TEMA 2 PDF - Curso de Especialización Cultivos Celulares

CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Unidad 2.- -BUENAS PRÁCTICAS EN LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES 0. Introducción 1. Buenas prácticas en los cultivos celulares 1.1. Buenas prácticas de laboratorio 1.2. Normas de T...

CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Unidad 2.- -BUENAS PRÁCTICAS EN LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES 0. Introducción 1. Buenas prácticas en los cultivos celulares 1.1. Buenas prácticas de laboratorio 1.2. Normas de Trabajo en un laboratorio de Cultivos Celulares 1.3 Niveles de bioseguridad biológica 1.4. Asepsia 1.5. Equipos de protección individual 2. Contaminación 3. Gestión de residuos: químicos y biológicos 1 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES 0. INTRODUCCIÓN Actualmente los cultivos celulares son ampliamente utilizados en la industria de la biotecnología para la producción de vacunas, enzimas, anticuerpos monoclonales, proteínas, etc. También son útiles en distintas disciplinas de la investigación biomédica como: citología, virología, inmunología, investigación sobre el cáncer, embriología, estudios cromosómicos y tratamientos médicos entre los que cabe destacar el mantenimiento y producción de tejidos para trasplantes. Desde el punto de vista preventivo, los cultivos celulares son considerados agentes biológicos según la definición recogida en el Artículo 2 del Real Decreto 664/1997,de 12 de mayo, sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo, en la que se considera: “Agentes biológicos: microorganismos, con inclusión de los genéticamente modificados, cultivos celulares y endoparásitos humanos, susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad”. “Cultivo celular: el resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas de organismos multicelulares”. Por lo que, en las actividades que implican la utilización o manipulación de estos cultivos se deberán adoptar medidas para proteger la salud y seguridad del trabajador y del medio ambiente. Estas medidas se decidirán a partir de una exhaustiva evaluación de riesgos. 1. BUENAS PRÁCTICAS EN LOS CULTIVOS CELULARES Es importante definir normas o reglas de trabajo en los laboratorios de cultivos celulares a fin de evitar riesgos o peligros y contaminación de los cultivos. Se le considera peligroso a las fuentes de daño potencial o situación que potencialmente puede causar daño, mientras que se habla de riesgo cuando se refiere a la combinación de la probabilidad de ocurrencia de daño y la severidad del daño. Es importante analizar los peligros y riesgos con el objetivo de disminuirlos. La seguridad se debe garantizar en todo momento. El TRABAJO EN UN LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR, ACTIVIDADES Y MANIPULACIÓN DEL CULTIVO. En esquema, en un laboratorio de cultivo celular se realizan las siguientes actividades: a) Preparación de medios de cultivo, b) Esterilización de medios y reactivos, c) Lavado, esterilización y preparación del material, d) Mantenimiento y uso del aparataje del laboratorio (cabina de seguridad biológica, incubadores, centrífugas, microscopios, dispositivos de pipeteo, etc.), e) Cultivo celular y la manipulación del mismo. 2 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas complejas, en el interior de aparatos que mantienen las condiciones físico- químicas adecuadas para el cultivo (incubadores) y sobre soportes o recipientes que los contienen y aíslan del exterior (placas Petri, matraces, etc.). Por lo que se considera que el medio de cultivo está formado por cuatro elementos: a) La naturaleza del sustrato o fase en la que crecen las células. b) Las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio, c) La naturaleza y composición de la fase gaseosa, d) Las condiciones de incubación, especialmente de humedad y temperatura. En la manipulación de cultivos celulares se realizan generalmente las siguientes tareas: 1) Disgregación celular para obtener células en suspensión, que puede realizarse por métodos químicos, enzimáticos o mecánicos o por combinación de dos o tres de estos métodos. Como ejemplos, la tripsinización (la tripsina digiere las proteínas responsables de la adhesión celular al sustrato, así las células adheridas al sustrato pasan a estar en suspensión) o el pipeteo repetido o el barrido/arañado de la superficie de cultivo. 2) Siembra mediante suspensión o depósito de las células en el medio de cultivo. 3) Congelación (para la conservación de las líneas celulares) y descongelación del cultivo 4) Modificación genética de las células, mediante distintos métodos: infección con virus, etc. 5) Cambios de medio de cultivo para reponer nutrientes y eliminar productos de desecho que frenen el crecimiento o produzcan la senescencia o la muerte celular. 6) Diluciones de la densidad celular del cultivo para evitar la confluencia o inhibición del crecimiento celular por contacto. 7) Pase de células a otras placas (replaqueo) para la propagación o expansión de la línea celular, 8) Centrifugación para separar las células del medio de cultivo, tinción celular para distinguir entre células vivas y muertas. 9) Observación al microscopio, para recuento y control morfológico. 10) Recuento celular. - PRINCIPALES RIESGOS BIOLÓGICOS Los cultivos celulares no contaminados generalmente no presentan un riesgo significativo y la posible inoculación dérmica origina sólo una inflamación local. Sin embargo, estos cultivos pueden contribuir sustancialmente al riesgo de exposición a otros agentes biológicos, ya que pueden actuar como base o ayudar a la supervivencia o a la replicación de agentes oportunistas. Los agentes contaminantes accidentales, probablemente constituyen el principal riesgo asociado a la manipulación de cultivos celulares, ya que a menudo son difíciles de detectar. Los principales contaminantes son: bacterias, hongos, parásitos, micoplasmas, virus y priones. Esta contaminación puede provenir de la fuente (tejido o células origen del cultivo) o bien producirse en el proceso de manipulación del cultivo, por el empleo de reactivos biológicos contaminados o de material contaminado o por el ambiente de trabajo. 3 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades CDC, (Centers for Diseases Control and Prevention) indican que los peligros potenciales asociados a los cultivos de células o tejidos humanos incluyen entre otros los patógenos trasmitidos por sangre como el virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y agentes tales como Mycobacterium tuberculosis que puede estar presente en tejidos pulmonares humanos. Estos centros han informado de varios casos de infección en personal de laboratorio que manipulaba cultivos celulares primarios de primates. Los cultivos de células humanas y de primates pueden contener virus de la hepatitis B y C (VHB y VHC), virusde las leucemias humanas (VLHT), herpesvirus (Virus de Epstein- Barr, Cytomegalovirus, virus del herpes simplex tipos 1 y 2), retrovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). La contaminación por parásitos intracelulares puede resultar un aspecto a tomar en consideración cuando se manejan cultivos celulares primarios en sus primeras etapas procedentes de donantes sobre los que se sabe o sospecha que están infectados. Algunos ejemplos serían: Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Lehismania sp. etc. También las células carcinogénicas son fuente de riesgo como resultado de la auto-inoculación accidental del trabajador. - EVALUACIÓN DE RIESGOS La evaluación de riesgos en la manipulación de los cultivos celulares de origen humano o animal se basa tanto en las propiedades intrínsecas del cultivo celular, incluidas las propiedades posteriores adquiridas como consecuencia de una modificación genética, como en la posibilidad de que el cultivo celular pueda estar deliberadamente o inadvertidamente contaminado por agentes patógenos. Esta información permitirá determinar el nivel de riesgo asociado al cultivo celular. La evaluación de riesgos debe tener también en cuenta las condiciones de trabajo. Propiedades intrínsecas del cultivo celular Las propiedades intrínsecas de los cultivos celulares que se deben considerar en la evaluación de riesgos son: 1) La fuente (especie origen de las células). 2) El tipo de células o el tejido de procedencia 3) El tipo de cultivo. Los cultivos celulares de mayor riesgo son los que proceden de humanos y de primates, especialmente si derivan de sangre periférica, tejido linfoide y nervioso. En ningún caso el trabajador que realice los cultivos celulares podrá utilizar sus propias células para el desarrollo in vitro. Las células humanas para cultivo deberán obtenerse solamente de individuos que no tengan relación con el trabajo experimental. 4 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Propiedades adquiridas como resultado de la modificación genética En el caso de modificaciones genéticas hay que tener en cuenta, que las células recombinantes pueden haber aumentado o disminuido su capacidad de causar daño a la salud humana y el medio ambiente en comparación con sus equivalentes no recombinantes. El primer paso en el proceso de evaluación debe consistir en identificar las propiedades nocivas del organismo receptor (célula huésped) y, en su caso, del donante, así como cualquier propiedad nociva relacionada con el vector o con el material introducido, incluidas las alteraciones de las propiedades iniciales del receptor. Propiedades adquiridas como resultado de una infección con agentes patógenos En el caso de cultivos celulares deliberadamente o inadvertidamente contaminados por agentes patógenos, la evaluación de los riesgos potenciales del cultivo celular contaminado o infectado por el patógeno requiere un examen de las propiedades intrínsecas del patógeno. El riesgo biológico del cultivo celular infectado dependerá del riesgo biológico del patógeno, según la clasificación en grupos de riesgos de los agentes biológicos establecida. La Directiva 90/679/CEE sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos, en el artículo 2 y establece la clasificación de los agentes biológicos en cuatro grupos de riesgo, según su diferente índice de riesgo de infección: ▪ Agente biológico de grupo 1: Agente biológico que resulte poco probable que cause enfermedad en el hombre. ▪ Agente biológico de grupo 2: Agente patógeno que pueda causar una enfermedad en el hombre y pueda suponer un peligro para los trabajadores; existen generalmente profilaxis o tratamientos eficaces. ▪ Agente biológico de grupo 3: Agente patógeno que pueda causar una enfermedad grave en el hombre y presente serio peligro para los trabajadores; existe el riesgo de que se propague a la colectividad pero existen generalmente profilaxis o tratamientos eficaces. ▪ Agente biológico de grupo 4: Agente patógeno que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presente serio peligro para los trabajadores; existen muchas probabilidades de que se propague a la colectividad; no existen generalmente profilaxis o tratamientos eficaces. 5 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Condiciones de trabajo Finalmente, en la evaluación de riesgos hay que tener en cuenta la posibilidad de dispersión del material infeccioso y de exposición del trabajador en función de las características del trabajo como: 1) Procedimientos y técnicas utilizados, 2) Equipos y material que se va a utilizar, 3) Cantidad o concentración del agente infeccioso, etc. Con toda la información recogida se determinará el nivel de bioseguridad necesario para el trabajo en laboratorio con cultivos celulares. 1.1 BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO Las buenas prácticas de laboratorio (BPL) son sistemas de calidad relacionados con los procesos organizativos y las condiciones bajo las cuales los estudios no clínicos de seguridad sanitaria y medioambiental son planificados, realizados, controlados, registrados, archivados e informados. - ORGANIZACIÓN DEL TRABAJO El trabajo en el laboratorio con personal no fijo, estudiantes, doctorandos, investigadores etc., debe estar debidamente jerarquizado, con unas cadenas de responsabilidad claramente definidas. La organización del trabajo en el laboratorio debe permitir que cualquier alteración (trabajo fuera de horas, por la noche, aparatos fuera de servicio, anomalías en el suministro de agua y energía, etc.) sea conocida por todos y permita así la adopción de las medidas oportunas desde el punto de vista de la seguridad (evitar que se trabaje solo, prevenir los cortes de agua y luz, etc.). Otros aspectos, como el control de existencias, el adecuado etiquetaje e identificación de reactivos, la señalización y el mantenimiento adecuado de los equipos de protección individual, extintores, duchas y lavaojos, el orden y limpieza en el laboratorio y en el almacén de reactivos, la formación de socorristas, actuación en emergencias, etc. son una serie de actividades que sólo tendrán lugar con garantías si existe una buena organización y jerarquización en el laboratorio. Aspectos puntuales relacionados con la organización del laboratorio que deben ser tenidos en cuenta son los siguientes: - No debe trabajar nunca una persona sola en el laboratorio y especialmente fuera de horas habituales o en operaciones con riesgo. - De las operaciones con riesgo se debe informar incluso a las personas que no intervengan en las mismas. - Se debe trabajar en las vitrinas siempre que se manipulen productos tóxicos o inflamables y comprobar periódicamente su correcto funcionamiento. - Los reactivos almacenados en el laboratorio deben preservarse del sol, no guardarse en estanterías altas, cuidar su etiquetado y mantenerlos en las cantidades imprescindibles. - Debe regularse adecuadamente la eliminación de residuos. No se debe eliminar por el desagüe, aunque sea en pequeñas cantidades, productos tales como: los que reaccionan violentamente con el agua, muy tóxicos, pestilentes, lacrimógenos, no biodegradables y cancerígenos. 6 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES - HÁBITOS PERSONALES Con respecto a los hábitos personales del trabajador, entendiendo como tales a los inherentes a su comportamiento al margen de los que haya desarrollado para el trabajo, han de observarse las siguientes precauciones: o Mantener en todo momento las batas abrochadas. o No abandonar objetos personales en mesas de trabajo o poyatas. o No comer ni beber en los laboratorios. o No guardar alimentos ni bebidas en los frigoríficos del laboratorio. o No fumar en los laboratorios. o Las batas no deberían llevarse a lugares de uso común: bibliotecas, cafeterías, comedores, etc. o Es recomendable usar gafas de seguridad cuando se manipulen productos químicos o líquidos en ebullición. o No utilizar lentes de contacto en el laboratorio. o No es aconsejable guardar la ropa de calle en el laboratorio. o Lavarse las manos antes de abandonar el laboratorio, al quitarse unos guantes protectores y siempre que se haya estado en contacto con material irritante, cáustico, tóxico o infeccioso. - HABITOS DE TRABAJO Por lo que respecta a los hábitos adquiridos en la época de formación, o bien a lo largo de los años de trabajo en el laboratorio, deben tenerse en cuenta las recomendaciones siguientes: No manipular un producto químico sin conocer sus características físico- químicas y toxicológicas. Deberán conocerse como mínimo los indicadores de peligro (frases H) y los de prudencia (frases P) de los productos, incluidos en la etiqueta del envase. Exigir las fichas de datos de seguridad. Calentar los tubos de ensayo de lado y utilizando pinzas. No llevar tubos de ensayo ni productos en los bolsillos de las batas. Utilizar en todo momento gradillas y soportes. Transportar los productos en bandejas o recipientes para evitar derrames en caso de roturas. No tocar con las manos ni probar los productos químicos. No trabajar separado de la mesa o poyata. No efectuar pipeteos con la boca. Asegurarse del enfriamiento de los materiales antes de aplicar directamente las manos para cogerlos. Utilizar la vitrina siempre que sea Al terminar el trabajo, asegurarse de la desconexión de aparatos, agua, gases, etc. Los mecheros no deberán dejarse encendidos sin vigilancia. Al finalizar una tarea u operación, recoger materiales, reactivos, equipos, etc., evitando las acumulaciones innecesarias. Usar y almacenar productos inflamables en las cantidades imprescindibles. Respetar posibles incompatibilidades de los productos al almacenarlos: 7 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES - IDENTIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS En cuanto a la identificación de los productos químicos y sus riesgos, es aconsejable: - Comprobar el adecuado etiquetaje de recipientes y botellas. - Etiquetar debidamente las soluciones preparadas en el laboratorio. - No reutilizar envases para otros productos sin quitar la etiqueta original. - No sobreponer etiquetas. - TRASVASES En lo referente a operaciones de trasvase, debe tenerse en cuenta: Trasvasar, siempre que sea posible, cantidades pequeñas de líquidos. En caso contrario, emplear una zona específica para ello. Efectuar los trasvases de sustancias inflamables lejos de focos de calor. Efectuar los trasvases de sustancias tóxicas, irritantes y corrosivas con las prendas de protección adecuadas a los riesgos del producto. Evitar que ocurran vertidos empleando para el trasvase embudos, dosificadores, sifones o bandejas recoge vertidos. - MEDIOS DE PROTECCIÓN Por lo que respecta a los equipos o medios de protección, como mínimo deben seguirse las siguientes pautas: o Tener siempre a disposición las gafas de seguridad. o Conocer y ensayar el funcionamiento de equipos extintores. o Utilizar los guantes adecuados para cada tarea que requiera el uso de tales prendas. o Conocer la protección brindada por los distintos equipos de protección individual para las vías respiratorias. o Mantener en condiciones de uso las duchas de emergencia y lavaojos. o Conocer la aplicación de los productos de primeros auxilios del botiquín y los mecanismos para recibir posibles ayudas exteriores. 1.2 NORMAS DE TRABAJO EN UN LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES Las normas para seguir en el trabajo con cultivos celulares para proteger al trabajador, al medio ambiente y al cultivo son: 1) Proporcionar formación y capacitación al operador o al trabajador en relación a las buenas prácticas microbiológicas, los riesgos y las medidas de prevención, 2) Adoptar el principio de precaución, tratar todos los cultivos que se utilizan por primera vez como potencialmente infecciosos. Trabajar siempre dentro de una cabina de seguridad biológica tipo II (protege a la muestra, al trabajador y al ambiente), hasta que se demuestre que los cultivos están libres de bacterias, virus, micoplasmas u hongos. 8 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES 3) Manipular los cultivos celulares de origen humano o de primates, en general, en un nivel de bioseguridad 2 y en una cabina de seguridad biológica tipo II. 4) Manipular los cultivos celulares procedentes de fuente infectadas mínimo en un nivel de bioseguridad 2, adoptar niveles superiores en función del riesgo del agente patógeno. 5) Identificar de forma adecuada los cultivos y todo el material biológico, obtener siempre los cultivos de centros reconocidos que certifiquen el origen, por ejemplo: la Colección Americana de Cultivos Tipo ATCC, (American Type Culture Collection), la Colección Europea de Cultivos Celulares ECACC, (European Collection of Cell Cultures) o de la Colección Española de Cultivos Tipo CECT, etc. 6) Rechazar cultivos no seguros, poco caracterizados o sin referencia o tratarlos con la precaución adecuada. 7) Trabajar siempre con material estéril (pipetas, matraces, etc.). El material estéril sólo puede abrirse, dentro de una cabina de seguridad biológica. Todo aquello de lo que no se esté seguro al 100% de su esterilidad ha de ser considerado como no estéril. 8) Descontaminar la mesa de trabajo, las cabinas de seguridad biológica y el material reutilizable antes y después de trabajar con material biológico, limpiar inmediatamente cualquier derrame del cultivo, 9) Lavarse las manos antes, después y frecuentemente durante el trabajo con cultivos, para evitar contaminaciones en los experimentos, la contaminación del usuario con material biológico y la posible diseminación de éste. 9 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES 10) Descontaminar por agentes químicos o calor todo el material biológico o contaminado con éste antes de ser eliminado. 11) Si se trabaja con más de una línea celular a la vez, evitar la contaminación cruzada. Limpiar y desinfectar las superficies y útiles de trabajo cada vez que se trabaja con distintas líneas. Manipular en último lugar la línea de mayor proliferación. 12) En caso de cultivos de larga duración, verificar periódicamente las propiedades del cultivo. Llevar a cabo un control de calidad de las células, que demuestre la ausencia de posibles agentes patógenos, 13) Establecer un programa adecuado de almacenamiento de línea celular. 14) Utilizar equipos de protección individual: guantes, mascarillas, gafas, ropa de protección, 15) Implantar programas específicos de vigilancia de la salud del trabajador, siendo recomendable la vacunación contra la hepatitis B, por el riesgo de exposición a patógenos transmitidos por sangre. En resumen, la manipulación de cultivos celulares requiere de instalaciones, equipos y prácticas microbiológicas adecuadas para evitar la contaminación del cultivo, la dispersión de posibles agentes patógenos y para eliminar o reducir al mínimo la exposición del trabajador. 10 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES 1.3 NIVELES DE BIOSEGURIDAD Según el riesgo relativo que entrañan los microorganismos infectantes que se manipulan en el laboratorio, la construcción, el diseño y también los medios de contención el Manual de Bioseguridad de la O.M.S. los clasifica en cuatro categorías: 1.Laboratorio básico. 2.Laboratorio básico con cabina de seguridad biológica u otros dispositivos apropiados de protección personal o contención física. 3.Laboratorio de contención. 4.Laboratorio de contención máxima. Cuando se trate de un agente biológico que no haya sido objeto de una evaluación concluyente para clasificarlo, pero se sospecha que su manipulación puede comportar un riesgo para la salud, las actividades deberán desarrollarse en un lugar de trabajo cuyo confinamiento físico corresponda como mínimo al nivel de contención 3. Nivel de contención biológica 1 Le corresponde el nivel de riesgo I, que indica escaso riesgo individual y comunitario. Se aplicarán las medidas del laboratorio básico. No necesita ningún equipo especial de contención. Nivel de contención biológica 2 Le corresponde el nivel de riesgo II, indicador de riesgo individual moderado y riesgo comunitario limitado. Instalación del laboratorio Cada unidad debe tener un lavabo para el lavado de manos. Éste deberá funcionar preferentemente con el codo o con el pie. Las ventanas estarán herméticamente cerradas. El laboratorio donde se manipulen los agentes biológicos, estará separado del pasillo de circulación por un vestíbulo. Éste servirá a los usuarios para cambiarse la ropa de trabajo, ya que tiene que ser distinta a la habitual. Si el aire del laboratorio es renovado regularmente, el aporte de aire nuevo será como mínimo de 60 m3 por persona y hora. Hay que vigilar que con los movimientos, no haya arrastre de aire del interior hacia el exterior y de esta forma no haya contaminación. Será necesario que haya un autoclave en el mismo laboratorio, para la descontaminación de desechos y de material biológico contaminado. Ha de haber una sala de reposo para el personal. Equipo especial de contención Se utilizarán sólo Cabinas de Seguridad Biológica clase I y clase II. 11 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Técnicas de laboratorio específicas Para la centrifugación de grandes concentraciones y volúmenes de agentes infecciosos, se utilizará una centrífuga herméticamente cerrada (sistema "aerosol free") y tubos de seguridad. El llenado, el cierre y la apertura de los tubos debe efectuarse en Cabinas de Seguridad Biológica. Todas las técnicas que puedan producir aerosoles tales como la centrifugación, la trituración, las mezclas, las agitaciones enérgicas, las disrupciones sónicas, la apertura de envases de materiales infecciosos, cuya presión interna pueda diferir de la presión ambiente, etc., se realizarán en cabinas de seguridad biológica. También se evitará manipulaciones tales como la inserción de asas o agujas calientes en un cultivo, y se utilizarán asas desechables; se evitará también la inyección violenta de fluidos a partir de pipetas o jeringas ya que todas estas técnicas pueden generar aerosoles. El modo de empleo y las limitaciones de las Cabinas de Seguridad Biológica se explicarán a todos los usuarios. Las puertas del laboratorio se mantendrán cerradas durante las manipulaciones. El personal se lavará las manos después de haber manipulado el material biológico, los animales y antes de dejar el laboratorio. Será obligatorio llevar guantes apropiados durante todas las técnicas que comporten un riesgo de contacto accidental directo con el material biológico infeccioso. El responsable del laboratorio deberá establecer las reglas o los procedimientos según las cuales se autorice el acceso al laboratorio. Sólo las personas prevenidas de la naturaleza de los riesgos pueden ser autorizadas a entrar en el local de trabajo. Las personas que sean de alto riesgo para la adquisición de una infección (inmunodeprimidas) o a las que la infección podría ser particularmente perjudicial, no se les autorizará la entrada al laboratorio. El empleo de jeringas y agujas hipodérmicas estará restringido a la inyección parenteral y a la aspiración de líquidos de los animales y de los viales con cápsula perforable, así como a la extracción de fluidos biológicos, debiendo extremar las precauciones en su manejo y eliminación. Por ello se utilizarán agujas y jeringas de un solo uso, no se deberá reencapsular las agujas y se eliminarán directamente en recipientes rígidos, aptos para la esterilización o para la incineración. La señalización internacional de riesgo biológico se colocará en las puertas de acceso al laboratorio. También deben señalizarse los congeladores y refrigeradores utilizados para guardar microorganismos del tipo de riesgo 2 Debe exigirse el uso de vestidos específicos, que no se llevarán fuera del laboratorio. Se recomienda el uso de gafas de seguridad, de máscaras o de otros dispositivos de protección. Los accidentes que puedan llevar a una evidente exposición a los agentes infecciosos deben informarse inmediatamente al responsable del laboratorio. Se preparará y adoptará un manual de seguridad biológica para el laboratorio. Los miembros del personal deben estar prevenidos de los riesgos a los que están expuestos y deben leer las instrucciones sobre las prácticas de laboratorio. La conducta a seguir en caso de accidente estará en lugar bien visible y claramente expuesta en el laboratorio. Nivel de contención biológica 3 Le corresponde el nivel de riesgo III, indicador de riesgo individual elevado y riesgo comunitario escaso. 12 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Instalación del laboratorio El laboratorio, al igual que para el nivel 2 de seguridad biológica, tendrá el acceso separado del pasillo de libre circulación por un pequeño vestíbulo donde el personal se cambiará de ropa por otra específica para el laboratorio, aunque en este caso también es recomendable cambiarse de zapatos. Un sistema de seguridad impedirá que las dos puertas se abran simultáneamente. Debe haber un sistema de ventilación que produzca una presión negativa dentro del laboratorio, de manera que se establezca una corriente de aire que vaya desde el pasillo o el laboratorio básico, hasta la zona de trabajo del laboratorio de contención. El personal debe comprobar que la corriente de aire circula del lugar menos contaminado al más contaminado. El aire expulsado del laboratorio debe pasar a través de filtros HEPA (filtro de alta eficacia para partículas). En ningún caso, este aire puede ser reciclado hacia otra parte del edificio. El aire extraído de las cabinas de seguridad biológica después de pasar a través de los filtros HEPA, será expulsado al exterior del laboratorio. Excepcionalmente podrá ser reciclado, si las cabinas de seguridad biológica de clase I o II son controladas al menos una vez al año por un organismo competente. El aire procedente de cabinas de seguridad biológica de clase III debe expulsarse directamente al exterior. La recirculación del aire dentro del laboratorio sólo se hará después de haberlo filtrado mediante filtros HEPA comprobados y certificados. Las puertas del laboratorio, tendrán cierre automático y con cerradura, aunque desde el interior será de fácil abertura. Es recomendable un interfono para el contacto con el exterior. En este tipo de laboratorio no habrá ni conexión al gas de la red, ni al sistema de vacío centralizado. Equipo especial de contención El laboratorio estará equipado con Cabinas de Seguridad Biológica del tipo I, II o III. Estas se utilizarán para todos los trabajos y actividades que puedan provocar cualquier riesgo de exposición a los aerosoles infecciosos. Si el volumen o la naturaleza de la actividad no permitiera el uso de Cabina de Seguridad Biológica, se estudiarán sistemas de protección según los principios básicos empleados en Higiene y Seguridad. Técnicas de laboratorio específicas En principio, el número de personas presentes en el laboratorio no será nunca superior al de Cabinas de Seguridad Biológica; sin embargo, debe tenerse en cuenta que una persona suplementaria trabajando en la poyata, puede colaborar activamente a mejorar el rendimiento de los que trabajan en las cabinas de seguridad. Hay que aplicar la regla de trabajo en parejas, en virtud de la cual ningún individuo debe trabajar solo en el interior del laboratorio. Todo el material contaminado hay que desinfectarlo antes de salir del laboratorio, sea a través del autoclave o bien por vía química. Hay que prever la desinfección del local. Es importante que cuando se manipulen animales infectados o se abran viales que puedan generar aerosoles fuera de las Cabinas de Seguridad Biológica se emplee un equipo de protección respiratoria. Cualquier accidente con exposición a agentes infecciosos debe ser inmediatamente notificado al responsable del laboratorio y al médico de empresa y servicio de prevención. 13 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES El responsable del laboratorio debe establecer las reglas o los procedimientos según las cuales se autorizará el acceso al laboratorio. Sólo las personas prevenidas de la naturaleza de la investigación y/o que estén vacunadas contra el agente biológico en cuestión, serán autorizadas a entrar en el lugar de trabajo y teniendo en cuenta para ello la opinión del, servicio médico. La lista de las personas autorizadas estará colgada en la puerta de acceso al nivel de contención biológica 3. Nivel de contención biológica 4 Le corresponde el nivel de riesgo IV, indicador de elevado riesgo individual y comunitario. Los laboratorios de contención máxima en funcionamiento deben estar supervisados por las autoridades sanitarias nacionales o de otro tipo. Instalación del laboratorio Antes de construir y poner en funcionamiento un laboratorio de contención máxima se requiere una labor intensiva de consulta con instituciones que hayan adquirido experiencia en la utilización de laboratorios de este tipo. El laboratorio de contención biológica 4 estará situado en un local con acceso limitado y aislado del resto de laboratorios por tabiques. La entrada y la salida del personal se hará a través de vestíbulos de independencia. Al entrar el personal se cambiará completamente de ropa y al salir se duchará antes de ponerse la ropa de calle. Las paredes estarán construidas de forma que el laboratorio sea un recinto cerrado herméticamente que permita la descontaminación por vaporización y que además impida la entrada y la salida indeseada de animales (roedores, insectos, artrópodos, etc.). La superficie de las paredes será de material resistente a los productos químicos y desinfectantes, para facilitar su limpieza y desinfección. El equipamiento del laboratorio tiene que ser robusto, sólido y simple. Los espacios entre mesas, aparatos etc., tienen que ser accesibles y fáciles de limpiar. Las puertas del laboratorio deben cerrarse automáticamente y con cerradura. Las ventanas deben de ser de material irrompible, además de cerrar herméticamente. El suministro de agua tiene que estar protegido, para que no haya ningún retroceso. Si existe un sistema de vacío propio del laboratorio debe utilizarse fuera de la cabina de seguridad biológica. Los líquidos de desecho provenientes de los fregaderos, de las cabinas de seguridad biológica y de los autoclaves, se tienen que descontaminar antes de evacuarlos. Los efluentes procedentes de las duchas y lavabos serán descontaminados, antes de su evacuación, por un tratamiento químico o por calor dentro del sistema de descontaminación de los residuos líquidos. El laboratorio de nivel 4 de seguridad biológica tendrá un sistema de ventilación propio, que lo mantendrá en depresión, mediante un sistema mecánico de entrada y la expulsión de aire a través de filtros HEPA. Sería conveniente un sistema de alarma en caso de un mal funcionamiento. La salida al exterior estará separada de tomas de aire y de lugares habitados. Los filtros HEPA deben tener fácil acceso para su descontaminación y las distintas pruebas y ensayos después de su colocación. El aire que proviene de las cabinas de seguridad biológica puede ser evacuado hacia el exterior por el sistema de ventilación del laboratorio. Hay que tener precaución que en las ramificaciones del sistema de salida no haya interferencias entre las salidas de las cabinas y el sistema de depresión del laboratorio. 14 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Equipo especial de contención El laboratorio que experimente con microorganismos que necesiten el nivel 4 de seguridad biológica, estará equipado con cabinas de seguridad biológica tipo III. También se puede trabajar en cabinas de tipo I y II si el laboratorio está preparado para admitir trabajadores con trajes aislantes con presión positiva. Técnicas de laboratorio específicas En los laboratorios de contención máxima, nivel 4 de contención biológica, la entrada y salida de personal y de los suministros se realizará a través de vestíbulos de independencia, cambiándose de ropa al entrar y ducharse al salir. Las superficies de trabajo serán desinfectadas con un desinfectante apropiado después de cada experiencia e inmediatamente después de cualquier derrame de material con riesgo biológico. Una nota clara y a la vista debe especificar el desinfectante a utilizar, la concentración y el tiempo de contacto. El material biológico que deba salir del laboratorio de nivel 4 de contención biológica, tiene que estar en un embalaje formado por tres capas: un recipiente primario estanco donde se coloca la muestra (a), un recipiente estanco secundario (b) que contiene material absorbente (c) en cantidad suficiente y una envoltura exterior (d) con la adecuada protección (e). Por fuera del recipiente secundario se colocará la información relativa a la muestra y las condiciones de abertura. Esta información se remitirá por separado al receptor y el expedidor se quedará con una copia. No puede salir ningún material del laboratorio de nivel 4 de contención biológica, exceptuando el material biológico que debe mantenerse en estado viable, sin antes haber sido esterilizado o descontaminado. Los muebles o equipos que se puedan estropear a altas temperaturas o con vapor, antes de salir del laboratorio se desinfectarán por inmersión o fumigación. Sólo estarán autorizadas para entrar, las personas que su presencia sea necesaria para la experiencia que se esté realizando. Las personas que tengan un alto riesgo para la adquisición de una infección o las que una infección puede ser altamente perjudicial, no estarán autorizadas para entrar en el local ni tampoco en el animalario. La lista de las personas autorizada para entrar se colocará en la puerta de entrada del laboratorio. El personal sólo podrá entrar y salir únicamente por el vestuario y la ducha de seguridad. Los trabajadores tienen que ducharse cada vez que salgan del laboratorio de máxima contención. El vestíbulo se utilizará solamente como entrada y salida en caso de urgencia. La ropa de la calle de los usuarios se guardará en el vestuario y habrá a su disposición un equipo completo de ropa de laboratorio, incluido zapatos, guantes, etc. Toda persona que entre en el laboratorio de nivel 4 de contención biológica debe cambiarse de ropa. Los vestidos de trabajo deben dejarse en el vestuario en el momento de la salida y antes de entrar en la ducha además éstos no saldrán del vestuario sin antes ser descontaminados. A causa de la gran complejidad del trabajo, habrá que editar un manual detallado de operaciones que se ensayará en el curso de los programas de prácticas. - Medidas de protección 15 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Se reducirá el riesgo de exposición al nivel más bajo posible para garantizar adecuadamente la seguridad y la salud de los trabajadores, por medio de las siguientes medidas: a) Establecimiento de procedimientos de trabajo adecuados y utilización de medidas técnicas apropiadas para evitar o minimizar la liberación de agentes biológicos en el lugar de trabajo. b) Reducción, al mínimo posible, del número de trabajadores que estén o puedan estar expuestos. c) Adopción de medidas seguras para la recepción, manipulación y transporte de los agentes biológicos dentro del lugar de trabajo. d) Adopción de medidas de protección colectiva o, en su defecto, de protección individual, cuando la exposición no pueda evitarse por otros medios, utilizando siempre las medidas de contención adecuadas en función del grupo de riesgo en que el agente biológico haya sido clasificado. Sustitución de los agentes biológicos por otros de menor peligro. Confinamiento de los agentes biológicos, obligatorio en el caso de utilización deliberada de los mismos, utilizando las medidas de contención adecuadas en función del grupo de riesgo en que el agente biológico haya sido clasificado. Aplicación de procedimientos de trabajo que permitan el encerramiento o aislamiento de operaciones potencialmente peligrosas. Extracción localizada, que consigue reducir las concentraciones de contaminantes antes de difundirse en el medio de propagación. Implica la utilización de cabinas de seguridad biológica. La desinfección de los locales, vehículos de transporte, ropa, equipos de protección, que debe realizarse siguiendo un protocolo que asegure la acción específica y eficaz sobre los agentes biológicos. Desinsectación (control y eliminación de insectos y otros artrópodos) y desratización (control de roedores), que tienden a eliminar los vectores, como transportadores de la enfermedad. La realización de estas operaciones, puede ocasionar problemas de salud a los ocupantes de los lugares de trabajo, por lo que dichas operaciones han de efectuarse según procedimientos seguros. Limpieza adecuada, que conduce en muchos casos a una disminución de los niveles de contaminación. Las medidas de protección a nivel individual se basan fundamentalmente en los equipos individuales de protección. Su elección corresponderá a dos criterios: seguridad, es decir, protección adecuada al riesgo específico, y confort. e) Utilización de medios seguros para colectar, almacenar y desechar residuos por parte de los trabajadores, incluido el uso de recipientes seguros e identificables, previo tratamiento adecuado si fuese necesario. f) Utilización de medidas de higiene que eviten o dificulten la dispersión del agente biológico fuera del lugar de trabajo. 16 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES g) Utilización de una señal de peligro biológico así como de otras señales de advertencia. RIESGO DEL TRABAJO CON CULTIVOS Los cultivos celulares no contaminados generalmente no presentan un riesgo significativo, y aun la inoculación dérmica origina sólo una inflamación local. Además, estos cultivo pueden contribuir sustancialmente al riesgo de exposición a agentes biológicos ya que pueden actuar como la base de crecimiento o ayudar a la supervivencia o la replicación de agentes oportunistas, o ser origen de otros riesgos potenciales. Respecto a los cultivos celulares habrá que considerar asimismo tanto su origen anatómico como el de la especie, ya que está directamente relacionado con su potencial infeccioso por virus u otros agentes patógenos en humanos. En ningún caso el trabajador que realice los cultivos celulares podrá utilizar sus propias células para el desarrollo in vitro. Las células humanas para cultivo deberán obtenerse solamente de individuos que no tengan relación con el trabajo experimental. Los cultivos celulares de mayor riesgo son los que proceden de primates y humanos, especialmente si derivan de sangre periférica, tejido linfoide y nervioso. Cuando se sospeche la infección del cultivo celular por un agente patógeno para el hombre, dichos cultivos deberán ser manejados en un nivel de contención adecuado al agente en cuestión. La elección del nivel de contención, según el origen del cultivo celular, se muestra en la siguiente tabla: 17 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES RIESGOS EN LOS PROCEDIMIENTOS DE CULTIVOS CELULARES En la manipulación de cultivos celulares deberán minimizarse todas las tareas que contribuyan a la formación de aerosoles o salpicaduras: trasvases, derrames, pipeteos continuados y rápidos. Las agujas no deberán utilizarse si existe una alternativa razonable. Como en todo trabajo con material infeccioso o potencialmente infeccioso, deberán utilizarse cabinas de seguridad biológica, las cuales estarán correctamente instaladas y regularmente mantenidas y comprobadas. Algunos productos celulares pueden ser alergénicos por lo que en estos casos se requerirán unos estrictos niveles de contención primaria y/o protección personal de los trabajadores para prevenir la inhalación o el contacto con las mucosas. Contención Como se indica en la tabla, cuando hay evidencia o sospecha de la presencia de patógenos (por ejemplo: Herpes virus simiae en tejidos de simios o VIH en células blancas de sangre periférica), los cultivos celulares se manipularán en el nivel de contención requerido para el patógeno en cuestión. Todos los procedimientos implicados en la propagación y manipulación de cultivos celulares que estén contaminados deberían llevarse a cabo como mínimo en el nivel de contención 2. 1.4 ASEPSIA La técnica aséptica ayudar a eliminar la contaminación mediante el establecimiento de un código de práctica estricto, asegurándose de que todos utilicen las instalaciones siguiendo los protocolos establecidos. La contaminación por microorganismos es un problema muy importante en los cultivos celulares. Pueden ser como ya veremos por bacterias, esporas fúngicas, levaduras y micoplasma… Definiciones importantes Asepsia: sin infección o contaminación. Ausencia absoluta de gérmenes. Conjunto de procedimientos o maniobras para evitar la contaminación. Exclusión continua de microorganismos contaminantes. Esterilización: conjunto de procedimientos que destruyen los gérmenes, impiden su desarrollo y evitan contaminación. Eliminación de toda forma de vida de un material o medio. Desinfección: conjunto de procedimientos para destruir o eliminar agentes contaminantes de todo lo que no pueda esterilizarse (mobiliario). Destrucción de cualquier organismo vivo que pueda causar daño particular o infección. Antisepsia: maniobras que se aplican a la piel, mucosas y manos del personal, el cual debe usar guantes. ¿Cómo evitar la contaminación masiva? 18 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Revisar cuidadosamente los cultivos visualmente y al microscopio invertido Mantener los cultivos libres de antibióticos para poder evidenciar contaminaciones ocultas. Verificar la esterilidad de los reactivos antes de usarlos. No compartir medios o reactivos con otros usuarios. No usar los frascos de medio u otro reactivo para diferentes líneas celulares. Técnica aséptica Combinación de procedimientos diseñados para reducir la probabilidad de infección. Las causas de contaminación son multifactoriales y las soluciones no son simples ni obvias. En esos casos hay que continuar con los cuidados, así será más fácil identificar la fuente de contaminación. Elementos del ambiente aséptico Área tranquila Si no se tiene una campana de flujo laminar, se necesita un cuarto estéril o por lo menos un espacio tranquilo con poco movimiento de personal. Si se tiene flujo laminar, debe estar libre de corrientes de aire de puertas y ventanas. No debe tener cerca equipo que genere corrientes de aire, como centrífugas, refrigeradores, congeladores. Superficie de trabajo La superficie de trabajo debe estar limpia y ordenada. Hay que limpiarla con alcohol al 70%. Sólo colocar en la mesa el material para utilizar en el procedimiento. Tener una superficie de trabajo al centro, libre de equipos y cosas que puedan contaminar. Si algo se derrama, hay que limpiarlo inmediatamente con alcohol. Higiene personal Las manos deben lavarse frecuentemente. Usar guantes quirúrgicos cuando haya riesgo o peligro. De acuerdo a la Food and Drug Administration (FDA), para Good manufacturing Practices (GMP) es necesario usar gorro, cubrebocas y ropa quirúrgica. No es necesario si se tiene campana de flujo laminar, pero se debe usar bata y recoger el cabello. Reactivos y medio Limpiar las superficies externas con alcohol. Hay que quitar las envolturas antes de colocar los frascos en la campana. Cultivos Si vienen de otros laboratorios hay un alto riesgo de que estén contaminados ya sea por su fuente o por el tránsito. Pasos para reducir problemas de contaminación 19 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES 1. Usa frascos de cultivo sellados siempre que sea posible, especialmente para cultivos por largo tiempo. 2. Evita verter medio de cultivo, en su lugar, usa pipetas. Si no se puede evitar verter, usa gasa estéril para eliminar el medio de cultivo que haya quedado en el cuello del frasco. 3. No uses la campana como área de almacenamiento: las cajas, botellas, etc., además de agregar carga microbiana, alteran el patrón laminar del aire. 4. Usa bata de laboratorio limpia para proteger el cultivo de contaminantes provenientes de la piel o de la ropa. Su uso debe ser restringido al área de cultivo celular. 5. Trabaja en la campana sólo con una línea celular a la vez. Para evitar posibles contaminaciones entrecruzadas, usa recipientes separados de medios para cada línea celular. Usa desinfectante para limpiar la superficie de trabajo entre líneas celulares. 6. Transporta tus cultivos no sellados en bandejas, para minimizar el contacto con contaminantes transportados por aire. 7. Usa medio de cultivo libre de antibiótico para el mantenimiento rutinario. 8. Mantén los recipientes abiertos tan poco tiempo como sea posible. 9. Haz alícuotas de soluciones estériles con volúmenes pequeños para reducir el número de veces que debe ser abierto. 10. Deja el flujo laminar encendido durante el día. Apágalo sólo cuando no sea usado por periodos extensos. 11. Si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir. 12. Reduce los accidentes marcando cuidadosamente los cultivos y las soluciones. Indica si han sido esterilizados. 13. Mantén el área limpia. Las incubadoras, especialmente aquellas que mantienen altos niveles de humedad, requieren limpieza periódica y desinfección. El agua de los baños usados para atemperar los medios o inactivar los sueros debe ser cambiada periódicamente. Los frascos deben secarse cuidadosamente antes de usarse. Los contenedores de pipetas de deshecho y otros contenedores de basura son una fuente de material potencialmente contaminado. Debe ser vaciado diariamente. 1.5 EQUIPOS DE PROTECCIÓN INDIVIDUAL Se Define como “cualquier equipo destinado a ser llevado o sujetado por el trabajador para que le proteja de uno o varios riesgos, que puedan amenazar su seguridad o su salud en el trabajador, así como cualquier complemento o accesorio destinado a tal fin”. 1) Batas de laboratorio Es necesario usar batas dentro del laboratorio para evitar que la ropa se salpique o contamine con agentes biológicos. Las batas deben tener mangas largas, preferiblemente con puños con elástico o ajustados, y se llevarán siempre abrochadas. 20 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Las mangas nunca deben remangarse. Las batas serán lo bastante largas para cubrir las rodillas, pero en ningún caso rozarán el suelo. Siempre que sea posible, el tejido de la bata debe ser resistente a las salpicaduras y se cruzará por delante. Las batas de laboratorio pueden ser reutilizables o desechables; cuando sean reutilizables, el lavado deberá ser realizado por el laboratorio o por un contratista especializado. El lavado se hará regularmente; se estudiará la posibilidad de esterilizar en autoclave cualquier bata que esté visiblemente contaminada antes de lavarla. Las batas solo deben usarse en zonas designadas. Cuando no estén en uso, deben almacenarse correctamente; no deben colgarse encima de otras batas de laboratorio, ni en taquillas o ganchos junto con artículos personales. El personal no llevará a casa las batas de laboratorio. 2) Calzado En el laboratorio se utilizará siempre calzado, con un diseño que reduzca al mínimo los resbalones y los tropiezos y disminuya la probabilidad de lesiones por caída de objetos y exposición a agentes biológicos. El calzado cubrirá la parte superior del pie; debe ser cómodo y de la talla adecuada para que el personal pueda realizar sus tareas sin fatiga o distracción. 3) Guantes Se usarán guantes desechables apropiados para todos los procedimientos que entrañen un contacto, previsto o inadvertido, con sangre, líquidos corporales u otros materiales potencialmente infecciosos. No deben desinfectarse ni reutilizarse, ya que la exposición a desinfectantes y el uso prolongado reduce su integridad y disminuye la protección del usuario. Los guantes siempre deben inspeccionarse antes de usarlos para cerciorarse de que estén intactos. Es posible que se necesiten diferentes tipos de guantes para diferentes aplicaciones u otros riesgos ocupacionales, como la protección frente al calor o la protección contra objetos punzocortantes o productos químicos. Se dispondrá de varias tallas a fin de garantizar un ajuste correcto para cada usuario, que permita un movimiento y una destreza adecuados para los procedimientos que se realizan. Los guantes de nitrilo, vinilo y látex son los más comunes para la protección contra agentes biológicos. Cabe señalar que la proteína de látex puede provocar alergia con el tiempo; existen otras opciones bajas en proteínas y sin polvo para minimizar la aparición de alergias. 4) Protección ocular Se deben usar gafas protectoras de patilla o de máscara, pantallas (o viseras) faciales u otros dispositivos de protección cada vez que sea necesario con el fin de proteger los ojos y el rostro de salpicaduras, proyecciones de objetos o radiación ultravioleta artificial. El artículo de protección ocular debe limpiarse después de cada uso. En caso de que haya recibido salpicaduras, se descontaminará con un desinfectante adecuado. Las gafas graduadas personales no deben utilizarse como medio de protección ocular, ya que no cubren una parte suficiente del rostro alrededor de los ojos, particularmente a los lados de la cabeza. Se adquirirán gafas 21 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES de seguridad graduadas especializadas para los trabajadores que las necesiten. Existen algunos modelos de gafas protectoras con unas cavidades que permiten al usuario utilizar sus gafas graduadas debajo de ellas. 5) Protección respiratoria La protección respiratoria no suele ser necesaria para la protección contra agentes biológicos como parte de los requisitos básicos. Cuando la evaluación de riesgos indique que es necesario utilizar protección respiratoria, se considerará que se trata de una medida de control reforzada. Sin embargo, puede haber circunstancias en las que se requiera protección respiratoria por otras razones basadas en evaluaciones de peligros no biológicos, como productos químicos o alérgenos. Video EPIS cultivos https://www.youtube.com/watch?v=MdwoTgnOweg 2. CONTAMINACIÓN La característica principal que define a un laboratorio de cultivo celular es que ha de ser una instalación aséptica (sala de cultivo limpia, con cabinas de seguridad biológica de tipo II, incubadores y materiales estériles), debido a que la tasa de crecimiento de las células en cultivo es muy inferior a la de sus contaminantes habituales. Por lo tanto, uno de los problemas más frecuentes en el cultivo de células es la aparición de contaminaciones. Las células eucariotas en cultivo crecen lentamente, con tiempos de duplicación superiores en muchos casos a las 24 horas; mientras que tanto las bacterias como las levaduras tienen una tasa de crecimiento superior. En algunos casos, las contaminaciones producidas por estos organismos pueden dar lugar a la muerte del cultivo celular en poco tiempo. Por ello, para el mantenimiento del cultivo es vital evitar la aparición en éste de cualquier microorganismo contaminante. 22 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Las contaminaciones pueden ser de carácter biológico o químico. También pueden darse contaminaciones cruzadas si se trabaja con varias líneas celulares al mismo tiempo. Esta contaminación puede llegar al cultivo por varios focos de contaminación: - El operador - La manipulación - La atmósfera - Las superficies - Los utensilios - Los medios y soluciones CONTROL DE LA CONTAMINACIÓN En general los medios de cultivo en los que crecen las células eucariotas de interés, proporcionan un medio ideal para el crecimiento de organismos contaminantes, y los procedimientos habituales de manipulación (abertura de recipientes, pipeteo, etc) son susceptibles de provocar distintas contaminaciones. Además, las células crecen en un ambiente de alta humedad y temperatura, también ideal para el crecimiento de contaminaciones. Existen diferentes métodos para detectar si existe una contaminación. Sin embargo, no existe un test único capaz de detectar todos los contaminantes. Las precauciones generales para evitar contaminación de los cultivos celulares son: - Trabajar en un ambiente estéril (preferentemente en una cabina de flujo laminar). - Utilizar pipeteadores automáticos. - Mantener los recipientes abiertos el mínimo tiempo posible, manipulando el tapón de forma que no toque ninguna superficie con la cara interna y evitando pasar la mano o cualquier objeto sobre un recipiente abierto. - Secar cuidadosamente antes de usar cualquier botella de medio o de solución atemperada en un baño y posteriormente rociar con etanol 70% antes de abrir e introducir en la cabina de flujo laminar. - Ante cualquier duda limpiar con alcohol 70% el material contaminado o reemplazarlo si es posible. - Si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir. Si se han de tomar muestras para su análisis conviene hacerlo en ambiente estéril y después limpiar cuidadosamente el área de trabajo y conectar la iluminación UV. En cualquier caso, no es fácil reducir a una lista las precauciones a tomar y la única forma de aprender es practicar bajo supervisión. 23 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES TIPOS DE CONTAMINACIÓN a) CONTAMINACIÓN QUÍMICA Se produce por cualquier contaminante “no vivo” como radicales libres, iones metálicos, residuos de desinfectantes o detergentes, endotoxinas presentes después de eliminar el contaminante biológico. Puede producirse por una limpieza ineficaz de los materiales reutilizables (por ejemplo, las pipetas de vidrio) puede derivar en restos de detergentes que no se ven eliminados en el autoclave. También pueden proceder de medios o suplementos, como el FBS, no tratados correctamente en origen, por lo que hay que asegurarse de que los productos provengan de proveedores de confianza. b) CONTAMINACIÓN POR VIRUS La contaminación viral no es muy frecuente. Sin embargo, cuando aparece es un problema grave pues su prevención y eliminación es realmente difícil. Desde que se descubrió que el suero bovino podía ser una fuente importante de contaminación por diferentes virus (herpesvirus y virus parainfluenza-3) los sueros son controlados rutinariamente; aunque la única alternativa para afirmar con rotundidad que un cultivo está libre de virus es el uso de medios libres de suero. Los virus que tienen altas tasas de crecimiento y un efecto citopático marcado (cambios bioquímicos, moleculares, morfológicos y/o de viabilidad celular) son más fáciles de detectar. Mientras que las contaminaciones por virus con bajas tasas de crecimiento o que infectan sólo a unas pocas células son los más peligrosos porque afectan a los resultados de los experimentos cuando se utilizan las células contaminadas sin que el investigador tenga conocimiento de la contaminación. Fuente más probable de contaminación vírica: el suero. Prevención: adquirir sueros controlados rutinariamente. Síntomas: ◦ Efecto citopático; cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular causados por virus. ◦ Baja tasa de división. CONTAMINACIÓN POR BACTERIAS La contaminación bacteriana generalmente se manifiesta por un repentino cambio de pH, turbidez del medio y a veces con una ligera película blanquecina en la superficie de las placas o en la parte inferior de las botellas de medio, que típicamente se disipa cuando se mueve. 24 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES En el análisis microscópico a pocos aumentos (100x) aparecerán regiones granulosas o puntos negros muy pequeños en los espacios entre las células. En general a mayor aumento (400x) se pueden distinguir cocos o bacilos en movimiento. El uso de cócteles de antibióticos es muy frecuente en los laboratorios de cultivo celular para evitar contaminación bacteriana, ya que el efecto sobre el crecimiento del cultivo es mínimo y la prevención muy buena. Sin embargo, no es recomendable utilizar antibiótico de forma continuada en el mantenimiento de cultivos a largo plazo ni para la realización de determinados experimentos y está prohibido su uso en industrias de bioproducción en cultivo celular para uso humano o animal. Fuente más probable: el ambiente Prevención: Cumplir normas de trabajo en esterilidad; Gestión óptima del cuarto de cultivo y, si es posible, uso de antibióticos en los medios de cultivo Síntomas: Cambio repentino de pH; Medios turbios; pequeños puntos negros entre las células en la observación microscópica. Contaminación por levaduras La contaminación inicial por levadura en un cultivo celular es generalmente a través de una vía aérea, pero pueden colonizar fácilmente un incubador y extenderse a otros cultivos. Las levaduras son hongos Ascomycetes, se encuentran en las plantas, la tierra, el agua y en la superficie de la piel y el tracto digestivo de los animales. Se propagan como células individuales y pueden crecer rápidamente en cultivos celulares (con tiempos de duplicación de menos de 12 horas en algunos casos). Bajo el microscopio, a un aumento de 100X aparecen de forma individualizada como esferas o partículas ovoides o bien formando cadenas de dos a cuatro o incluso más partículas que pueden llegar a ser multi- ramificadas. Las levaduras se distinguen fácilmente de las bacterias por su tamaño, son más grandes que las bacterias y más pequeñas que las células de mamífero. La contaminación por levadura es de las más fáciles de tratar y eliminar: los dos agentes antimicóticos más utilizados contra las levaduras son la anfotericina B y la micostatina. Fuente más probable: el ambiente. Prevención: Seguir normas de trabajo en esterilidad. Gestión óptima del cuarto de cultivo. Revisión de los sistemas de ventilación. Síntomas: En fases iniciales son de difícil detección (no hay cambios en el pH), sin embargo, en fases más avanzadas se observan partículas ovoides en cadena. Contaminación por hongos Los hongos (mohos) suelen ser de crecimiento muy lento, pero en etapas avanzadas de la contaminación se puede apreciar a simple vista un crecimiento difuso (blanquecino o negro). 25 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Los hongos presentan una apariencia bien de un micelio filamentoso delgado o bien como grupos densos de esporas. Las esporas están en todas partes en el medio ambiente; los sistemas de calefacción y el aire acondicionado suelen presentar altas concentraciones de esporas. En las fases iniciales, las esporas que dan lugar a la formación de micelios son a menudo difíciles de detectar en los cultivos. Los dos agentes antimicóticos utilizados en caso de contaminación por levaduras (anfotericina B y micostatina) son también utilizados en caso de contaminación por mohos. Fuente más probable de contaminación: el ambiente, sistemas de ventilación y el propio tejido de origen en los cultivos primarios. Prevención: Seguir normas de trabajo en esterilidad Gestión óptima del cuarto de cultivo Revisión de los sistemas de ventilación Síntomas: En fases iniciales son de difícil detección. En fases más avanzadas de contaminación forman un micelio filamentoso que puede detectarse a simple vista. Contaminación por micoplasma Los micoplasmas son células procariotas pequeñas (de 0,3 a 0,5 μm de diámetro) que no poseen pared celular y sólo son capaces de crecer en ciertos medios. Existen varios grupos de micoplasmas de los géneros Mycoplasma y Acholeplasma; los contaminantes responsables de las infecciones de los cultivos celulares proceden mayoritariamente de cuatro especies: M.orale (de humano), M.hyorhinis (del cerdo), M.arginini (de ganado bovino) y A.laidlawii (de ganado bovino y también de roedores). La contaminación puede proceder de suero animal contaminado, de tripsina de cerdo contaminada y en algún caso de transferencia desde el ser humano. Hay datos diversos sobre el porcentaje de cultivos celulares contaminados, sugiriendose que, de los cultivos celulares utilizados actualmente, rangos de entre el 50 al 95% están contaminados con micoplasmas. La contaminación con micoplasmas no es tan evidente como la contaminación por bacterias o levaduras por lo que es muy importante estar atentos a su posible efecto sobre el cultivo. Para ello conviene controlar cambios en la tasa de crecimiento y realizar controles periódicos para detectar su presencia. La contaminación por micoplasma además de modificar la tasa de crecimiento celular, puede alterar los patrones enzimáticos, la composición de la membrana de las células e inducir anormalidades cromosómicas. Fuente más probable: uso de medios y/o sueros contaminados. Prevención: Seguir normas de trabajo en esterilidad. Revisiones periódicas para eliminar contaminaciones en fases iniciales. Síntomas: Muy difícil detección por observación de cultivos. Alteración de la tasa normal de crecimiento celular. 26 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Sistemas de detección de micoplasma Cultivo específico. El cultivo de micoplasmas requiere de dos a cuatro semanas y pueden presentar dificultades debido a las condiciones especiales de crecimiento que requieren estos microorganismos. Además hay algunas especies no son cultivables, como Mycopasma hyorhini. Las colonias de micoplasma que creen en agar tiene un aspecto característico “de huevo frito”. Técnicas de microscopía con tinción de ADN. Se suele usar el colorante Hoechst que se une al ADN de las células del cultivo y de los micoplasma si los hubiera y se observa con un microscopio de fluorescencia con luz ultravioleta. Si hay contaminación además de la tinción nuclear del cultivo, se observa coloración fuera de la zona nuclear de las células y entre las células del cultivo. Métodos bioquímicos (colorimetría). Se han comercializado varios ensayos colorimétricos que determinan la presencia de micoplasmas detectando la presencia de determinados antígenos (ELISA) o la activación de receptores de patógenos en líneas celulares (TLR2). Técnicas de biología molecular con PCR ó qPCR. Se suelen amplificar regiones de RNA ribosómico (26S ó 16S) compartidas por las especies más comunes de micoplasmas. Contaminación cruzada Cuando se está trabajando dentro de una cabina de flujo laminar en un experimento, control de calidad o producción, nunca se debe utilizar más de un tipo de células al mismo tiempo. Existe un elevado riesgo de que unas células y otras se mezclen y tengamos contaminación cruzada. En general es recomendable el trabajo por líneas celulares diferentes e, incluso, con ciclos de esterilización de la cabina de flujo laminar por UV entre las diferentes líneas celulares. En muchos casos, los medios de cultivos y reactivos se utilizan exclusivamente para un tipo celular concreto impidiendo de esta manera que pueda haber contaminación cruzada por el uso de las mismas botellas de medios y reactivos. 3. GESTIÓN DE RESIDUOS QUÍMICOS Y BIOLÓGICOS. Los residuos son los productos o materiales inservibles generados en las operaciones que se realizan en el laboratorio. El tipo de tratamiento y gestión de los residuos dependerá de las características y peligrosidad de los mismos. En general, es recomendable seguir estas tres premisas: Generar la menor cantidad posible de residuos. Reciclar la máxima cantidad posible de residuos. Eliminar de forma adecuada los residuos que no son reciclables. 27 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Concepto de residuo sanitario El riesgo asociado al uso o a la manipulación del material propio de la actividad sanitaria (agujas, gasas empapadas en sangre en una cura o una intervención quirúrgica, tejidos extirpados, pipetas de laboratorio, etc.) no tiene nada que ver con el riesgo asociado a los residuos. Sólo cuando este material es rechazado (porque su utilidad o manejo clínico se dan por acabados definitivamente), y únicamente a partir de este momento, se convierte en residuo. Clasificación: Los residuos generados por actividades sanitarias se pueden clasificar en: Residuos sanitarios asimilables a residuos municipales o de tipo I. Residuos sanitarios no específicos o de tipo II. Residuos sanitarios específicos o de riesgo o tipo III. Residuos tipificados en normativas singulares o de tipo IV. Residuos sanitarios asimilables a residuos municipales o de tipo I Son los que no plantean exigencias especiales en su gestión. Estos residuos incluyen cartón, papel, material de oficinas y despachos, cocinas, bares y comedores, talleres, jardinería y residuos procedentes de pacientes no infecciosos, no incluidos en los grupos II y III. Residuos sanitarios no específicos o de tipo II Son residuos sobre los cuales se han de observar medidas de prevención en la manipulación, la recogida, el almacenamiento y el transporte, únicamente en el ámbito del centro sanitario. Estos residuos incluyen material de curas, yesos, ropa y material de un sólo uso contaminados con sangre, secreciones y/o excreciones, todos ellos no englobados dentro de los residuos clasificados como residuos sanitarios específicos. Residuos sanitarios específicos de riesgo o de tipo III Son residuos sobre los cuales se han de observar medidas de prevención en la manipulación, la recogida, el almacenamiento, el transporte, el tratamiento y la eliminación, tanto dentro como fuera del centro generador, ya que pueden representar un riesgo para la salud laboral y pública. Los residuos sanitarios específicos de riesgo se pueden clasificar en: 1. Residuos sanitarios o infecciosos, capaces de transmitir alguna de las enfermedades infecciosas 2. Residuos anatómicos. Cualquier resto anatómico humano que se pueda reconocer como tal. 3. Sangre y hemoderivados en forma líquida. Recipientes que contengan sangre o hemoderivados, u otros líquidos biológicos. Se trata siempre de líquidos, en ningún caso de materiales cerrados o que hayan absorbido estos líquidos. 28 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES 4. Agujas y material punzante y cortante. Cualquier objeto punzante o cortante utilizado en la actividad sanitaria, independientemente de su origen. Se trata fundamentalmente de agujas, pipetas, hojas de bisturí, portaobjetos, cubreobjetos, capilares y tubos de vidrio. 5. Vacunas vivas y atenuadas. Residuos tipificados en normativas singulares o de tipo IV Son los residuos cuya gestión está sujeta a requerimientos especiales desde el punto de vista higiénico y medioambiental, tanto dentro como fuera del centro generador. Estos residuos incluyen: Residuos citostáticos: restos de medicamentos antineopiásicos no aptos para el uso terapéutico, y todo el material de un solo uso que haya estado en contacto con los fármacos nombrados. Por su peligrosidad, importancia cuantitativa y especificidad sanitaria, los residuos citostáticos destacan en el grupo de los residuos con contaminación química que se pueden generar en una actividad sanitaria. Restos de sustancias químicas: residuos contaminados con productos químicos que les dan el carácter de residuo industrial. Se trata de materiales muy diversos, como pilas, termómetros, disolventes, reactivos químicos, baños de revelado de radiografías,medicamentos, lubricantes, etc. Medicamentos caducados. Aceites minerales y sintéticos. Residuos con metales. Residuos radiactivos: residuos contaminados con sustancias radiactivas. Su recogida y eliminación es competencia exclusiva de ENRESA. Restos anatómicos humanos con entidad: cadáveres y restos humanos con entidad, procedentes de abortos u operaciones quirúrgicas. Su gestión está regulada por el Reglamento de Policía Sanitaria Mortuoria. Recogida El primer paso a seguir en el tratamiento de los residuos sanitarios es su clasificación, por lo que no se depositarán en un mismo recipiente residuos sanitarios de tipos diferentes, respetando la clasificación establecida, consiguiéndose así minimizar la cantidad de residuos. Al mismo tiempo, la recogida de residuos sanitarios deberá atender a los criterios de asepsia, inocuidad y economía. Recipientes Los residuos de los grupos II y III se recogerán en bolsas y recipientes cuyas características técnicas se adaptarán a los criterios siguientes: a. Estanqueidad total. 29 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES b. Opacidad a la vista. c. Resistentes a la rotura. d. Asepsia total en su exterior. e. Ausencia total en su exterior de elementos sólidos, punzantes y cortantes. f. Volumen no superior a 70 litros. g. Cierre especial hermético de fácil apertura y que no pueda abrirse de forma accidental. Residuos sanitarios cortantes y punzantes Los residuos cortantes y punzantes han de ser recogidos en recipientes impermeables, rígidos y a prueba de pinchazos. Una vez llenos estos recipientes, tendrán que eliminarse como residuos sanitarios específicos. Residuos citostáticos Se recogerán en contenedores de un sólo uso, de polietileno o de poliestireno, de manera que permitan la incineración completa, que sean resistentes a los agentes químicos y a los materiales perforantes y que dispongan de cierre hermético especial. Identificación La identificación externa de las bolsas, recipientes y contenedores destinados a la recogida de residuos del grupo III y citostáticos, será la siguiente: Grupo ll: no necesitarán identificación. Grupo : "Residuos de riesgo". Citostáticos: Material contaminado químicamente. Citostáticos". Residuos tipo sangre y hemoderivados La opinión que predomina en el ámbito internacional (Centers for Disease Control, Ministerio de Sanidad del Canadá, Ministerio de Medio Ambiente de Holanda, OMS, etc.), es que el mejor método de eliminación de la sangre, derivados y secreciones orgánicas es el de verterlos por el desagüe conectado a la red de saneamiento del centro sanitario y que por lo tanto no es necesaria la desinfección previa de los residuos. Se ha de tener en cuenta que las cloacas están concebidas para recibir grandes cantidades de materias orgánicas infecciosas. Por otro lado, los residuos biológicos sanitarios líquidos representan un volumen ínfimo en comparación con las materias orgánicas fecales que se eliminan normalmente para la red de saneamiento. La única excepción a esta práctica la constituyen los residuos sanitarios específicos líquidos procedentes de pacientes con infecciones no endémicas en España y los cultivos líquidos de microbiología, que han de tratarse como a residuos sanitarios específicos sólidos. Es importante que el vertido por el desagüe se haga con especial precaución, de forma que se eviten al máximo las salpicaduras y la formación de aerosoles. Por lo tanto, si el recipiente con líquido biológico es 30 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES difícil de abrir, no se ha de intentar agujerearlo o forzarlo, sino que se ha de eliminar como residuo sanitario específico sólido (grupo III). Transporte intracentro Es recomendable que los residuos sanitarios recogidos en las diferentes zonas del centro sean transportados al almacén de residuos sanitarios con una periocidad máxima de 12 horas. Los contenedores o estructuras de soporte y sistemas de transporte han de limpiarse en lugares adecuados con agua a presión y detergentes. Es recomendable que, tanto los sistemas de transporte como los contenedores de los centros generadores de residuos, sean estructuras sin rincones, que faciliten al máximo el proceso de limpieza. No se han de dejar bolsas ni recipientes de residuos en lugares no previstos, si no es la zona donde se han producido, o bien en el almacén. Uno de los problemas más importantes que pueden aparecer durante el transporte de los residuos dentro de un centro hospitalario es la rotura de las bolsas. Para poder evitarlo es necesario: a. Utilizar bolsas de galga adecuada (nunca inferior a 220 mg/cm 2 ). b. No almacenar las bolsas unas encima de la otras; las bolsas deben colocarse una al lado de la otra sobre una superficie horizontal. c. Dentro de la estructura o carro de transporte no se han de comprimir para poder transportar mayor cantidad en un solo trayecto, ni se puede sobrepasar el nivel que permita el cierre de la tapa del carro. d. Nunca deberán arrastrarse las bolsas por el suelo, sino que se han de utilizar los sistemas de transporte. El personal que transporta los residuos ha de llevar guantes resistentes a los pinchazos por agujas, vidrios y otros materiales punzantes y que no se puedan agujerear pero que a la vez se adapten y sean cómodos. Este personal ha de disponer de una ropa exclusiva para este trabajo y en el momento de acabarlo han de tener a su disposición un baño con ducha y ropa limpia. Siempre que en la manipulación se sospeche que pueden producirse aerosoles o salpicaduras, se han de utilizar gafas y mascarilla. Almacenamiento Los residuos sanitarios se podrán almacenar en el mismo edificio durante un período máximo de 72 horas, que se puede alargar a una semana si el almacén de residuos dispone de un sistema de refrigeración (temperatura máxima 4 ºC). El almacén tendrá que estar ventilado, bien iluminado, debidamente señalizado, acondicionado para poder desinfectarlo y limpiarlo, y situado de manera que no pueda afectar a espacios vecinos. El almacén se ha de poder cerrar y ha de tener fácil acceso. 31 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES En caso de no disponer de un sistema de tratamiento propio, las operaciones de carga en los vehículos de transporte se tendrán que realizar en condiciones de seguridad, limpieza y agilidad, disponiendo al efecto los espacios y medios que sean necesarios. Estas instalaciones tendrán que permitir una fácil limpieza y desinfección. El almacén ha de estar protegido de la intemperie, de las temperaturas elevadas, de los animales y el acceso al mismo sólo se permitirá al personal autorizado. Tratamiento y eliminación El tratamiento y eliminación de los residuos sanitarios del grupo III y citostáticos deberá atender a criterios de inocuidad, asepsia y salubridad con el fin de garantizar la eliminación de los gérmenes patógenos y la protección del medio ambiente. Fuera de los centros, los residuos del grupo II se tratarán y eliminarán como residuos asimilables a los municipales. Los residuos del grupo III se podrán eliminar mediante incineración, en hornos preparados para esta finalidad y estarán construidos con unas características técnicas definidas. Se ha de tener en cuenta que cuando se habla de incineración se refiere a incineración efectuada fuera del recinto sanitario y llevada a cabo por empresas autorizadas que ofrezcan toda la garantía de no contaminar el medio ambiente. La generación de residuos biológicos sanitarios representa fundamentalmente un problema de seguridad e higiene en el trabajo, especialmente en el interior de los centros sanitarios, mientras que el riesgo de infección para la comunidad es poco importante y prácticamente limitado a ciertas infecciones no endémicas de España. El riesgo mayor proviene de una incineración inadecuada. Por este motivo, en muchos países, se está imponiendo como medida alternativa a la incineración, el tratamiento de los residuos mediante la esterilización y, una vez triturados, se asimilan a los residuos urbanos. Otro método de eliminación es el tratamiento por microondas, aunque este es más complejo que el anterior, ya que primero se han de humedecer los residuos pues sólo así las microondas serán efectivas. Los residuos del grupo III también se podrán eliminar como residuos asimilables a los municipales, siempre que hayan sido previamente tratados mediante esterilización por vapor caliente a presión por técnica de autoclave, es decir mediante acción desinfectante por proceso fraccionado de vapor al vacío. Los residuos del grupo III que sean cortantes y punzantes, como agujas de bisturí, estiletes y cualquier material metálico que pueda ser vehículo de transmisión de enfermedades, podrán ser tratados mediante esterilización en el mismo centro, y después eliminados como residuos asimilables a los municipales. La eliminación de residuos citostáticos se realizará mediante neutralización química o incineración a una temperatura que pueda garantizar su destrucción. 32 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Plan de gestión intracentro La responsabilidad de hacer cumplir la normativa referente a la clasificación, la recogida, el almacenaje, o la cesión de los residuos sanitarios al transportista autorizado y si es necesario, la referente al tratamiento y eliminación, corresponde normalmente al director o al gerente del centro sanitario que genera los residuos sanitarios. En consecuencia, el gerente ha de desarrollar las siguientes funciones: Vigilar el cumplimiento de las disposiciones aplicables a las operaciones citadas anteriormente. Informar al personal del centro sanitario de los riesgos asociados a los residuos sanitarios y la forma de prevenirlos. Tomar las iniciativas oportunas para conseguir la gestión correcta de los residuos sanitarios. Tramitar a la Administración competente las informaciones y los datos que les sean solicitados, y garantizar su exactitud. NORMAS BÁSICAS DE ACTUACIÓN Nunca viertas al desagüe residuos peligrosos, ni siquiera en cantidades pequeñas. Procura segregar al máximo los residuos de cada línea de trabajo con objeto de minimizar los residuos genéricos y mezclas. Evita incompatibilidades entre los residuos peligrosos. Hay grupos que, aun perteneciendo al mismo grupo, son incompatibles químicamente, por lo que no deben envasarse conjuntamente. Infórmate de las características de las sustancias químicas que componen los residuos peligrosos producidos en tu laboratorio. Identifica todos los envases con una etiqueta donde se reflejen todos los constituyentes que forman parte del residuo. Evita los nombres genéricos o ambiguos, abreviaturas o nombres en otro idioma que no sea el castellano. Evita trasvasar residuos peligrosos de un recipiente a otro, disminuirás con ello el riesgo de accidente. Deja aproximadamente un 25% del envase para líquidos de 25 litros (L25) sin llenar, esto evitará fugas durante la retirada y almacenamiento. Esteriliza mediante procesos químicos o físicos aquellos residuos potencialmente infecciosos antes de desecharlos. Almacena los envases que contengan residuos peligrosos en lugares adecuados hasta su retirada, evitando las zonas de tránsito, las fuentes de calor o la luz directa del Sol. Antes de la recogida, asegúrate de que los envases se encuentren herméticamente cerrados y que no estén deteriorados, manchados ni presenten derrames o fugas. 33 Profesora: Helena Amigo González