Fertilizasyon PDF

FERTİLİZASYON Prof.Dr. Mehmet CINCIK MALTEPE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ SUNUŞ SIRASI 1. Tanım 2. Fertilizasyon sürecindeki aşamalar 3. Fertilizasyona etki eden faktörler – a. Spermin fertilizasyon sürecinde etkili olan özellikleri Kumulus bariyerinin geçilmesi Kapasitasyon ve in-vitro kapasitasyon H...

FERTİLİZASYON Prof.Dr. Mehmet CINCIK MALTEPE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ SUNUŞ SIRASI 1. Tanım 2. Fertilizasyon sürecindeki aşamalar 3. Fertilizasyona etki eden faktörler – a. Spermin fertilizasyon sürecinde etkili olan özellikleri Kumulus bariyerinin geçilmesi Kapasitasyon ve in-vitro kapasitasyon Hiperaktivasyon Akrozom reaksiyonu Oosit hücre zarı ile füzyonu Sperm hücre zarının protein içeriği ve özellikleri – b. Oositin fertilizasyon sürecinde etkili olan özellikleri Matürasyon Oosit sitoplazmasının özellikleri Kortikal granül göçü ve zona reaksiyonu Oosit aktivasyonu 3. Pronükleus oluşumu 4. Anormal fertilizasyon ve unfertilizasyon sebepleri FERTİLİZASYON Erkek ve dişi gametlerin birleşmesini ve spermiumun oosit içerisine girerek aktivasyonunu sağlayan ve birbirini düzenli bir sıra ile takip eden karmaşık moleküler olaylar sürecidir. (Acosta 1994) DÖLLENME SÜRECİNDEKİ AŞAMALAR 1. K.oophorus matriksi + spermium etkileşmesi 2. Kapasitasyon 3. ZP3 aracılığı ile birinci bağlanma 4. Akrazomal reaksiyon 5. ZP2 ile ikinci bağlanma 6. Zona pellusidaya penetrasyon 7. Oolemmaya penetrasyon 8. Korteks granülleri reaksiyonu 9. II. mayozun tamamlanması ve II. kutup hücresi 10. Pronükleus oluşumu 11. DNA replikasyonu 12. Homolog kromozom eşleşmesi 13. Oosit iğ iplikleri aktivasyonu 14. 1. yarıklanma Gamet füzyonu Kromozom eşleşmesi Oosit aktivasyonu Zigot oluşumu FERTİLİZASYONUN SONUÇLARI 1. Diploid kromozom sayısı yeniden kurulur 2. Cins varyasyonları oluşur 3. Embriyonun primer cinsiyeti belirlenir 4. Yarıklanma başlatılır Spermin Fertilizasyon Sürecinde Etkili Özellikler a. Kumulus hücreleri arasında ilerleme -mekanik yolmotilite -enzimatik yol hyaluronidaz etkisiyle b. Kapasitasyon c. İn-vitro kapasitasyon d. Hiperaktivasyon e. Akrozom reksiyonu ile f. Moleküler temel -sperm hücre zarının lipid içeriği ve özellikleri -sperm hücre zarının protein içeriği ve özellikleri KAPASİTASYON Kapasitasyon sonuçta kalsiyuma karşı membranların geçirgenliğini artıran biyokimyasal bir olaydır. Hiperaktivite sağlar Akrozom reaksiyonuna hazırlar Kapasitasyonun Spermde Meydana Getirdiği Değişiklikler 1.Adenil siklaz aktivitesi artar c-AMPprotein kinaz stimülasyonuzardaki protein fosforilasyonu zarın iyongeçirgenliğinde artış 2.Metabolik Değişiklikler Glikolitik aktivasyonla birlikte enerji tüketimi de artar 3.İntrasellüler iyonlardaki değişiklikler Spermlerin dişi ve erkek genital kanal salgılarındaki Ca++’u hücre içine alması veya vermesi zardaki bazı proteinler tarafından kontrol edilir. Hücre içine alınan Ca++ adenilat siklaz aktivitesini c-AMP Zarın permeabilitesi değişir fosforilasyon 4.Sperm zarındaki değişiklikler 5.Hiper aktivasyon 6.Akrozom Reaksiyonu protein kinaz aktive olur İv-Vitro Kapasitasyonu Etkileyen Faktörler 1-Isı: 37 c’de inkübe edilmelidir 2-Spermler arasındaki farklılıklar -Ejekulatuar daha geç kapasitasyon gösterir -Kauda epididymisten alınan spermle ise erken kapasitasyon 3-Kumulus hücrelerinin etkisi -Bu hücrelerin glikoprotein salgılarısperm kapasitasyonunu arttırır. 4-Mediumların kompozisyonu -Follikül sıvısında bulunan taurin, hypotaurin ve epinefrin gibi düşük ağırlıklı moleküller kapasitasyonu arttırmak amacı ile mediumlara katılır Kapasitasyon mediumunda bulunan Ca++ sperm başındaki zardan geçer ve akrozom reaksiyonunun başlamasında çok etkili olur. TFF’de spermlerin henüz kapasite olmadığı akla gelen olasılıklardan biri olmalıdır. Hiperaktivasyon 1 Kapasitasyon sonrası kuyruk dalgalanmalarındaki asimetri artar, progresif motilite azalır,heliks, starpin veya trashing hareketler gözlenebilir. High amplitude, high curvature kıvrılma High velocity (ancak yol lineer değil) İn-vitro üç saatte hiperaktivasyon gelişir, 6-24. saatlerde azalır. Hiperaktivasyon 2 Hiperaktivasyonda üç regülator faktör: c-AMP, Calcium,intrasellüler PH Yıkama Mediumlarında yeterli kalsiyum yoksa inrasellüler kalsiyum artmazcAMP yükselmez hiperaktivasyon olmaz Akrozom Reaksiyonu Temelinde hücre içine kalsiyum alınması sözkonusudur. Sadece akrozom reaksiyonunu tamamlamış spermium ZP’yi aşabilir ve sperm ile oositin hücre zarlarının penetrasyonunu sağlar Fare spermleri Ca içeren mediumlarda 2 dk.da akrozom rx. tamamlar, inseminasyondan 11 dk sonra %15’i, 20 dk. Sonra %80’i penetre olur. Hypothetical pathway for calcium release Sperm-ZP Tanıma Bağlanma Penetrasyon 1 1. Sinyal molekülleri (ör.:Sp-56) ZP3’ü tanır 2. Ekstrasellüler Ca etkisiyle ZP3’e primer bağlanma 3. ZP3’e bağlanan spermlerin akrozom rx nu tamamlanırken akrozomal membran reseptörleri (Pr.akrozin) ZP2 ile sekonder bağlanmayı sağlar 4. Bir saat sonra, ZP’nin derin kısımlarına penetrasyon sonrasında ZP aşılır Tanıma, Bağlanma 2 Sperm zar proteinleri: fertilin,G proteini, PH20, proakrozin, sp56,M-42, ESA-152 Putativ Zona Reseptörleri (Enzimatik aktivite): Gal-ase Fuc-ase a-D mannosidaz tripsin benzeri proteazlar 56 kD proteini, 95kD proteini, Mr 40kD polipeptidi gi zona reseptörleri ve sinyal molekülleri tanıma ve bağlanmada etkili olur.  Fare sperm proteini sp56 ZP3’e bağlanarak akrozom reaksiyonunu başlatan sinyal molekülü olarak çalışır Oositin Fertilizasyon Sürecinde Etkili Olan Faktörler a-Oosit maturasyonu b-Oositin sitoplazmik özellikleri sitoplazma açık renkli, parlak, homojen granülasyona sahip olmalı OOSİTİN – Çekirdek – Sitoplazma – Zar – ZP olgunlaşması EŞ ZAMANLI (senkronize) OLMALIDIR GRANÜLER SİTOPLAZMA ÖRNEKLERİ AER sarnıçlarının genişlemesiyle oluşan vakuoller gelişimin optimal olmadığını belirler. 15 micrometre ise %20’si döllenebilir. SİTOPLAZMİK VAKUOL Refraktil Cisimler 10m çapında lipid ve granül içeren koyu inklüzyon molekülleridir. Fertilizasyona engel olurlar. Bunlarda fertilizasyon oranı %2 gibi oldukça düşüktür. Oositin erken gelişim dönemindeki bir dejenerasyonudur Çapı çok büyük oositlerde fertilizasyon oranı düşük,normalden küçük olanlarda nispeten daha yüksektir 1nci kutup cisimciğinin büyüklüğündeki farklılıklar oositin optimal koşullarda olmamasından kaynaklanabilir. Bunun büyüklüğünü mayoz cisimciğinin oolemmaya uzaklığı belirler. Çok büyük görünenler genellikle büyük sitoplazmik fragmanlardır. KUTUP CİSİMCİĞİ ANORMALLİKLERİ A B A BÜYÜK VE FRAGMANTE KC B DEFEKTİF BÖLÜNMÜŞ VE BÜYÜK KC’Lİ OOSİT Yassı yada parçalı kutup cisimcikleri mayoz bölünmede fazla aktive olduğu yada aktivasyonun yetersiz kaldığı hallerde görülür, fertilize olsalar bile genellikle embriyoner gelişimi yeterli olmaz. ZP’nin >30m dan daha kalın olması halinde fertilizasyon ve implantasyonun gerçekleşmemesiyle sıklıkla karşılaşılır. ZONA PELLUCİDA ANORMALLİKLERİ ZP İKİNCİ İNCE BİR TABAKA HALİNDE PVA’I İKİYE BÖLMÜŞTÜR Zp bazen PVAyı ikiye bölecek şekilde perdelenebilir (fractured zona) yada dış yüzeyinden bir tabaka kalkabilir, bunlarda triploidi oranı artar. ZP’DEN AYRILAN BİR TABAKANIN UZADIĞI GÖRÜLÜYOR, KC YASSI VE PARÇALI, PVA ÜST KUTUPTA GENİŞ KALIN ZP ÖRNEKLERİ B A A ZP’Sİ KALIN (kZP), İMMATÜR, UNFERTİLİZE OOSİT, kZP’YE BAĞLANAN YADA PENETRE OLAN SPERM YOK B ZP’Sİ KALIN (kZP), UNFERTİLİZE, M II OOSİT ÖRNEĞİ, ZP’NİN DIŞ KISIMLARINDA PENETRE SPERMLER VAR, İÇ KATMANDA PENETRASYON YOK Dejeneratif yada kıvrık ZP varsa, genellikle ooplazma koyu renklidir. Bu, genellikle aspirasyon negatif basıncından kaynaklanır. Empty Zona: ZP’deki bir açıklıktan sitoplazma akabilir. Oosit dejenerasyonunun fazla olduğunu gösterir. Geniş PVA: -aspirasyon negatif basıncının yüksek olması -İndüksiyonda LH’ın aşırı yükselmesi Bu alandaki döküntüler genellikle fertilizasyon ve embriyoner gelişimi bozabilecek birikimler olarak kabul edilir. GENİŞLEMİŞ PVA A B C D A OOSİT YÜZEYİNDE PVA AYNI ORANDA GENİŞLEMİŞ, M I, OOSİT ÇAPI KÜÇÜK B PVA HER YERDE EŞİT GENİŞLEMİŞ, M II OOSİT ÖRNEĞİ C PVA KUTUP CİSİMCİĞİ BÖLGESİNDE GENİŞLEMİŞ, KC OOSİT İLE İLİŞKİSİNİ KESMİŞ ÖRNEK D OOSİT İLE ZP ARASINDAKİ MESAFE GENİŞLEMİŞ, İRREGÜLER GÖRÜNÜMLÜ OOSİT KOMPLET SİTOPLAZMA LYZİSİ BİNOVÜLAR OOSİT İKİ OOSİT İÇEREN BİNOVÜLAR ZP HYALURİNİDAZDA ÇOK BEKLETİLDİĞİ İÇİN DEJENERE OLAN OOSİT Yaş- fertilizasyon ilişkisi -İleri yaşta oosit kalitesi bozulur; çünkü gonodotropinlere olan duyarlılığı azalır -maturasyonlarını tamamlama süresi uzar, bu nedenlerle fertilizasyon oranı düşer ve embriyoner gelişim etkilenir. LH ile uzun süre etkileşime bağlı postmatür oositlerde de fertilizasyon düşük, poliploidi yüksektir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda,folliküler sıvıda immünoreaktif β endorfinlerin artışı ve östrojen/progesteron oranının fertilizasyonu etkilediği anlaşılmıştır. FAS’daki steroid düzeyi ve anjiotensinlerin ise fertilizasyonu etkilemediği belirlenmiştir. Sperm-Oosit hücre zarlarının birleşmesi Oolemmanın mikrovillusları ile spermin ekvatoryal segmenti arasındaki ilk temastan sonra zarlar birleşmeye başlar. Oositin subkortikal bölgesindeki aktin ve miyozin filamanları da inkorporasyona yardımcı olur. Kumulus hücrelerinin sitoplazmik uzantıları ile oosit mikrovillusları arasında desmozom ve gap junction tipi bağlantı kompleksleri bulunur İnkorporasyon Sperm çekirdeği Sperme ait mitokondriyonlar Kuyruğun bir bölümü Perinüklear organeller Oosit sitoplazması içinde serbest kalır. Kortikal reaksiyon Oositin fertilizasyona karşı ilk cevabıdır. Kortikal granüller hücre yüzeyine salgılanarak polispermiye karşı yavaş blok oluştururlar. ZP’nin biyokimyasal kompozisyonunun değişmesi de zona reaksiyonunu oluşturur (polispermiye karşı hızlı blok). Erken yada geç kortikal reaksiyon polispermi nedenidir. Kortikal granüller sülfatlı mukopolisakkaritler içerir (peroksidaz, β1-3 glukokinaz vb. ). Kortikal granül reaksiyonu kalsiyum artışı ile başlar. Serbest kalsiyumun%20-30’u hücre dışına verilir. Kortikal reaksiyonda kalsiyumun hücre içinde artışını IP3, G protein, Tirozin kinaz bağlı reseptörler sağlar. Zona Reaksiyonu Polisperminin hızlı blokunu sağlayan zona reaksiyonunda, ZP3’ün sperm bağlama aktivitesi kaybolur. Bu, kortikal granül enzimlerinden N-Asetil glukozaminidazın Gal-Tase bağlanma birimlerini ortadan kaldırmasıyla olur. Oositin Metabolik Aktivasyonu Kortikal granül ekzositozu + ikinci mayozun tamamlanması oositin aktive olduğunu gösterir. Bu, oosite sperm tarafından taşınan ve reseptörler tarafından yönlendirilen aktivasyon faktörleri (SAOAF vb.) ile sağlanır. Pronükleusların gelişmesi 1 Fertilizasyonun tamamlanması gametlerin çekirdek materyallerinin reorganize olarak pronükleuslarının gelişmesine bağlıdır. NORMAL FERTİLİZASYON (2PN) A B A ICSI SONRASI 18. SAATTE NORMAL FERTİLİZASYON, 2 PN, 1. VE 2. KC’LER SEÇİLMEKTEDİR B ICSI SONRASI 18. SAATTE FERTİLİZE OOSİT, PN’LERDEN BİRİNİN BÜYÜKLÜK FARKININ ÇARPICI OLMASI GELİŞMELERİN SENKRONİZE OLMADIĞINI GÖSTEREBİLİR Erkek pronükleusunun gelişmesi 2 Sperm çekirdek zarı erir. Sperm kromatini sitoplazmada dağılır (dekondansasyon) Erkek pronükleus zarı yeniden oluşur. IVF’de immatür oositlerle birleştiklerinde sperm çekirdek zarında bir değişiklik olmaz çünkü yıkımdan sorumlu materyal matür oositin aktivasyonuyla etkinleşir. ICSI’de enjekte edilen spermin plazma ve çekirdek zarları değişikliğe uğramamış haldedir. Dişi pronükleusun gelişmesi 3 Oositin anafaz II’de sitoplazmaya dağılan kromozomları çevresinde veziküller toplanır ve kromozomları içlerine alır. Bu veziküller birleşerek dişi pronükleusunun zarını yaparlar. Dişi pronükleusu 1. KC’ye yakın olarak gelişir. Oosite ait sentrioller fertilizasyondan önce dejenere olmuşlardır. Böylece zigotun bölünerek gelişimini devam ettirebilmesi için gerekli olan bölünme merkezi sperm tarafından zigota aktarılır. Pronükleusların hareketi 4 Pronükleusların zigotun merkezine yerleşmeleri inseminasyondan sonraki 20. saatte gerçekleşir. İki hareket tarzı vardır a. Penetrasyon yolu: Zigot yüzeyine vertikal b. Kopulasyon yolu: PN’lerin birbirleriyle ilişkisine bağlı ortaya yerleşme sperm asteri buna eşlik eder. Sperm sentriollerindeki mikrotübüller itici güçtür. Sperm asterindeki defektler pronükleusların migrasyonunu önler. PN’lerin hareketine hücre iskeleti mikrofilamanları (aktin içeren) da katılır. Pronükleusların birleşmesi 5 İnsanda askaris tip fertilizasyona benzer şekilde zigot çekirdeği şekillenmez. Çünkü füzyon sonrası pronükleuslar birleşmezler. Maternal ve paternal genom ilk defa iki hücreli dönemdeki blastomerlerde tek bir çekirdek olarak ortaya çıkar. Pronükleus skorlaması Pronükleusların lokalizasyonu, birbirine göre pozisyonları, çevresindeki ooplazmanın özellikleri, çekirdekçiklerin sayısı ve yerleşimi, embriyonik gelişimin kalitesi hakkında fikir verici olacaktır. Ör: Pronükleusların birbirlerine komşu yüzeyinde çekirdekçiklerin dizilmeleri embriyonal gelişimin yeterli olacağını gösteren iyi bir belirteçtir. PRONÜKLEER / NÜKLEOLAR MORFOLOJİ Pronükleer skorlama 1 Embriyo seçiminde pronükleer skorlamayı alternatif bir strateji olarak kullanan klinikler vardır. Bazı gruplar ise pronükleuslar ve I. ve II. KC’ler arasındaki mesafeye göre embriyo kalitesinin ve implantasyonun tahmin edilmesini önermektedirler. Pronükleer skorlama 2 İyi pronükleer skora sahip embriyoların erken klivaj gösterdiği ve sayısal olarak normal kromozomlara sahip olma olasılıklarının daha yüksek olduğu PGD çalışmaları ile ortaya konmuştur. Nükleolusların dizilim şeklinin de euploidi için bir gösterge olabileceği iddia edilmiştir. PRONÜKLEER / NÜKLEOLAR MORFOLOJİ A B C D A MERKEZE YERLEŞİK, EŞİT BÜYÜKLÜKTE 2PN, BİRBİRİNE BAKAN YÜZLERE YERLEŞMİŞ YAKIN VEYA AYNI HİZADA ÇEKİRDEKÇİKLER NET SEÇİLMEKTEDİR B SAĞDAKİ BÜYÜK PN’DE RASTGELE YERLEŞMİŞ 10 KADAR ÇEKİRDEKÇİK; SOLDAKİ KÜÇÜK PN’DE SEÇİLEN 2 ÇEKİRDEKÇİK SAĞDAKİNE GÖRE DAHA BÜYÜK GÖRÜNMEKTEDİR C EŞİT BÜYÜKLÜKTE 2PN, ÇEKİRDEKÇİKLERİN SAYI VE DAĞILIMLARI FARKLIDIR D SOLDAKİ PN DAHA BÜYÜK OLUP DAHA FAZLA DAHA BÜYÜK ÇEKİRDEKÇİKLERE SAHİPTİR, ANCAK HİÇBİRİ JUGSTAPOZİSYONEL DEĞİLDİR, GEÇ İLERLEYEN SAĞDAKİ KÜÇÜK PN’İN ÇEKİRDEKÇİKLERİ DAHA KÜÇÜK OLUP BİRBİRLERİNE DAHA YAKIN YERLEŞMİŞLERDİR KÖTÜ SKORLU 2PN ÖRNEKLERİ A B A SİTOPLAZMADA DÜZGÜN SINIRLI YUVARLAK VAKUOLLER (*) MEVCUT, ÜSTTE PVA GENİŞ, PRONÜKLEUSTAKİ ÇEKİRDEKÇİKLER SEÇİLİYOR (OKLAR) B SOLDA PVA GENİŞLEMİŞ, DEJENERE 2PN, SAĞDA İRREGÜLER OOLEMMA, GENİŞ PVA, DEJENERE UNFERTİLİZE OOSİT ICSI’de fertilizasyon 1. Akrozomal enzimlerin oosit sitoplazmasındaki akıbeti ne olacaktır? 2. Kortikal reaksiyon ICSI sonrasında nasıl gerçekleşmektedir? 3. Normal yolla fertilize edemeyecek defektif spermler nasıl olup da ICSI’de oositi aktive etmektedirler? Fertilizasyon anormallikleri 1 TFF (KLASİK IVF) OOSİT ÇEVRESİNDE HAREKETLİ SPERM VAR, ZP’A BAĞLANMA VEYA PENETRASYON YOK ZP’A PENETRASYON YARIYA KADAR ANCAK İLERLEMEMİŞ ZP’A BAĞLANMA VE PENETRASYON TAM ANCAK FERTİLİZASYON YOK OOSİT YÜZEYİNDE RESEPTÖRLER YOK YADA OOSİT AKTİVE OLAMAMIŞ SPERM MORFOLOJİSİ KÖTÜ İMMATÜR OOSİT VEYA SİTOPLAZMİK ANOMALİ VAR ICSI’de TFF Teknik yetersizlik (spermin PVA’da kalması, geri çekilmesi, mitoz iğciğinin zarar görmesi) Oosit azlığı (1-3) Oosit matürasyonundaki yetersizlikler Sitoplazmik anomaliler ICSI + IVF’de TFF Oositte aktivasyon yetersizliği düşünülmelidir. Fertilizasyon anormallikleri 2 İmmatür oositlerde spermler ZP’ya penetre olabilir, inkorporasyon sonrası kromatin kondanse olarak kromozom benzeri yapılara dönüşebilir. Ancak kromatin kondansasyonu yetersiz kalır, PN gelişimi gerçekleşmez (PCC). Unfertilize oositlerin bir kısmında diploidiuneuploidi saptanmıştır. Fertilizasyon anormallikleri 3 Çok pronükleuslu (3PN veya 4PN) - Polispermi (%90, IVF’de) - İkinci KC’nin atılamaması (ICSI) İmmatür ve postmatür oositlerde daha sıktır. Dondurulup çözülen spermlerle insemine edilen oositlerde polispermik fertilizasyon sıktır. ANORMAL FERTİLİZASYON A B C A 3PN VE PN’LERDE ÇEKİRDEKÇİKLER SEÇİLMEKTEDİR (TRİPLOİDİ) B 2PN, 2 KC (OKLAR) SEÇİLEBİLMEKTEDİR, ZP İKİ AYRI YERDE PVA’YI KOMPARTMANLARA AYIRMIŞ, ZP YAPISAL ANOMALİSİ OLAN BU FERTİLİZE OOSİTİN İLERLEMEDİĞİ GÖZLENMİŞTİR C MİKROENJEKSİYONDAN SONRA TRİPLOİDİ GÖZLENMİŞ OOSİTTE İKİNCİ KUTUP HÜCRESİ ATILAMAMIŞTIR ANORMAL FERTİLİZASYON (1PN) FERTİLİZASYON KONTROLÜNDE 1PN İÇERDİĞİ SAPTANAN OOSİT 24 SAAT SONRA EMBRİYONAL GELİŞİM GÖSTERMİŞTİR HALEN ARAŞTIRILMAKTA OLAN DÖLLENEMEME SEBEPLERİ  Sperm sentrozomundaki mikrotübül organizasyon defektleri  Sitotoksik faktör  m-phase spesifik protein kinaz kompleksinin inhibisyonu  in-vitro olarak RNA gen transferi ile oosit aktivasyonunun sağlanması