Culture Cellulaire Animale : Principes et Procédés PDF

Culture Cellulaire Animale : Principes et Procédés Table des matières {#table-des-matières.En-ttedetabledesmatires} ================== [[Historique de la Culture Cellulaire] 1](#historique-de-la-culture-cellulaire) [[Précurseurs de la Culture Cellulaire] 1](#pr%C3%A9curseurs-de-la-culture-cellula...

Culture Cellulaire Animale : Principes et Procédés Table des matières {#table-des-matières.En-ttedetabledesmatires} ================== [[Historique de la Culture Cellulaire] 1](#historique-de-la-culture-cellulaire) [[Précurseurs de la Culture Cellulaire] 1](#pr%C3%A9curseurs-de-la-culture-cellulaire) [[Définitions de la Culture Cellulaire] 2](#d%C3%A9finitions-de-la-culture-cellulaire) [[Culture de Cellules Eucaryotes] 3](#culture-de-cellules-eucaryotes) [[Types de Cultures Cellulaires] 3](#types-de-cultures-cellulaires) [[Cellule Immortelle et Transformée] 3](#_Toc188709747) [[Transformation] 4](#transformation) [[Les culture Cellulaire] 4](#_Toc188709749) Objectif du cours : Comprendre les fondements et applications L'objectif de la culture cellulaire animale est de maîtriser les principes fondamentaux, les techniques associées et leurs applications, notamment en recherche pharmaceutique, où elle joue un rôle clé dans le développement de médicaments. Historique de la Culture Cellulaire ----------------------------------- ##### Évolution de la Théorie Cellulaire La compréhension que les êtres vivants sont constitués de cellules est le fruit de plusieurs découvertes majeures : ***Anton van Leeuwenhoek (1632-1723)*** - Amélioration du microscope et observation de micro-organismes comme les bactéries et protistes, initiant le domaine de la microbiologie. ***Robert Hooke (1655)*** - Première observation de cellules mortes alignées dans un morceau de liège. Il invente le terme *\"cellula\"* pour décrire ces structures. ***Rudolf Virchow (1858)*** - Définition de la cellule comme unité fondamentale de la vie. Principe selon lequel toute cellule provient d'une autre cellule et lien entre maladies et atteintes cellulaires. ***Louis Pasteur (1860)*** - Démonstration scientifique réfutant la théorie de la génération spontanée. Les premières cultures cellulaires remontent seulement au début du XXe siècle, marquant une avancée majeure en biologie. Précurseurs de la Culture Cellulaire ------------------------------------ Harrison (1907) - Premier essai de culture d'un explant (tissu prélevé sur une grenouille) dans du liquide lymphatique. Ces travaux sont les bases des recherches sur les cellules souches. Carrel (1912) - Développement de la culture de tissus suivant trois axes principaux : 1. Amélioration des techniques de prélèvement. 2. Mise en place des règles d'asepsie. 3. Étude des besoins nutritionnels des cellules. Sabin (1936) - Culture du virus de la poliomyélite sur du tissu embryonnaire nerveux *in vitro*. Enders (1949) - Étend la culture du virus de la poliomyélite à d'autres tissus humains (peau, muscle, intestin), permettant la culture à grande échelle et ouvrant la voie aux vaccins viraux. ##### Innovations Techniques dans les Années 1960-1970 ***Optimisation des Milieux Nutritifs (1960)*** - Études approfondies sur les milieux de culture pour améliorer la survie et la multiplication des cellules. Des liquides naturels enrichis sont introduits comme solutions de culture. ***Avancées Majeures (1970)*** Technologie des Hybridomes - Fusion de deux cellules pour en créer une nouvelle, viable et fonctionnelle. *Exemple : fusion de deux lymphocytes B ou des cellules trophoblastiques formant le syncytium dans le placenta.* Génie Génétique - Développement de protéines recombinantes grâce à l'ADN recombinant, permettant la modification génétique des protéines. La culture cellulaire animale est ainsi le fruit d'évolutions scientifiques progressives, alliant découvertes fondamentales et innovations techniques. Elle constitue aujourd'hui un outil central pour la recherche biomédicale et pharmaceutique. Définitions de la Culture Cellulaire ------------------------------------ ***Définition Générale*** La culture cellulaire est une technique permettant de maintenir des cellules isolées dans des conditions de laboratoire favorables à leur survie et à leur croissance. ##### Culture de Cellules Procaryotes Les cellules procaryotes, comme les bactéries, peuvent se multiplier sur des milieux inertes, également appelés milieux purement chimiques ou synthétiques. ***Conditions de Culture*** - Ces milieux doivent contenir des éléments essentiels comme le potassium, le calcium, le phosphate, ainsi que des facteurs de croissance spécifiques à l\'espèce ou au génotype bactérien. - Les conditions de culture assure la prolifération des bactéries *in vitro*. ***Cas particuliers de mise en culture*** Virus - Contrairement aux bactéries, les virus ne peuvent pas se multiplier sur des milieux chimiques. Étant intracellulaires obligatoires, ils nécessitent d\'abord une culture cellulaire pour se développer. Bactéries incultivables in vitro - Certaines bactéries, comme le *Mycobacterium leprae* (bacille de la lèpre), ne se multiplient pas en culture et ne font que survivre. Découverte d\'espèces symbiotiques - Une équipe japonaise a découvert, dans les fonds marins, deux types cellulaires fonctionnant en symbiose et incapables de survivre indépendamment. Culture de Cellules Eucaryotes ------------------------------ Les cellules eucaryotes peuvent être cultivées pour plusieurs raisons et sites de culture. - Tissus : maintenance et conservation des fonctions spécifiques *in vitro* (exemple : ingénierie tissulaire). - Organes : maintien de la structure et des fonctions spécifiques *in vitro*. - Cellules Isolées : les cellules peuvent être naturellement isolées (comme les levures) ou issues de tissus végétaux et animaux. Le terme « culture » désigne le maintien de cellules vivantes en dehors de leur organisme d\'origine. ***Objectif pour les cellules isolées*** - Maintenir leur capacité à se diviser et à exprimer leur métabolisme. - Conserver leurs fonctions spécifiques *in vitro*. Types de Cultures Cellulaires ----------------------------- Les cultures cellulaires se divisent en deux grandes catégories : culture primaire et culture secondaire (ou lignée cellulaire). ##### Culture Primaire (ou Primo-Culture) - Initiée à partir de tissus, organes ou cellules directement prélevés sur un organisme. - Les cellules sont dissociées de leur organe d\'origine et mises en culture sous forme d\'explants. ##### Lignée Cellulaire - Constituée d\'un ensemble de cellules issues d\'une culture primaire. - Ces cellules sont obtenues après un repiquage c'est-à-dire leur transfert dans un nouveau milieu de culture. Ces définitions fournissent les bases nécessaires à la compréhension des différents types de cultures cellulaires et de leur utilisation en recherche et en biotechnologie. []{#_Toc188709747.anchor} Cellule Immortelle et Transformée --------------------------------- ***Définition de l'immortalisation*** L\'immortalisation désigne l\'acquisition, par une cellule, de la capacité à se diviser indéfiniment *in vitro*. ##### Origine de l\'immortalisation ***Spontanée*** - Peut survenir dans certaines tumeurs bénignes. - Résulte parfois d\'une interaction avec des éléments du milieu de culture ou de substances endogènes qui stimulent l\'immortalisation. ***Induite*** - Provoquée par des agents tels que des virus ou des gènes spécifiques (ex : activation des télomérases permettant de maintenir les télomères et d'assurer une prolifération illimitée). *Exemple d\'une lignée immortelle --- › les lignée VERO.* - Issue de cellules épithéliales du rein de singe vert (*Verda Reno* 1962). - Immortalisée grâce à des conditions particulières (ex : forte concentration en calcium). - Devenue aneuploïde (caryotype modifié : 2n + a). - Capable de se diviser indéfiniment, bien qu'elle ait subi des altérations chromosomiques. Transformation -------------- La transformation correspond à une conversion maligne des cellules, souvent liée à l'action d'un oncogène (gène favorisant le développement d'un cancer). ##### Mécanisme de la transformation ***Facteurs inducteurs*** - Oncogènes viraux Exemple : le virus SV40 produisant un antigène T transformant les cellules en cellules immortelles. - Résultat : Les cellules transformées expriment des gènes oncogènes et deviennent une lignée transformée. ***Conséquences de la transformation*** - Immortalisation : La transformation induit nécessairement l'immortalisation de la cellule. - Comportement tumoral : Les cellules transformées injectées dans une souris *Nude* (modèle immunodéficient) provoquent le développement d'une tumeur *in vivo*. ***Origine de la transformation*** Spontanée - Certaines cellules cultivées *in vitro* proviennent de tumeurs *in vivo*. *Exemple : lignée HeLa issue d'un carcinome utérin de Henrietta Lacks.* Induite Par exposition à un oncogène ou des agents transformants. []{#_Toc188709749.anchor} Les culture Cellulaire ---------------------- Aujourd'hui la majorité des tissus humains et animaux peuvent être cultivés en laboratoire, assurant leur maintien et leur prolifération. ##### Origine des Cellules Cultivées Les cellules cultivées proviennent des trois feuillets embryonnaires : endoderme, mésoderme et ectoderme. - Endoderme : exemple des cellules intestinales. - Mésoderme : exemple des tissus conjonctif, cartilage, os, muscle et éléments sanguins. - Ectoderme : exemple Kératinocytes (épiderme) et cellules nerveuses (plus complexes à cultiver). Bien que les cellules de ces trois origines soient cultivables, leur complexité varie selon leur fonction et leur organisation. **Cultures Primaires** Les **cultures primaires** correspondent aux premières cellules mises en culture, directement isolées à partir d'un organe ou d'un tissu, appelé **explant**. Ces cultures sont couramment utilisées en laboratoire, par exemple pour l'étude des **kératinocytes humains**. **Procédé de mise en culture primaire** 1. **Dissociation des cellules** : - Les cellules sont séparées à l'aide d'enzymes protéolytiques, comme la **collagénase** ou la **trypsine**, qui digèrent la **matrice extracellulaire (MEC)** et libèrent les cellules. - Une méthode alternative, mais peu utilisée, consiste à employer un microscope équipé d'un laser pour dissocier les îlots cellulaires. 2. **Mise en culture** : - Les cellules dissociées sont placées **in vitro** pour la première fois, sur un support en plastique ou en verre, dans un milieu de culture adapté (**repiquage 0**). - Ce support est indispensable pour permettre aux cellules de s'organiser en tissu. La majorité des cultures sont effectuées dans des boîtes ou flasques en plastique. **Exception** : Certaines cellules, comme les cellules sanguines, ne s'organisent pas en tissu. Elles sont cultivées en **suspension**, car elles n'adhèrent pas au support. **Types de cellules dans les cultures primaires** - **Cellules adhérentes** : Elles nécessitent un support pour survivre et s'organiser en monocouche. - **Cellules en suspension** : Elles ne nécessitent pas de support et restent en suspension dans le milieu. **Caractéristiques des cultures primaires** - **Diploïdie** : Les cellules sont diploïdes (2n) et conservent le même génotype que dans l'organisme d'origine. - **Fonctions spécifiques** : Elles maintiennent les fonctions caractéristiques de leur tissu ou organe d'origine. - **Durée de survie limitée** : Dans la majorité des cas, les cultures primaires ne se multiplient pas indéfiniment. Certaines peuvent proliférer temporairement, mais cette période est courte. - **Dépendance à l'adhérence** : - Les cellules doivent s'attacher à un substrat pour survivre. Si elles ne s'adhèrent pas, elles déclenchent un processus d'**apoptose** (mort cellulaire programmée). - Les propriétés du plastique utilisé peuvent influencer l'adhérence des cellules (certains types de plastiques peuvent agir comme des perturbateurs hormonaux). - **Inhibition de contact** : Les cellules adhérentes se développent jusqu'à couvrir la surface disponible en formant une monocouche. Une fois cette surface saturée, l'**inhibition de contact** empêche leur prolifération. Si elles manquent d'espace, elles se détachent et meurent. Pour prolonger la culture, il est possible de les réensemencer. - **Caractère non malin** : Les cellules issues de tissus sains restent non malignes. Cependant, celles provenant de tissus cancéreux peuvent présenter un caractère malin. **Étapes de préparation des cultures primaires** 1. Réaliser une **dissection stérile** de l'organe ou du tissu. 2. **Désagréger le tissu** en utilisant des enzymes (comme la trypsine ou la collagénase). 3. **Laver la suspension cellulaire** dans le milieu de culture pour éliminer les résidus enzymatiques. 4. **Mettre en culture** les cellules, avec une sélection éventuelle d'un type cellulaire spécifique. **Applications des cultures primaires** Les cultures primaires sont utilisées pour des études en : - **Biochimie**, **pharmacologie**, **toxicologie**, **parasitologie**, et **virologie**. - Elles reflètent de manière fiable les processus biologiques **in vivo**. **Morphologie des cellules en culture** - **Kératinocytes** : Forme **hexagonale**. - **Fibroblastes** : Forme **allongée**. - **Neurones** : Aspect **étoilé**. **Lignées Cellulaires** Les **lignées cellulaires** désignent des populations homogènes et stables de cellules capables, en théorie, de se diviser indéfiniment (si elles sont immortelles). Elles sont caractérisées par leur capacité à être maintenues en culture sur une longue durée grâce à des **repiquages** successifs. Un **repiquage** consiste à transférer les cellules d'un récipient rempli vers un nouveau récipient. Ce processus inclut : 1. Décoller les cellules adhérentes. 2. Les diluer dans un milieu approprié. 3. Redistribuer les cellules dans de nouveaux flacons.\ Chaque repiquage correspond à un **passage** (exemple : passage 1, passage 2, etc.). Ce procédé est répété à mesure que les flacons atteignent leur capacité maximale. **A. Lignées Diploïdes ou Semi-Continues (Cultures Secondaires)** Les **lignées semi-continues**, également appelées **cultures secondaires**, sont dérivées de cultures primaires via des repiquages. Ces lignées peuvent être **achetées** auprès de fournisseurs spécialisés ou créées directement au laboratoire. Elles partagent plusieurs caractéristiques des cultures primaires, notamment : - **Diploïdie** : Les cellules conservent leur caryotype d'origine (2n). - **Propriétés fonctionnelles** : Elles expriment les fonctions spécifiques du tissu d'origine, bien que ces propriétés s'estompent avec le temps. À ces caractéristiques s'ajoutent : 1. **Multiplication cellulaire** : - Les lignées semi-continues ont une forte capacité de prolifération, permettant jusqu'à **50 à 60 générations cellulaires** (ou repiquages). Une cellule en produit deux, qui en produisent quatre, et ainsi de suite. 2. **Sénescence progressive** : - Après de nombreux repiquages, les cellules perdent progressivement leurs propriétés fonctionnelles. - Cette dégénérescence entraîne une perte des caractéristiques spécifiques à l'organisme d'origine et conduit finalement à une mort cellulaire par **apoptose**. - Les cellules deviennent de moins en moins représentatives de l'organisme à mesure qu'elles approchent la sénescence, c'est pourquoi elles sont étudiées **le plus tôt possible**, après un faible nombre de passages. **Note** : Lorsqu'une culture primaire (polymorphe) est repiquée pour ne conserver qu'une seule cellule, le processus est appelé **clonage**. Cela permet d'obtenir une population homogène dérivée de cette cellule unique. **Cellules Maintenues en Culture** Les lignées cellulaires peuvent inclure : - **Cellules immortalisées ou transformées** : Capables de se diviser indéfiniment sous certaines conditions. - **Cellules cancéreuses** : Issues de tumeurs, elles sont déjà immortalisées naturellement. - **Cellules souches** : Lorsqu'une seule cellule souche est isolée pour créer une culture, on parle également de **clonage**. Les lignées cellulaires, notamment les lignées semi-continues, sont des outils essentiels pour la recherche, permettant d'étudier des processus biologiques sur une période prolongée tout en assurant une certaine homogénéité cellulaire. **Culture Secondaire et Sénescence** **A. Culture Secondaire et Sénescence** La culture secondaire est obtenue par repiquage de cellules issues de cultures primaires, dans un milieu adapté à leur survie et prolifération. **Exemple : Fibroblastes humains** - Les fibroblastes humains peuvent être repiqués jusqu\'à **50 fois** avant d'atteindre leur limite de prolifération. - Si l\'on représente le nombre de cellules en fonction des repiquages sur une échelle logarithmique : - **Phase initiale (point 0)** : Les cultures primaires montrent d\'abord une légère diminution du nombre de cellules (adaptation au milieu). - **Phase de prolifération exponentielle** : Une fois les cellules adaptées, leur multiplication s'accélère de manière exponentielle. - **Point d'inflexion** : Vers le 12ᵉ repiquage, la prolifération ralentit en raison de l'apparition de la **sénescence**. - **Phase de sénescence** : L'équilibre entre division et mort cellulaire bascule en faveur de la mort cellulaire. **Variabilité selon le type cellulaire** : - Les fibroblastes humains montrent une prolifération relativement longue (jusqu'à 50 générations). - Les hépatocytes, en revanche, dégénèrent rapidement après quelques repiquages. **B. Lignées Cellulaires Continues** Les **lignées continues** sont des lignées cellulaires immortelles qui peuvent être cultivées indéfiniment. Ces lignées sont généralement fournies par des laboratoires industriels spécialisés. **a. Origine et caractéristiques** Elles proviennent de **cultures secondaires** ayant subi des processus de **transformation** ou **immortalisation**. **Transformations possibles** : 1. **Chromosomiques** : - Présence d'aberrations chromosomiques telles que **aneuploïdie** ou **hétéroploïdie**. - Exemple : **Lignée Vero** (rein de singe vert), caractérisée par des anomalies chromosomiques. 2. **Morphologiques** : - Les cellules prennent un aspect arrondi ou épithélioïde. 3. **Physiologiques** : - Les cellules acquièrent un caractère tumoral induit, leur permettant une prolifération infinie. - **Multiplication illimitée** : Ces lignées peuvent être repiquées indéfiniment. **Propriétés tumorales** : - Les cellules transformées perdent l'**inhibition de contact**, ce qui permet la formation de multicouches cellulaires (non observées dans les cultures normales). - Les cellules deviennent moins dépendantes du support (plastique ou verre) et peuvent se multiplier les unes sur les autres. **Exemple** : - Si ces cellules sont injectées dans une souris, elles forment une tumeur, illustrant leur caractère tumoral. **b. Cellules issues de tissus tumoraux** Certaines lignées continues proviennent directement de tumeurs, comme : - **HeLa** : Lignée immortelle dérivée d'un carcinome du col de l'utérus. **Différences entre cellules normales et transformées** **Propriété** **Cellules normales** **Cellules transformées** --------------------------- ------------------------------------------------------------------------- -------------------------------------------------- **Multiplication** Limitée (phase de sénescence observable). Illimitée (croissance exponentielle continue). **Inhibition de contact** Présente : cellules arrêtent de se diviser une fois la surface occupée. Absente : formation de multicouches possible. **Adhérence au support** Forte dépendance à l'adhérence. Faible dépendance ou absence totale d'adhérence. **Caractère tumoral** Non tumoral (sauf pour cellules tumorales primaires). Tumoral : induction de tumeurs in vivo. Les lignées cellulaires continues sont essentielles pour des études biologiques à long terme, car elles permettent de surmonter la limitation imposée par la sénescence des cultures secondaires. **Conservation des Cellules et Conditions de Culture Cellulaire**  **Conservation des Cellules** La conservation des cellules est essentielle pour prolonger leur viabilité et constituer un stock utilisable à long terme. **Pourquoi conserver les cellules ?** 1. **Durée de vie limitée** : Certaines cultures ne survivent que sur une courte période. 2. **Nombre de repiquages limité** : Les cellules perdent en fonctionnalité au fil des repiquages. 3. **Prévention des pertes** : En cas de contamination par des virus ou bactéries, il faut disposer d'un stock de secours. 4. **Création d'une banque cellulaire stable** : Les cellules peuvent être conservées jusqu'à 30 ans grâce à la cryoconservation (exemple : Master Cell Bank). **Cryoconservation : La méthode universelle** Cette technique est adaptée à tous les types de cellules, qu'elles soient primaires, secondaires ou immortalisées. - **Banque de cellules** : Conservation en grandes quantités pour des besoins de recherche ou de production. - **Cryoconservateurs** : - Glycérol ou DMSO (10%) sont utilisés pour protéger les cellules. - Ces agents empêchent la formation de cristaux de glace intracellulaires, responsables de l'éclatement des membranes cellulaires. - **Procédure de congélation** : - **Congélation lente** : - Refroidissement progressif pour éviter la congélation massive. - Le cryoconservateur remplace l'eau intracellulaire pour éviter la cristallisation interne. - Formation de cristaux extracellulaires grâce à un **efflux liquidien** équilibrant la pression osmotique. - **Stockage** : - Conservation dans de l'azote liquide à -196°C. - **Décongélation rapide** : - Passage immédiat de l'azote liquide à un bain-marie à 37°C. - Une décongélation trop lente pourrait entraîner des dommages cellulaires. **Conditions de Culture Cellulaire** Pour reproduire un environnement similaire à celui in vivo, les cellules sont cultivées dans des milieux de culture adaptés. **1. Milieux de culture synthétiques** Ces milieux, comme le **MEM** (Minimum Essential Medium), le **DMEM** ou le **RPMI**, sont conçus pour fournir aux cellules les éléments essentiels nécessaires à leur survie et prolifération. - **Acides aminés** : - Essentiels : Isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, tryptophane, valine. - Autres : Glutamine (nécessite un renouvellement fréquent), tyrosine, cystéine, arginine, histidine. - **Glucose** : - Source principale de carbone et d'énergie (\~1 g/L). - **Vitamines** : - Exemples : Acide folique, acide nicotinique, choline, inositol, riboflavine. - Les besoins en vitamines varient selon les cellules. - **Ions inorganiques** : - Sodium (Na⁺), potassium (K⁺), phosphates (PO₄²⁻), magnésium (Mg²⁺), calcium (Ca²⁺), chlorures (Cl⁻), bicarbonates (HCO₃⁻). - Maintiennent un environnement iso-osmotique et l'équilibre électrolytique. - **Régulation du pH** : - Le bicarbonate (HCO₃⁻) joue un rôle clé en association avec le CO₂ atmosphérique (environ 5% dans les incubateurs). - Le **couple tampon HCO₃⁻/CO₂** stabilise le pH à environ 7,4 malgré l'acidification du milieu par les déchets cellulaires. - **Colorants de contrôle** : - Les milieux contiennent des colorants comme le **rouge de phénol** pour indiquer le pH. - Exemple : Une couleur jaune indique un milieu trop acide, nécessitant un ajustement des conditions de culture. **2. Points techniques supplémentaires** - D'autres systèmes tampons comme **HEPES** peuvent être utilisés pour stabiliser le pH. - Les milieux de culture pour cellules eucaryotes sont plus complexes que ceux des cellules procaryotes, car ils doivent reproduire des conditions physiologiques proches de celles in vivo. Grâce à des techniques comme la cryoconservation et des milieux de culture adaptés, il est possible de garantir la survie et la fonctionnalité des cellules dans un cadre de recherche ou de production. **Milieux de Culture Cellulaire : Additifs et Entretien** **2. Additifs aux Milieux de Culture** En complément des milieux commercialisés, des additifs spécifiques sont souvent ajoutés pour répondre aux besoins des cellules : - **Protéines de transport** : Albumine, transferrine. - **Hormones** : Insuline, IGF (Insulin Growth Factor). - **Facteurs de croissance** : EGF (Epidermal Growth Factor), interleukines (IL), interférons (INF). - **Facteurs d'attachement** : Collagène, facilitant l'adhésion des cellules au support. - **Antioxydants** : Vitamines E et C, mercaptoéthanol, limitant le stress oxydatif, nuisible aux cellules. - **Substances lipidiques** : Précurseurs de prostaglandines et acides gras pour l'assemblage des membranes. - **Antibiotiques** : - Souvent utilisés à titre préventif, comme la pénicilline-streptomycine. - Attention : ralentissent la division cellulaire et sont proscrits dans les cultures destinées à une réinjection chez des patients (conditions aseptiques requises). - **Indicateurs de pH** : Le rouge de phénol, qui vire entre 7,2 et 7,6. - Rouge orangé : pH optimal. - Jaune : milieu trop acide. - Violet : milieu trop alcalin. - **Sérum** : Présent dans 90% des cultures. - Types : Sérum de veau fœtal (SVF) ou sérum humain, ajouté en proportions de 5 à 10%. **3. Sérum dans le Milieu de Culture** Le sérum apporte plusieurs avantages mais présente aussi des limites. **Avantages :** - **Richesse en éléments essentiels** : - Facteurs de croissance (mitogènes), hormones, oligo-éléments, facteurs d'attachement. - **Protection** : Neutralise les toxines et inhibe les protéases (exemple : la trypsine). - **Rôle tampon** : Retarde l'acidification du milieu, stabilisant ainsi les conditions de culture. **Inconvénients :** - **Variabilité de composition** : Nécessité de tester plusieurs lots pour trouver un sérum adapté. - **Composants inconnus** : Risques d'interférences biologiques ou contamination par des virus/toxines. - **Innocuité incertaine** : Vérification des tests microbiologiques fournie par l'industriel nécessaire. - **Approvisionnement fluctuant** : Variabilité des prix et disponibilité. - **Alternative coûteuse** : Les milieux définis sans sérum sont précis mais très chers. **4. Rôles des Milieux de Culture** Les milieux de culture sont conçus pour : 1. **Fournir les nutriments nécessaires** à la croissance, à la production de molécules et au maintien des fonctions cellulaires spécifiques. 2. **Gérer les déchets métaboliques** : Complexer des sous-produits tels que le lactate, l'ammonium (NH₄) et le CO₂ pour éviter leur accumulation nocive. 3. **Reproduire l'environnement naturel** des cellules. **5. Échanges Gazeux** - **Oxygène (O₂)** : Introduit sous forme d'air pour les besoins métaboliques. - **Dioxyde de carbone (CO₂)** : Régulé dans un incubateur (5-10%) pour stabiliser le pH grâce au couple tampon bicarbonate/CO₂. **6. Température de Culture** La température optimale pour les cellules de mammifères est de **37°C**, simulant celle du corps humain. **Entretien d\'une Culture Cellulaire** **1. Cultures Primaires** Les cultures primaires nécessitent un entretien simple, sans repiquage fréquent, car leur prolifération est limitée. - **Durée de culture** : Correspond au temps de survie des cellules ou à l'expression de leurs fonctions spécifiques. - **Procédure d'entretien** : - Remplacement rapide du milieu usagé par un milieu frais. - Attention : Ne pas laisser les cellules sans milieu pour éviter leur dessèchement. **Lignées Cellulaires et Matériel de Culture** **1. Lignées Cellulaires** - **Pour les cellules adhérentes** (exemple : kératinocytes) cultivées sur un support, deux étapes sont nécessaires : 1. **Décollage par trypsination** : Utilisation de trypsine pour détacher les cellules du support. 2. **Réensemencement après dilution** : Les cellules sont diluées et repiquées sur un nouveau support. Cela est réalisé lorsque : 1. **Confluence cellulaire** : Les cellules ont entièrement recouvert le support, formant un tapis uniforme (inhibition de contact). 2. **Épuisement du milieu** : Si le milieu devient acide, un simple changement de milieu peut être effectué. - **Pour les cellules en suspension** : 1. Le repiquage est effectué par dilution dans un milieu neuf, sans nécessiter l'utilisation de trypsine. 3. **Matériel de Culture**  - **Flacons de culture** : - Posés à plat, stériles à l'intérieur, et identifiés par leur surface d'adhérence. - Équipés de bouchons ventilés percés d'une membrane filtrante (porosité de 0,2 µm), permettant des échanges gazeux stériles tout en empêchant le passage des bactéries. - Empilables pour optimiser l'espace. - **Plaques à micropuits** : - Destinées à la culture de cellules dans des puits de 0,4 cm de diamètre. - **Boîtes de Pétri** : - Stériles et contenant un liquide nutritif. - **Microscope inversé** : - Conçu pour observer les cellules sans condensation, avec des objectifs situés sous la platine et une lumière provenant du haut. - **Incubateur à CO₂** : - Maintient un environnement à 37°C avec une atmosphère contenant 5% de CO₂ et une humidité contrôlée. - **Poste de Sécurité Microbiologique (PSM)** : - Utilisé dans une salle stérile pour minimiser la contamination. Il comprend : - Une paillasse en inox (parfois perforée). - Grilles d'aspiration et un ventilateur. - Un écran transparent. - Deux filtres HEPA pour retenir les particules \> 0,3 µm et redistribuer l'air filtré (65% d'air stérile dans l'enceinte, 35% dans l'atmosphère). **3. Entretien des Cultures Cellulaires** Les étapes clés pour entretenir une culture cellulaire sont les suivantes : 1. **Élimination du milieu ancien** : Retirer le milieu épuisé. 2. **Rinçage avec un tampon sans calcium** : Nettoyer les cellules. 3. **Ajout de trypsine** : Décoller les cellules adhérentes. 4. **Observation au microscope** : Surveiller l'action de la trypsine. 5. **Inactivation de la trypsine** : Ajouter un milieu complet contenant du sérum de veau fœtal (SVF). 6. **Dispersion des cellules** : Réaliser plusieurs aspirations/refoulements pour homogénéiser la suspension. 7. **Prélèvement pour comptage** : Évaluer la concentration et la viabilité des cellules. - **Comptage cellulaire** : - Utilisation d'un colorant vital, comme le **bleu de Trypan**, qui colore uniquement les cellules mortes. - Réalisé avec une lame de comptage type Malassez (Kovaslide). **Systèmes et Modèles de Culture** La culture en masse repose sur deux principes clés utilisés en (bio)fermenteurs pour la biofermentation industrielle : 1. **Extensification** : - Augmenter le volume des cultures pour produire davantage de cellules. 2. **Intensification** : - Augmenter la densité cellulaire par unité de volume pour maximiser la production.