Chapitre 1 BPC nv. Biologie cellulaire avancée 2024-2025 PDF

Biologie cellulaire avancée Prof. Mireille Kallassy Awad Dr Marc Bouji Dr Ali Mteyrik 2024-2025 1  Descriptif du cours 1. Méthodes d’exploration de la cellule 2. Le cycle cellulaire 3. Le vieillissement 4. L’apoptose 5. La différenciation cellula...

Biologie cellulaire avancée Prof. Mireille Kallassy Awad Dr Marc Bouji Dr Ali Mteyrik 2024-2025 1  Descriptif du cours 1. Méthodes d’exploration de la cellule 2. Le cycle cellulaire 3. Le vieillissement 4. L’apoptose 5. La différenciation cellulaire 6. La cancérogenèse 2  Plan du Chapitre 1 I- Introduction II- La culture cellulaire 1- Locaux et Matériels (niveaux de confinement, hotte, outils) 2- Isolement des cellules 3- Réalisation de la culture a. Milieux de culture b. Types de culture et lignées cellulaires c. Entretien (Passage, comptage, congélation/décongélation) Exemple de cultures : Culture de cellules de la peau - culture des lympocytes 3  Plan du Chapitre 1 III- Techniques d’exploration cellulaire 1- Les méthodes microscopiques a. Microscopie photonique b. Microscopie électronique 2- Visualisation des molécules dans les cellules vivantes 3- Techniques de séparation a. Centrifugation b. Chromatographie c. Electrophorèse d. Cytométrie en flux 4.Techniques de marquage a. Marquage par radioactivité b. Marquage par des anticorps 4  I. Introduction Réfléchir à son projet scientifique et déterminer son protocole expérimental: – Animal? >> In vivo – Organes /cellules? >> Ex vivo – Tube à essai, cellules en culture? In vitro – In silico > Choix du protocole.: Pourquoi? 5  I. Introduction In vivo et in vitro, ces deux locutions latines, la première signifiant « dans l'être vivant » et la seconde « dans le verre », sont employées pour désigner les conditions dans lesquelles se déroulent les expériences biologiques. In vitro: fait référence aux expériences hors de l'organisme vivant, en général le tube à essai. In vivo: désigne les réactions physiologiques observables dans un organisme vivant. Il est donc employé abusivement quand on s'adresse à des cellules en culture sorties du contexte de l'organisme. 6  I. Introduction En biologie cellulaire, les procédures ex vivo impliquent souvent des cellules ou tissus vivants issus d'organismes et maintenus en laboratoire généralement en conditions stériles sans modifications sur 24 heures. Les expérimentations durant sur un temps plus long utilisant des cellules ou des tissus vivants sont typiquement considérées comme étant in vitro. 7  I. Introduction In silico: désigne la «puce» à base de silice des ordinateurs modernes. En effet, il devient aujourd'hui difficile de concevoir la recherche sans l'appui de l'informatique. Comment mémoriser entre autres les milliers de séquences d'ADN connues, pouvoir les comparer en quelques minutes grâce à la constitution de nombreuses banques de données, sans la puissance des logiciels informatiques ? Ils interviennent non seulement dans le stockage de séquences, mais s'avèrent également indispensables comme outils de modélisation moléculaire, d'analyse de structures tridimensionnelles. L'étude d'interactions molécule- molécule (par exemple: ligand- récepteur) grâce à la modélisation assistée par ordinateurs constitue aujourd'hui la base de la conception de nouveaux médicaments. 8  I. Introduction Etude in vitro: Etude Biochimique Protéines, Dissociation ADN, ARN, Interaction Tissu Cellules prot-prot Séparation Structure intégrale - Structure intacte - Localisation des protéines Culture Cellulaire? - Dynamique des protéines - Calcium, AMPc, Techniques? - Activité des canaux ioniques 9  I. Introduction Pourquoi utilise-t-on la culture cellulaire? 10 II. La culture cellulaire 11  II. La culture cellulaire Les manipulations sont autorisées sous réserve qu’elles soient effectuées dans des laboratoires adéquats, de façon à protéger les utilisateurs et l’environnement en fonction des risques. Confinement: 12 II. 1. Les locaux 13 II. 1. Les locaux SAS 14  II. 1. Les locaux > Les niveaux de confinement: L1 – L2 – L3 – L4 (Annexe 1) 15  II.1. Matériels: Hotte Le meilleur moyen pour travailler stérilement est d’utiliser une hotte à flux laminaire 16  II.1. Matériels: Hotte Il existe deux grandes catégories de hottes à flux laminaire : 1- Les flux laminaires horizontaux: > L'air traité sur le filtre(s) est « soufflé » vers le manipulateur. Cette technique protège le produit mais pas le manipulateur ni l'environnement des contaminants. 2- Les flux laminaires verticaux: > Le principe physique est d’obtenir une laminarité des filets d’air filtrés, ceux-ci devant s’écouler en filets rectilignes, parallèles, verticaux de même vitesse et même sens. > On obtient ainsi un apport d’air filtré sur le plan de travail. > Le flux laminaire crée un bouclier qui interdit aux particules extérieures d’entrer dans l’enceinte. 17 II.1. Matériels: Hotte 18  II.1. Matériels: Hotte Flux laminaire verticales: A) Hotte de type I : Ce type d’appareil dirige un flux laminaire vertical à travers un filtre absolu (HEPA). En revanche, le manipulateur n’est pas protégé car une partie du flux d’air vertical (20%) sort de l’enceinte à l’avant de la hotte mais 80% sont recyclés. B) Hotte de type II: La manipulation, le produit et l’environnement sont parfaitement protégés. Le flux d’air est repris par la base du panneau arrière pour recyclage (70%) et évacuation vers l’extérieur (30%) après passage par un filtre HEPA (High- Efficiency Particulate Air ) sur le haut de la hotte. La protection du manipulateur par un flux d’air entrant en façade avant qui compense celui rejeté à l’extérieur. 19 II.1. Matériels: Hotte 20  II.1. Matériels: Hotte Pour l’utilisation de matériel à risque (lignées cellulaires de primates et d’humains, lignées produisant des virus), il faut obligatoirement utiliser des hottes PSM (Poste de Sécurité microbiologique) de type II 21  II.1. Matériels (Annexes 2) Les différents facteurs à considérer : oxygène, température, pH et osmolarité Oxygène: l’apport d’oxygène est indispensable (cellules aérobies strictes): Il est présent dans l’air atmosphérique pour les cultures placées en étuve: dévisser le bouchon des flacons la hauteur de milieu au dessus du tapis cellulaire ne doit pas être élevée pour que le transfert de l’oxygène aux cellules se fasse correctement. Température doit être vérifiée régulièrement : si la température augmente, la croissance cellulaire ralentit puis on assiste à une mort cellulaire si la température diminue, la croissance cellulaire ralentit, mais les cellules restent viables. Taux d'humidité requis est apporté par le bac d'humidification situé dans le bas de l'incubateur. S’il n’y a pas assez d’eau, l’eau des milieux de culture va s’évaporer et on concentre certains produits se trouvant dans les milieux de culture. Atmosphère saturé en vapeur d’eau pour prévenir l’osmolarité pH : stabilité obligatoire pour les cellules de mammifères (6.8 – 7.5). Elle peut être assurée par deux systèmes : soit apport d’une molécule tampon dans le milieu de culture : HEPES soit apport de bicarbonate de sodium dans le milieu et apport de CO2 gazeux dans 22 l’atmosphère de l’étuve NB/ La majorité des cellules survit dans un intervalle de pH compris entre 6,8 et 7,6. Toutes modifications du pH extracellulaire entraîne un blocage métabolique. Le pH du milieu de culture, doit donc être maintenu constant d'où l'utilisation de systèmes tampon dans les milieux de culture. Le tampon le plus employé est le tampon bicarbonate qui fonctionne de la façon suivante : H+ + HCO3 - H2CO3 CO2 + H2O La production de >H+ par le métabolisme cellulaire déplace l'équilibre vers la formation de CO2, c'est pourquoi on utilise ces milieux en atmosphère régulée à 5% de CO2 de façon à maintenir un équilibre entre CO2 et HCO3-. On utilise parfois un autre tampon dont le pKa, 7,55 est plus proche du pH optimal de culture (pH > 6,8) que celui du tampon bicarbonate (pKa = 6,1) : le tampon HEPES. Pour suivre les variations de pH du milieu, on ajoute dans le milieu un indicateur de pH le rouge de phénol. 23 Comment procéder pour réaliser une culture cellulaire 24  II. 2. Isolement des cellules Traitement avec des enzymes protéolytiques (Trypsine et collagénase) Agitation lente + EDTA Perturbation des protéines de la matrice Différents extracellulaire Tissu types de cellules EDTA chélate le Les tissus fœtaux et calcium néonataux fournissent le meilleur rendement de cellules dissociées viables Etudes biochimiques Séparation par différentes techniques Culture cellulaire 25  II.2. Séparation des cellules 1- Centrifugation: séparation selon le gradient de densité (séparation des organites et macromolécules) 2- Propriétés d’adhésion: certaines cellules s’attachent au verre ou au plastique >>> séparation des cellules qui s’attachent moins. 26  II. 2. Séparation des cellules 3- Utilisation des anticorps spécifiques 4- Utilisation d’un séparateur cellulaire utilisant l’immunofluorescence 27  II. 3. Réalisation de la culture - Les cultures sont effectuées à partir de suspension de cellules isolées de tissu; - Contrairement aux bactéries, la plupart des cellules ne peuvent être maintenues en suspension et ont besoin d’un support solide sur lequel elles preuvent croitre et se diviser; - Ce support est généralement la surface plastique d’une boite de culture/ verre pour microscopie confocale (Boite en polystyrène) - Selon le type cellulaire: certaines cellules ont besoin d’une matrice pour se développer et se différencier >> traiter les boites de culture avec du collagène, laminine, etc… 28 II. 3. Réalisation de la culture Boites de culture “coated” avec la laminine Incubateur: Milieu de culture Température: 37°C 5% CO2 29  II. 3. Réalisation de la culture Les modes de culture varient selon les cellules, certaines sont cultivées en suspension (cellules lymphocytaires), d'autres adhèrent au support pour former un tapis cellulaire (cellules fibroblastiques). 30  II. 3. Réalisation de la culture - Les cellules peuvent vivre, se diviser et se différencier dans les boites de culture 31  II. 3. Réalisation de la culture Les cellules en culture: Peuvent être suivies en continu sous microscope; Analysées biochimiquement ▪ Explorer l’effet de l’ajout ou de l’absence de molécules spécifiques (hormones, facteurs de croissance) ▪ Mélange de deux populations de cellules : étude de l’interaction 32  II.3.a. Milieux de culture Si les bactéries et les levures croissent rapidement dans des milieux simples, les cellules eucaryotes supérieures (exemple: cellules de mammifères) en culture ne conservent leur aptitude à se diviser qu'en présence de nombreux nutriments et d'apport de facteurs de croissance dans le milieu de culture. (NB: Toutes les cellules ne se divisent pas en milieu de culture. Ex: cellules cardiaques adultes) 33  II.3.a. Milieux de culture Les milieux de culture doivent reproduire aussi fidèlement que possible les conditions de l’environnement que les cellules trouvaient in vivo. Un certain empirisme subsiste au niveau de la composition de ces milieux. En effet, si la base du milieu (milieu synthétique de base) se constitue d'un mélange de petites molécules (tableau I), l'apport de protéines, de facteurs de croissance et d'attachement s’effectue en général par l'addition de sérum de veau fœtal (SVF). Ces milieux, habituels pour la plupart des cultures de routine, restreignent les connaissances sur l'environnement de la cellule et sur ses réels besoins pour croître. 34  II.3.a. Milieux de culture De nombreuses raisons existent pour éliminer le SVF du milieu de culture et peu à peu on s'efforce de formuler des milieux mieux définis: Dans ces milieux, outre le mélange de nutriments, d'autres molécules apparaissent plus spécifiques. C'est le cas : - Hormones (l’insuline) qui stimule la prolifération de la plupart des cellules somatiques in vivo. Elle agit en synergie avec de nombreuses hormones, - des facteurs de croissance: facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance fibroblastique (FGF), facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), facteur de croissance nerveux (NGF), 35 II.3.a. Milieux de culture - des protéines comme la transferrine pour le transport du fer et l'albumine pour la fixation et le transport des acides gras, - des facteurs d'attachement, fibronectine, collagène, etc., qui sont prépondérants pour l'adhésion des cellules au flacon de culture. 36 II.3.a. Milieux de culture Acides aminés Vitamines Sels inorganiques Autres composants Arginine Biotine Ca(NO3)2 Glucose Asparagine Choline KCI HEPES Acide aspartique Pantothénate MgSO4 Rouge de phénol Cystine Acide Folique NaCl Pénicilline Acide glutamique Nicotinamide NaHCO3 Streptomycine Glutamine Pyridoxal Na2HPO4 Glycine Riboflavine Histidine Vitamine B12 Hydroxyproline Thiamine Isoleucine Leucine Lysine Méthionine Phénylalanine Proline Sérine Thréonine Tryptophane Tyrosine Valine Les acides aminés sont sous la forme L, leur concentration varie de 0,1 à 0,2 mM; pour les vitamines elles n'excèdent pas 1 µM. Les deux antibiotiques, pénicilline et streptomycine, empêchent la croissance d'éventuelles bactéries contaminantes. Le rouge de phénol sert d'indicateur de pH. Les cultures se font dans des flacons en verre ou en plastique permettant l'attachement des cellules. Les flacons sont placés à 37 °C dans une atmosphère contenant généralement 5 % de C02. HEPES 37  II. 3.b Types de culture Après dissociation d'un tissu par dilacération ou par hydrolyse enzymatique ménagée (trypsine, etc.), les cellules mises en suspension peuvent vivre en culture. On appelle culture primaire ces cellules cultivées directement à partir d'un tissu. Généralement, les cellules sont prélevées de la culture primaire et repiquées dans d'autres boîtes pour former des cultures secondaires. 38  II. 3.b Types de culture Au cours des repiquages successifs (durant plusieurs semaines), les cellules continuent à exprimer les propriétés propres à leur tissu d'origine. Par exemple: des cellules provenant du muscle squelettique embryonnaire forment des fibres musculaires géantes et se contractent; les cellules nerveuses établissent des synapses entre elles. De tels phénomènes ne peuvent s'observer et s'étudier qu'en culture. 39  II. 3.b Types de culture (A) Phase-contrast micrograph of fibroblasts in culture. (B) Micrograph of myoblasts in culture shows cells fusing to form multinucleate muscle cells. (C) Oligodendrocyte precursor cells in culture. (D) Tobacco cells, from a fast-growing immortal cell line called BY2, in liquid culture. Nuclei and vacuoles can be seen in these cells. (A, courtesy of Daniel Zicha; B, courtesy of Rosalind Zalin; C, from D.G. Tang et al., J. Cell Biol. 148:971–984, 2000. © The Rockefeller University Press; D, courtesy of Gethin Roberts.) 40  II. 3.b Types de culture Cependant la durée de vie de ces cellules reste limitée Des cellules de peau, essentiellement des fibroblastes ne peuvent se diviser plus de 50 fois avant de mourir. En revanche, Les cellules provenant de tumeurs cancéreuses sont immortelles et se propagent indéfiniment constituant des Lignées cellulaires. 41  II. 3.b Lignées cellulaires La plus connue provient du carcinome utérin d'Hélène Lacks (cellule HeLa) et se perpétue dans les laboratoires depuis 1952. Des cellules normales après transformation par des virus ou des agents tumorigènes deviennent immortelles. Les lignées cellulaires aujourd'hui très nombreuses constituent un matériel de prédilection pour la compréhension des mécanismes de la synthèse des constituants cellulaires et de leur régulation en biologie cellulaire. Aux diverses techniques de microscopie s'associent les techniques analytiques pour l'étude in situ de l'organisation au niveau moléculaire. 42  II. 3.b Lignées cellulaires HeLa Cells Cellules cancéreuses Lignée Cellulaire Cellules transformées Les cellules normales HEK sont transformées par Cells un virus ou agent chimique. 43  II. 3. Réalisation de la culture Le recouvrement de la totalité du support en une monocouche cellulaire entraîne l'arrêt de la division pour des cellules normales au contraire des cellules tumorales qui forment des amas irréguliers. 44  II.3.c. Entretien cellulaire Confluence cellulaire Ensemencement Confluence Prolifération Culture de Fibroblaste en confluence (x200) Arrêt de prolifération: Cellules de Sertoli en culture from Fiorini et al. Reproductive - ‘Inhibition du contact’ Toxicology; Volume 18, Issue 3, May 2004, - Epuisement de ressources45  II.3.c. Entretien cellulaire Passage cellulaire Confluence Repiquage 1er passage 2ème passage 3ème passage Etc … 46  II.3.c. Entretien cellulaire Passage cellulaire Retirer le milieu de culture (verser dans un bécher désinfectant) Lavage au PBS sans Ca2+ Trypsination (0,5 à 1 mL) Trypsine + EDTA 1-2 minutes à 37°C ou 4-5 min à TA. 47  II.3.c. Entretien cellulaire Passage cellulaire Décoller les cellules en ‘’tapotant’’. Suivre la dissociation sous microscope. Ajout d’un nouveau milieu de culture (Inactivation de la trypsine: SVF) Prélèvement d’une fraction pour numération 48  II.3.c. Entretien cellulaire Comptage cellulaire Cellule de Malassez Le volume total de la cellule est de 1 mm3 (1 µl.) (La cellule de Malassez (ou Hématimètre de Malassez) Dimensions : L : 2,5 mm , l : 2 mm, H (ou profondeur) : 0,20 mm. Constitué de 100 rectangles d’égales surface. Permet de compter le nombre de cellules en suspension dans une solution. Permet de compter les cellules (vivantes ou non) dans une solution, et non d'autres organismes tels que les Bactéries. Il s'agit d'une lame de verre sur laquelle un quadrillage a été gravé de 100 rectangles (10x10) contenant eux-mêmes 25 petits carrés. Elle a été inventée par Louis-Charles Malassez. Pour dénombrer les cellules, on place une lamelle de verre sur la cellule de Malassez, appelée lame de Malassez sur laquelle on dépose entre 10 et 15 µl de cellules en suspension. Après avoir attendu quelques minutes pour que les cellules sédimentent, on peut compter le nombre de cellules dans 10 rectangles (quadrillés). le volume d'un rectangle quadrillé étant de 0,01 µl, en faisant la moyenne du no de cellule obtenu sur 10 rectangles, il suffit alors de multiplier le résultat par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules par ml. Par exemple, si 30 cellules sont observables sur 10 rectangles, on obtient un total de 300 000 cellules par ml. 49 Remise en culture à la bonne dilution  II.3.c. Entretien cellulaire Congélation Les cellules animales peuvent être conservées par congélation à -196°C (azote liquide) dans leur milieu de culture riche en sérum de veau fœtal (10 à 20%) en présence d'un cryoprotecteur (glycérol ou surtout DMSO). Condition à respecter: Travailler sur une culture de cellules sub-confluente. Éviter les pipetages vigoureux et les centrifugations à haute vitesse avant la congélation. Réaliser une congélation progressive. Réaliser une décongélation rapide (cytotoxicité accrue du cryoconservateur lors d'une décongélation douce). 50  II.3.c. Entretien cellulaire Protocole de congélation Trypsiner si cellules adhérentes et arrêter l'action de la trypsine par addition de milieu Compter les cellules en hématimètre de Malassez. Centrifuger 5 min à 1000 rpm à 4°C. Éliminer le surnageant et placer le culot cellulaire dans la glace. Ajouter extemporanément au milieu de congélation le DMSO (Dimethyl Sulfoxide). Dans la glace, re-suspendre le culot cellulaire dans un volume de milieu de congélation pour obtenir 5.106cellules/ml Aliquoter par 1 mL dans des cryotubes Nunc (spéciaux congélation dans N2 liquide) ou des Eppendorfs marqués avec stylo dont l'encre résiste et entourés de scotch. 2 cas: i/ enrober de mousse et placer à -80°C (congélation lente), ii/ laisser 2h à 4°C, puis 8h à -20°C, puis à -80°C (congélation par palier). 51  II.3.c. Entretien cellulaire Protocole de décongélation Préparer la boite de culture avec 10 mL de milieu de culture approprié +20% de SVF final. Faire décongeler rapidement le tube de congélation au bain mairie à 37°C Transférer 1 mL de suspension cellulaire décongelée dans le milieu de culture, centrifuger et remettre en suspension le culot. Prélever un aliquote et énumérer les cellules viables. Déterminer le rendement de conservation. Inoculer les boites et placer dans l'incubateur à 37°C, 5% CO2 Après 24h, changer le milieu et placer les cellules en milieu +10% SVF 52 Annexes 3: Exemples de culture 53 III. Techniques d’exploration cellulaire 54 III.1. Les méthodes microscopiques Structure des cellules au microscope: Chaque diagramme représente une image agrandie d'un facteur de dix à partir d'un pouce, à travers les cellules de la peau, à un ribosome, à des protéines et finalement à un groupe d'atomes. Les détails de la structure moléculaire, comme illustré dans les deux derniers groupes, sont au-delà de la puissance du microscope électronique. 55 Pouvoir de résolution Tailles de cellules et de leurs composants établis sur une échelle logarithmique, indiquant la gamme d'objets qui peuvent être facilement résolus par l'œil nu, aux microscopes photonique et électroniques. Les unités de longueur suivantes sont couramment utilisées en microscopie: μm (micrometer) = 10-6 m nm (nanometer) = 10-9 m Å (Ångström unit) = 10-10 m 56  III.1.a. Microscopie photonique (Annexe 4) Utilise la lumière visible (λ comprises entre 400 et 700 nm) comme source lumineuse limite de résolution de 0,2 μm, 500 fois supérieure à celle de l'œil humain. Les plus petits objets biologiques observables avec ce type de microscope sont : des bactéries ou des organites cellulaires (mitochondries, chloroplastes,...) dont la taille avoisine 0,5 μm. Le grossissement maximum, en microscopie photonique, se situe aux environs de 1400. 57  III.1.a. Types de microscopie photonique Quatre images sont présentées de la même cellule de fibroblaste en culture. Les quatre types d'images peuvent être obtenues avec la plupart des microscopes modernes en échangeant des composants optiques. III.1.a.1. Microscopie à fond clair (besoin de coloration) (fig.A) III.1.a.2. Microscopie à contraste de phase (pas de coloration, figure en 3D) (fig.B) III.1.a.3. Nomarski microscopie différentielle à contraste de phase différentielle en 3D, (fig.C) III.1.a.4. Microscopie à fond noir (fig.D) 58  III.1.a. Microscopie photonique III.1.a.5 Microscopie à fluorescence (Annexe 5) Certaines molécules, appelées fluorochromes, absorbent les photons à une longueur d'onde donnée (excitation) pour émettre ensuite de la lumière à une longueur d'onde (émission) supérieure à celle de l'excitation. Par des jeux de filtres il est possible de sélectionner les deux longueurs d'ondes et d'observer sur un fond sombre les seuls composants cellulaires ayant fixé le fluorochrome. L'observation de ce type de coloration s'effectue à l'aide d'un microscope à fluorescence. Cet appareil diffère des autres microscopes photoniques par la lumière incidente, provenant d'une source lumineuse puissante (lampes à vapeur de mercure, lasers) et par les filtres nécessaires à la sélection des longueurs d'ondes. Aujourd'hui une batterie de colorants fluorescents spécifiques de nombreux constituants cellulaires existe. Mais, avec cette technique la mise au point du microscope limite l'observation à un plan niveau de la cellule encore assez épais. 59 The maximum excitation and emission wavelengths of several commonly used fluorescent dyes are shown in relation to the corresponding colors of the spectrum. The photon emitted by a dye molecule is necessarily of lower energy (longer wavelength) than the photon absorbed, and this accounts for the difference between the excitation and emission peaks. GFP: is a green fluorescent protein, not a dye, and is discussed in detail later in the chapter. DAPI: is widely used as a general fluorescent DNA dye, that absorbs UV light and fluoresces bright blue. The other dyes are all commonly used to fluorescently label antibodies and other proteins. Many newer fluorescent dyes, such as Cy3, Cy5, and the Alexa dyes, have been specifically developed for fluorescence 60 microscopy.  Sur cette photographie d'une cellule en mitose, trois sondes fluorescentes différentes ont été utilisées pour colorer trois composants cellulaires différents. - Les microtubules du fuseau sont révélées avec un anticorps fluorescent vert - Les centromères avec un anticorps fluorescent rouge - L'ADN des chromosomes condensés avec le DAPI fluorescent en bleu. 61 III.1.a. Microscopie photonique III.1.a.5’. Microscopie confocale (Annexe 6) Permet la réalisation de «coupes optiques» très fines à différents niveaux de la cellule et la reconstitution grâce à l'informatique d'une image tridimensionnelle de l'organisation interne a donné à la microscopie optique une nouvelle puissance d'investigation. Fig. 3 : Coupes obtenues par microscopie confocale. Les différents plans montrent la distribution des mitochondries colorées par le fluorochrome JC 1 dans les cellules K562 (lignée cellulaire issue d'un clone de leucémie promyélocytaire humaine). En A et D, on observe respectivement les plans supérieur et inférieur; B et C représentent deux «coupes optiques intermédiaires ». Images obtenues avec un microscope confocal Bio-Rad 62 (grossissement x 750) Comparaison entre la microscopie à fluorescence conventionnelle et confocale Ces deux micrographies sont du même embryon de drosophile au stade gastrula coloré avec une sonde fluorescente pour les filaments d'actine. (A) L'image est floue due à la présence de structures fluorescentes au-dessus et en dessous du plan de mise au point. (B) dans l'image confocale, ce problème est supprimé, résultant en une section optique des cellules de l'embryon (image 3D) 63 Three-dimensional reconstruction from confocal microscope images (A) Pollen grains, in this case from a passion flower, have a complex sculptured cell wall that contains fluorescent compounds. Images obtained at different depths through the grain, using a confocal microscope, can be recombined to give a three-dimensional view of the whole grain, shown on the right. Three selected individual optical sections from the full set of 30, each of which shows little contribution from its neighbors, are shown on the left. (B) The tail region of this zebrafish embryo has been stained with two fluorescent dyes and imaged in a confocal microscope. The image below is a transverse optical section of the tail, digitally constructed by scanning the laser in a single line (indicated by arrowheads) while progressively varying the focus level. The dark cavity in the centre is the developing notochord. 64 Préparation des tissus pour la microscopie photonique 65  Immobilize + Embedding in permeabilize cells Fixation a supporting to staining media: resins Formaldehyde or waxes Glutaraldehyde Tissues are generally soft and fragile. Liquid media both permeate and surround the fixed tissue; they can then be hardened (by cooling or by polymerization) to form a solid block Tissue Rapid freezing Most tissue samples are too thick for their individual cells to be examined directly at high resolution Sections are laid flat on Making tissue Staining the surface sections of a glass (1–10 μm thick) microscope 66 slide Microtome III.1.b. Microscopie électronique Avec une longueur d'onde comprise entre 1 et 10-3 nm, les électrons à la différence des photons abaissent la limite de séparation au niveau de l‘Angstrom (0,1 nm). Dans un microscope électronique, la source lumineuse est un filament constitué le plus souvent de tungstène qui: porté à haute température, émet sous vide des électrons au sommet d'une colonne cylindrique. Accélérés par une forte différence de potentiel, 67 The principal features of a light microscope and a transmission electron microscope These drawings emphasize the similarities of overall design. Whereas the lenses in the light microscope are made of glass, those in the electron microscope are magnetic coils. The electron microscope requires that the specimen be placed in a vacuum. 68 III.1.b. Microscopie électronique Annexe 7 Ces électrons forment un faisceau qui est canalisé par une série de condensateurs. La formation de l'image résulte: - soit de la transmission des électrons à travers l'échantillon, c'est la microscopie électronique à transmission (MET) - soit de leur réflexion par l'échantillon, on parle alors de microscopie électronique à balayage (MEB). 69  Annexe 8 Préparation des tissus pour la microscopie électronique 70 III.2. Visualisation des Molécules dans les cellules vivantes Méthodes utilisées dans l’étude des mécanismes dynamiques ayant lieu dans les cellules vivantes: - Microscopie - Imagerie: radiations; lumière - Indicateurs et marqueurs fluorescents. ex: Les molécules pouvant être visibles: ions inorganiques (Ca2+ or H+) et larges macromolécules (protéines, ARN, ou ADN). 71  III.2. Visualisation des Molécules dans les cellules vivantes Mesure des concentrations ioniques intracellulaires Microéléctrode Problèmes!! Solutions: Utilisation d’indicateurs luminescents et fluorescents 72 Mesure des concentrations ioniques intracellulaires Exemple 1 Aequorin: protéine luminescente isolée des méduses marines; Emission de la lumière en présence de Ca2+ et réponse aux changements de concentration de calcium (0.5–10 μM). 73 La protéine aequorine luminescente émet de la lumière en présence de Ca2+ libre. Ici, un œuf de poisson ‘médaka’ a été injecté avec aequorine , qui a diffusé dans tout le cytosol. L'œuf a été fécondé avec un spermatozoïde et la luminescence à été suivie à l'aide d'un intensificateur d'image. Les quatre photos ont été prises sur le site de la pénétration des spermatozoïdes à intervalles de 10 secondes et révèlent une vague de libération de Ca2+ libre dans le cytosol juste en dessous de la membrane plasmique. Cette onde balaye l'oeuf à partir du point d'entrée des spermatozoïdes, comme l'indiquent les diagrammes de gauche. 74 Mesure des concentrations ioniques intracellulaires > Indicateurs calciques fluorescents: - se lient au calcium - excitation et émission à des longueurs d’onde différentes selon qu’ils sont libres ou lient le calcium Mesure du ratio de fluorescence Microscopie à fluorescence 75 76 Exemple 2: Visualisation des concentrations intracellulaires de Ca2+ en utilisant un indicateur fluorescent L'arbre de ramification de dendrites d'une cellule de Purkinje dans le cervelet reçoit plus de 100.000 synapses d'autres neurones. le corps de la cellule à la partie inférieure de l'image. Cette image de la concentration intracellulaire de Ca2+ dans une cellule de Purkinje unique (du cerveau d'un cochon de Guinée) a été prise avec un appareil photo de faible luminosité et l’indicateur fluorescent Ca2+- sensible: fura- 2. La concentration de Ca2+ libre est représentée par des couleurs différentes, rouge étant le plus élevé et le bleu le plus bas. Le plus haut des niveaux de Ca2+ sont présents dans les milliers de branches dendritiques. 77 Comment introduire ces indicateurs dans la cellule? 78 Méthodes d'introduction d'une substance dans une cellule (A) La substance est injectée à travers une micropipette, soit par application d'une pression ou, si la substance est chargée électriquement, par application d'une tension qui entraîne la substance dans la cellule comme un courant ionique (technique dite d'iontophorèse). (B) La membrane de la cellule est transformée transitoirement perméable à la substance en perturbant la structure de la membrane avec un choc électrique bref mais intense (2000 V/cm à 200 microsecondes, par exemple). (C) Des vésicules de membrane chargées avec la substance souhaitée sont induites pour fusionner avec des cellules cibles. (D) Les particules d'or enrobées d'ADN sont utilisés pour introduire un nouveau 79 gène dans le noyau.  D’autres moyens pour le faire Exemple 3: Fluorescent analog cytochemistry: une protéine purifiée est couplée à un fluorophore puis microinjectée dans la cellule. La destination de la protéine injectée peut être suivie pendant la croissance et la division de la cellule par le microscope à fluorescence. 80 Visualizing the dynamics of individual microtubules by fluorescence speckle microscopy (A) The principle of the method. A very low amount of fluorescent tubulin is injected into living cells so that individual microtubules form with a very small proportion of fluorescent tubulin. Such microtubules have a speckled appearance when viewed by fluorescence microscopy. (B) Fluorescence micrographs of a mitotic spindle in a living newt lung epithelial cell. The chromosomes are stained green, and the tubulin speckles are red. (C) The movement of individual speckles can be readily followed by time-lapse video microscopy. Images of the long, thin, rectangular, boxed region (arrow) in (B) were taken at sequential times and pasted side by side to make a montage of the region over time. Individual speckles can be seen to move toward the poles (representing poleward flux) at a rate of about 0.75 μm/min. 81 Direct observation of the dynamic instability of microtubules in a living cell Microtubules in a newt lung epithelial cell were observed after the cell was injected with a small amount of rhodamine labeled tubulin. The dynamic instability of microtubules at the edge of the cell can be readily observed. Four individual microtubules are highlighted for clarity; each of these shows alternating shrinkage and growth. 82  D’autres moyens pour le faire Exemple 4: GFP: Green Fluorescent Protein GFP est isolée (comme aequorin) de la méduse Aequoria victoria. La structure de la GFP, représenté ici schématiquement, met en évidence les onze feuillets β qui forment les douves d'un tonneau. Enterré à l'intérieur du canon est le chromophore actif (vert foncé) qui est formée après la traduction de chaînes latérales en saillie des trois résidus 83 d'acides aminés. Green Fluorescent Protein 84  Green Fluorescent Protein Reporter l’expression d’un gène; Organismes transgéniques; Couplage à un peptide signal 85 86  Green Fluorescent Protein Can Be Used to Tag Individual Proteins in Living Cells and Organisms (A) The upper surface of the leaves of Arabidopsis plants are covered with huge branched single-cell hairs that rise up from the surface of the epidermis. These hairs, or trichomes, can be imaged in the SEM. (B) If an Arabidopsis plant is transformed with a DNA sequence coding for talin (an actin-binding protein), fused to a DNA sequence coding for GFP, the fluorescent talin protein produced binds to actin filaments in all the living cells of the transgenic plant. Confocal microscopy can reveal the dynamics of the entire actin cytoskeleton of the trichome (green).The red fluorescence arises from chlorophyl in cells within the leaf below the epidermis. 87  GFP utilisé pour marquer des protéines clés dans des cellules et organismes vivants Autres applications au GFP: 1- Méthode FRET Interaction protéine-protéine: Fluorescence resonance energy transfer (FRET). Les deux molécules d’intérêt sont tagées par des fluorochromes différents de façon à ce que le spectre d’émission de l’un coincide avec le spectre d’absorption du second; Si les 2 protéines étudiées sont liées, leurs fluorochromes se rapprochent (distance de 2 nm), l’énergie de la lumière absorbée sera transférée directement au second fluorochrome; Illumination à la longueur d’onde d’excitation du premier, la lumière est émise à la longueur d’onde du second; Variants de la GFP 88 Fluorescence resonance energy transfer (FRET) To determine whether (and when) two proteins interact inside the cell, the proteins are first produced as fusion proteins attached to different variants of GFP. (A) In this example, protein X is coupled to a blue fluorescent protein, which is excited by violet light (370–440 nm) and emits blue light (440–480 nm); protein Y is coupled to a green fluorescent protein, which is excited by blue light and emits green light (510 nm). (B) If protein X and Y do not interact, illuminating the sample with violet light yields fluorescence from the blue fluorescent protein only. (C) When protein X and protein Y interact, FRET can now occur. Illuminating the sample with violet light excites the blue fluorescent protein, whose emission in turn excites the green fluorescent protein, resulting in an emission of green light. The fluorochromes must be quite close together—within about 1–10 nm of one another—for FRET to occur. Because not every molecule of protein X and protein Y is bound at all times, some blue light may still be detected. But as the two proteins begin to interact, emission from 89 the donor GFP falls as the emission from the acceptor GFP rises. Remarque: La méthode FRET (Fluorescence resonance energy transfer) peut aussi être utilisée pour vérifier la présence du Ca+ 90  Protéines diffusent dans la cellule Autres applications au GFP: 2- Méthode FRAP Le taux de la diffusion latérale d’une protéine membranaire peut être mesuré par la technique de FRAP: fluorescence recovery after photobleaching. Marquer la protéine d’intérêt par un fluorochrome (ligand fluorescent: anticorps qui se lie à la protéine ou prot-GFP) L’indicateur fluorescent est “bleaché” dans une petite zone par un laser, et le temps demandé pour que les autres protéines adjacentes diffusent de la zone intacte jusqu’à la zone bleaché est mesuré. 91 Measuring the rate of lateral diffusion of a membrane protein by photobleaching techniques A specific protein of interest can be labeled with a fluorescent antibody (as shown here), or it can be expressed as a fusion protein with green fluorescent protein (GFP), which is intrinsically fluorescent. (A) In the FRAP technique, fluorescent molecules are bleached in a small area using a laser beam. The fluorescence intensity recovers as the bleached molecules diffuse away and unbleached molecules diffuse into the irradiated area (shown here in side and top views). The diffusion coefficient is calculated from a graph of the rate of recovery: the greater the diffusion coefficient of the membrane protein, the faster the recovery. (B) In the FLIP technique, an area in the membrane is irradiated continuously, and fluorescence is measured in a separate area. Fluorescence in the second area progressively decreases as fluorescent proteins diffuse out and bleached molecules diffuse in; eventually, all of the fluorescent protein molecules will be bleached, as long as they are mobile and not permanently anchored to 92 the cytoskeleton or extracellular matrix.  III.3.a. CENTRIFUGATION La centrifugation est une méthode couramment utilisée en biochimie pour séparer ou analyser des fractions ou des structures cellulaires, des macromolécules, etc. On peut accentuer ou raffiner les méthodes de séparation en faisant cette centrifugation dans un gradient de concentration. En effet, un des facteurs qui influence la vitesse de sédimentation est la différence entre la densité de la particule et celle du solvant. On peut donc moduler cette vitesse en faisant varier de façon continue ou par étape (discontinue) cette différence de densité en créant un gradient de concentration. Si la densité de la particule est plus grande que celle du milieu, elle sédimentera. Plus la différence de densité est grande plus la sédimentation est rapide. S'il n'y a aucune différence de densité, il n'y aura aucune sédimentation, quelle que soit l'accélération. Si la particule est moins dense que celle du milieu, celle-ci s'élèvera dans le tube jusqu'à atteindre un niveau de densité égal à la sienne ou, le cas échéant, jusqu'à flotter à la surface. 93  III.3. a. CENTRIFUGATION Les variations de densités sont obtenues en faisant varier la concentration d'un produit chimique dans la solution. Divers produits peuvent être utilisés pour faire ces gradients. Le saccharose ("sucrose") est très souvent employé. Il permet d'atteindre des densités assez élevées, de l'ordre de 1.3 g/mL avec du saccharose 2.5 M. Son principal défaut est sa viscosité à forte concentration, ce qui rend son utilisation plus difficile. Un autre produit couramment utilisé, particulièrement dans la séparation des acides nucléiques, est le chlorure de césium (CsCl). Ce sel peut atteindre une densité très élevée, de l'ordre de 1.9 g/mL à 7.5 mol/L. Cette possibilité d'atteindre des densités si élevées en solution aqueuse est son principal avantage Le Ficoll™, un produit de la compagnie Pharmacia, est un polymère de glucose l'épichlorohydrine, comme le Sephadex™ de la même compagnie. Son principal avantage est qu'il peut produire des densités élevées sans générer de fortes pressions osmotiques. Il est cependant restreint à certains usages précis, surtout la séparation de cellules entières, à cause de son coût, de sa grande viscosité et des densités limitées qu'il permet d'atteindre. 94  Gradients continus et discontinus On peut faire des gradients discontinus en juxtaposant un par-dessus l'autre des solutions ayant des différences suffisantes de densités. On obtient ainsi des gradients discontinus. On peut facilement fabriquer des gradients discontinus en déposant une sur l'autre deux ou trois couches de solutions de diverses densités. 95 On peut aussi obtenir des gradients continus où la variation de densité est graduelle le long du tube à centrifuger. Cette variation graduelle peut être linéaire, exponentielle (concave), logarithmique (convexe), 96  Séparation isopycnique en gradient continu Dans ce type de méthode, les molécules soumises à la centrifugation sur le gradient se sépareront selon leur densité, non pas leur masse. La préparation à analyser est déposée sur le sommet du gradient, puis on centrifuge à équilibre. Chaque type de particule sédimentera jusqu'à ce qu'elle atteigne la concentration correspondant à sa densité. Elle s'immobilisera alors à ce niveau. Il est même possible de faire des gradients générés durant la centrifugation elle-même, sous l'influence directe du champ gravitationnel. Certains auteurs semblent restreindre le terme "isopycnique" uniquement aux gradients auto-générés. Cependant ce terme s'applique à tous les cas où on centrifuge à équilibre dans un gradient continu. Exemples: Purification de fractions cellulaires en gradient discontinu On peut purifier de façon de simple des fractions cellulaires en mettant à profit un autre critère de centrifugation: la différence de densité entre la particule et celle du milieu. En effet, certaines particules ou organites cellulaires ont des densités différentes. On peut donc les isoler, ou s'en débarrasser, par centrifugation à équilibre. En choisissant bien les densités de ces couches, la fraction cellulaire qu'on veut isoler se localisera sur la couche qui a une densité plus forte. Les autres fractions, ayant des densités différentes, sédimenteront plus bas ou seront immobilisés plus haut. Séparation isopycnique de macromolécules Différents types d'ADN peuvent être séparés par centrifugation isopycnique sur un gradient de CsCl. 97  III.3. a. CENTRIFUGATION Centrifugation différentielle (selon la vitesse de sédimentation) Une séparation grossière en fonction de la taille des organites Consiste en une série répétée de centrifugation selon le matériel désiré 98  III.3.b. CHROMATOGRAPHIE Méthode de séparation des constituants d’un mélange gazeux, liquide ou solide. Elle peut être utilisée pour la séparation des protéines en solution (phase mobile) en se basant sur leurs différences d’affinités envers une phase fixe ou stationnaire. a) Filtration sur gel b) Echangeuse d’ions a) Chromatographie d’affinité 99  III.3.b. CHROMATOGRAPHIE a) Filtration sur gel (exclusion) Sépare les protéines selon leur taille et leur forme la colonne est formée de bille de résine poreuse Les protéines à Rs (rayon de Stokes) élevé passent entre les billes. Plus le Rs est faible, plus les molécules traversent les espaces situés à l'intérieur des billes, donc plus la progression dans la colonne est lente. 100  III.3.b. CHROMATOGRAPHIE a) Filtration sur gel (exclusion): Profil d’élution temps Ve Détermination de la protéine en fonction du volume d’élution (Ve) 101  III.3.b. CHROMATOGRAPHIE b) Echangeuse d’ions La méthode de chromatographie d’échange ionique met à profit la charge des protéines. La colonne contient une résine (gel: agarose, polyacrylamide, polystyrène…) formée d’une matrice sur laquelle sont greffés des groupes chargés. Échangeur d’anions = Échangeur de cations = gel porteur de charges fixes positives gel porteur de charges fixes négatives 102 b) Echangeuse d’ions 1. Equilibration 4. Elution 2 2. Passage 5. Elution 3 3. Elution 1 103  III.3.b. CHROMATOGRAPHIE c) Chromatographie d’affinité Repose sur la relative spécificité d’interaction d’une protéine pour certains ligands Exemple: fixation d’anticorps sur une matrice solide et faire passer la solution sur la colonne pour y attraper les protéines reconnues par l'anticorps. 104  III.3.c ELECTROPHORESE Séparation de solutés chargés (Protéines, ADN, ARN) en les migrant dans un champ électrique Dans le cas d’une protéine, la migration dépend: de la charge de la protéine de sa taille et du support (gel plus ou moins réticulé, papier): a) Electrophorèse unidimensionnelle (SDS-PAGE) b) Electrophorèse Isoélectrofocalisation (IEF) c) Electrophorèse bidimensionnelle (2D) 105  III.3.c ELECTROPHORESE a) Electrophorèse unidimensionnelle (SDS-PAGE) Séparation en fonction de la masse moléculaire (taille), par effet de filtration sur gel (acrylamide). SDS: (Dodécyl-Sulfate de Sodium) = Agent dénaturant qui transforme les macromolécules en poly-anions 106  III.3.c ELECTROPHORESE Repérage des protéines par ajout de bleu de Coomassie ou de nitrate d’argent Dépôt du mélange de protéines Marqueurs de 107 taille (KD)  III.3.c ELECTROPHORESE b) L’Isoélectrofocalisation (IEF) 108  III.3.c. ELECTROPHORESE Séparation des protéines suivant le pI (avec un gel sur lequel on a réalisé un gradient de pH : la protéine s’arrête lorsqu’elle atteint la zone du gel où pH = pI) Focalisation isoélectrique. 109  III.3.c. ELECTROPHORESE c) Electrophorèse 2D 1) Séparation des protéines suivant leur pI 2) Séparation des protéines suivant leur masse moléculaire SDS-PAGE. Protéines à pI proches Meilleure séparation surtout si les pI ou les tailles des protéines sont proches 110  III.3.c. ELECTROPHORESE Exploitation des électrophorèses Purification de la protéine désirée en connaissant sa masse moléculaire Vérification que la protéine purifiée est celle désirée Déterminer les protéines néo-synthétisés suite à un stimulus: Induire des acides aminés radioactifs dans la cellule → stimulation de la cellule → récupération des protéines → électrophorèse → révélation des protéines par le bleu de Comassie et par autoradiographie. (semi-quantification et récupération) 111  III.3.c. ELECTROPHORESE Electrophorèse sur gel d’agarose pour la séparation d’ADN (Annexe 9) Méthode de choix pour la séparation et l’identification des fragments d’ADN. Sous l’influence d’un courant électrique, les acides nucléiques chargés négativement se déplacent à travers le gel d’agarose vers la borne positive. Le taux de migration de l'ADN dépend de quatre paramètres: 1. la taille de la molécule d'ADN 2. la conformation de l'ADN 3. la concentration de l'agarose 4. le courant appliqué. 112 III.3.c. ELECTROPHORESE 113  III.3.c. ELECTROPHORESE Ajout du bromure d’éthidium (BET), qui s’intercale entre les bases de l’ADN et le rend fluorescent (λém = 570 nm) 114  III.4. TEQUNIQUES DE MARQUAGE Les propriétés d’interactions entre les molécules peuvent être mises à profit pour leur détection et leur quantification. Ainsi, les méthodes de marquages sont capables de: Révéler avec une haute spécificité un petit nombre de molécules.. Suivre la quasi-totalité des processus cellulaires et leur localisation (mobilité d’une cellule, différentes étapes de production d’une molécule,…) Quantification des molécules a. Marquage radioactif b. Marquage par anticorps 115  III.4.a. Marquage radioactif Les molécules radioactives autorisent le suivi de la quasi-totalité des processus cellulaires et leur localisation dans la cellule. Les expériences consistent à fournir aux cellules un précurseur spécifique d'une macromolécule, sous une forme radioactive pour le différencier du précurseur endogène. PULSE-CHASE: On cultive des cellules in-vitro, dans un milieu acide. Etape ‘Pulse’: Ajout dans le milieu des acides aminés marqués radioactivement. Etape ‘chase’: Transfert dans un milieu où les acides aminés ne sont pas marqués. Prélèvement à intervalles réguliers des cellules de ce nouveau milieu 116  III.4.a. Marquage radioactif Autoradiographie: Fixation de la cellule et coupage au microtome. Sur la plaquette obtenue, on dépose un film photographique contenant des grains d'argent, et on laisse le tout reposer quelques semaines à l'obscurité. Les électrons issus de la désintégration des noyaux radioactifs assimilés par la cellule réduisent les ions Ag+ en grains noirs d'argent, donnant ainsi une « photographie » de la localisation de la radioactivité cellulaire. On peut ainsi retracer, par observation de lames minces à temps de «chasse » différents, le trajet cellulaire des protéines lors de leur synthèse. Ultracentrifugation: Récupération des organites cellulaires et mesure de la radioactivité dans chaque compartiment en fonction du temps → Retrouver le trajet des acides aminés nouvellement assemblés en protéines 117  III.4.b. Marquage par des anticorps L’Immuno-marquage est un terme général en biochimie qui s'applique à toute utilisation d'une méthode basée sur les anticorps pour détecter une protéine spécifique dans un échantillon. Il existe plusieurs techniques d'immunomarquage qui peuvent être appliquées sur des tissus, les cellules et les composants cellulaires a) L’immunofluorescence b) Marquage immunoenzymatique b.1) chimiluminescence (ELISA,WB) b.2) colorimétrie (IHC) 118  III.4.b. Marquage par des anticorps Les anticorps Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire comme moyen de défense contre l'infection. Ils sont sécrétés par des cellules dérivées des lymphocytes B : les plasmocytes. Les anticorps possèdent un site de liaison qui reconnaît une molécule cible spécifique (ou antigène). La spécificité des anticorps précis fait d’eux des outils puissants pour la biologie cellulaire. Étiquetés avec des colorants fluorescents ou enzymatiques: les anticorps sont devenus des outils pour détecter et localiser des molécules. 119  III.4.b. Marquage par des anticorps Principe Quand le nombre d’antigènes présents est suffisamment important un marquage direct suffira : marqueur Anticorps Antigène Quand la concentration d’antigènes est très faible un marquage indirect est nécessaire afin d’amplifier le signal : 120  III.4.b. Marquage par des anticorps Protocol standard (a) Préparation de l’échantillon contenant la protéine cible selon la méthode et les supports utilisés (tissu sur une lame, solvant dans des plaques, protéine sur une membrane, …) (b) Blocage des sites non spécifiques avec du BSA ou du lait (a) (b) (c) (c) Ajout de l’anticorps primaire selon une concentration et pendant un temps déterminé, puis lavage (d) (e) (d) Ajout de l’anticorps secondaire couplé à un marqueur, puis lavage (e) Révélation du marquages selon le type du marqueur utilisé 121  III.4.b. Marquage par des anticorps Types de marqueurs 122  III.4.b. Marquage par des anticorps a) L’immunofluorescence L’Immunofluorescence est une réaction antigène-anticorps, où les anticorps sont marqués avec un colorant fluorescent (fluorochrome) et le complexe antigène- anticorps est visualisé après excitation par un microscope fluorescent (marquage de tissus/cellule) ou un fluomètre (marquage de protéine en suspension). 123  III.4.b. Marquage par des anticorps 1) Microscope à fluorescence 2) Quantification des protéines Détection de protéines cibles à l'aide d'anticorps conjugué à un fluorophore. Synaptophysin (rouge) et la protéine associée Plaque de 96 puits noir aux microtubules 2 (MAP2, vert) dans les neurones corticaux de souris. 3) Cytométrie en flux 4) Western blot L’inconvénient majeur des techniques de détection par fluorescence est qu’elles nécessitent un appareillage complexe et coûteux pour l’excitation et la détection 124 du signal émis.  III.4.b. Marquage par des anticorps La cytométrie en flux La cytomètre en flux a été conçu pour automatiser l'analyse et la séparation des cellules colorées avec un anticorps fluorescent. L'un des principes fondamentaux de la cytométrie en flux est la capacité à mesurer les propriétés des particules individuelles. Lorsqu'un échantillon en solution est injecté dans un cytomètre de flux, les particules sont réparties de façon aléatoire dans l'espace à trois dimensions. Les particules sont amenées alors à passer une par une dans le système pour être détectées par la machine 125  III.4.b. Marquage par des anticorps La cytométrie en flux Le cytomètre en flux utilise un faisceau laser et un détecteur de lumière pour compter des cellules intactes individuelles en suspension. Chaque fois qu'une cellule passe le faisceau laser, la lumière est déviée du détecteur, et cette interruption du signal de laser est enregistrée. Les cellules ayant un anticorps marqué par fluorescence lié à leurs antigènes de surface sont excités par le laser, et émettent de la lumière qui est enregistrée par un second système de détection située à un angle droit avec le faisceau laser. La forme la plus simple de l'instrument compte chaque cellule lors de son passage devant le rayon laser et enregistre le niveau de fluorescence que la cellule émet. Un ordinateur génère des points du nombre de cellules en ordonnée et leur 126 intensité de fluorescence en abscisse. III.4.b. Marquage par des anticorps 127 https://www.youtube.com/watch?v=244tN5d1p7U 128  III.4.b. Marquage par des anticorps Cytométrie en flux 129  III.4.b. Marquage par des anticorps Interprétation des résultats Résultats en dot blot 130  III.4.b. Marquage par des anticorps Interprétation des résultats Résultats en histogramme 131  III.4.b. Marquage par des anticorps Interprétation des résultats Exemple : analyse du cycle cellulaire 132  III.4.b. Marquage par des anticorps Intérêt Le cytomètre de flux a de multiples applications à des problèmes cliniques et de recherche. Une utilisation clinique courante consiste à déterminer le type et le nombre de globules blancs dans le sang. En analysant les échantillons de sang traitées de manière appropriée avec un anticorps marqué par fluorescence et en effectuant une analyse par cytométrie de flux, on peut obtenir les informations suivantes: * Nombre de cellules exprimant l'antigène cible >>> (On peut également isoler) * La distribution de la densité de l'antigène à l'intérieur de la population de cellules qui possèdent l'antigène. * Taille des cellules 133  III.4.b. Marquage par des anticorps La cytométrie en flux permet également d'analyser des populations cellulaires qui ont été marqués par deux ou même trois anticorps fluorescents différents. Ex.1: si un échantillon de sang est marqué à la fluorescéine spécifique des cellules T, et avec un anticorps spécifique marqué à la phycoérythrine pour les cellules B, les pourcentages de cellules B et T peuvent être déterminés simultanément par une seule analyse Ex.2: La mesure rapide des sous-populations de cellules T, un indicateur pronostique important dans le SIDA, se fait couramment par cytométrie de flux. Les anticorps monoclonaux marqués contre les principaux sous-types de cellules T portant les antigènes CD4 et CD8 sont utilisés pour déterminer leurs taux dans le sang du patient. Ex.3: Le choix du traitement pour la leucémie dépend fortement des types cellulaires impliqués, ainsi le cytomètre en flux est l'un des outils indispensables pour la détection et la classification des leucémies 134  III.4.b. Marquage par des anticorps b) Marquage Immunoenzymatique Il existe d’autres méthodes de marquage où au lieu du fluorochrome on couple une enzyme à l’anticorps. Etant donné que 1) plusieurs anticorps secondaires peuvent se lier sur l’anticorps primaire et 2) plusieurs enzymes sont couplés à l’anticorps secondaire, cette méthode augmente considérablement la sensibilité de détection. Selon le type de la réaction enzymatique: - La chimiluminescence 135 - La colorimétrie  III.4.b. Marquage par des anticorps b) Marquage Immunoenzymatique b.1 Chimiluminescence Les enzymes les plus utilisées sont les horseradish peroxydase (HRP) et la phosphatase alcaline (PA). La HRP catalyse l’oxydation du luminol en présence du H2O2 ce qui aboutit à l’émission d’un signal lumineux: c’est une réaction de chimiluminescence qui peut être mesurée par un spectrophotomètre. 136  III.4.b. Marquage par des anticorps ELISA (Enzyme Linked Immunostaining assay) Ce test est basé sur le principe de l’immunomarquage enzymatique* Il sert à déterminer la concentration d’une protéine dans une suspension (surnageant, sérum, plasma…) Il existe plusieurs types d’ELISA: 137  III.4.b. Marquage par des anticorps ELISA (Enzyme Linked Immunostaining assay) le test est réalisé en général dans des plaques de 96 puits ou de 380 puits Une courbe de standard est effectuée dans la plaque, constituée de protéines à concentration connus 138 https://www.youtube.com/watch?v=RRbuz3VQ100  III.4.b. Marquage par des anticorps ELISA (Enzyme Linked Immunostaining assay) La plupart des supports utilisés dans les immunomarquages ont une forte affinité pour les protéines Par conséquent, il est important d'empêcher les surfaces des supports d’être libre afin d’éviter la fixation non spécifique des anticorps de détection au cours des étapes ultérieures Ainsi un tampon de blocage est utilisé (BSA, lait, …) qui se fixe sur les sites non-spécifiques et améliore ainsi la sensibilité du dosage en améliorant le rapport signal/bruit de fond 139  III.4.b. Marquage par des anticorps ELISA (Enzyme Linked Immunostaining assay) L’utilisation d’un lecteur de densité optique de mesurer les densités optique de chaque échantillon et de déterminer ainsi la concentration de la protéine mesurée * NB: le dosage ELISA peut aussi être fait avec un marquage fluorescent 140  III.4.b. Marquage par des anticorps ELISA (Enzyme Linked Immunostaining assay) 141  III.4.b. Marquage par des anticorps WESTERN BLOT Technique utilisée pour identifier une protéine cible dans un mélange complexe, et mesurer son taux d'expression. ‘Blot/Blotting’ est un terme qui décrit le transfert de molécules à partir d'un gel sur une membrane et d'un filtre à effet de mèche. 142  III.4.b. Marquage par des anticorps WESTERN BLOT La première étape du Western blot est la séparation des protéines par la technique d’électrophorèse sur gel (SDS-PAGE). Après électrophorèse, les molécules séparées sont transférées sur une deuxième matrice: une membrane de nitrocellulose ou de vinylidène difluorure (PVDF). (Annexe 10) Ensuite, la membrane est bloquée pour empêcher tout liaison non spécifique de l'anticorps La membrane est imprégnée par un anticorps marqué et un substrat approprié est ensuite ajouté: marquage chimiluminescent 143  III.4.b. Marquage par des anticorps WESTERN BLOT Le rendement lumineux peut être capturé en utilisant un film conçu pour la chimiluminescence. Cette méthode est utilisée pour confirmer la détection de la protéine sur gel et pour la quantifier. Le Southern Blot et le Northen Blot suivent le même principe du Western Blot mais pour l’ADN et l’ARN respectivement. 144  III.4.b. Marquage par des anticorps b) Marquage Immunoenzymatique b.2 Colorimétrie La détection de l’interaction peut également se faire par l’intermédiaire d’un signal colorimétrique visible à l’œil (λ: 400 – 800 nm). Utilisation de la phosphatase alcaline comme enzyme et la BCIP/NBT comme substrat Cette méthode est largement utilisée dans Le marquage des tissus: Immunohistochimie ainsi dans l’application médicale par exemple pour les tests de grossesse et la détection des virus et bactéries (Rota-Adeno, HIV) 145  III.4.b. Marquage par des anticorps Immunohistochimie (IHC) Préparation des tissus en coupant l’organe sur Imprégnation des tissus un cryostat/microtome dans les différents solutions (AcI, AcII, DAB). Etalement du tissu sur Astrocytes marqués dans des lames le cortex du rat en utilisant Observation sur microscope 146 un Ac anti-GFAP optique  III.4.b. Marquage par des anticorps Anticorps polyclonaux et monoclonaux L'obtention d‘Ac. s'effectue par injections répétées d'un antigène à un animal (lapin, chèvre, etc.). Cependant différents lymphocytes B vont réagir et produire des Ac. différents. Le sérum de l’animal contient alors un mélange hétérogène d‘Ac. (anticorps polyclonaux) dirigés contre diverses parties (épitopes) de la molécule injectée. Sensibilité élevée Spécificité réduite Les isoler les uns des autres s'avère difficile. L'alternative consiste à produire des anticorps monoclonaux. Sensibilité réduite Spécificité élevée 147  III.4.b. Marquage par des anticorps Production d’anticorps monoclonaux 148