Ejercicio 5 Amplificación gen 16S rDNA.pdf

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO DE ARECIBO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Ejercicio 5. Detección del gen 16SrDNA utilizando la técnica de PCR OBJETIVOS 1. 2. 3. Explicar la técnica de PCR y sus aplicaciones. Discutir las caracterís...

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO DE ARECIBO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Ejercicio 5. Detección del gen 16SrDNA utilizando la técnica de PCR OBJETIVOS 1. 2. 3. Explicar la técnica de PCR y sus aplicaciones. Discutir las características del gen 16S rDNA. Amplificar el gen 16S rDNA del genoma de la cepa DH5α de Escherichia coli. INTRODUCCIÓN La técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) (Reacción en Cadena de la Polimerasa) permite aumentar la cantidad de DNA (número de copias) de una muestra de sangre, pelo, saliva, semen, tejidos, huesos y dientes entre otros. En esta técnica se amplifica el DNA en un microtubo usando ciclos repetitivos de temperatura (94o, 60o y 72oC). El DNA es duplicado en forma exponencial en cada ciclo (2, 4, 8, 16...), Después de 30 ciclos se ha amplificado el DNA 230 = 1.07 x 109 veces. El instrumento utilizado para realizar esta técnica es un “Thermal Cycler” (termociclador). La técnica se puede utilizar para la detección de patógenos bacteriales o virales como HIV y COVID 19. Permite la detección de mutaciones en genes asociados a enfermedades tales como: fibrosis quística, anemia falciforme, cáncer entre otras. También permite identificar individuos en casos criminales, paternidad e identificación de cadáveres o restos humanos en casos de grandes catástrofes. Para que se realice la amplificación se requieren los siguientes componentes: 1. DNA (molde, template) Es una molécula de doble hebra (double strand DNA, dsDNA) con la secuencia específica que se quiere amplificar 2. “Primers” (forward y reverse) Son moléculas de DNA de hebra sencilla (single strand DNA, ssDNA). Son oligonucleótidos sintéticos, cortos y flanquean el gen que se quiere amplificar. Estos se unen (annealing) al extremo 3” y tienen complementariedad con el DNA de interés. 3. Desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) – dATP, dGTP, dCTP, dTTP (base nitrogenada, grupo fosfato, desoxirribosa). 4. DNA polimerasa Taq polymerase que se aisló de la bacteria Thermus aquaticus de las aguas termales (hot springs) en el Parque Nacional de Yellowstone en Wyoming y es la más utilizada. Tth polymerase que se aisló de la bacteria Thermus thermophilus. 2 5. 6. Ambas tienen una temperatura óptima de 72ºC, pero se mantienen activas y estables de 94-96º C. Buffer de Taq polimerasa o Tth (necesario para que la enzima pueda trabajar en forma óptima). MgCl2 (cofactor necesario para que la DNA polimerasa pueda sintetizar DNA en forma óptima). Pasos de amplificación Etapa 1- Desnaturalización inicial (94- 97oC) 1X Para asegurar la separación de la doble hebra de DNA (double strand -dsDNA) y la formación de las hebras sencillas (single strand-ssDNA). Permite activar la Taq polymerase. Etapa 2- 30X (Ciclos) Desnaturalización (94- 97oC) Ocurre rompimiento de los puentes de hidrógeno y las dos hebras del DNA se separan. Se estará utilizando una temperatura de 95oC. Alineamiento (annealing) (47-60oC) Los “primers forward y reverse” se unen al extremo 3’ del “template”. Se estará utilizando una temperatura de 62oC. Extensión (elongación) (72oC) La Taq polimerasa reconoce los “primers” y añade los dNTPs. Se forman las hebras nuevas complementarias a cada “template”. Se estará utilizando una temperatura de 72oC. Etapa 3- Extensión Final (72oC) 1X Los extremos de los productos son completamente extendidos. 2 3 Una vez el DNA es amplificado se realiza una electroforesis en gel de agarosa. Esta permite determinar: a. Presencia del producto específico (Muestras experimentales) en las muestras o grupos experimentales que contenía gDNA de la bacteria gen de interés16SrDNA tamaño esperado de 1.5 kb b. Presencia de productos no específicos (Muestras experimentales) en las muestras o grupos experimentales que contenía gDNA de la bacteria de mayor o menor tamaño (kilobases) que el producto específico esperado de 1.5 kb c. Contaminación de DNA exógeno (Control negativo) solamente aplica a las muestras control negativo El control negativo contiene agua ultrapura pero no contiene gDNA. En los carriles con el control negativo no se espera ver bandas. La contaminación con DNA exógeno puede alterar la veracidad de los resultados. La contaminación de DNA exógeno puede provenir de células epiteliales de manos, brazos y cara del estudiante o personas realizando la amplificación o de algún componente utilizado para la reacción de amplificación. Por lo tanto, es sumamente recomendable: Utilizar puntas con filtro para evitar la introducción de DNA exógeno a sus muestras Usar guantes Usar bata de laboratorio limpia 3 4 d. Presencia de “primer dimers” en todas las muestras (control negativo y grupo experimental) Se forman por la unión de “primers” FW con FW, RV con RV o FW con RV. Cuando ocurrir cuando hay cierta complementariedad de bases debido al diseño incorrecto de los mismos o cuando se trabaja con altas concentraciones de los “primers”. En este laboratorio se estará amplificando el gen 16S rDNA. Este gen: codifica para el rRNA que forma parte de la subunidad más pequeña del ribosoma procariota contiene secuencias conservadas de DNA común en todas las bacterias contiene secuencias variables únicas para cada especie de bacteria (polimorfismo) En este ejercicio de estarán utilizando los siguientes “primers” universales para amplificar una región conservada del gen 16S rDNA. Forward 27f: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ (20 bp, TM=65.1oC) Reverse 1525r: 5’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3’ (17 bp, TM=54.4 oC) M= A, C W=G, T R=Purinas (A y G) El tamaño del producto específico (amplicon) esperado es de 1.5 kilobases (kb) o 1500 pares de bases (bp). El marcador que se estará utilizando es 1kb (Kilobase). Las bandas más importantes del marcador son las últimas tres (3): 0.5, 1.0 y 1.5 kb. 4 5 Ejemplo para analizar en el laboratorio MATERIALES Y EQUIPOS 2X Go Taq Green Master Mix (Taq polimerasa, 3 mM MgCl2, 400 µM dNTPs, 2X Buffer pH 8.5) (Promega #M7122) “Universal Forward and Reverse Primers” gDNA aislado (50 ng) Marcador 1 kb (kilobase) Microtubos 1.5 mL estériles Tubos de PCR estériles Micropipetas (P10 y 100), Puntas con filtro estériles P10 y P100 Agarosa, Matraz 125 mL, Probeta de 50 mL IX TBE Cámara de electroforesis (3), peinillas, soporte, “Power supply” (3) Microcentrífuga y Adapters Thermal Cycler (verificar parámetros con anticipación) CHEMI DOC Touch Imaging System (BioRad) 5 6 PROCEDIMIENTO Preparación Master Mix 1. Go Taq Green Master Mix se debe descongelar en hielo y realizar una centrifugación rápida antes de utilizarse. 2. Preparar el master mix en un microtubo estéril de 1.5 mL. Se debe añadir cada componente en orden. Reactivo Agua Go Taq Green Master Mix FW primer Rv primer Concentración Concentración original final 2X 1X 10µM 10µM 0.4µM 0.4µM Volumen (1 reacción) 9.5 12.5 Volumen (2 reacciones) 19 25 1 1 24 2 2 48 3. Realizar una centrifugación rápida. 4. Rotular todos los microtubos de PCR (control -, experimental). 5. Transferir 24 μL del “master mix” a cada microtubo de PCR. Cerrar inmediatamente la tapa para evitar contaminación con DNA ambiental. NO se debe hablar hasta terminar de preparar las reacciones. 6. Añadir 1 µL de agua ultrapura al control negativo. 7. Añadir 1 µL de gDNA (template) de 20-30 ng/µL al microtubo con el grupo experimental. Mantener los tubos en hielo. El volumen total de la reacción de PCR es 25 μL. 8. Realizar una centrifugación a todos los tubos antes de colocarlos en el termociclador. Recuerde colocar en el rotor, los “adapters” de tubos de PCR. Verificar que todos los tubos estén cerrados completamente para evitar la evaporación de las muestras hasta que se hayan a colocar en el termociclador. Amplificación de DNA por PCR (Alrededor de 2 horas) 1. Colocar los tubos de PCR con las muestras en el bloque de aluminio con la gradilla. 2. Programar el Termociclador (Thermal Cycler) y comenzar la corrida. 3. Verificar nuevamente que el instrumento este corriendo en el método correcto. 6 7 Etapa Desnaturalización (1X) Ciclos (30X) Desnaturalización Annealing Extensión Extensión final (1X) Temperatura (ºC) 95 Tiempo 3 min 95 62 72 72 45 seg 1 min 2 min 7 min Electroforesis Preparación del gel de Agarosa 1% Pesar 0.5g de agarosa y mezcle con 50mL de 1X TBE. Anadir 0.75 µL de bromuro de etidio. La electroforesis se corre a un voltaje de 100. Preparación de las Muestras y Control 1. Remover los tubos de PCR del “Thermal Cycler y colocarlos en hielo. 2. Realizar una centrifugación rápida y cargar las fosas del gel directamente con 10 µL de la muestra. 3. Utilizar 8 µL del marcador 1 kb + 2 µL de “loading dye” 6X. 4. El Go Taq Green Master Mix contiene el “loading dye” necesario para visualizar la migración de las muestras. Los tintes en el “loading dye” son: azul que migra con las muestras de mayor kb y amarillo que migra con las de menor kb. RESULTADOS Figura ___. Foto del gel 1. En la parte superior identificar cada carril como M, 1, 2, 3, 4, etc. No escribir encima de la foto del gel. 2. En el lado izquierda identificar:kb más importantes del marcador 1 Kb. Deben quedar en la misma posición que la banda. 3. En el lado derecho identificar: a. producto específico amplificado 16S rDNA de 1.5 kb b. productos no específicos c. primer dimers Deben quedar en la misma posición que la banda. 4. En la parte inferior: a. Una oración inicial con el % de agarosa utilizada y la muestra trabajada. Recuerde mencionar nuevamente la cepa y la bacteria. b. Identificar los carriles con la muestra correspondiente (Marcador__, controles negativos, grupos experimentales con gDNA). Se pueden agrupar las muestras y carriles. 7 8 DISCUSIÓN Carril con el Marcador 1kb Carriles con controles negativos (todos) Carriles con grupos experimentales (todos) Hacer referencia a la Figura PREGUNTAS 1. ¿Qué pasa si el “primer” “forward” y “reverse” tienen secuencias de bases complementarias entre sí? 2. Después de 30 ciclos, ¿cuántas copias se formaron del DNA original? Se debe incluir el cálculo. 3. ¿Cuál fue el tamaño del producto de PCR 16S rDNA obtenido? Revisado 2024 8