Analisi dell'mRNA - Biologia Molecolare - PDF

Analisi dell’mRNA Le tecniche che andremo ad analizzare sono: Northern Blotting RT-PCR Whole-Mount ISH Section ISH Microarrays In silicio PURIFICAZIONE RNA L’enzima RNAasi che degrada RNA è presente dappertutto ed è molto stabile (mettendolo a 120°...

Analisi dell’mRNA Le tecniche che andremo ad analizzare sono: Northern Blotting RT-PCR Whole-Mount ISH Section ISH Microarrays In silicio PURIFICAZIONE RNA L’enzima RNAasi che degrada RNA è presente dappertutto ed è molto stabile (mettendolo a 120° in autoclave per esempio, rimane ancora attivo, mentre la DNAasi si denatura), e non richiede cofattore per essere attiva pertanto bisogna lavorare in condizioni altamente controllate per evitare comunque di degradare RNA. RNA infatti essendo a singolo filamento è molto delicato. Si limano i tessuti o cellule in una soluzione che denatura le ribonucleasi senza danneggiare l’acido nucleico. Si usa un denaturante delle proteine come il guanidinio tiocianato. Ci si ritrova dunque ad avere l’RNA totale che contiene: tRNA, rRNA, mRNA, ecc. Si osservano nella tabella le percentuali dei tipi di RNA che si ottengono e da quali polimerasi sono prodotti. Gli rRNA sono spesso trascritti in tutte le cellule in modo simile, in quanto senza ribosomi la cellula non sopravvive, l’RNAm è quello che varia in una cellula in base alle caratteristiche. Inoltre in basi agli stimoli diversi che può ricevere una cellula, questa comincia a esprimere in modo diverso alcuni geni, e questa è una delle analisi che più si fanno in laboratorio, ovvero quali differenze ci sono nelle regolazioni geniche in risposta a stimoli. Come si studiano? Bisogna separare il 5% di mRNA dal resto 95% di tRNA e rRNAs. Si può usare un oligonucleotide di poli-T legato a una particolare sferina. È possibile usare delle colonne supporto per separare le molecole, ad esempio come la cromatografia su strato sottile. Molecole come agarosio possono essere molecole con una carica positiva (o negativa) che possono così interagire con DNA mentre altre componenti della cellula se ne vanno, si usa poi una concentrazione salina per spezzare questo legame che si è venuto a formare. Nel nostro caso si fa una cosa simile detta CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ. Si hanno delle sferuline in ferro in una colonna, legate a un oligonucleotide formato da sequenze di molte T e le si mettono nella soluzione di RNA totale. L’RNA che termina con una coda di poli- A può così legarsi. Effettuo ora un lavaggio. Per separare queste sferine poi, nel caso in cui queste siano per l’appunto in ferro, possono trattenerle grazie a un magnete, e in questo modo posso poi rimuovere tutto il resto. Dunque la purificazione dell’RNA avviene per affinità con un oligonucleotide legato a sferetta in ferro. IBRIDAZIONE - NORTHERN BLOTTING Gli acidi nucleici hanno la possibilità grazie alla complementarietà delle basi di formare dei duplex. Questo rende molto semplice la loro analisi, poichè basta usare una sequenza specifica per un determinato aminoacido, che non è presente in nessun altro, chiaramente non si può usare la coda di poli-A che è presente in tutti gli RNA. Si utilizza così una sonda, che va marcata, in modo da usare metodologie simili al Southern Blotting. Si può infatti usare: radioattività, sistema enzimatico o fluorescenza per renderle facilmente rilevabili. Si generano dunque piccole molecole rilevabili e visibili in un qualche modo. Il tutto deve essere fisato. La sonda viene fatta col DNA proprio per renderla semplice da maneggiare Si genera del DNA complementare all’RNA messaggero e in questo modo si permette l’ibridazione. La marcatura per radioattività si effettua marcando il fosforo in alpha con fosforo radioattivo isotopo 32. Questo viene usato per replicare il DNA utilizzando specifici primer generando molecole che ogni tanto presenteranno un nucleotide radioattivo. Viene marcato il fosforo in alpha poichè giustamente sarà l’unico che rimarrà attaccato nel DNA nascente. Si ottengono dunque dei labled probe (sonda marcata). L’appaiamento si basa sulla TEMPERATURA. La temperatura di melting, definita già per i primer, è la temperatura a cui la sonda e il suo bersaglio sono dissociati o associati al 50%. La regola di Wallance quando le sequenza sono >40 bp, non si può utilizzare. La temperatura viene calcolata in questo modo, che vale anche per sequenza più corte. Tm = 81.5°C + 16.6logM + 0.41(%G+C) M = la forza ionica del tampone utilizzato espressa in moli/litro, dunque la molarità del tampone su cui si fa la reazione, meno è salino più il probe tende a distaccarsi. Per sonde lunghe di solito si usa una temperatura di ibridazione pari a Tm - 25°C. Esempio Tampone 500mM e G+C 50%: Tm= 81.5+16.6(-0,3)+0.41(50%)-25= 72°C Se è più ricco di G e C chiaramente si hanno molti legami a idrogeno e vanno compensati. Considerando sequenze lunghe potrebbero esserci regioni simili in regioni differenti, dunque bisogna fare in modo che la sonda si appai in modo specifico e non aspeifico. Viene stabilita la temperatura più alta che si possa usare, poi si lavora sulla salinità, in quanto più bassa è la concentrazione salina, più specifico è l’appaiamento e si evita maggiormente appaiamento aspecifico. STRINGENZA = Specificità con cui una sonda si lega (si ibrida) ad una determinata sequenza bersaglio complementare. Ad alta stringenza la sonda si potrà ibridare soltanto ad una sequenza ESATTAMENTE COMPLEMENTARE. Si aumenta la stringenza aumentando la temperatura e riducendo la salinità. A bassa stringenza l’ibridazione potrà avvenire anche con sequenze parzialmente complementari. Dipende dalle condizioni: temperatura e salinità delle soluzioni di ibridazione e lavaggio Il NOTHERN BLOTTING, definito tale in seguito alla scoperta del Southern, ci permette di definire la grandezza del trascritto evidenziando splicing alternativi. Permette di definire la grandezza del trascritto evidenziando differenze nei siti di inizio trascrizione o di poliadenilazione Analisi del gene di interesse e paragone di espressione in diversi tessuti o diverse linee cellulari. È un metodo quantitativo. Se bisogna fare l’ibridazione e si ha l’RNA messo sul gel di agarosio, dunque separati in base alla grandezza, bisogna immobilizzare l’RNA dopo la migrazione esattamente come per il southern blotting, la soluzione è un po’ diversa ma il concetto è lo stesso. Per capillarità è così posta una soluzione in basso, una spugna, il gel sopra la membrana e delle carte da filtro asciutte che richiamano verso l’alto la soluzione per capillarità, così l’RNA è richiamato e viene bloccato. Posso così fare l’ibridazione in presenza di sonda radioattiva, si lava per togliere l’eccesso e si va ad osservare. L’osservazione può essere fatta con autoradiografia che riconosce la radioattività del fosforo. In basso si vede come si presenta facendo migrare in presenza di gel di agarosio il bromuro di etidio, con colorazione rosa. Si osserva che si possono distinguere gli RNA ribosomiali e l’RNA messaggero migrato per un gene specifico. Si osserva una banda radioattiva in cui è avvenuta ibridazione. In alcune regioni di certi tessuti dunque posso osservare che si trova in quantità differenti e questo ci permette di quantizzarlo.  In questo caso si osservano vari siti di poliadenilazione. Vengono disegnate diverse sonde per i diversi siti per poter osservare i diversi splicing alternativi. Nel Nothern Blotting nella seconda sonda specifica per tutte, si osservano 3 siti. Se si usa quella specifica per la molecola più lunga si osserverà solo una banda. In base a dove si è pianificata la sonda, ci permette di osservare vari tipi di RNA oppure uno solo. PCR Richiede due primer che possano appaiarsi o al filamento superiore o al filamento inferiore. L’RNA messaggero ha un unico filamento dunque non si può fare la PCR; è però molto comodo analizzarlo con questa tecnica, in quanto per il Northern impiega qualche giorno e si utilizzano molecole radioattive, mentre con PCR ci mette solo mezza giornata. Si deve utilizzare un cDNA, ovvero DNA complementare che deriva da RNA retrotrascritti. La retrotrascrizione si basa sulle proprietà delle DNA polimerasi RNA dipendenti ricavate da retrovirus come l’AMV, virus della mieloblastosi aviaria o il MuLV, virus della leucemia murina di Moloney. Si può pensare di utilizzare un primer con retrotrascrittasi che lo copia. Si deve poi usare una RNAasi per degradare RNA (una molto usata è RNAasiH). La retrotrascrittasi continua a lavorare bene da sola, dunque non c’è bisogno di un ulteriore primer in 5’. Si forma una forcina e la polimerasi si agggancia per sintetizzare il secondo filamento. Uso poi una nucleasi per svolgere il loop e si ottiene il cDNA copia originale del mRNA. Posso usare degli oligo primer di dT, oppure dei random primer, generati casualmente e ottenendo speci di DNA differenti, ma spesso molto efficienti in quanto si agganciano in conformazioni strane che permettono di retrotrascriverlo. L’RNA scompare ma si ottiene la copia di DNA che si potrà così utilizzare per la PCR, il filamento superiore/inferiore si appaia. SCELTA DI UN PRIMER Bisogna tenere conto che a volte non si ottiene un ottima purificazione, quindi si può rischiare di amplificare RNA genomico e non RNA messaggero. Si fanno quindi delle PCR molto piccole 100-200bp in modo che sia molto veloce e molto efficiente. Normalmente per evitare di fare una detection del genomico invece che del messaggero, i primer non sono messi su un esone, ma su due esoni diversi. In questo modo se si appaiano su quello genomico, amplificando in tempi molto brevi, in modo che non riesca ad amplificare due esoni molto lontani.  Normalmente si fa una REAL TIME PCR QUANTITATIVA Lo strumento rileva ad ogni ciclo di PCR quanto amplificato si è generato. All’inizio avendo dato lo stampo è difficile definire quanto se ne è ottenuto. Misurando ciclo dopo ciclo si può osservare il raggiungimento della saturazione grazie alla curva di saturazione. Si seguono le molecole di amplificato grazie all’uso del SYBR green per monitorare la sintesi del DNA. SYBR green è un colorante che si lega al DNA a doppio filamento ma non al DNA a singolo filamento e viene usato per monitorare la sintesi del DNA durante le reazioni real-time PCR. Quando si lega al DNA a doppio filamento emette una fluorescenza molto superiore di quella del bromuro di etidio. Si usa SYBR green anche perché il rapporto della fluorescenza in presenza di DNA a doppio filamento e della fluorescenza in presenza di DNA a filamento singolo è molto superiore del rapporto con bromuro di etidio. Si utilizza un termociclatore in cui vi è un raggio laser che va ad analizzare campione per campione ad ogni ciclo misurando quanta fluorescenza viene emessa. Qualunque DNA può essere quantizzato. Al primo ciclo da una molecola se ne dovrebbero produrre 2, ma non sappiamo quante molecole ci sono, quindi osserviamo all’inizio comunque un minimo di fluorescenza, si definisce comunque un ciclo soglia, ovvero il ciclo in cui viene rivelata una frequenza. Il numero dei cicli necessari perché un campione raggiunga il suo Ct è inversamente proporzionale al numero di copie target presente inizialmente. Il calcolo della quantità di DNA dei campioni incogniti viene effettuata determinando il ciclo della PCR (ciclo soglia, Ct) a cui viene raggiunto il valore soglia di fluorescenza del reporter e dove cioè i segnali di amplificazione specifici sono separabili da quelli del rumore di fondo del sistema. Ci basiamo sopratutto sul Ct in quanto è il primo momento in cui si può rilevare un determinato gene. Questa tecnica è quantitativa poiché si confronta la quantità di un trascritto rispetto ad un trascritto ubiquitario (es. RNA ribosomale o b-actina). Maggiore è il numero di molecole di un particolare cDNA presenti all’inizio della reazione prima verrà rilevato il segnale della fluorescenza dell’intercalante. Il confronto viene fatto quando la reazione è in fase esponenziale Esempio quantizzazione relativa Dal gene dell’actina presente in tutte le cellule, posso andare a quantizzare le quantità iniziali. Andando a rilevare il ciclo soglia di un gene housekeeping si può andare a rilevare quanto cDNA era stato generato, vado poi a rilevare il gene di interesse. Il rosso è quello che si vede prima, nel rosso si vede meno. Non è così banale dire che il rosso ne ha più del nero. Vado a calcolare bene la differenza. Diciamo che il numero di molecole di RNA messaggero nei due tessuti e 2 e 4. Per ogni gene avrò 2 e 4 cDNA, nel momento in cui copio con retrotrascrizione ho le quantità relative. Vado avanti con la PCR e tutto raddoppia. Per rilevare la differenza il ciclo soglia è al raggiungimento di 32 molecole di PCR prodotte e amplificate. Nel tessuto 2 il 32 è raggiunto al primo ciclo per il primer, nell’1 al primo. Il gene di interesse relativamente al terzo e al quarto. Calcolo dunque la differenza fra i cicli soglia per i primer del gene di interesse e di normalizzazione, ottenendo lo stesso risultato. Ciò vuol dire che sono espressi nello step modo. Senza normalizzazione avrei detto che erano differenti.  Se inseriscono i dati in un grafico: il più basso indicherebbe il più espresso, per questo viene espresso come 2 alla meno deltaCt, in modo da osservare la colonna più alta come il gene più espresso, a livello visivo rende molto meglio. Il numero dei cicli necessari perché un campione raggiunga il suo Ct è inversamente proporzionale al numero di copie target presente inizialmente La PCR quantitativa riesce a dirci dunque QUANTE moelcole ci sono. Utilizza delle sonde fluorogeniche rispetto a coloranti che legano il DNA che danno una specifica ibridazione tra la sonda ed il DNA da analizzare. Da un lato ha un fluorocromo, dall’altra una molecola che ferma il fluorocromo in modo che non si veda la fluorescenza. La quantizzazione non viene influenzata da amplificazioni non specifiche dovute a legame non specifico del primer o dimerizzazione dei primer. Possibilità di marcarle con fluorocromi diversi e distinguibili. Con l’utilizzo di fluorocromi diversi l’amplificazione di due sequenze diverse può venire analizzata in contemporanea in un’unica reazione di PCR. Lo svantaggio delle sonde fluorogeniche è la necessità di sintetizzare sonde specifiche per ogni gene da analizzare e ciò è molto costoso. Quando però è sviluppato un protocollo preciso è altamente sensibile. All’inizio dell’amplificazione si appaiano i primer a 5’-3’, viene disegnata una sonda complementare al gene da analizzare che abbia un fluorocromo e una molecola detta quencher che ferma la fluorescenza. L’estensione dal primer al 5’ spiazza la sonda e la stacca, viene poi idrolizzata. Il fluorocromo si allontana così dall’’inibitore e si può sviluppare in questo modo la fluorescenza. Dunque sono molecole che solo quando si spezzano diventano fluorescenti. È detta TAQ PCR. Il 79% della sequenza del genoma umano presenta siti unici quindi è possibile disegnare sonde specifiche a parte in regioni ripetute. IBRIDAZIONE IN SITU DELL’mRNA Non è per niente quantitativa ma permette di individuare in un embrione o in un tessuto quali cellule producono quel determinato gene. Essendo fatta in tessuti ci sono poche molecole di RNA, dunque si devono trovare le condizioni migliori possibili, si utilizza quindi una sonda a RNA. 1. La sonda viene trascritta come RNA antisenso cioè complementare all’mRNA del gene da analizzare. Durante la trascrizione con la RNA polimerasi viene incorporato un nucleotide marcato: l’UTP è modificato con digossigenina (in situ non radioattiva) o con 35S (in situ radioattiva). 2. Gli embrioni o le sezioni di tessuti vengono ibridati con una sonda di RNA antisenso marcata con digossigenina. 3. In seguito si tratta il campione con un anticorpo anti-digossigenina che la lega marcato con l’enzima fosfatasi alcalina. 4. Il campione viene poi trattato con un substrato per questo enzima che forma un precipitato colorato che marca indelebilmente le cellule che esprimono il gene di interesse. Perchè una sonda di RNA? Il tasso di ibridazione e la stabilità dell’associazione tra sonda e molecola bersaglio sono più elevate negli ibridi RNA/RNA, rispetto a quelli DNA/RNA o DNA/DNA. Viene trascritta con RNA polimerasi che non necessita di un primer per iniziare la trascrizione. Si utilizzano RNA polimerasi (T3, T7, SP6) derivate da fagi che si legano a sequenze specifiche promotoriali più forti dei promotori di E.coli permettendo la sintesi di alte quantità di RNA. I virus hanno l’RNA polimerasi che è un’unica proteina e si lega a promotori di circa 20 nucleotidi. Esempio Questo è il vettore della pBluescript. A monte e a valle ha i promotori per queste RNA polimerasi, sono già generati dai biotecnologi con tutte le basi per effettuare i nostri esperimenti. Si ragionerà su quale promotore lavorare per avere la sonda complementare all’RNA messaggero. Bisogna utilizzare la RNA polimerasi che lega il cDNA da T3. Per avere una molecola che si appaia all’RNA messaggero alle molecole avrò bisogno di una sequenza corrispondente al filamento inferiore che si agganci al superiore. Viene denaturato, RNA polimerasi si aggancia, utilizzerà da 3’ a 5’ e genererà una sonda complementare. UTP modificata Esistono due livelli di analisi: 1. Ibridazione in situ su embrioni interi (Whole mount) = Solo a stadi precoci di sviluppo 2. Ibridazione in situ su sezioni = Su embrioni interi o tessuti anche adulti Come posso caratterizzare TUTTI i geni espressi da un particolare tessuto? È possibile analizzare tutti gli RNA prodotti con un unico esperimento ovvero attraverso il TRASCRITTOMA. I microarrays cDNA permettono l’analisi in contemporanea di un gran numero di geni: codificano per proteine (solo il 3-5% dell’RNA costituisce il mRNA) Contengono in uno spazio piccolissimo delle sonde che posso ibridare l’intero trascrittoma umano = circa 20.000 geni che corrispondono in modo specifico a tutti i geni trascritti. Sono state dunque generate delle sequenze specifiche per questo e vengono immobilizzate su un supporto frammenti di circa 100bp, corrispondenti a una singola sequenza e si osserva dove si lega RNA. Viene poi effettuata retrotrascrizione con cDNA. Si analizza poi con un raggio laser facendo dei confronti con questo esperimento semplice.  Il computer poi riconosce le diverse sonde e sequenze attribuendole ai geni. Esistono chip commerciali con numerosissimi oligonucleotidi per poter osservare trascrittomi umani o di altre specie e le diverse forme. Si può ad esempio confrontare i geni espressi nel genoma tumorale e nel genoma normale, osservando cosa si spegne o cosa si accende di differente. DATABASE Si possono poi andare a utilizzare i database, che contengono sequenze del genoma e le informazioni dei trascritti. PROGETTO IMAGE È un progetto degli anni 90’’/2000 e hanno preso RNAm di cuore, cervello e fegato e hanno generato il genoteca, ovvero hanno sequenziato del cDNA, andando ad osservare cosa era espresso nei diversi tessuti. Questo perchè il genoma è lo stesso ma l’espressione è diversa. Hanno trovato quindi cose in comune e cose differenti. Sono stati sequenziati milioni di cDNA, con laboratori di tutto il mondo coinvolti. Questo ha permesso la realizzazione di un database in cui si trova l’espressione di geni specifici per i tessuti e per dei tumori. Questi sono definiti EST, ovvero expressed sequence tags. Ci sono due depositi dbEST e RIKEN. Da questi si può ricavare : Esempio La rhodopsina espressa nei bastoncelli della retina si trova oltre che nell’occhio, nel muscolo, cosa mai minimamente pensata. L’actina si trova invece praticamente ovunque. Ecc. Da queste possiamo direttamente, se necessario, andare a vedere se questo è espresso nel nostro tessuto.  Traduzione & Sintesi Proteica La trascrizione è il porcesso per cui da una molecola di DNA si ottiene una molecola di RNA, spesso si parla della trascrizione degli mRNA che sono quelli che codificano per le proteine. La traduzione è il processo di lettura dell’informazione codificata in un mRNA per sintetizzare la catena polipeptidica. Il DNA ha solo 4 tipi di base azotate: 4 diversi tipi di nucleotidi dalla cui combinazione si ottiene la grande variabilità dei geni; le proteine invece derivano dalla combinazione dei 20 aa. CODICE GENETICO Per capire qual’è il codice genetico, quindi come sono organizzate le sequenze di basi del RNA che codificano per una aminoacido, si sono fatti vari esperimenti che hanno dimostrato che le combinazioni di 3 nucleotidi danno 64 combinazioni sufficienti per i 20 aminoacidi—> il codice genetico è organizzato in triplette. Una volta acquisite le conoscenze per sintetizzare in vitro piccole sequenza di DNA, le triplette, traducendole si ottiene un solo aminoacido questo perchè una tripletta codifica per un solo aminoacido. Se in vitro il sistema di lettura inizia dal primo nucleotide allora si ha l’alternanza di aminoacidi scritta nel DNA. Se si considerano letture diverse delle triplette allora si avrà una sequenza diversa di aminoacidi, tutta a scalare. Per conoscere in modo preciso il codice si introdussero delle molecole per la lettura di sequenze piccolissime di 3 nucleotidi, il legame con il ribosoma e il transfer però non era facilitato per cui 52°. Nella sequenza dell’mRNA solamente 2 aminoacidi sono codificati da un'unica tripletta: la metionina è codificata dalla sequenza AUG—> sempre il primo aminoacido delle proteine; Il triptofano invece è codificato da UGG; Altre sequenze specifiche sono quelle dei 3 codoni di Stop o non senso che sono: UAA UGA UAG CODICE DEGENERE Gli altri aminoacidi sono codificati da diversi codoni: in tutti questi ciò che varia tra i diversi codoni è solamente l’ultima base della tripletta—>è la terza base è quella meno stringente nell’interazione codone- anticodone. La Valina è codificata da 4 possibili sequenze, tutte iniziano con GU variano la terza base. L’Aspartato e l’Acido glutammico sono codificate da sequenze dove i primi due nucleotidi sono uguali, GA, cambia il terzo. La natura ha introdotto i primi due nucleotidi, che sono i più stringenti, in comune ai codoni che codificano per un determinato aminoacido, nel caso avvenisse una mutazione nel terzo nucleotide nel codone o non si ha un cambiamento dell’aminoacido oppure, nel caso in cui comporti l’introduzione di un aminoacido diverso, spesso esso non ha una carica diversa da quello originale e quindi l’impatto della mutazione sulla proteina è spesso silente o comunque non causa danni gravi—>si hanno dei polimorfismi, sono delle variazioni che però portano a generare la stessa proteina. Nei mitocondri il codice genetico è leggermente diverso, ad esempio un codone di stop nella cellula nel mitocondrio diventa codificante per il triptofano. Qualunque RNA messaggero si trova nei databse pubblici ma poiché non è possibile sequenziare direttamente RNA messaggero bisogna sintetizzare il suo cDNA. I database pubblici segnalano la sequenza della metionina e del codone di stop. Sequenza sonic hedgehog solitamente le sequenze di mRNA viene sempre presentano come sequenza di cDNA. Partendo dall’ ATG al codone di stop, la ORF, open reading frame, permette di leggere codone dopo codone predicendo la sequenza del RNA. Dalla sequenza della proteina non si può sapere qual è la vera sequenza del gene proprio per il vacillamento delle terza base—> ci sono tanti possibili codoni che sono validi per lo stesso aminoacido. Quando si ha un qualunque DNA, esso ha 3 cornici di lettura, ORF: 1. Se la lettura, da parte del ribosoma, inizia dal primo nucleotide, AUG, si ha una cornice di lettura aperta, ogni 3 nucleotidi, dalla metionina al codone di stop; 2. Se la lettura, da parte del ribosoma, iniziasse dal secondo nucleotide si avrebbe un codone di stop, un po di aminoacidi, e poi un altro codone di stop—> non si ha una cornice di lettura aperta; 3. Se la lettura, da parte del ribosoma, inizia dal terzo nucleotide, si ha una cornice aperta MUTAZIONI FRAME-SHIFT Le mutazioni possono rompere le cornici di lettura: si può avere una mutazione che porta ad una delezione di un nucleotide sfalsando tutta la cornice di lettura: questo comporta la presenza di diversi aminoacidi diversi e quindi la sintesi di una proteina diversa. Lo stesso vale se viene aggiunto un nucleotide, viene sfalsato tutto—> con l’inserzione di un nucleotide, errore nella replicazione del DNA, si ottiene un proteina mutata. Se varia una base come, ad esempio, nella mutazione dell’anemia falciforme, nel gene dell’emoglobina c’è solo una base diversa dal genotipo wilde type che però porta un cambiamento dall’acido glutammico ad una valina che tende a fare aggregare all’interno dei globuli rossi. Inoltre, variazione di un nucleotide può portare alla inserzione di un codone di stop derivato da un errore di replicazione. RNA TRANSFER Regola: una tripletta corrisponde un solo aminoacido, ma un aminoacido può essere codficato da triplette diverse. Fu Francis Crick che, nel 1955, cercò di capire come la tripletta si abbina ad una aminoacido. È difficile che sia l’aminoacido stesso a riconoscere la tripletta in modo diretto—> ci deve essere un acido nucleico che può appaiare le basi in modo specifico, la molecola adattatore è appunto un RNA transfer. I tRNA vengono trascritti negli eucarioti dall’RNA polimerasi 3 , con promotori forti. Nel genoma si hanno più di 400 geni diversi raggruppati in 49 famiglie che portano a molti transfer. Se si tolgono i 3 codoni di STOP che non legano un RNA: rimangono 61 codoni per 20 aminoacidi—> ogni aminoacido può avere più transfer che lo caricano. I transfer per la serina ad esempio possono avere diversi anticodoni e legano diversi codoni dell’mRNA. Il 15 % dell’RNA trascritto è RNA transfer contro il 5% di mRNA. Nel 1957 Zamecnik e Mahlon dimostraronoche i tRNA sono molecole di RNA a cui è legato un aminoacido in 3’. Questà estremità del tRNA termina sempre con CCA ed è alla adenina che si lega l’aminoacido. La ansa si chiama D perché i nucleotidi sono stati modificati a diidrouridina, è stato ridotto. Ansa PSI perché è l’ansia della pseudouridina dove il ribosio lega il carbonio in 5 Ansa dell’anticodone Stelo accettore che lega l’aminoacido Dunque i tRNA sono spesso rappresentati con una struttura a trifoglio, piuttosto semplicistica, le anse si creano con dovuto appaiamento delle basi complementari in determinate posizioni. Ansa D perché i nucleotidi sono statu modificati con a diidrouridina; Ansa PSI perché i nucleotidi sono modificati con la pseudo-uridina dove il ribosio lega il carbonio in 5’; Ansa dell’anticodone con le 3 basi esposte, Stelo accettore; Queste modificazioni avvengono nel nucleolo, successivamente il tRNA viene trasportato nel citoplasma. In realtà il tRNA nei processi ha un forma a L capovolta dove l’ansa D e l’ansa PSI sono una vicina all’altra e l’anticodone si trova in basso. Le tre basi dell’anticodone sono parallele tra di loro e possono così interagire con il codone dell’mRNA, così posizionate le prime due hanno una poca libertà di movimento, la terza invece dato che si trova proprio nel punto di ripiegamento è un po’ più libera e può vacillare. La traduzione richiede due passaggi di decodificazione: Appaiare l’aminoacido corretto alla sequenza in 3’ del tRNA; Legame tra codone ed anticodone di tRNA carico; ABBINAMENTO DELL’AMINOACIDO CORRETTO SUL t-RNA Questa è l’unica fase della sintesi proteica che richiede ATP, l’energia viene spesa per formare il legame acilico tra tRNA e il suo aminoacido. 1. L’aminoacido ha il un gruppo carbossilico che attacca il fosfato in alfa dell’ATP formando un legame intermedio, aminoacido adenilato. Il pirofosfato ottenuto viene degradato. 2. Questo intermedio, gruppocarbossili-fosfato, viene attaccato dall’ossidrile in 3’ della adenina in 3’ della sequenza CCA del tRNA. 3. L’aminoacido viene trasferito sul tRNA formando il legame acilico tra l’estremità 3’ del tRNA e aminoacido. Esistono in realtà due classi di enzimi che catalizzano la reazione: Enzimi che legano l’aminoacido in 2’ OH del ribosio; Enzimi che legano l’aminoacido in 3’ OH del ribosio; L’RNA ha il ribosio e non il deossiribosio quindi ha due gruppi OH disponibili. L’enzima che se ne occupa è l’aminoacil-tRNA sintetasi ha un sito di legame per l’aminoacido e per l’ATP. Come prima reazione catalizza il trasferimento di AMP della ATP sull’aminoacido e sul carbossile. Successivamente ADP viene rilasciato e l’aminoacido-AMP viene legato al transfer. Esiste un aminoacil-tRNA sintesi per ogni aminoacido, è specifico. Al contrario, più transfer possono legare lo stesso aminoacido. La specificità arriva dal fatto che si hanno diversi anticodoni, sono detti tRNA isoaccettori, legano allo stesso modo l’amminoacido pur avendo anticodoni leggermente diversi. Ci sono molti nucleotidi nello stesso accettore ed essi sono chiavi per il riconoscimento del corretto aminoacido. - Nucleotidi adiacenti a quelli in posizione 3 e 70 sono identici, non la sequenza CCA, ma la porzione adiacente spesso è identica in modo che lo stesso enzima carica lo stesso aminoacido. Tre transfer isoacettori che legano con il legame acilico l’aminoacido. Essendo isoaccettori gli anticodoni sono leggermente diversi—> quello che varia è la prima base dell’anticodone (si legge sempre da 5’ a 3’). La prima base dell’anticodone è quella che varia e corrisponde alla terza base del codone perché sono rovesciati dato che si devono appaiare. Poiché è l’aminoacil-tRNA sintetasi che controlla l’appaiamento corretto aminoacido-tRNA, ci devono essere degli altri punti della traduzione in cui avviene il riconoscimento. C’è una parte vicina al braccio CCA che è molto conservata, il riconoscimento avviene in particolare grazie allo stelo accettore (transfer isoaccettori). APPAIAMENTO t-RNA ISOACCETTORI Normalmente l’mRNA viene scritto con 5’ a sinistra e 3’ a destra, mentre il tRNA al contrario. Un transfer si può appaiare in modo perfetto con l’mRNA oppure avere un appaiamento wobble pairing ovvero c’è un tentennamento del transfer sul codone—> dato che le prime due basi del codone siano molto conservate, il sistema di lettura del ribosoma permette un appaiamento perfetto dei primi due nucleotidi il terzo può essere tentennante. I legami ad H tra codone ed anticodone sono pochi ma vengono stabilizzati e perciò è permessa anche la lettura di transfer che non sia appaiano perfettamente Man mano che si sequenziavano i transfer si è notato che spesso nell’anticodone c’era una base diversa: inosina, deriva dalla adenina mediante idrolisi del gruppo amminico che viene sostituito con un gruppo chetonico. Essa è abbastanza presente nei transfer e favorisce il wobble, fatto dalla prima base dell’anticodone e la terza del codone —> l’inosina può appaiarsi quasi con tutti gli altri nucleotidi a parte la G, guanina. Questa base da grande possibilità al transfer di appaiarsi con diversi codoni che presentano basi differenti tra loro, se c’è una G l’inosina però non riesce ad appaiarsi. L’inosina è una purina, doppio anello, perciò si appaia preferibilmente con U, uracile, e C, citosina, che sono pirimidine, ma si appaia bene anche con la A, adenina. La G, guanina, normalmente si appaia con la C, citosina, ma nel caso del tentennamento riesce ad appaiarsi anche con U, uracile. L’U, uracile, si appaia con A, adenina, e con la G, guanina; La A, adenina, si può appaiare solo con U, uracile L’inosina, I, si può appaiare con A, adenina, U, uracile e C, citosina; Sono sempre un purina con le due diverse pirimidine e la pirimidina con due diverse purine. Come mai è la prima base dell’anticodone che si appaia con la terza base del codone? Le basi dell’anticodone sono parallele tra di loro e si trovano in una regione con una certa restrizione sterica derivante dalla loro conformazione. La prima base dell’anticodone può accomodare un numero di legami ad idrogeno leggermente non classici perché essa si trova in corrispondenza di un punto di ripiegamento. Il tentennamento si spiega guardando la struttura del transfer. SINTESI PROTEICA In questo processo ci sono 3 RNA che hanno un ruolo chiave: 1. mRNA che porta la copia in singolo filamento del DNA, può essere letto a triplette partendo dalla tripletta AUG fornisce la cornice di lettura ed è aperto dalla prima tripletta a al codone di stop; 2. tRNA è un adattatore che permette di leggere i codoni a livello del braccio dell’anticodone e di appaiare il corretto aa, che è mediato dalla aminacil-tRNA-sintetasi. => devi saperlo bene 3. Ribosomal-RNA o rRNA: sono chiave nella sintesi proteica per varie funzioni tra cui formare il legame peptidico. Nella sintesi delle proteine si associa a proteine per formare i ribosomi strutture che funzionano come macchine per la sintesi; All’interno del RIBOSOMA gli aminoacidi vengono uniti dal legame peptidico per formare la proteina. Come si distinguono le dimensioni degli rRNA e delle due subunità? L’unità di misura è chiamata Svedberg, ovvero è un unità che si basa sulla loro disposizione dopo essere stati sottoposti alla forza centrifuga in presenza di un gradiente di cesio. Se si depositano sul basso allora saranno più pesanti se invece rimangono più in soluzione, sono più in alto, saranno più leggeri. Ogni ribosoma è composto da due subunità, una maggiore e l’altra minore: Per i ribosomi dei procarioti sono stati individuati: complesso 70s composto da 30s , subunità minore, e 50s, subunità maggiore; Per i ribosomi degli eucarioti sono stati individuati: complesso 80s composto da 40s, subunità minore, e 60s, subunità maggiore; Le subunità dei ribosomi sono catalogate in base agli rRNA che le codificano: Procarioti: subunità 30s è codificata da rRNA 16s; la subunità 50s è codificata da rRNA 5s e 23s; Eucarioti: subunità 40s è codificata da rRNA 18s; la subunità 60s è codificata da rRNA 5,8s 5, e 28s; Gli rRNA ribosomiali hanno una struttura piuttosto complicata caratterizzata da tanti appaiamenti, come zone a forcine queste si formano in base alla sequenza delle regioni appaiamento che si legano per complementarietà classica della basi dell’acido nucleico. Hanno funzioni strutturali e catalitiche. Gli rRNA vengono trascritti, nei procarioti, come un unico trascritto da cui poi vengono tagliati negli rRNA delle due subunità. Negli eucarioti vengono trascritti dalla RNA polimerasi I a partire da un unico gene in cui è presente l’rRNA 18s e 5.8 s e 28s, essi poi subiscono delle modificazioni nel nucleolo dove sono presenti gli enzimi specifici. I transfer 5s sono trascritti a partire da una altro gene dalla RNA polimerasi II e hanno i promotori più forti delle cellule eucariotiche—> la maggior parte di RNA trascritti sono rRNA e tRNA. Dai trascritti dei due geni si ottengono tutti gli rRNA che andranno a formare le due subunità del ribosoma. Normalmente la conformazione assemblata viene presentata “a bacio di dama” ma solitamente se si osserva dall’alto è differente. Generalmente poi ribosoma eucariotico è più grande di quello procariotico. Il fatto di avere le due subunità permette ai ribosomi di dissociarsi perciò ci deve essere un controllo all’inizio della sintesi proteica per farli riassociare altrimenti le due subunità rimarrebbero dissociate—> l’associazione e la dissociazione dei ribosomi avvengono ciclicamente durante la traduzione. All’interno del rRNA 28s ci sono 3 tRNA che possono essere in parte legati alla subunità maggiore e in parte alla subunità minore—> i transfer spaziano tra la subunità minore, su cui si trova il messaggero da leggere, la subunità maggiore in cui di trova il sito catalitico per la formazione del legame peptidico. Esternamente ci sono le proteine ed internamente c’è l’rRNA. Sito A e P spaziano dalla subunità minore alla subunità maggiore, in questi siti avviene l’interazione tra codone-anticodone L’anticodone si trova all’interno della subunità maggiore, il codone nella subunità minore dove c’è il canale di legame con mRNA. Il sito E è quasi tutto nella subunità maggiore. L’aminoacido legato al tRNA è nella subunità opposta all’anticodone. Sito A= legame dell’aminoacil-tRNA, ovvero il tRNA legato ad un aminoacido; Sito P= sito di legame del peptidil-tRNA —> al centro si ha la catena polipetidica nascente che rimane legata al transfer. Sito E = è il sito da cui esce il tRNA scarico dopo che ha trasferito il peptide nascente sull’aminoacido. Il legame tra la subunità maggiore e la subunità minore è ciclico. La sequenza AUG del’mRNA viene posizionata in modo preciso sul ribosoma—> al centro della subunità minore del ribosoma. Il primo transfer, che lega la metionina, si lega al codone, a livello del sito P e solo dopo si assembla la subunità maggiore. Il tRNA iniziatore si trova sul sito P, l’aminoacil-tRNA si lega nel sito A ed inizia la sintesi proteica. Quando poi si raggiunge il codone di STOP il complesso di slega. Nei procarioti man mano che viene sintetizzato il mRNA appena è disponibile il sito AUG si lega il ribosoma e si ha una trascrizione parallela alla traduzione. Questo perché nei procarioti non c’è distinzione tra citoplasma e nucleo; l’mRNA è già maturo. Negli eucarioti la trascrizione avviene nel nucleo e la traduzione nel citoplasma; inoltre mRNA deve maturare prima di poter essere tradotto. La traduzione di un mRNA viene svolta da tanti ribosomi che lavorano in contemporanea: si lega il primo che traduce, non appena si sposta dalla sequenza AUG si lega il secondo e così via poi. Si ha un poliribosoma che è un complesso piuttosto pesate. Per studiare le proteine prodotte in quel momento dalla cellula generalmente si deve purificare il poliribosoma. Nella cellula eucariotica i ribosomi si trovano nel citoplasma e nel RER. Mettendo tanti ribosomi sulla stessa molecola di messaggero la produzione della proteina è molto più veloce ed efficiente. La traduzione come la replicazione e la trascrizione avviene in una unica direzione da 5’ a 3’. La crescita dalla proteina va dal ammino-terminale al carbossi-terminale questa direzionalità dipende da come è legato al transfer l’amminoacido. REGOLA: la sequenza di aminoacidi viene data da N-term—> C-term Questa convenzione corrisponde alla direzione di sintesi. FORMAZIONE LEGAME PEPTIDICO L’aminoacido viene legato o all’estremità 3’ OH del ribosio o all’estremità 2’ OH dall’enzima aminoacil- tRNA sintetasi che ha un tasca per il legame tra aminoacido e tRNA e una tasca per l’ATP perchè serve energia. La reazione avviene in due passaggi: 1. L’aminoacido forma un intermedio con la sua estremità Carbossi-terminale con AMP, e si rilascia il prifosfato; 2. L’aminoacido viene trasferito nell’altro sito, si lega con il tRNA tramite legame acilico con ossidrile in 3’ o in 2’ dipende dalla classe di aminoacil-tRNA-sintetasi. È il gruppo Carbossi- terminale che si lega con il tRNA, l’estremità Ammino-terminale rimane libera. È un legame ad alta energia e favorisce la formazione del legame peptico nel ribosoma; Ci sono due transfer uno nel sito P, a cui è legata la catena polipeptidica nascente; ed uno nel sito A, è un aminoacil-tRNA, tRNA a cui è legato un singolo aminoacido. È la catena polipeptidica che viene trasferita sul nuovo transfer entrato nel sito A. Il gruppo amminico che è libero, ha l’azoto che può attaccare il carbonio del gruppo carbossilico se si trova una distanza opportuna per la formazione del legame covalente con il l’aminoacido del tRNA. La catena polipeptidica si trasferisce sul transfer con l’aminoacido entrante, questo tRNA poi si posta nel sito P e quello che era sul sito P viene fatto uscite dal sito E. Chi è che posiziona il modo perfetto i transfer per permettere che si formi il legame aminoacidico? Il catalizzatore di questa reazione è l’ rRNA non le suo proteine—> è chiamato ribozima perché ha attività enzimatica. Struttura cristallografica Ci sono delle basi azotate molto conservate nel sito catalitico del rRNA, qui c’è solo RNA non proteine. La terminazione del transfer in CCA permette l’interazione tra il tRNA e rRNA—> si formano legami ad H, che seguono le regole di appaiamento classico delle basi tra CC del tRNA e GG del rRNA. È questo che permette al tRNA iniziatore di posizionarsi esattamente in corrispondenza dal sito P. Anche il transfer che entra nel sito A viene posizionato in modo corretto dai legami ad H che si formano tra le sue basi e quelle del rRNA—> per questo motivo sono basi conservate in tutti i transfer, sono quelle che permettono di formare le interazioni responsabili del corretto posizionamento dei due tRNA ad una distanza tale da formare il legame peptidico. Queste informazioni sono state ottenute grazie all’analisi cristallografiche di veri ribosomi legati ai transfer. La traduzione ha 3 fasi: 1. Fase di inizio; 2. Estensione; 3. Terminazione INIZIO Il ribosoma deve individuare la sequenza AUG del mRNA e appaiare essa il tRNA iniziatore che porta con se la metionina. Metionina: Esistono i tRNA per la metionina che va a comporre le proteine; Esistono i tRNA per la metionina iniziatrice; Il tRNA iniziatore è modificato: la metionina lega con il suo carbossi-terminale all’ossidrile in 3’, il gruppo amminico della metionina è bloccato da una molecola di formile posizionato dall’enzima met-tRNA- transformilasi per bloccare l’interazione del gruppo amminico con altri aminoacidi. Normalmente poi il formile viene rimosso dall’enzima deformilasi è una delle caratteristiche del tRNA iniziatore nei procarioti. Inizialmente avviene un legame tra subunità minore ed mRNA; poi tra mRNA, con AUG nel sito P, e il tRNA iniziatore. Solo dopo il ribosoma si chiude con l’aggancio della subunità maggiore. La strategia usata da eucarioti e procarioti è motto diversa; ma d’altra parte anche i tRNA sono piuttosto diversi. PROCARIOTI A monte di AUG, 15 nucleotidi, si trova la sequenza di Shine Delgarno che è molto conservata ed è caratteristica di tutti i trascritti procariotici. La sequenza AUG deve essere posizionata sul sito P. Per capire qual è AUG, dato che in base alla cornice di lettura ce ne sarebbero tanti, si guarda se c’è una sequenza a monte molto conservata, Shine Delgarno, essa forma dei legami ad H che l’appaiano con rRNA 16s della subunità minore. È questa l’importanza del rRNA nella subunità minore: è il 16 s che ha delle sequenza che si appaino perfettamente alla sequenza di Shine Delgarno e in questo modo AUG si posiziona perfettamente nel sito P. Bisogna inserire sempre la sequenza di Shine Delgarno per far produrre le proteine nei procarioti, batteri. Con unico promotore nei procarioti si producono degli RNA messaggeri policistronici—> nel trascritto ci sono molte sequenze di Shine Delgarno, dette RBS ribosome bounding site, si trovano a monte di una decina di basi da AUG. Sull’mRNA policistronico le sequenze RBS sono alternate ai codoni di STOP. In definitiva nei batteri il legame del messaggero con la subunità minore è mediato da una sequenza di RNA che si appaia al 16s, sequenza di Shine Delgrano—> non avviene negli eucarioti. La subunità minore deve accomodare in un canale l’mRNA e grazie alla sequenza di Shine Delgarno posiziona AUG nel sito P. Si deve poi legare RNA iniziatore con l’anticodone e poi i può legare la subunità maggiore. L’inizio della traduzione richiede che: 1. Il ribosoma si associ all’mRNA 2. Un tRNA carico si posizioni nel sito P 3. Il ribosoma sia posizionato correttamente sul sito di inizio. L’esatto positivamente del ribosoma sul codone di inizio è cruciale: fissa la corretta lettura per la traduzione (reading frame) Perché non si lega subito la sub maggiore? Ci sono i fattori di inizio, IF1 IF2 e IF3 che si legano alla subunità minore e schermano l’attacco di quella maggiore fino a quando la prima non è pronta. Quando la subunità minore è libera IF3 occupa il sito E —>la subunità maggiore non può legarsi. Per evitare che il tRNA iniziatore si leghi per sbaglio al sito A ci sono i fattori IF1 ed IF2 legato a GTP che occupano il sito A. Il transfer con la formil-metionina si appaia perfettamente con il sito P perché è l’unico libero. Quando IF 3 viene rilasciato la subunità maggiore si assembla e si chiude il ribosoma, in questa conformazione IF2 interagisce con la subunitàmaggiore. Nel momento in cui il transfer si lega esso interagisce in modo stretto con IF2 che è lega al GTP, questo attiva la sua attività GTPasica ed idrolizza il fosfato in gamma del GTP—> permette il rilascio di tutto il complesso dei fattori e il ribsoma è pronto per accettare il primo tRNA nel sito A. I fattori IF si chiamano initiation factors e hanno due funzioni: 1. Impedire che il transfer si leghi nel sito inappropriato; 2. Impedire che il ribosoma sia completo e chiuso subito in modo che la subunità minore rimanga libera per legarsi prima a mRNA e tRNA iniziatore; La sintesi proteica è molto basata sull’attività GTPasica —> la scissione di GTP in GDT è alla base della variazione conformazionale delle proteine mentre l’attività ATPasica è alla base della formazione dei legami. Lo stesso modo nella trasduzione del segnale alla base c’è idrolisi del GTP. Nessun mRNA inizia con la sequenza AUG prima c’è sempre una regione di 5’ nTraslato.  EUCARIOTI L’mRNA eucariotico ha subito delle modificazioni post-trascrzionali, perciò ha un CAP al 5’ e la sequenza del 5’ non traslato è piuttosto lunga. 1986, Kozak M bioinformatico : Aveva a disposizione il sequenziamento di tanti cDNA, sequenziati con metodo di Sanger. Ma le sequenze AUG negli eucarioti ha attorno sequenze conservate o piuttosto causali? Per rispondere egli ha osservato e studiato i geni depositati nel database pubblico ha trovato che AUG ha spesso seguita da una G e preceduta da una purina C-C. La purina è in pozione 3 rappresenta la sequenza consenso di Kozak. Per gli eucarioti ci sono dei fattori di inizio detti eIF. Sul ribosoma ci sono: eIF3 si lega al sito E è un fattore molto allungato perché scherma anche il canale del messaggero che non può entrare finchè non la subunità non è pronta; eIF1A si lega al sito A Non essendoci la sequenza di Shine Delgarno la cinetica di legame è diversa: 1. Il tRNA iniziatore arriva sulla subunità minore accompagnato da eIF2 e il GTP —> viene detto complesso ternario: tRNA iniziatore + eIF2 + GTP; 2. Il ribosoma con tRNA, eIF2, eIF3 sul sito P e eIF1A sul sito A e eIF2 viene detto complesso 43s; 3. L’mRNA ha un cap al 5’ che è molto importante per regolare la traslazione. Esso viene legato da eIF4E, riconosce il cap. 4. Si reclutano eIF4G ed eIF4A; 5. Interviene anche un elicasi—> eIF4B attiva l’attività elicasica di eIF4A che rompe le regioni a forcina che si possono essere formare in seguito al movimento di mRNA da nucleo a citoplasma;  L’mRNA grazie ad interazione con i fattori eIF in particolare con eIF3 riesce ad entrare nel canale solo se è legato da eIF4E. Nel momento in cui i fattori eiF4 entrano nella subunità minore del ribosoma eiFA si attiva grazie a scissione di GTP—> fa scorrere l’mRNA e quando c’è appaiamento perfetto con AUG si attiva l’attività ATPasica di eIF2, vengono rilasciati tutti i fattori a parte 1° che richiama eIF5B GTP, non c’è più la schermatura della subunità maggiore che quindi si aggancia. Si attiva l’attività atpiasica di eIF5B , si liberano i due siti e rimane occupato il sito P con tRNA iniziatore. La coda poliA è coperta da delle proteine che la legano, esse interagiscono anche con eIF4G formando il poliribosoma circolare Esistono i trascritti policistronici in eucarioti? No, nel genoma eucariotico non esistono. Ma esistono nei virus che infettano gli eucarioti, essi possono avere un trascritto e far agganciare il ribosoma in diversi punti—> sequenze virali dette IRES (internal, ribosomal entry site). Il 5’ del mRNA virale ha il cap perché devono essere trascritti dalle cellule eucariotiche. Essi sfruttano la loro corta sequenza che porta a trascritti policistronici. La sequenza IRES interagisce e si lega a eIF4G, esso a sua volta interagisce con eIF3 e posiziona il ribosoma in un punto preciso. Si possono sfruttare le sequenze IRES nel genoma umano per fare esprime l’insulina nelle cellule eucariotiche. Nel momento in cui entra il DNA nella cellula a cui si vuol fra produrre la proteina. Il trascritto con il cap, contiene geni informazioni per l’insulina, ha delle sequenze IRES a cui si lega poi il ribosoma; esso contiene anche il gene per il colore blu beta-galattosidasi, e poi si ha la coda poliA. Essendo i due geni nello stesso RNA per capire se la cellula ha prodotto le proteine di interesse si guarda se la cellula ha espresso i geni della beta-galattosidasi. Filmato => Man mano che avviene la lettura dei codoni e l’appaiamento degli anticodoni nella subunità minore, la proteina viene prodotta come sequenza primaria e immediatamente acquisisce già la sua struttura secondaria. Questo perchè la struttura secondaria è definita dalle sequenze di amminoacidi e le interazioni tra questi. ALLUNGAMENTO Abbiamo il transfer iniziatore con la metionina e andremo a vedere come viene accompagnato il transfer per i vari amminoacidi, e come viene testata l’interazione codone-anti codone. Entra nel sito A. Deve poi formarsi il legame peptidico e trasferire la metionina da P ad A. Tutto poi slitta. Il transfer slitta nel Sito E, l’altro in P, e A rimarrà libero. Tutto può poi così ripartire. La fase di allungamento avviene in modo identico in procarioti ed eucarioti, i nomi dei fattori che useremo sono quelli degli eucarioti. Abbiamo nel sito P il transfer iniziatore con la metionina. L’appaiamento va testato, se è corretto e complementare , se la geometria di distanza tra i due aminoacidi è tale che il gruppo aminico può attaccare il carbossile e trasferire l’aminoacido per formare il legame peptidico. Per leggere il prossimo codone il complesso si muove, portando il transfer nel sito di uscita e poi un altro nel sito nascente. SITI ATTIVI RIBOSOMA Ne abbiamo uno nella subunità minore in cui viene testato l’appaiamento codone-anti codone. Si ha poi il sito della peptidil transferasi. Questa è in grado di trasferire la catena polipeptidica nascente da T ad A, per poi essere trasportato l’intero complesso in P. Il legame peptidico è catalizzato dall’RNA ribosomiale, detto ribozima. In queste reazioni di catalisi di macromolecole in realtà sono gli ioni metallici, la struttura del sito catalitico, permette l’attacco dei due aminoacidi. Questa fase prevede tre eventi chiave che devono avvenire affinche’ ogni amminoacido venga aggiunto correttamente. Primo, l’ amminoacil- tRNA corretto viene caricato sul sito A, come determinato dal codone presente nel sito. Il secondo passaggio e’ la reazione di peptidiltransferasi che avviene fra la catena peptidica del peptidil-tRNA nel sito P e l’ amminoacil-tRNA del sito A, con conseguente trasferimento della catena peptidica sul tRNA nel sito A. Terzo, il risultante peptidil-tRNA nel sito A e il codone ad esso associato devono essere traslocati nel sito P. Qui c’e’ bisogno di precisione per mantenere la corretta cornice di lettura. Due proteine ausiliarie note come fattori di allungamento controllano questi eventi. Differentemente dall’ inizio, il processo di allungamento e’ altamente conservato sia in procarioti che in eucarioti  FATTORI DI ALLUNGAMENTO Sono due EF-Tu ed EFG. I transfer nel citoplasma sono legati a EF-Tu, il quale scorta l’amminoacido-tRNA al sito A, schermando l’aminoacido in modo che non possa formare legami peptidici indesiderati. Solo quando il transfer si sistema in modo perfetto, EF-Tu finisce in una regione del ribosoma detta centro di legame del fattore. Nel momento in cui la proteina si posiziona perfettamente nel centro di legame del fattore, si attiva l’attività GTP-asica. Viene rilasciato il fosfato e si ottiene GDP. Questo cambia la conformazione della proteina provocando il distacco dal transfer. L’aminoacido a questo punto ruota. APPAIAMENTO CODONE-ANTICODONE A volte non si appaia correttamente, anche solo due nucleotidi sono in grado di stabilizzare il legame infatti. Quando i primi due nucleotidi del codone si attaccano correttamente infatti si possono formare nuovi legami che stabilizzano. Per questo il terzo si può legare anche in modo scorretto. Avviene un errore ogni 1000 amminoacidi. Ci sono poi sistemi di controllo successivi. POSIZIONAMENTO tRNA Si legano tutti storti con una geometria che favorirà il legame peptidico. Dopo il legame con EG-Tu ruota, avviene poi il trasferimento del peptide del nuovo aminoacido. L’attività della peptidil transferasi li porta. Ha una geometria tale in cui il gruppo aminico legato al transfer, nel sito A, riesce ad attaccare il gruppo carbossilico legato al transfer nel sito P. In questo modo l’intero peptide è trasferito al transfer nel sito A. Questo transfer dunque rimane vuoto e tende a occupare così il sito E. CICLO DI ESTENSIONE Nel momento in cui il peptide è trasferito dal sito A, qui deve entrare un nuovo codone. Per slittare interviene il fattore EFG, sempre legato al GTP. Abbiamo quindi il trasferimento del peptide e dobbiamo muovere tutto. EFG-GTP è chiuso e riesce a entrare nel sito del legame del fattore. Questo è fondamentale perchè una volta entrato attiva attività GTP-asica, si forma GDP e permette di allungare la molecola. Il complesso infatti si apre, si sblocca il ribosoma aprendo in modo allosterico i cancelli fra i siti A,P, E. Inoltre il complesso EFG-GDP si lega al sito A, competendo col tRNA che si sposta nel sito P, e quello nel sito P nel sito E. Si spostano anche i tre nucleotidi nell m- RNA a causa dell’appaiamento codon- anticodon. Ruota la subunità minore e si torna al complesso di partenza. CICLO CAMBIO COMFORMAZIONALE Si parla di mimetismo molecolare, ovvero le molecole hanno una conformazione diversa che sembra uguale. Il viola è il transfer a cui è legato EF-Tu, ha attività ATP-asica. EFG dopo aver subito la rottura è molto simile, con una struttura che assomiglia proprio a un transfer. Il primo è un RNA legato a una proteina, il secondo solo una proteina con GDP. Abbiamo dunque dei cicli per questi cambi di conformazione. EFG ha bassa affinità con GDP, che viene subito rilasciato. Si riforma GTP e da una conformazione aperta EFG torna a conformazione chiusa. Le molecole vengono così sempre riciclate. Negl eucarioti EFG si chiamerebbe eEF2.  TERMINAZIONE Man mano che la proteina cresce, alla fine si arriva a un codone non senso, detto codone di stop, ovvero per i quali non esiste un transfer. Vengono richiamati così dei fattori detti fattori di rilascio. Questi sono in grado di attivare l’idrolisi del polipeptide dal peptidil- tRNA. Nei procarioti: riescono a legare diversi codoni non senso: RF1, RF2, Negli eucarioti : ce n’è solo uno : eRF1 Il sito A viene occupato d a una proteina, proprio il releasing factor. La proteina viene legata dal RF3 che agisce su RF1 o RF2 per staccarlo. Il Release factor ha una struttura molto simile a un tRNA, altro esempio dunque di mimetismo molecolare. Come fanno i fattori di rilascio a riconoscere il codone di stop? Dato che sono composti interamente di proteine, si verifichera’ un’ interessante interazione proteina-RNA. Si e’ identificata una regione di 3 amminoacidi (glicina, glicina, glutammina GGQ) cruciale per la specificita’ del fattore di rilascio, chiamata anticodone peptidico, che interagisce coi codoni di stop dell’ mRNA. La prima immagine mostra una struttura tridimensionale dove e’ evidente il legame di RF1 all’ anticodone nel sito A. Si vede l' anticodone peptidico in prossimita' del codone di stop, ma ci sono probabilmente anche altre strutture che contribuiscono alla specificita' del fattore, interagendo pero' con delle parti del ribosoma stesso. La seconda immagine mostra un' altra forma di interazione, questa volta fra RF1 e l' estremita' 3' del peptidil-tRNA che si trova nel sito P Viene richiamata una molecola di acqua dalla sequenza GGQ e avviene l’idrolisi con il rilascio del peptide con il t-RNA. Abbiamo dunque concluso che in qualche modo i fattori di rilascio di classe I inneschino il distacco della catena polipeptidica neoformata dal tRNA mediante una reazione idrolitica. A questo punto, il fattore di classe I deve essere rimosso dal ribosoma. Questo compito e' svolto da RF3. RF3 pero' ha un' affinita' maggiore per il GDP che per il GTP e pertanto RF3·GDP sara' la forma prevalente. RF3·GDP si lega al ribosoma dipendentemente dal fattore di classe I. Il rilascio del polipeptide fa avvenire un cambiamento conformazionale del ribosoma e del fattore di classe I, che viene anch' esso rilasciato: contemporaneamente, RF3 scambia il GDP per il GTP. RF3·GTP si lega con alta affinita' al ribosoma: si ha pertanto uno stato intermedio, nel quale RF3·GTP si lega al sito di legame del fattore nella subunita' maggiore. Questo a sua volta stimola l' idrolisi del GTP: RF3·GDP, avendo una bassa affinita' per il ribosoma, viene rilasciato. Con questo processo dunque si ha l' uscita di tutti i fattori di rilascio. DISASSEMBLAGGIO RIBOSOMA Le due subunità insieme ai due tRNA deacetilati nei siti P ed E devono essere tutti disassemblati affinche' il processo di traduzione possa ricominciare per quel ribosoma. Nei procarioti incontriamo un fattore di riciclaggio del ribosoma detto RRF. Esso agisce insieme a EF-G e IF3 (ricordiamo che al momento dell' inizio della traduzione IF3 sia gia' assemblato sulla subunita' minore). RRF si lega al sito A vuoto dove simula un tRNA. Esso recluta inoltre EF-G-GTP sul ribosoma. Avviene la reazione EF-G-GTP -> EF-G-GDP + Pi (similmente come nell' allungamento) che favorisce il rilascio dei due tRNA dai siti P ed E: conseguentemente a cio', RRF si muove dal sito A al sito P (imitando lo spostamento del peptidil-tRNA durante l' allungamento). A questo punto, RRF, EF-G-GDP e l' mRNA vengono rilasciati dal ribosoma mentre IF3 opta per un legame alla subunita' minore (favorira' l' inizio del prossimo ciclo di traduzione). Anche se RRF imita il tRNA, questo e' vero fino a un certo punto: le interazioni fra RRF e ribosoma sono, tutto sommato, piu' deboli da quelle fra tRNA e ribosoma, per il fatto che RRF deve essere rilasciato direttamente dal sito P (ricordiamo che il destino del tRNA e' solitamente quello di passare al sito E prima di uscire). REGOLAZIONE TRADUZIONE Gli errori di replicazione sono molto rari : ogni 10^9-10^10, questo perchè se si stabilizza una mutazione qui questa viene trasmessa ed è estremamente problematico. Gli errori nella trascrizione sono ogni 10^4-10^5, tanto RNA è una molecola di transisto poco stabile. Gli errori nella traduzione sono ogni 10^3-10^4, tanto ci sono numerosi sistemi di controllo, nel caso in cui una proteina sia sbagliata questa viene degradata. I controlli nella traduzione avvengono principalmente nell’ appaiamento con il codone e nelle sequenze all’inizio da trascrivere. Il controllo di copia è un compromesso tra velocità e accuratezza, nonchè dispendio energetico. Il 40% degli antibiotici bloccano la sintesi proteica. Agiscono molto nella sintesi proteica. Ad esempio la puromicina va a legarsi nel sito A, sia su procarrioti che eucarioti. Può essere letale proprio perchè agisce nella sintesi proteica. Si mette nel sito A, sostituendosi a un amminoacil-tRNA nella reazione di peptidiltransferasi. Dato che la puromicina non si lega fortemente al ribosoma, la catena proteica che e' ora legata alla puromicina viene rilasciata insieme alla puromicina stessa, e la sintesi proteica ha fine. Nei PROCARIOTI avviene molto controllo dell’espressione nella sequenza di Shine-Delgarno e le sequenze adiacenti. Ci sono sequenze regolatorie nelle vicinanze della sequenza di Shine-Delgarno e AUG. Questo perchè se andasse direttamente su SD, uguale per tutti RNAm, andrei a bloccare tutta la traduzione. In questo modo ne vengono bloccati solo di specifici. Ci sono dunque dei sistemi di autocontrollo in cui la proteina stessa prodotta si lega al proprio RNA quando è in eccesso. L’altro sistema è l’assunzione di informazioni chiuse. Ci sono conformazioni per esempio che si aprono solo quando il primo gene viene prodotto. Ci sono delle regolazioni sopratutto nelle sequenze di Shine Delgarno e AUG. Anche gli EUCARIOTI hanno sistemi di controllo. Regolazione su fattori di riconoscimento e iniziatori Ci sono condizioni legate a uno stress (deprivazione di nutrienti o altro) in cui la cellula decide di rallentare la sintesi proteica in quanto ci sono una serie di proteine che non stanno acquisendo la conformazione corretta. Ci sono sensori che portano alla fosforilazione del fattore elEF2, in questo modo si inibisce l’attività del fattore di scambio per GTP, non riesce a legare il transfer e non può iniziare la sintesi. Non è legata a un gene specifico ma in generale rallenta la sintesi proteica. Solo se legato a GDP elEF2 funziona, solo che nel momento in cui diminuiscono i livelli di GTP il sistema tende a riformarlo a discapito di elF2-GDP, portando dunque all’inibizione della traduzione. eIF4E va ad attivare la sintesi proteica. Si può legarsi una proteina 4E-BP, binding protein, che lega il fattore impedendo così che avvenga la traduzione, in quanto non può più legarsi eIF4G. Una kinasi detta m-Tor, va a fosforilare 4E-BP impedendole di legare il fattore. In questo modo questa kinasi fa sì che non si blocchi più la sintesi proteica e questa procede. Una sovraespressione di eIF4E può però portare a trasformazioni tumorali. Per questo gli inibitori di mTor sono sostane particolarmente chemioterapici. Ci possono poi essere dei sistemi più specifici per particolari geni. Ad esempio quando ci sono eccessi di ioni ferro, che portano tossicità nelle cellule ma che sono molto importanti come cofattori. Viene così prodotta ferritina, una proteina in grado di legare il ferro. C’è una sequenza complementare che forma una forcina, IRE. Solitamente abbiamo attività elicasica di elF4 per togliere questa forcina. In questo caso si lega IRP all’IRE in modo che non possa disfarsi e non possa proseguire la traduzione, nel caso in cui si sia poco Fe2+. Se la proteina è legata al ferro, perchè ce ne è molto, IRP si legherà a elF4 perdendo la capacità di legare IRE, e la traduzione continua.  DANNI A mRNA Nei PROCARIOTI quando ci sono mutazioni che non hanno il codone di stop, la traduzione va in stallo perchè non riesce a reclutare i fattori necessari. Viene così richiamato un fattore detto tmRNA SSrA, è un’unica molecola di RNA chimerica, mix tra un transfer e un messaggero. In 5’ ha struttura del transfer con legato un AA (alanina) ed è legata a una porzione allungata che fungerà da RNAm. Può così venire legato da EF-Tu-GTP ed entrare nel sito A del ribosoma e partecipa alla reazione della peptidil transferasi. La traslocazione ha come risultato il rilascio dell’mRNA danneggiato. Negli EUCARIOTI ci può essere un decadimento mediato da codoni non stop in cui gli mRNA sono privi del codone di stop, in questo modo viene prodotta anche la coda di poli-A, aggiungendo una serie di lisine (in quanto vengono prodotte UUU che codificano per questo AA) La proteina che si formerà avrà una porzione carbossi-terminale di sole lisine. Il ribosoma è portato a uno stallo, che provoca il distacco dello stesso e la degradazione dell’mRNA. Vengono richamati fattori che riconoscono RNA come anomalo e vengono richiamare le RNAasi. In entrambi i casi c’è una sorta di etichetta terminale che porta alla degradazione. Quando un mRNA ad esempio contiene un codone di stop prematuro, questo blocca troppo presto la traduzione —> decadimento dell’mRNA mediato da codoni non senso. Il riconoscimento di questi codoni prematuri avviene grazie all’assemblaggio di complessi proteici che rimangono legati al complesso di giunzione di splicing (esone-esone), che solitamente sono spiazzati quando il ribosoma traduce mRNA. Se c’è un codone prematuro il ribosoma si stacca prima che avvenga lo spiazzamento, si attiva così la degradazione dell’mRNA con rimozione del CAP 5’ grazie al richiamo di proteine Upf.