 1. Las pipetas se colocan en recipientes con solución desinfectante hasta el lavado. Previamente se les saca el trozo de algodón que ha actuado como filtro en el extremo superior, utilizando un alambre fino o aguja. 30 2. Las placas de petri y tubos de ensayo con medio de cultivo se destapan y colocan boca abajo en un recipiente, se los hierve en agua jabonosa a fin de eliminar todo el medio de cultivo que contienen. 3. El material que contiene colorantes se separa del resto y se trata con soluciones especiales (ácido clorhídrico, solución sulfocrómica, etc.). Los instrumentos de metal pueden desinfectarse antes, y luego de su uso se los puede limpiar utilizando algodón embebido en alcohol al 70%. Una vez que el material está limpio y seco, se debe acondicionar en forma adecuada para su posterior esterilización. Según el material, se acondiciona siguiendo las pautas que se presentan a continuación. A C O N D I C I O N A M I E N T O: 1. Pipetas: en su extremo superior se introduce, mediante una aguja o alambre fino, un pequeño trozo de algodón que actuará como filtro. Luego se las envuelve individualmente con papel. 2. Placas de Petri: se envuelven individualmente con papel. 3. Tubos de ensayo: se tapan con tapones de algodón o tapones bacteriológicos.1 4. Portafiltros y jeringas: se envuelven en papel. 5. Recipientes para recibir filtrados: se tapan con tapones de algodón y se envuelven individualmente con papel. 6. Tips 1: se colocan en cajas porta-tips resistentes a la esterilización por calor húmedo. 7. Como alternativa, para esterilizar pipetas o placas de Petri existen cajas metálicas especiales que permiten agrupar el material a esterilizar. Los materiales así acondicionados y posteriormente esterilizados, conservan dicha condición hasta su uso. Métodos de esterilización Los métodos de esterilización se basan en la utilización de agentes físicos (calor, filtración, radiación) o agentes químicos. La elección del método de esterilización que se emplee dependerá del tipo de material a esterilizar. A. CALOR Los métodos que utilizan el calor como agente esterilizante se dividen en tres, según sea el tipo de calor utilizado: calor seco, húmedo o directo. a) Calor seco El calor seco se utiliza para esterilizar objetos de vidrio u otros materiales resistentes a las altas temperaturas. Los objetos acondicionados (envueltos en papel) se esterilizan en la estufa de esterilización a una temperatura de 170ºC durante 90 minutos. La estufa tiene una doble pared que permite la circulación de aire caliente por la formación de una corriente convectiva que tiene por finalidad difundir mejor el calor (Figura 2). Al finalizar la esterilización debe observarse un color ligeramente tostado en el envoltorio de papel,

Microbiología - Resumen de la Unidad Temática 1 (PDF)

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