Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica Lezione PDF

Biochimica clinica e biologia molecolare clinica Prof.ssa Barbara Cellini Dipartimento di Medicina sperimentale Edificio D piano 2° Tel. 075 5858339 [email protected]  Testi consigliati Lauro Gal...

Biochimica clinica e biologia molecolare clinica Prof.ssa Barbara Cellini Dipartimento di Medicina sperimentale Edificio D piano 2° Tel. 075 5858339 [email protected]  Testi consigliati Lauro Galzigna Introduzione alla Biochimica patologica e clinica Ed. Piccin Elisabetta Albi Biochimica clinica essenziale Ed. Zanichelli Marcello Ciaccio, Giuseppe Lippi Biochimica clinica e medicina di laboratorio EdiSES  La BIOCHIMICA CLINICA è una branca della Medicina di laboratorio che studia i parametri biochimici di campioni provenienti dall’uomo per ottenere informazioni su processi fisiologici e/o patologici Diagnosi e determinazione della PRELIEVI LIQUIDI: terapia Sangue Urine Saliva Monitoraggio della terapia Liquido amniotico Liquidi intrarticolari Prognosi da Studi di screening -CENTRO PRELIEVI -REPARTI OSPEDALIERI  Organizzazione del laboratorio analisi Il laboratorio analisi è una Medici, biologi, chimici, struttura che esegue esami con farmacisti, tecnici di metodi chimici, fisici o biologici laboratorio, personale su campioni di pazienti e ausiliario e amministrativo produce risultati analitici corredati da giudizi diagnostici Area accettazione Area chimica clinica Area ematologia Area esame urine Area immunochimica Area coagulazione... Area microbiologia  Tipologie di analisi Esami di routine Referto in ore o giorni Esami in regime di urgenza Referto in 1-3 ore Esami in regime di emergenza ü TEST INIZIALI Referto nel più breve tempo possibile ü TEST DI APPROFONDIMENTO ü TEST DI CONTROLLO  Fasi dell’analisi Analisi qualitative (tampone rapido Preparazione e Check-in del Covid) trasmissione del campione Analisi Fase Fase referto Trattamenti Fase analitica quantitative preanalitica preanalitici (es. (dosaggio glicemia) postanalitica Conservazione e archiviazione del centrifugazione) Analisi semi- campione quantitative (stick esame urine)  Variabilità Variabilità preanalitica Variabilità postanalitica Variabili legate al Errata valutazione dei Errato inserimento dei Variabili legate al paziente campione risultati dati Appropriatezza della richiesta, identificazione Variabilità pre-pre- Variabilità biologica del campione, campione analitica insufficiente o coagulato o emolizzato Dieta, digiuno prolungato, Genere, etnia, età, fumo, esercizio fisico, gravidanza, variabili consumo di alcol, stagionali, variabili altitudine, stress mensili,... psicologico,...  Variabilità pre-analitica Il brain-to-brain loop descrive tutte le fasi che attraversa il processo di acquisizione di un’informazione Circa il 60% di tutti gli errori di laboratorio sono relativi alla fase pre-analitica. Nel sistema FRONT-END l’automatizzazione consente un risparmio di tempo e una maggiore sicurezza.  Errori delle prestazioni analitiche Dipende da fattori casuali imponderabili Diminuisce se si fanno misure ripetute e si applica l’analisi statistica Imprecisione Ha delle cause definite che possono dipendere dal metodo o dalla strumentazione utilizzata Errore Determina una deviazione identica per tutti i dati (sovrastima o sottostima) sistematico Dipende dalla errata applicazione di un metodo o da errate pratiche di laboratorio Errore Può essere evitato dalla definizione e dal rispetto di protocolli standard grossolano  Valutazione delle prestazioni analitiche Popolazione: insieme di tutte le unità alle quali si riferisce un’analisi statistica Campione: sottogruppo di unità rappresentativo della popolazione  Valutazione delle prestazioni analitiche La valutazione si basa su VALORI DI RIFERIMENTO o VALORI DI NORMALITA’ Cut-off quantitativo Misura di un certo valore in un numero elevato di soggetti sani e analisi della DISTRIBUZIONE dei dati in classi di frequenza. Si individua un RANGE DI NORMALITA’ mediante vari metodi fra cui quello parametrico rappresentato da una gaussiana  Valutazione delle prestazioni analitiche Per la descrizione dei dati si usano: Misure di tendenza centrale Misure di dispersione  Valutazione delle prestazioni analitiche Per la descrizione dei dati si usano: Misure di tendenza centrale Misure di dispersione Varianza La varianza è la media del quadrato degli scarti. La deviazione standard è la radice quadrata della varianza ed è espressa nella stessa unità di misura della misura del campione Deviazione standard  Valutazione delle prestazioni analitiche I percentili dividono la popolazione in parti uguali alle quali corrisponde una % della distribuzione. La distribuzione dei dati più frequente nelle variabili biologiche di interesse in laboratorio è la distribuzione normale o gaussiana. La distribuzione gaussiana è definita dalla media e dalla deviazione standard. È una curva simmetrica in cui media mediana e moda coincidono Valutazione delle prestazioni analitiche Precisione Accuratezza Sensibilità Specificità Linearità  Valutazione delle prestazioni analitiche PRECISIONE: è il grado di concordanza fra misure ripetute indipendenti dello stesso campione in condizioni sperimentali definite. -ripetibilità o precisione entro il run -precisione intermedia o precisione entro il laboratorio -riproducibilità inter- laboratorio  Valutazione delle prestazioni analitiche PRECISIONE: è il grado di ACCURATEZZA: è il grado concordanza fra misure di concordanza fra il ripetute indipendenti valore vero (o di dello stesso campione in riferimento) e il valore condizioni sperimentali medio ottenuto da una definite. serie di misurazioni. Si esprime come bias, cioè -ripetibilità o precisione come differenza fra il entro il run valore medio dei -precisione intermedia o replicati e il valore vero. precisione entro il Può essere calcolato laboratorio anche come recupero -riproducibilità inter- utilizzando uno standard laboratorio interno  Valutazione delle prestazioni analitiche PRECISIONE: è il grado di ACCURATEZZA: è il grado concordanza fra misure di concordanza fra il ripetute indipendenti valore vero (o di dello stesso campione in riferimento) e il valore condizioni sperimentali medio ottenuto da una definite. serie di misurazioni. Si esprime come bias, cioè -ripetibilità o precisione come differenza fra il entro il run valore medio dei -precisione intermedia o replicati e il valore vero. precisione entro il Può essere calcolato laboratorio anche come recupero -riproducibilità inter- utilizzando uno standard laboratorio interno  Valutazione delle prestazioni analitiche SENSIBILITA’ ANALITICA: è il limite inferiore Limite di rivelabilità o limite di a cui il metodo analitico è in grado di sensibilità (LOD) identificare e/o quantificare un analita E' la concentrazione più bassa dell'analita che può essere distinta in modo affidabile dal LoB e alla quale è possibile il rilevamento Limite di quantificazione (LOQ) E' la concentrazione più bassa Segnale alla quale l'analita non solo può essere rilevato in modo affidabile ma può essere quantificato in modo preciso Concentrazione dell’analita  Valutazione delle prestazioni analitiche LINEARITA’: capacità di dare risultati che siano direttamente proporzionali alla concentrazione dell’analita in esame  Valutazione delle prestazioni analitiche SPECIFICITA’ ANALITICA: è la capacità di distinguere un certo analita in una miscela complessa Reattività crociata con analiti simili Interferenze di altri metaboliti  Dall’analisi alla diagnosi Sensibilità analitica e specificità analitica Sensibilità diagnostica e specificità diagnostica Capacità di distinguere i soggetti affetti da una malattia rispetto ai soggetti sani Sensibilità diagnostica e specificità diagnostica Test ideale Test inutile Test reale  Sensibilità diagnostica e specificità diagnostica Sensibilità diagnostica: capacità di identificare le persone affette da una malattia sul totale dei malati Sensibilità diagnostica = veri positivi /veri positivi + falsi negativi Specificità diagnostica: capacità di identificare le persone non affette da una malattia sul totale dei soggetti sani Specificità diagnostica = veri negativi/veri negativi + falsi positivi a: veri positivi b: falsi positivi c: falsi negativi d: veri negativi  Valore predittivo Valore predittivo positivo: probabilità che un soggetto che risulta positivo sia effettivamente affetto dalla malattia a/a+b Quanti soggetti positivi al test sono realmente malati? Valore predittivo negativo: probabilità che un soggetto che risulta negativo sia comunque affetto dalla malattia d/d+c Quanti soggetti negativi al test sono realmente sani? a: veri positivi b: falsi positivi c: falsi negativi d: veri negativi  I campioni da analizzare SANGUE URINE  Le tecniche utilizzate CHEMILUMINESCENZA: reazione che genera luce visibile o vicino IR. Si basa sull'uso di enzimi come perossidasi di rafano. COLORIMETRIA E SPETTROFOTOMETRIA: basata sullo sviluppo di una radiazione ad una certa lunghezza d'onda TURBIDIMETRIA: basata sull’assorbimento di una radiazione da parte di una sospensione di particelle DOSAGGI RADIOIMMUNOLOGICI: basati sulla combinazione di una reazione immunologica con un antigene radioattivo e sulla competizione fra antigene marcato e antigene «freddo» DOSAGGI ELISA: basati sulla reazione dell'analita con un anticorpo coniugato con un enzima che genera prodotti colorati o luminescenti ELETTROFORESI: usata per dosaggio delle proteine. HPLC e UFLC MS: usate per l'identificazione di analiti a basso peso molecolare in miscele complesse CITOMETRIA A FLUSSO: permette di contare, separare e analizzare elementi corpuscolati marcati con un fluoroforo fatti passare attraverso un sistema ottico ESAMI DIAGNOSTICI DI BASE Insieme di test che rilevano Profilo alterazioni metaboliche primarie o biochimico o derivanti da uno stato patologico metabolico su plasma o siero Insieme di test effettuati su sangue intero per valutazioni Profilo qualitative e quantitative degli ematologico elementi corpuscolati Profilo Valutazione di indicatori urinario di funzione o di lesione dell’apparato urinario  Il profilo biochimico generale ü Dosaggio di costituenti chiave che riflettono la funzionalità di specifici organi ü Dosaggio di elettroliti ü Dosaggio di enzimi markers di specifiche lesioni tissutali  Risultati Valori di riferimento Dosaggio di glicemia, trigliceridi e colesterolo: diagnosi di endocrinopatie, nefrosi, epatiti, prevenzione di patologie di natura cardiovascolare,...  Proteine totali e albumina PREALBUMINA (TRANSTIRETINA) Adibita al γ GLOBULINE trasporto della Prodotte dai linfociti tiroxina e della B durante la reazione retinol binding immunitaria protein ALBUMINA α e β GLOBULINE Rappresenta circa il 50% delle proteine plasmatiche. Proteine di trasporto (retinol binding protein, -Funzioni di trasporto di svariate molecole sia polari cortisol binding protein, transferrina,..). che apolari nonché di proteine. Proteine coinvolte nella coagulazione. -Mantenimento della pressione oncotica (cioè la Proteine della risposta infiammatoria acuta pressione osmotica dovuta alle proteine sieriche) (proteina C reattiva). -Funzioni antiossidanti per la presenza di ponti S-S Proteine totali e albumina Il tracciato elettroforetico delle proteine plasmatiche si può ottenere mediante metodologie differenti: Elettroforesi su gel di agarosio Elettroforesi capillare  Proteine totali e albumina Aumento delle proteine totali Ridotto volume del sangue (disidratazione, colera,..), eccessiva sintesi Diminuzione delle proteine totali Emodiluizione, eccessive perdite renali, intestinali, cutanee, ridotta sintesi (epatopatie) o eccessiva degradazione (digiuno prolungato) Esempio: diagnosi di discrasie plasmacellulari in cui si osserva l’eccessiva produzione e secrezione di una immunoglobulina monoclonale  Urea, creatinina, acido urico CREATININA ACIDO URICO UREA Deriva dal metabolismo della Deriva dal metabolismo delle L’azotemia è una misura dei mg di creatina. Aumenta in condizioni di purine. L’iperuricemia può essere azoto presente nel sangue. insufficienza renale, o in presenza dovuta ad insufficienza renale o ad di miopatie. un’eccessiva produzione, come nel L’urea può aumentare per caso della gotta. insufficienza renale, o diminuire per insufficienza epatica.  Elettroliti MACROELEMENTI (fabbisogno > 100 mg/die): calcio, fosforo, sodio, potassio, cloro, magnesio,... MICROELEMENTI (fabbisogno < 100 mg/die): ferro, rame, zinco, iodio, selenio, fluoro, cromo,... Importanza strutturale (ossa, tessuti molli) Importanza metabolica (cofattori di enzimi)  Elettroliti Na+/K+ Ca2+, PO43- Na+ extracellulare, K+ Ca2+ importante per coagulazione, intracellulare. Importanti per contrazione muscolare, rilascio di trasporto attivo, propagazione neurotrasmettitori. impulsi nervosi,... PO43- importante come costituente di numerose molecole Fe Emoglobina, catena respiratoria,... La sideremia viene controllata regolandone l’assorbimento intestinale e il deposito legato alla ferritina. Viene trasportato legato alla transferrina  Omeostasi metabolica Controllo del bilancio fra la necessità e la disponibilità di substrati. Dipende da: Disponibilità di Necessità substrati tissutali energetici Concentrazione ematica di nutrienti e metaboliti Segnali ormonali Segnali provenienti dal sistema nervoso centrale Il GLUCOSIO svolge un ruolo chiave nel mantenimento dell’omeostasi metabolica  Omeostasi del glucosio Glicolisi aerobia e anaerobia produzione di ATP Via dei pentoso fosfati (sintesi di NADPH e nucleotidi) Glucosio ematico Glucosio intracellulare Glucosio-6-fosfato (80-100 mg/dL) Sintesi di proteoglicani, Sintesi di glicogeno glicoproteine e glicolipidi Sintesi di UDP- Conversione in UDP- galattoso e lattosio glucosio nella ghiandola mammaria Sintesi di UDP- glucuronato per reazioni di detossificazione  Omeostasi del glucosio L’omeostasi del glucosio è controllata principalmente da due ormoni prodotti dal pancreas: insulina e glucagone Tessuti bersaglio dell’insulina: fegato, muscolo, tessuto adiposo. Tessuti bersaglio del glucagone: fegato e tessuto adiposo GLUCAGONE +glicogenolisi Porzione endocrina +gluconeogenesi INSULINA Porzione esocrina +mobilzzazione degli +glicogenosintesi CORTISOLO E ADRENALINA acidi grassi +uptake del glucosio Controregolatori dell’insulina in risposta allo +sintesi di lipidi e di stress proteine + crescita cellulare Omeostasi del glucosio Omeostasi del glucosio  Il diabete mellito Il diabete mellito rappresenta la terza causa di morte negli USA dopo malattie cardiache e cancro. È dovuto alla non sufficiente produzione di insulina o alla non efficiente azione dell’ormone sulla cellula bersaglio. Il principale sintomo della malattia sono alti livelli di glucosio nel sangue (>160-180 mg/dL) che portano alla sua escrezione renale (glicosuria) DIABETE DI TIPO I DIABETE DI TIPO II È detto anche insulina- È detto anche insulina- dipendente. Ha insorgenza indipendente. Ha insorgenza precoce e rappresenta circa il tardiva e rappresenta circa il 90% 10% dei casi di diabete. Dovuto dei casi di diabete (circa il 18% alla mancata produzione di della popolazione over 65). È insulina come conseguenza della dovuto al fenomeno della perdita o del malfunzionamento insulino-resistenza. delle cellule β.  Il diabete mellito Aumentata lipolisi Aumento dei livelli Aumentati livelli di e ossidazione degli di H+ ematico con glucosio ematico acidi grassi; Cellule in conseguente Diminuita volemia, che non viene aumentata sintesi starvation. aumentata disidratazione internalizzato e di corpi chetonici; escrezione di ioni usato accentuata H+, NH4+, Na+, K+ gluconeogenesi DIAGNOSI DI DIABETE MELLITO > 126 mg/dL Glicemia a digiuno Metodiche enzimatiche > 200 mg/dL Glicemia post-prandiale Curva da carico orale di glucosio Si misura il beta-idrossibutirrato Corpi chetonici > 20 mg/dL nel siero deriva dalla condensazione del gruppo aldeidico del glucosio con le estremità N-term delle catene beta. Emoglobina glicata (HbA1c) Misura mediante analisi cromatografiche Gold standard per valutazione del controllo glicometabolico (2-3 controlli annuali) Albuminuria Marker di sviluppo di nefropatia diabetica Dosaggio di insulina e peptide Importante per il diabete di tipo I e per monitorare la terapia con insulina C L’intensità della luce assorbita ad una certa lunghezza d’onda è proporzionale alla concentrazione di analita Il glucometro  Le misurazioni degli enzimi vengono utilizzate in medicina in due modi principali: 1) Misurazione nel siero e in altri fluidi corporei per rilevare lesioni a un tessuto che contiene l'enzima. Le lesioni ai tessuti rilasciano enzimi che possono essere utilizzati come marcatori plasmatici del danno tissutale. 2) Misurazione all’interno di un tessuto, per identificare anomalie o assenza dell’enzima, che possono causare malattie. § Elevato grado di specificità Vantaggi dell’uso di § Attività rilevabile anche a basse concentrazioni enzimi sierici come markers diagnostici § Utilizzo di isoenzimi come marcatori d’organo § Diagnosi di enzimopatie (es. deficit di G6PD, fenilchetonuria)  La specificità di un marcatore può essere diversa in quanto alcuni enzimi si trovano prevalentemente in tessuti specializzati, mentre altri hanno una distribuzione più ampia. La finestra diagnostica è l’intervallo temporale dopo una lesione tissutale, nel quale il marcatore presenta un’aumentata concentrazione plasmatica. Essa può variare in funzione di: -entità del danno -gradiente di concentrazione fra plasma e citosol (normalmente alto) -Velocità di clearance degli enzimi MARCATORI PRECOCI MARCATORI TARDIVI  Enzimi muscolari CREATINA CHINASI (CK o CPK) Valori elevati in presenza di danno, necrosi o infiammazione del tessuto muscolare scheletrico o cardiaco. Valori aumentati anche in caso di tossicità da farmaci come le statine ATP:4-5 nmoli/mg proteina Fosfocreatina: 20-25 nmoli/mg proteina  Enzimi epatici Transaminasi Aspartato transaminasi (AST) Alanina transaminasi (ALT), la seconda è più specifica Diagnosi di epatopatie, carcinomi del fegato  Enzimi epatici: il catabolismo dell’eme La degradazione dell’eme avviene nei macrofagi del sistema reticolo endoteliale e porta alla sintesi di bilirubina nel fegato (circa 250 mg al giorno) 1. Eme ossigenasi 2. Riduzione della biliverdina a bilirubina 3. Coniugazione della bilirubina con acido glucuronico (FEGATO) 4. Escrezione della bilirubina diglucuronide  Enzimi epatici: il catabolismo dell’eme La degradazione dell’eme avviene nei macrofagi del sistema reticolo endoteliale e porta alla sintesi di bilirubina nel fegato (circa 250 mg al giorno) Bilirubina indiretta: non coniugata, insolubile non reagisce con il reattivo di Van den Bergh tranne dopo solubilizzazione in solvente organico Bilirubina diretta: coniugata, solubile, reagisce con il reattivo di Van den Bergh Il rapporto fra bilirubina diretta e indiretta indica l’attività della UDP-glucuroniltransferasi ed è solitamente intorno a 1/4 1/5  Ittero E’ dovuto all’accumulo di pigmenti biliari nel sangue che ne determina l’accumulo nella pelle. Può essere causato da : Iperproduzione di bilirubina (emolitico) Ostruzione delle vie biliari Deficit congenito di bilirubina UDP- glucuronil transferasi (in forma transiente nei neonati) Enzimi pancreatici La LIPASI PANCREATICA è un marker specifico per la diagnosi di pancreatite acuta L’AMILASI è un marker meno specifico di pancreatite o di infiammazione delle ghiandole salivari.  Lattato deidrogenasi (LDH) L’enzima Lattico deidrogenasi (LDH) agisce in forma tetramerica. Dalla combinazione delle 4 subunità derivano 5 differenti isozimi: LDH1: 4H LDH2: 3H 1M LDH3: 2H 2M LDH4: 1H 3M Isoforme muscolari LDH5: 4M I livelli sierici di LDH aumentano in varie condizioni patologiche incluse epatiti, emolisi e infarto del miocardio Lattato deidrogenasi (LDH)  Marcatori tumorali + misura diretta sul Markers tissutali bersaglio; alta specificità e Sono prodotti dei tumori maligni evidenziabili sensibilità nel tessuto e/o nei fluidi biologici. metodi istologici -prelievo di un piccolo test immunochimici campione di tessuto che può Si trovano in elevate quantità nelle cellule tumorali e vengono rilasciati nel siero di pazienti portatori di test immunoistochimici non essere rappresentativo; tumore: criticità tecniche di prelievo immunoglobuline proteine fetali enzimi Markers umorali + ripetibilità; facile prelievo di campione ormoni test immunoenzimatici proteine del citoscheletro -misura indiretta molecole di adesione influenzabile da fattori esterni; bassa sensibilità e specificità  Marcatori tumorali Per ciascun marcatore va definito un VALORE SOGLIA, al di sopra del quale il test si considera positivo  Marcatori tumorali I markers tumorali vengono misurati mediante metodi immunometrici che si basano sulla specifica reazione dell’antigene con un anticorpo specifico:  Marcatori tumorali Caratteristiche dei metodi immunometrici : -notevole variabilità fra laboratori diversi (scarsa accuratezza, cioè scarsa correlazione con il valore vero) -alta precisione ottenuta mediante l’avanzamento tecnologico Esame emocromocitometrico E’ l’esame completo delle cellule del sangue. Si effettua su prelievo venoso in presenza di un anticogulante. Dosaggio dell’emoglobina Determinazione dell’ematocrito (% RBC) Conte cellulari  Esame emocromocitometrico Dosaggio dell’emoglobina Hb + Ferricianuro MetHb + cianuro Picco di di potassio à di potassio à assorbanza a MetHb cianometaHb circa 545 nm Reattivo di Drabkin: Ferricianuro di potassio + cianuro di potassio  Esame emocromocitometrico Determinazione dell’ematocrito (% RBC) Valore di emoglobina su RBC «paccati» HCT = ----------------------------------------------- Valore di emoglobina su sangue intero  Esame emocromocitometrico Conte cellulari Esame emocromocitometrico MCV (Volume Globulare Medio): rapporto fra l’ematocrito e il numero di RBC Microcitemia/Macrocitemia MCH (Hb Corpuscolare Media): rapporto fra Hb e numero di RBC Ipocromia/Ipercromia MCHC (Concentrazione Corpuscolare Media di Hb): rapporto fra Hb e ematocrito Diagnosi di emoglobinopatie come HbS Il profilo urinario Torbidità: eventuale presenza di Sali o di sostanze organiche Colore: stato di idratazione, dipende dalla presenza di urocromo derivato da urobilina Aspetto: presenza di sedimento analizzato a parte Il profilo urinario pH: presenza di sostanze acide derivanti dal metabolismo Presenza di glucosio o di corpi chetonici: diabete mellito Proteine: danno renale Hb: danno renale Bilirubina: danno epatico