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COURS D’ANALYSES TOXICOLOGIQUES PHA 5 UDM Prof. Jos NDELO TOXICOLOGUE Université De Kinshasa  OBJECTFIS DU COURS Le cours de complément de...

COURS D’ANALYSES TOXICOLOGIQUES PHA 5 UDM Prof. Jos NDELO TOXICOLOGUE Université De Kinshasa  OBJECTFIS DU COURS Le cours de complément de toxicologie a trait au laboratoire de toxicologie clinique d’urgence. Il s’agit d’apprendre au biologiste clinicien et à tout autre pharmacien à organiser son laboratoire ordinaire afin qu’il soit apte à prendre en charge l’analyse toxicologique d’urgence; et à lui apprendre à pratiquer l’analyse toxicologique d’urgence en routine. En même temps, une révision de la prise en charge des intoxiqués aigus et une vue sur les mesures préventives en matière d’intoxications sont prévues pour les futurs pharmaciens communautaires. Ainsi, à la fin du cours, l’étudiant devra être capable : 1. De procéder à un rappel des mesures de prise en charge clinque des intoxiqués 2. D’énumérer les mesures préventives contre les intoxications 3. D’intégrer l’analyse toxicologique de routine au sein d’un laboratoire ordinaire de biologie clinique ou autre PLAN DU COURS 1. Introduction 2. Matériel nécessaire 3. Substances de référence et réactifs 4. Prévention des intoxications 5. Laboratoire de toxicologie clinique d’urgence 1. Gestion et fonctionnement du laboratoire 2. Collecte et conservation des échantillons 3. Fiche de demande d’analyse 4. Que faire à la réception d’un échantillon 5. Mise en œuvre de l’analyse toxicologique Université De Kinshasa  1. INTRODUCTION Comme son nom l’indique, l’analyse toxicologique d’urgence est une course contre la montre ou mieux, une course contre la mort chez un intoxiqué aigu. Elle a pour but de pouvoir aider le clinicien à venir en aide efficacement à l’intoxiqué. Pour ce faire, elle s’organise et s’exécute de manière telle qu’au bout de 2 à 3 heures au maximum elle puisse aboutir à l’identification qualitative et/ou quantitative du ou des toxiques en cause. Dans les pays développés, l’analyse toxicologique ne rencontre aucune difficulté majeure malgré les exigences de coût élevé qu’elle entraine. Elle s’organise en effet dans diverses structures parfois simples, parfois complexes, pouvant aller jusqu’au Centre anti-poisons. Dans les pays en voie de développement par contre, l’analyse toxicologique est quasiment inexistante. Les toxicologues sont rares, les laboratoires exceptionnels. Depuis quelques années, l’organisation mondiale de la santé initie dans ces pays l’introduction de l’analyse toxicologique au sein des laboratoires ordinaires. C’est dans ce contexte que nous plaçons le présent cours. Université De Kinshasa 2. MATERIEL Les analyses toxicologiques peuvent être effectuées dans un laboratoire ordinaire desservant un hôpital ou un service d'urgence local. Pour ce faire, en plus du matériel de base, le laboratoire a besoin d'un appareillage spécialisé pour la chromatographie sur couche mince, la spectrophotométrie UV et visible ainsi que d’une hotte efficace et fonctionnelle. Université De Kinshasa  MATERIEL DE BASE POUR ANALYSES TOXICOLOGIQUES -Balances de laboratoire fiables, régulièrement entretenues et étalonnées - Centrifugeur de paillasse - Agitateur rotatif et agitateur Vortex - Bain-marie - bloc de chauffage électrique - Réfrigérateur - pH-mètre - Pipettes automatiques et semi- automatiques - Verrerie de laboratoire (notamment Université volumétrique) et moyens de nettoyage De Kinshasa MATERIEL DE BASE POUR ANALYSES TOXICOLOGIQUES - Source d'approvisionnement en eau chimiquement pure - Air ou azote comprimé - Plaques pour chromatographie sur couche mince - Matériel pour développer et révéler les chromatogrammes sur couche - Lampe à ultraviolets (254 nm et 366 nm) - une hotte - Spectrophotomètre ultraviolet/visible - Cuve à micro – diffusion de Conway - Plaque à godets en porcelaine - Rotavapor - Sèche – cheveux Université De Kinshasa 3. SUBSTANCES DE REFERENCE ET REACTIFS Il est essentiel de disposer de substances relativement pures pouvant servir d'étalons. Toutefois, il n'est généralement pas nécessaire d'utiliser des substances de référence hautement purifiées et très coûteuses comme celles servant au contrôle de la qualité des produits pharmaceutiques.. Une simple extraction d’un médicament par solvant peut permettre d’obtenir un étalon suffisamment pur pour procéder à une analyse toxicologique qualitative. Les réactifs doivent être de qualité « pro analysi » garantie par le fabricant. Université De Kinshasa  Université De Kinshasa Prof. Dr. Jos NDELO/UNIKIN/RDC  Université De Kinshasa Prof. Dr. Jos NDELO/UNIKIN/RDC  Université De Kinshasa Prof. Dr. Jos NDELO/UNIKIN/RDC  Université De Kinshasa Prof. Dr. Jos NDELO/UNIKIN/RDC BIEN CONSERVER PRODUITS CHIMIQUES Hors de vue et de portée d’enfants, Eviter surplus inutiles, Ne pas mettre dans récipients alimentaires.  UTILISATION ADEQUATE Lire étiquette, appliquer recommandations, emballage bien étiqueté. ELIMINATION ADEQUATE BIEN FERMER RECIPIENTS BONNE CONSERVATION PROTECTION CONTRE LES SERPENTS  5.1. GESTION ET FONCTIONNEMENT DU LABO 5.1.1. HYGIENE ET SECURITE - Eviter contact avec produits chimiques - Eviter l’inhalation solvants et autres réactifs volatils - Ne pas entreposer bases et acides dans un même endroit - Ne jamais ajouter eau aux acides et bases mais faire l’inverse. - Evaporation solvants, minéralisation et pulvérisation de révélateurs CCM doivent toujours se faire sous une hotte.  5.1. GESTION ET FONCTIONNEMENT DU LABO 5.1.1. HYGIENE ET SECURITE -Avoir document écrit sur hygiène et sécurité au laboratoire et sur manipulation et destruction échantillons biologiques, de solvants organiques et autres substances dangereuses. - Prévoir gants en plastic jetables et lunettes en permanence. - Désigner responsable pour appliquer politique de sécurité et hygiène et faire 5.1.2. EXIGENCES SUPPLEMENTAIRES - Veiller à la qualité et pureté des réactifs et étalons - Veiller à propreté balances et pipettes et en vérifier régulièrement l’exactitude - Pipettes semi-automatiques doivent être utilisées uniquement pour solutions aqueuses - Lors de préparation réactifs, veiller masse moléculaire relative et degré d’hydratation 5.1.2. EXIGENCES SUPPLEMENTAIRES -Après analyse enregistrer résultats sur fiche de labo avec date, nom analyste, du patient, nature et nombre échantillons reçus et analyses effectuées. - Attribuer à chaque échantillon un numéro unique à sa réception et l’utiliser tout au long de toutes les épreuves sur cet échantillon - Bien conserver spectres UV et autres preuves produites au cours de l’analyse (résultats tests de coloration, CCM…) 5.1.3. ASSURANCE QUALITE -Analyser échantillons positifs et négatifs connus en même temps que l’échantillon à examiner - Témoin négatif permet éviter résultats faussement positifs - Inclusion échantillon positif connu permet vérifier qualité et stabilité réactifs - En cas de faux positif, répéter analyse avec verrerie bien lavée avec solvant organique comme méthanol et eau purifiée 5.1.3. ASSURANCE QUALITE -Rincer immédiatement verrerie et tubes à essais avec eau purifiée puis les laver minutieusement avec solution chaude de détergent de labo, rincer à eau de robinet puis eau purifiée avant de les sécher à l’air. - Instituer système interne de contrôle de qualité pour analyses quantitatives et, chaque fois que possible, participer à programme  5.2. COLLECTE ET CONSERVATION ECHANTILLONS 1. Urine - Utile pour tests d’identification. - Peut être recueillie en grande quantité - Concentrations des toxiques élevées - Recueillir le plus vite possible avant tout traitement.  5.2. COLLECTE ET CONSERVATION ECHANTILLONS 2. Contenu gastrique - Vomissures et produits d’aspiration ou de lavage gastrique: 20 à 50 ml - 20 à 50 ml - Homogénéiser, filtrer et/ou centrifuger avant tests. - Quantités fort importantes - Pas de métabolites - Parfois présence comprimés ou capsules pouvant accélérer identification du toxique.  3. Sang - Souvent dosages quantitatifs - Tests qualitatifs pour certains toxiques: monoxyde de carbone, cyanures. - 10 à 15 ml recueillis sur fluorure ou oxalate 4. Produits suspects - Flacons, récipients, autres matériaux trouvés près de l’intoxiqué. - Sont soumis à l’analyse car peuvent avoir lien avec l’intoxication.  ETIQUETTE - Nom complet du patient - Date et heure du prélèvement, - Nature de l'échantillon - Date et heure de réception au laboratoire. - Utile pour éviter confusions lors de l’analyse  REGLES POUR ECHANTILLONS - Avoir un numéro d'identification unique pour chaque échantillon. - Emballer séparément échantillons biologiques et produits volatils (solvants organiques) pour éviter contamination - Conserver échantillons biologiques à 4°C, si possible, jusqu'à leur analyse. - Après analyse garder échantillons à 4°C pendant trois ou quatre  5.3. FICHE DE DEMANDE D’ANALYSE - Outil de collaboration et de communication indispensable - Indique au médecin nature et quantité échantillons à prélever, mesures conservation en attendant analyse et conditions acheminement au laboratoire.  5.4. QUE FAIRE A RECEPTION ECHANTILLON 1. Obtenir détails sur le patient: circonstances de l'intoxication, résultats examens biochimiques et hématologiques. 2. Prendre connaissance antécédents médicaux du patient, si disponibles. 3. Décider des priorités de l'analyse. 4. Entreprendre l’analyse 5. Interpréter résultats en consultation avec le clinicien. 6. Si nécessaire effectuer des analyses complémentaires sur les prélèvements  5.5. MISE EN ŒUVRE DE L’ANALYSE TOXICOLOGIQUE 1. EXAMEN URINE COLORATION CAUSES POSSIBLES Marron ou noir s’intensifiant Paracétamol, Nitrobenzène, avec le temps Phénols, Rhubarbe, (Insuffisance hépatique) Jaune ou orange Phénolphtaléine, Fluoréseine, Cascara, Séné Rouge vin Phénothiazines, Phénytoïne, Quinine, Warfarine (Hématurie). Bleu ou vert Amitryptiline, Phénols, Indométhacine Il convient d’examiner également le pH (acide ou basique), rechercher d’éventuels cristaux d’oxalate  ODEURS CARACTERISTIQUES Amande amère Cyanures Fruitée Alcools (y compris l'éthanol), Esters. Ail Arsenic, phosphore Antimite Camphre Poire Chloral Essence Distillats de pétrole (diluants pour pesticides) Phénolique Désinfectants, Phénols Tabac Nicotine Cirage Nitrobenzène Sucrée Chloroforme et autres hydrocarbures halogénés Œuf pourri Sulfure d’hydrogène 2. TESTS DE COLORATION DANS URINE ET CONTENU GASTRIQUE - Dans tubes à essais ou, mieux, dans plaque à godets - Prévoir toujours un blanc (urine sans substance à étudier) - Prévoir également un échantillon positif (urine contenant quantité connue de substance à rechercher). Les principaux tests de coloration courants sont repris dans les diapositives qui suivent.  REACTIONS COLOREES QUALITATIVES 1. Salicylates (y compris l'acide acétylsalicylique ou aspirine) - Réaction de Trinder: Ajouter 100 µl de réactif de Trinder (obtenu en mélangeant 40 g de chlorure mercurique dissous dans 850 ml d'eau et 120 ml d'acide chlorhydrique 1 mol/l avec 40 g de nitrate ferrique hydraté dissous dans 1 l d'eau) à 2 ml d'urine et mélanger pendant 5 secondes. Une coloration violette indique la présence de salicylates. Réaction de Trinder REACTIONS (suite) COLOREES QUALITATIVES Si l'on ne dispose que d'un échantillon de contenu gastrique ou de produit suspect, l'hydrolyser en chauffant avec de l'acide chlorhydrique 0,5 mol/l sur un bain- marie bouillant pendant 2 minutes, puis neutraliser avec de l'hydroxyde de sodium 0,5 mol/l avant d'effectuer la réaction. Si la réaction est positive, effectuer un dosage quantitatif sur le plasma ou le sérum. 2. Phénothiazines - Réaction au FPN Ajouter 1 ml de réactif FPN (5 ml de solution aqueuse de chlorure ferrique à 50 g/I, 45 ml de solution aqueuse d'acide perchlorique à 200 g/kg et 50 ml d'acide nitrique dilué à 500 ml/l) à 1 ml d'échantillon et mélanger pendant 5 secondes. Une coloration allant du rose au rouge, à l'orange, au violet ou au bleu doit faire penser à la présence de phénothiazines. Un résultat positif doit être confirmé par CCM. - Réaction de Forrest. Ajouter 1 ml de réactif de Forrest (25 ml de solution aqueuse de dichromate de potassium à 2 g/l, 25 ml d'acide sulfurique dilué à 300 ml/l, 25 ml de solution aqueuse d'acide perchlorique à 200 g/kg et 25 ml d'acide nitrique dilué à 500 ml/l) à 0,5 ml d'échantillon et mélanger pendant 5 secondes. Une coloration jaune-vert virant au vert foncé, puis au bleu, indique la présence d'imipramine ou de substances apparentées. Un résultat positif doit être confirmé dichloralphénazone et le trichloréthylène) - Réaction de Fujiwara Dans trois tubes de 10 ml, ajouter respectivement a) 1 ml d'échantillon, b) 1 ml d'eau purifiée (blanc - essentiel) et c) 1 ml de solution aqueuse d'acide trichloracétique à 10 mg/l. Ajouter 1 ml de solution d'hydroxyde de sodium 5 mol/l et 1 ml de pyridine dans chaque tube, mélanger soigneusement et chauffer au bain-marie bouillant pendant 2 minutes. L'apparition d'une coloration rouge-violet intense dans la couche supérieure (pyridine) des tube a et c indique la présence de 5. Paracétamol, phénacétine - réaction à l' o-crésol/ammoniaque Ajouter 0,5 ml d'acide chlorhydrique concentré à 0,5 ml d'échantillon, chauffer au bain-marie bouillant pendant 10 minutes et refroidir. Ajouter 1 ml de solution aqueuse d' o-crésol à 10 g/l à 0,2 ml d'hydrolysat, puis 2 ml d'hydroxyde d'ammonium 4 mol/l, et mélanger pendant 5 secondes. Une coloration bleue à bleu-noir intense apparaissant immédiatement indique la présence de paracétamol ou de phénacétine. Si le résultat est positif, doser  Ajouter 0,5 ml d'hydroxyde d'ammonium 2 mol/l à 1 ml de solution à examiner, mélanger pendant 5 secondes et ajouter environ 20 mg de dithionite de sodium en poudre. Une coloration bleue à bleu-noir intense indique la présence de paraquat; le diquat donne une coloration jaune-vert, mais celle-ci est imperceptible en présence de paraquat. Si coloration disparaît après agitation prolongée à l'air et réapparaît après addition nouvelle quantité dithionite de sodium, confirmation présence paraquat ou de diquat.  Réaction au dichromate Appliquer 50 µl de dichromate de potassium (25 g/l dans l'acide sulfurique dilué à 500 ml/l) sur une bandelette de papier-filtre en fibres de verre et introduire celle-ci dans l'ouverture d'un tube à essai contenant 1 ml d'urine. Boucher légèrement le tube et le plonger dans un bain-marie bouillant pendant 2 minutes. Un changement de coloration de l'orange au vert indique la présence de substances réductrices volatiles. Si résultat positif, doser 8.Chlorates et autres substances oxydantes - réaction à la diphénylamine Ajouter avec précaution 0,5 ml de diphénylamine (10 g/l dans l'acide sulfurique concentré) à 0,5 ml de contenu gastrique filtré ou d'une solution de produit suspect. Une coloration bleue intense se développant rapidement indique la présence de substances oxydantes. 100 µl d'acide chlorhydrique 2 mol/l et 50 µl de solution aqueuse de ferricyanure de potassium à 10 g/l. A une autre portion de 50 µl d'échantillon, ajouter 100 µl d'acide chlorhydrique et 50 µl de solution de ferrocyanure de potassium à 10 g/l. La formation d'un précipité bleu foncé à la suite de l'addition de ferricyanure ou de ferrocyanure de potassium indique la présence de fer ferreux ou ferrique, respectivement. Si le résultat est positif, doser quantitativement le fer dans le sérum. EXEMPLES RESULTATS TESTS DE COLORATION 0,1 N) - Centrifuger - Séparer les phases - Filtrer la phase organique sur Na2S04 anhydre - Evaporer le solvant au rotavapor - Reprendre résidu avec 2 ml méthanol dans tube à fond conique - Evaporer sous courant d’air comprimé Extraire avec 10 ml de solvant sous forte agitation mécanique, dans tube à centrifuger et non dans boule à décanter. Recours au rotavapor et au sulfate de soude anhydre.  minutes - Centrifuger , Extraire extrait acide par 5ml NaOH 0,1 N et extrait alcalin par 5 ml HCl 0,1 N - Acidifier phase aqueuse alcaline, alcaliniser phase aqueuse acide et extraire respectivement avec 10 ml de solvant organique -Centrifuger, Evaporer solvant organique à 60°C sous courant air comprimé dans un tube conique Pas rotavapor ni sulfate de sodium anhydre. Elimination impuretés (purification extraits) par système de double extraction. - Evaporer le solvant au courant d’air comprimé ou à défaut au bain-marie - Spoter sur micro – plaque de silicagel d’abord en point avec solution étalon (CCM analytique) puis en bande sans étalon (CCM préparative) en utilisant un sèche – cheveux. - Développer mini – plaques dans flacons à mayonnaise - Observer les plaques sous UV et entourer les spots au crayon - Pulvériser les révélateurs sur la plaque analytique sous la hotte - Conserver la plaque préparative pour la suite des opérations (Spectre UV) Phase mobile: a). Acétate d'éthyle/méthanol/hydroxyde d'ammonium concentré (densité relative 0,88) (85: 10: 5) (EMA), tant pour acides que bases. b). Méthanol/hydroxyde d’ammonium concentré (99: 1,5), phase mobile uniquement pour la CCM des produits basiques.  CCM SUR GRANDE PLAQUE Délimiter huit couloirs sur la plaque en gravant traits verticaux à l'aide d'un crayon. Tracer légèrement au crayon ligne à environ 1 cm du bas de la plaque (ligne de départ) et graver une ligne horizontale à 10 cm de l'origine pour marquer limite du développement  CCM SUR GRANDE PLAQUE Phase mobile: Ethylacétate-Méthanol-Ammoniaque (85:10:5) EMA  REVELATION GRANDE PLAQUE Pulvériser sur chaque partie réactifs indiqués figure ci-dessous. Veiller à masquer avec plaque de verre propre les parties de la plaque ne devant pas être pulvérisées. REVELATION GRANDE PLAQUE  REVELATEURS CCM 1. Réactif au nitrate mercureux (extrait acide): taches blanches avec un centre gris sur fond plus foncé avec barbituriques et substances apparentées, glutéthimide. 2.Réactif à l'iodoplatinate acidifié (extrait basique): principalement taches violettes, 3. bleues Réactifou de brunes avec diverses Mandelin (extrait substances basique): basiques etallant colorations neutres du et leurs bleu et métabolites. du vert à l'orange et au rouge avec diverses substances basiques. Certains toxiques comme antidépresseurs tricycliques, amitriptyline et nortriptyline, donnent en plus taches fluorescentes sous. Acide sulfurique 4lumière à 500 ml/l ultraviolette (366(extrait nm)basique): après taches rouges, pulvérisation violettes ou bleues avec réactif. nombreuses phénothiazines et leurs  PREPARATION REVELATEURS CCM 1. Réactif au nitrate mercureux. Mélanger 1 g de nitrate mercureux avec 100 ml d'eau purifiée et ajouter de l'acide nitrique concentré (densité relative 1,42) jusqu'à ce que la solution soit limpide. 2.Réactif à l'iodoplatinate acidifié. Mélanger 0,25 g de chlorure platinique, 5 g d'iodure de potassium et 5 ml d'acide chlorhydrique concentré (densité relative 1,18) dans 100 ml d'eau purifiée. 3.Réactif de Mandelin. Mettre 1 g de vanadate d'ammonium finement pulvérisé en suspension dans 100 ml d'acide sulfurique concentré (densité relative 1,86). Bien agiter  EXEMPLES RESULTATS CCM Nitrate mercureux Iodoplatinate Mandelin Acide Sulfurique CODEINE ET METHADONE (iodoplatinate et mandelin)  Nitrate mercureux Iodoplatinate Mandelin Acide Sulfurique PHENOBARBITAL ET METHADONE (Nitr. Merc. et Iodoplatinate)  Nitrate mercureux Iodoplatinate Mandelin Acide Sulfurique PHENOTHIAZINE: Thioridazine (Iodoplatinate, Ma,delin, Ac Sulfurique)  Nitrate mercureux Iodoplatinate Mandelin Acide Sulfurique ANTIDEPRESSEUR TRICYCLIQUE: Dozulépine (Iodoplatinate)  5. SPECTROPHOTOMETRIE ULTRA – VIOLETTE Gratter le spot de la CCM - préparative - Ajouter 2 ml méthanol - Agiter la solution de méthanol - Filtrer le méthanol sur filtre sans Na2SO4 - Lire à l’UV entre 400 et 180 nm - Enregistrer chaque fois le spectre UV entre 400 nm et 180 nm. - Interpréter le spectre - Automatiquement par ordinateur  6. COMMUNICATION RESULTATS Résultats des analyses effectuées en urgence doivent être communiqués directement et sans délai au clinicien et confirmés dès que possible par compte rendu écrit. Un modèle de rapport d'analyse toxicologique est présenté à la figure ci-après. Lorsqu'on donne résultats quantitatifs, il faut indiquer clairement unités de mesure utilisées (de préférence unités de masse SI). En outre, toutes informations nécessaires pour bien interpréter implications cliniques du résultat doivent figurer dans rapport écrit. En cas résultat négatif donner informations sur les toxiques que les essais effectués ont permis d'exclure ainsi que sur sensibilité et sélectivité de la méthode. Etant donné implications potentielles de toute analyse toxicologique, notamment du point de vue médico-légal, éviter expressions générales telles que « résultats négatifs » ou « absence de... ». Il faut également présenter par écrit liste composés ou groupes de composés normalement détectés par méthodes utilisées. Si une liste de toxiques est reprise au dos du rapport, il est bon de désigner les épreuves qualitatives effectuées par un numéro.  EXEMPLE DE LISTE DES TOXIQUES ANALYSES AU DOS DU RAPPORT D’ANALYSE 1 Salicylates (acide acétylsalicylique (aspirine), acide 4- aminesalicylique, le salicylate de méthyle et acide salicylique) 2 Phénothiazines (chlorpromazine, perphénazine, prochlorpérazine, promazine, prométhazine et thioridazine) 3 Imipramine et substances apparentées (clomipramine, désipramine et trimipramine) 4 Composés trichlorés (hydrate de chloral, chloroforme, dichloralphénazone et trichloréthylène) 5 Paracétamol 6 Paraquat et diquat 7 Substances réductrices volatiles (éthanol et méthanol) 8 Substances fortement oxydantes (bromates, les chlorates, les hypochlorites, les nitrates et les nitrites.  SUITE LISTE TOXIQUES AU DOS DU RAPORT D’ANALYSE 9 Fer 10.a. Substances acides détectées par chromatographie sur couche mince: barbituriques, glutéthimide, méthylprylon, phénytoïne et primidone 10b. Substances basiques détectées par chromatographie sur couche mince : antihistaminiques (cyclizine et diphénhydramine), antipaludéens (chloroquine et quinine), amfétamine, atropine, caféine, carbamazépine, médicaments utilisés en cardiologie (lidocaïne, propranolol, quinidine et vérapamil), clométhiazole, cocaïne, éphédrine, halopéridol, méthaqualone, opioïdes (codéine, dextropropoxyphène, diamorphine, dihydrocodéine, méthadone, morphine et péthidine), orphénadrine, phénothiazines (chlorpromazine, perphénazine, prochlorpérazine, promazine, prométhazine et thioridazine), strychnine et antidépresseurs tricycliques (amitriptyline, clomipramine, doxépine, désipramine, dosulépine, imipramine, nortriptyline, protriptyline et trimipramine) RESUME DE MISE EN ŒUVRE ANALYSE TOXICOLOGIQUE 1 Evaluer l'urgence et la nature de la demande. Confirmer et noter les détails cliniques. 2 Vérifier les détails relatifs aux échantillons reçus, notamment la date et l'heure du prélèvement en relation avec la date et l'heure d'ingestion. 3 Procéder à l'examen physique préliminaire des échantillons et des produits suspects. 4 Selon les circonstances et les résultats de l'examen clinique, pratiquer des épreuves simples pour rechercher la présence de certaines substances. Le cas échéant, procéder à des dosages quantitatifs sur le plasma, le sérum ou le sang entier. Noter les résultats sur la fiche de laboratoire. 5 Effectuer les épreuves qualitatives applicables directement à l'urine, au contenu gastrique ou aux produits suspects. Noter les résultats sur la fiche de laboratoire. 6 Préparer des extraits acides et basiques pour chromatographie sur couche mince. Appliquer ces extraits et des solutions étalons (en commençant par les extraits) sur les plaques à chromatographie. Développer celles-ci à l'aide du mélange EMA (acétate d'éthyle/méthanol/hydroxyde d'ammonium concentré) (85:10:5). 7 Sécher les plaques et observer le chromatogramme en procédant dans l'ordre suivant: a) examen en lumière ultraviolette (254 nm et 366 nm), b) pulvérisation des révélateurs, c) examen en lumière ultraviolette (254 nm et 366 nm). 8 Noter les résultats et préparer un rapport écrit dès que possible. Vérifier qu'il n'y a pas incompatibilité entre les résultats et l'état clinique du patient. 9 Effectuer des dosages quantitatifs sur le plasma, le sérum ou le sang entier, le cas échéant. Eventuellement, effectuer toutes les épreuves complémentaires nécessaires sur l'échantillon original ou sur des échantillons supplémentaires. 10 Téléphoner les résultats urgents au clinicien en veillant à ce qu'ils soient notés par écrit et que les implications cliniques soient bien comprises. Rédiger un rapport écrit. MONOGRAPHIES  1. ACIDE FORMIQUE ET FORMIATES A) EPREUVE QUALITATIVE Réactifs 1. Acide citrique/acétamide. Solution d'acide citrique (5 g/l) et d'acétamide (100 g/l) dans le propanol. 2. Solution aqueuse d'acétate de sodium (300 g/l). 3. Anhydride acétique. Méthode 1. Ajouter 0,5 ml de solution à examiner à 1 ml d'acide citrique/acétamide, puis 0,1 ml de solution d'acétate de sodium et 3,5 ml d'anhydride acétique. 2. Agiter rapidement pendant 5 secondes et chauffer au bain-marie bouillant pendant 10 minutes. Résultats Une coloration rouge indique la présence d'acide formique. Le formaldéhyde et les formates ne donnent pas de réaction. Sensibilité Acide formique, 50 mg/l. B) EPREUVE DE CONFIRMATION Réactifs 1. Acide chlorhydrique dilué (2 mol/l). 2. Poudre de magnésium. 3. Acide chromotropique (en poudre). 4. Acide sulfurique concentré (densité relative 1,83). Méthode 1. Ajouter 0,1 ml d'acide chlorhydrique dilué à 0,1 ml de solution à examiner et agiter rapidement pendant 5 secondes. 2. Ajouter environ 100 mg de poudre de magnésium jusqu'à ce que cesse le dégagement de gaz. 3. Ajouter environ 100 mg d'acide chromotropique et agiter rapidement pendant 5 secondes. 4. Ajouter avec précaution 1,5 ml d'acide sulfurique concentré et chauffer au bain-marie à 60°C pendant 10 minutes. Résultats Une coloration violette indique la présence de formates ou d'acide formique. Le formaldéhyde réagit sans réduction préalable. Sensibilité Formate, 50 mg/l.  SALICYLES Réactif de Trinder: Mélanger 40 g de chlorure mercurique dissous dans 850 ml d'eau purifiée avec 120 ml d'acide chlorhydrique dilué (1mole/l) et 40g de nitrate ferrique, puis diluer à 1l avec de l’eau distillée. Ajouter 0,1 ml de réactif de Trinder à 2 ml d'échantillon et mélanger pendant 5 secondes. Une coloration violette intense indique la présence de salicylates. BENZODIAZEPINES Chlordiazépoxyde Clobazam Clonazépam Diazépam Flurazépam Lorazepam Nitrazépam Oxazépam Réactifs 1. Acide chlorhydrique concentré (densité relative 1,18). 2. Ether de pétrole (intervalle d'ébullition 40-60°C). 3. Plaque à chromatographie sur couche mince en gel de silice (10 × 20 cm; taille moyenne des particules 20 μm; voir section 4.4.1). 4. Acide chlorhydrique dilué (1 mol/l). 5. Toluène/acide acétique glacial (97:3). 6. Solution aqueuse de p-diméthylaminocinnamaladéhyde (5 g/l). 7. Acide trichloracétique dilué (500 g/l). 8. Acide sulfurique dilué (500 ml/l). 9. Solution aqueuse de nitrite de sodium (10 g/l, récemment préparée). 10. Solution aqueuse de sulfamate d'ammonium (50 g/l). 11. Chlorhydrate de N-(1-naphtyl) éthylènediamine (10g/l) dans un mélange acétone/eau (4:1). ANALYSE CCM 1. Mélanger 3 ml d'acide chlorhydrique concentré avec 10 ml d'échantillon ou d'étalon dans un tube à essai de 30 ml muni d'un bouchon rodé. 2. Placer le tube non bouché dans un bain-marie bouillant sous une hotte pendant 30 minutes. 3. Refroidir, ajouter 10 ml d'éther de pétrole, boucher le tube et agiter à vitesse modérée pendant 10 minutes. 4. Centrifuger pendant 5 minutes et recueillir la couche organique supérieure dans un autre tube. 5. Evaporer l'extrait à sec sous un courant d'air ou d'azote à 60°C. Chromatographie sur couche mince 1. Reconstituer l'extrait dans 100 μl d'éther de pétrole. 2. Diviser la plaque en quatre couloirs (deux fois deux) et déposer deux fractions de 25 μl d'échantillon et d'étalon sur chaque 6.