Biologia Cellulare e Molecolare - Traffico di Membrana PDF

Biologia cellulare e molecolare #01 – Prof. Milan – Traffico di membrana Pag. 1 a 8 Biologia cellulare e molecolare2 #01 Traffico di membrana Prof. Milan–8/04/2024– Autore: Elisabetta Gervasi– Reviewer: Ali...

Biologia cellulare e molecolare #01 – Prof. Milan – Traffico di membrana Pag. 1 a 8 Biologia cellulare e molecolare2 #01 Traffico di membrana Prof. Milan–8/04/2024– Autore: Elisabetta Gervasi– Reviewer: Alice Grico– linea Gialla 2029 La comunicazione cellulare è essenziale per gli organismi pluricellulari. Per avere un organismo pluricellulare la cellula ha bisogno di specializzare i tessuti, le funzioni ecc. Per far si che questo avvenga le cellule devono comunicare tra loro e per farlo hanno sviluppato processi chiamati “secrezione cellulare”. Le cellule hanno bisogno di nutrirsi e comunicare con l’ambiente circostante per adattarsi ai vari cambiamenti (ad esempio situazioni di stress), lo fanno modificando recettori, canali e trasportatori, secernendo molecole di segnale e internalizzando molecole dall’esterno. Per poter adattarsi all’ambiente esterno le cellule modificano le proteine che si trovano sulla superficie. Si parla di: ESOCITOSI🡪 se la cellula rilascia all’esterno attraverso una vescicola del materiale ENDOCITOSI🡪se del materiale dall’esterno della cellula viene invaginato nella stessa e poi trasportato all’interno Per il trasporto da e verso la membrana, il meccanismo concettuale è lo stesso ed è il trasporto vescicolare; esso consiste nel trasporto attraverso le vescicole chiuse da una membrana lipidica. Il trasporto tra i vari compartimenti della cellula avviene attraverso le vescicole. Cosa sono le vescicole? Sono strutture chiuse a singolo strato lipidico e mediano il traffico intracellulare da un compartimento donatore ad uno target o ricevente. L’interno della vescicola si chiama lume, è l’interno solubile del reticolo endoplasmatico. Esse, tuttavia, non sono tutte uguali, infatti con i microscopi elettronici si è visto che sono diverse per densità struttura, dimensione; ciò è necessario per il corretto funzionamento del traffico di membrana. Esistono fino a 10 compartimenti con vescicole che hanno caratteristiche diverse in cui la cellula ha bisogno di selezionare: - Il cargo, cioè la cellula può selezionare la concentrazione del carico e di conseguenza l’inserimento in vescicola con successivo ripiegamento di membrana - La destinazione delle vescicole I percorsi cellulari sono organizzati in percorsi direzionali: - Via secretoria o esocitica - Via endocitica - Vie di recupero (vanno a ripescare tutto ciò che procede lungo il percorso, ma che in realtà dovrebbe bloccarsi prima per svolgere ciclicamente la propria funzione) Queste vie sono state scoperte grazie ad esperimenti, ad es l’esperimento di Palade per la via secretoria. ESPERIMENTO DI PALADE Palade prese le cellule del pancreas (enzimi digestivi), aggiunse amminoacidi radioattivi (contenevano zolfo35), eliminò questi amminoacidi e poi con il tempo monitorò le proteine che avevano incorporato questi amminoacidi dove si trovavano. Quindi, accoppiò la microscopia elettronica con l’auto radiografia attraverso una pellicola sensibile e monitorò il segnale radioattivo nel tempo.  Biologia cellulare e molecolare #01 – Prof. Milan – Traffico di membrana Pag. 2 a 8 ER: 3 minutes. GOLGI: 15-20 min Osservò che dopo 3 minuti gli amminoacidi marcati si trovavano nel reticolo endoplasmatico ruvido. Le proteine che devono essere mandate dalla via secretoria all’esterno vengono sintetizzate nel reticolo endoplasmatico ruvido e dopo 15-20 gli amminoacidi marcati erano nel Golgi e via via dopo 1-2 ore si trovavano in vescicole secretorie sopra la membrana e successivamente nel lume. Quindi con questo esperimento Palade riuscì a capire che la via secretoria era ordinata, in quanto seguiva i passaggi visti in precedenza. Nel traffico intracellulare sono essenziali: Meccanismi di trasporto Ruolo dei compartimenti VESCICOLE SECRETORIE: 1-2 ore LUME La vescicola per poter funzionare ha bisogno di una forza che permetta a quel pezzo di membrana di gemmarsi; dunque, ha bisogno di una serie di meccanismi che forzino la curvatura (l’invaginazione) di questa vescicola e di conseguenza ne medino il distacco. Purché ciò avvenga, queste vescicole devono essere “rivestite” (Coated Vescicles) di un materiale proteico che si assembla sulla superficie esterna. Il rivestimento ha due scopi: 1) Forza la curvatura 2) Seleziona il cargo A seconda del trasporto esistono 3 tipi principali di Coated Vescicles: - Clatrina (evidenziate in rosso): sono quelle secretorie che vanno verso l’esterno, quindi quelle che vanno dal Trans-Golgi alla membrana - COP1: sono quelle che attuano il trasporto retrogrado lungo le cisterne del Golgi, e all’interno del Golgi - COP2: sono quelle che attuano il trasporto anterogrado ovvero dal ER (ER- Golgi intermediate compartment) al Golgi CLATRINA Formata da 3 catene pesanti e tre leggere che formano struttura particolare chiamata trischelio. Trischeli si assemblano tra loro formando canestri esagonali e pentagonali sulla superficie citosolica. Questi canestri contengono all’interno la membrana e via via che si impacchetta porta alla curvatura della membrana finché non la riveste tutta. Come funziona? La clatrina fa un’impalcatura di trischeli che si assemblano tra loro formando esagoni e pentagoni alternati e poi riesce ad interagire con molecole che si chiamano adattatrici (AP protein), si chiamano adattatrici proprio perché fanno da ponte tra la clatrina e la membrana dei recettori per i cargo presenti sulla membrana della vescicola. Le proteine adattatrici sono molto eterogenee perché ogni recettore per il cargo avrà affinità per una proteina adattatrice diversa, alcune sono a singola catena, altre formate a 4 subunità in base al compartimento. Le proteine adattatrici riconoscono che in quel punto c’è una vescicola che si sta formando grazie a segnali di nucleazione (fosfoinositide) nei vari compartimenti. Questi segnali portano le proteine adattatrici a legare i cargo receptor. Uno dei segnali molto noti è il fosfatidilinositolo (PIP) che ha delle modificazioni ovvero delle fosforilazioni diverse sull’inositolo, e a seconda della posizione riconosce e attiva proteine adattatrici diverse.  Biologia cellulare e molecolare #01 – Prof. Milan – Traffico di membrana Pag. 3 a 8 Il PIP si trova in diversi compartimenti, ma anche in porzioni diverse della membrana dello stesso compartimento. Purché si formi una vescicola serve una: - concomitanza di segnali (PIP, recettori cargo, GTPasi servono per l’attivazione delle proteine adattatrici) - cooperazione di interazioni (per mediare l’assemblaggio) - GTPASI REGOLANO IL RECLUTAMENTO Le GTPasi regolano il reclutamento, quindi l’assemblaggio delle proteine adattatrici. Si chiamano GTPasi perché riescono a legare il GTP e idrolizzarlo. Ci sono vari tipi di GTPasi (monomeriche) che legano la membrana dove si sta formando la vescicola e regolano una serie di passaggi necessari all’assemblaggio: - ARF1 GTPasi monomerica che media la formazione delle vescicole COPI nel Golgi e di clatrina nel Trans Golgi Network (TGN) - SAR1 GTPasi che regola assemblaggio COPII sul reticolo Normalmente inattive, solubili e si trovano nel citosol, finché una proteina GEF (fattori di scambio del nucleotide guanilico) le attiva caricandole con GTP. Una volta attive cambiano conformazione (Sar1) liberano una coda idrofobica (N- term) che permette alle GTPasi attive di inserirsi nella membrana della vescicola che si sta formando ed in seguito reclutano le proteine adattatrici. Non tutte le vescicole sono sferiche, ad esempio ci sono vescicole che impacchettano cargo di grandi dimensioni. Mutazioni di proteine adattatrici causano malattie scheletriche. Proteine con dominio BAR ripiegano la membrana Proteine con dominio BAR mediano il ripiegamento e curvature della membrana, infatti dimerizzano. e inducono ad una curvatura interagendo elettrostaticamente con le teste dei lipidi carichi negativamente. Nel reticolo esiste anche una famiglia di proteine chiamata RETICULON che contribuisce alle curvature delle membrane ENDOCITOSI MEDIATA DA CLATRINA: Abbiamo una molecola che reagisce con un recettore per il cargo, esso lega la proteina adattatrice (adattina), che a sua volta recluta la clatrina e ciò causa l’assemblamento dei trischeli di clatrina, forza la struttura, la vescicola inizia a formarsi; è necessaria la forza finale per staccare e fondere le membrane tra loro, essa è data dalla dinamina che è una GTPasi, e dunque può legare il PI (4,5)P2. La dinamina idrolizza il GTP e trova l’energia per staccare la vescicola. Una volta staccata la vescicola, bisogna rimuovere tutta l’impalcatura, dunque il PI(4,5)P2 che aveva reclutato una serie di fattori viene rimosso dalle fosfatasi, Sar1GTP e ARF1 GTP si disattivano e si passa al GDP, dunque collassa tutto il sistema.  Biologia cellulare e molecolare #01 – Prof. Milan – Traffico di membrana Pag. 4 a 8 La clatrina viene rapidamente disassemblata da AUXILIN e Hsp70 usando ATP. Simile alla clatrina anche per le vescicole COPI il rivestimento viene rimosso appena gemmate ARF idrolizza GTP e si stacca provocando l’uncoating rapido di COPI Invece l’idrolisi di GTP da parte di Sar1 è più lenta e il rivestimento delle vescicole COPII rimane per più tempo rispetto alle altre. Arrivano al docking con il compartimento successivo (ERGIC) dove lì il GTP legato a Sar1 viene idrolizzato a GDP e Sar1 inattivata. La vescicola una volta formata deve andare nel compartimento bersaglio e per far ciò vi sono dei meccanismi di trasporto. Intervengono due classi di famiglie di proteine: PROTEINE RAB direzionano le vescicole e mediano il riconoscimento del compartimento bersaglio PROTEINE SNARE mediano la fusione con il compartimento bersaglio Le proteine Rab sono più importanti, guidano il trasporto delle vescicole nel compartimento corretto e reclutano proteine specifiche che mediano l’ormeggio (DOCKING). Sono GTPasi monomeriche ed ogni vescicola/organello ha la sua RAB specifica esposta verso il citosol. RAB e SNARE Dopo che la cellula è riuscita a concentrare il cargo, a formare una struttura vescicolare e a staccarla dalla membrana, ha bisogno delle RAB che reclutano una serie di effettori proteici per guidare il trasporto delle vescicole nel compartimento giusto: arrivata qui deve liberare il contenuto; quindi la vescicola si forma e viene trasportata grazie alle RAB. Quando la vescicola è in prossimità del compartimento bersaglio avviene il cosiddetto docking, grazie al quale la vescicola si avvicina alla membrana a meno di 1,5 nM di distanza: in mezzo c’è però dell’acqua che respinge le due membrane, quindi bisogna che questa venga tolta affinché avvenga la fusione. Per far sì che si fondano intervengono le proteine SNARE, di cui ce ne sono due tipi: le v-SNARE sono le proteine SNARE della vescicola, mentre le t-SNARE sono quelle nel compartimento bersaglio (t sta per target). Di v-SNARE ce ne sono 35 diverse in base a dove deve andare la vescicola: inoltre queste sono a singola catena elicoidale che protrude all’esterno della vescicola. Le t-SNARE hanno invece 3 catene polipeptidiche elicoidali. Il dominio SNARE è formato da 60-70 amminoacidi che protrudendo verso l’esterno formano delle eliche in grado di intrecciarsi tra loro. Le 3 eliche delle t-SNARE legano quella della v-SNARE sulla vescicola, si avvolgono e si ripiegano: in questo modo quindi rimuovono l’acqua e avvicinano le membrane finchè non si fondono. Le t- SNARE possono essere inibite da proteine che le legano e vengono rimossi dalle RAB della vescicola o da altri meccanismi che così avviano il docking e la fusione. Una volta fuse la proteina citosolica NSF utilizza l’ATP per catalizzare il disassemblaggio delle SNARE, riseparandole. Non è ancora noto però come le v-SNARE vengano riciclate e riportate al compartimento iniziale per far parte della prossima vescicola e ripetere il loro lavoro. La vescicola quindi per trasporto e fusione ha bisogno delle proteine RAB e SNARE.  Biologia cellulare e molecolare #01 – Prof. Milan – Traffico di membrana Pag. 5 a 8 Apparato di Golgi e reticolo endoplasmatico Il primo compartimento che si occupa delle proteine è il reticolo endoplasmatico. Le proteine poi vengono trasportate fino all’apparato di Golgi e successivamente alla membrana plasmatica e ai lisosomi. Il primo trasporto che studiamo è dal reticolo endoplasmatico al Golgi: questa via secretoria è bidirezionale (quella principale è appunto dal reticolo, dove vengono sintetizzate le proteine, al Golgi); la via normale è mediata da COP II, mentre quella di recupero che avviene per salvare e recuperare proteine del reticolo che sono finite nelle vescicole per sbaglio, ma anche i vari autisti delle proteine che le trasportano ai loro compartimenti bersaglio, da COP I. L’apparato di Golgi prende il nome da un ricercatore italiano, Camillo Golgi che nel 1898 inventò una colorazione con nitrati di argento che gli permisero di vedere questo compartimento cellulare. L’apparato di Golgi è formato da una pila di cisterne con un diametro di 0,5-1 micrometro: di solito nei mammiferi sono presenti dalle 4 alle 6 cisterne nel Golgi, ma si può arrivare massimo fino a 8. Ci sono altri organismi nei quali le cisterne sono addiritura 20. Le vescicole arrivano dal reticolo endoplasmatico liscio all’apparato di Golgi. Il reticolo endoplasmatico è appunto diviso in liscio, zona da cui le proteine escono, e ruvido, dove vengono prodotte: il ruvido è chiamato così perchè ha i ribosomi associati sulla membrana Le proteine che escono dal reticolo endoplasmatico, quindi quelle da secernere nel lume, hanno un segnale di uscita nelle loro sequenza proteica, che permette loro di interagire con un recettore cargo delle membrana. Normalmente molte delle proteine che devono essere secrete sono glicosilate nel reticolo. Nei siti di uscita c’è un controllo qualità, ovvero le chaperones impediscono a proteine non ripiegate correttamente di uscire proseguire. Per esempio esistono delle proteine trasportatrici chiamate lectine che legano solo se gli oligosaccaridi sono stati aggiunti correttamente. Il reticolo deve mandare all’esterno solo prodotti ripiegati correttamente: per questo compito esistono le chaperon, proteine guida del ripiegamento. Se una proteina non è correttamente ripiegata il segnale di uscita spesso non è visibile perchè coperto da chaperon che la legano: quindi queste proteine vengono riportate nel citosol per essere ubiquitinate, deglicosilate e degradate dal proteasoma. Le vescicole che gemmano dal reticolo hanno sia le v- SNARE che le t-SNARE, le quali interagendo tra loro fanno fondere le vescicole appena uscite dal REL formando l’ERGIC, una precisterna del Golgi. L’ERGIC ha delle proteine motrici che gli permettono di muoversi verso il Golgi. Nel frattempo può succedere che una proteina solubile del reticolo finisca per sbaglio dentro una vescicola e vada nell’ERGIC per poi continuare nel compartimento successivo. Per evitare che le proteine sbagliate vadano fino al Golgi, appena arrivano nell’ERGIC avviene una selezione: tutto ciò che non doveva entrare nella vescicola viene riportato indietro attraverso la via di recupero in vescicole COP I assieme ai trasportatori della vescicola. Quindi vengono recuperate le v-SNARE presenti nelle vescicole e i recettori per il cargo. Questo avviene perchè le proteine del reticolo e le chaperon che finiscono al Golgi e poi devono tornare indietro per ripetere il loro lavoro, posseggono sugli ultimi 4 amminoacidi un segnale proteico chiamato KDEL (composto da una lisina e un acido aspartico). Il segnale KDEL lo hanno le proteine solubili, mentre le proteine di membrana hanno una sequenza KK e due amminoacidi a caso. Appena gemmano e arrivano all’ERGIC vengono immediatamente ricoperte in vescicole di recupero e riportate indietro. Il KDEL receptor è una proteina che si trova nell’ERGIC che funge da recettore per le proteine che hanno il segnale di recupero, le lega e le riporta indietro. Queste cose sono state scoperte perchè si vedeva una ripetizione del segnale, molte delle proteine del reticolo finivano con questa sequenza KDEL. Sono anche stati fatti degli esperimenti nei quali prendendo una proteina del reticolo che non doveva essere secreta e togliendo via questa sequenza finale, la proteina finiva fuori dalla cellula,  Biologia cellulare e molecolare #01 – Prof. Milan – Traffico di membrana Pag. 6 a 8 continuando il suo viaggio. Al contrario aggiungendo la sequenza KDEL a una proteina che deve essere secreta, questa verrà recuperata e riportata nel reticolo. ERGIC 53 è una proteina di membrana del reticolo che lega gli zuccheri e fa da autista alle proteine glicosilate che devono essere trasportate fuori dalla cellula. Una volta a trasportata fino al Golgi o all’ERGIC questa proteina deve tornare indietro mentre il suo carico deve andare fuori dalla cellula: questo avviene grazie a un cambio di conformazione, che è causato da un cambiamento di pH. Il pH del reticolo è circa 7, quello del Golgi è 6,5 (il Golgi ha quindi più protoni rispetto al reticolo). A un pH più neutro la proteina ERGIC 53 è in grado di legare il suo cargo glicosilato, viene quindi trasportata nel Golgi, e dato il pH più acido cambia conformazione e perde l’affinità per il cargo. Questo cambio di conformazione fa sì che si stacchi il cargo e grazie al segnale KK capace di legare COP I fa tornare indietro ERGIC 53. Queste proteine sono fondamentali per il trasporto dei fattori di coagulazione dall’interno della cellula al flusso sanguigno. Mutazioni di queste proteine che legano gli zuccheri fanno sì che fattori di coagulazione che sono proteine glicosilate non possono circolare e essere secrete nel nostro flusso sanguigno. Quindi mutazioni a ERGIC 53 causano malattie si sanguinamento eccessivo a causa di difetti della coagulazione. Il cargo deve proseguire e andare avanti nel Golgi. Il Golgi ha cisterne con funzioni e contenuto diversi l’una dall’altra: esistono le cisterne cis, mediali e trans. Le cisterne cis fanno smistamento dal reticolo mentre quelle trans sono le cisterne di uscita, da dove gemmano nuove vescicole direte o ai lisosomi o alla membrana o alle vescicole secretorie. La funzione generale di tutto il Golgi è quella di mediare assieme al reticolo nella glicosilazione delle proteine, infatti possiede proteine residenti che sono enzimi della glicosilazione. Il Golgi è anche la stazione di smistamento e di sintesi di polisaccaridi e zuccheri: quindi il Golgi smista in entrata le proteine che arrivano dal reticolo, fa delle modifiche di glicosilazione e poi smista in uscita verso i lisosomi o l’esterno della cellula. La glicosilazione è l’attività principale del Golgi ma un principio di essa avviene nel reticolo. La glicosilazione avviene principalmente in due modi: n-glicosilazione e o-glicosilazione, a seconda che gli zuccheri vengono legati al gruppo amminico dell’asparagina (n) o al gruppo ossidrile di serina e treonina (o). Nel reticolo avviene solo la n- glicosilazione, nel Golgi entrambe. Nel reticolo la glicosilazione avviene solo sull’asparagina alla quale viene attaccato uno scheletro di zuccheri composto da un oligosaccaride complesso formato da 2 molecole di n- acetilglucosammina , uno scheletro di glucosio e mannosio. Già nel reticolo viene eliminato il glucosio e un po’ di mannosio. Questo step di glicosilazione ha la funzione di facilitare il folding delle proteine nel reticolo e la loro selezione, smistamento e traporto. A questo punto nel Golgi possono avvenire i due tipi di glicosilazione. La n- glicosilazione può creare un oligosaccaride ad alto mannosio se gli zuccheri vengono semplicemente tagliati, senza che ci sia l’aggiunta di altro, oppure può diventare un oligosaccaride complesso se oltre al taglio del mannosio  Biologia cellulare e molecolare #01 – Prof. Milan – Traffico di membrana Pag. 7 a 8 avviene il montaggio di zuccheri complessi come galattosio o acido sialico. L’acido sialico ha la funzione di creare una sorta di patina di cariche negative rendendo più compatibile l’’acqua all’esterno delle cellule. La n-glicosilazione garantisce varie funzioni tra cui il folding delle proteine, isolando le parti idrofobi che che così non possono aggregare e facilita il trasporto con legame a lectine. Inoltre grazie allo scheletro di zuccheri protegge la proteina dall’azione degli enzimi. I batteri per esempi hanno una parete cellulare che li protegge, ma che li rende rigidi: l’evoluzione ha permesso alle nostre cellule di creare uno scheletro di zuccheri tutto intorno, che le proteggesse ma che non ne limitasse i movimenti. La glicosilazione è quindi l’evoluzione della parete dei batteri, in cui una cellula ha cominciato a secernere proteine glicosilate che proteggevano l’esterno dagli enzimi digestivi e non impedivano il movimento della cellula. Questo permette per esempio alle cellule dell’intestino di non venire digerite o ad altre cellule di essere protette da agenti patogeni. La n-glicosilazione inizia nel reticolo e finisce nel Golgi. La o-glicosilazione invece avviene completamente nel Golgi grazie alle glicosil transferasi che utilizzano uno zucchero preattivato legato a un nucleotide. Oltre alla glicosilazione nel reticolo, avvengono ache le aggiunte di solfati alle tirosine o agli zuccheri, e questo aumenta notevolmente la carica negativa, che rende più fluido il passaggio dell’acqua lungo la superficie. Maturazione delle cisterne e trasporto vescicolare Ci sono due modelli proposti per quanto riguarda il passaggio delle proteine dalla parte cis alla parte trans del golgi: il modello di maturazione delle cisterne e il modello di traporto vescicolare. Questi sono stati discussi per più di 60 anni, ma attualmente sono validi entrambi. La maturazione delle cisterne propone che delle vescicole gemmano dal reticolo, si fondono a formare l’ERGIC, questo diventa una cisterna cis, poi cisterna mediana e infine cisterna trans. Il concetto è che la cisterna rimane la stessa, con lo stesso cargo, e via via riceve enzimi diversi che le permettono di cambiare funzione; pian piano quindi si sposta verso la membrana plasmatica, cambiando nome e funzione. Il modello vescicolare e prevede che il cargo arrivi alla prima cisterna, ovvero l’ERGIC, da quello gemmi e arrivi alla cisterna cis; con lo stesso meccanismo passi poi alla cisterna mediana e infine alla trans, tutto attraverso a vescicole. Quello che sembra aver vinto attraverso gli esperimenti è una via di mezzo tra i due, che prevede sia traffico vescicolare che maturazione delle varie cisterne. Le prove della maturazione sono che se si blocca l’afflusso di nuove cisterne, il Golgi sparisce: se non si fa generare nuovo ERGIC il golgi non viene rinnovato e quindi si assottiglia fino a sparire. Ci sono prove anche del traffico vescicolare, se si guarda all’esterno del Golgi si possono vedere queste vescicole, che vanno in entrambe le direzioni: senza vescicole il contenuto delle cisterne non può cambiare. C’è un core centrale del Golgi che matura e tutto intorno ci sono vescicole che trasportano cargo solubili di piccole dimensioni e enzimi per far maturare la cisterna. Per cargo grandi come il procollagene il Golgi utilizza la maturazione delle cisterne, per cargo più piccoli si usa il trasporto vescicolare. All’esterno del Golgi ci sono delle proteine filamentose chiamate golgine che fanno da impalcatura del Golgi, mantenendone la struttura. Quando la cellula deve dividersi le golgine si disassemblano per poi riassemblarsi quando la cellula è divisa. Allo stesso modo se deve avvenire l’apoptosi le golgine vengono tagliate. Biologia 2 #lezione 2 – prof. Tiziana Anelli – Folding delle proteine nella via secretoria Pag. 1 a 10 Biologia 2 # lezione 2 Folding delle proteine nella via secretoria Prof. Tiziana Anelli – 10/04/2024– Autore: Lorena Genua – Reviewer: Giovanna Genua – linea Gialla - 2029 PROTEIN FOLDING Il folding rappresenta il ripiegamento proteico e serve a far raggiungere alla proteina la sua struttura nativa, dunque la struttura funzionante. La sintesi e folding delle proteine, nelle cellule eucariote, si svolge in tre compartimenti intracellulari distinti,che contengono ribosomi: - Citosol - Reticolo endoplasmatico - Mitocondri Le informazioni per il folding sono contenute all’interno della struttura primaria, ovvero la sequenza amminoacidica.L’esperimento che dimostra questo concetto fu condotto da Anfinsen nel 1957,sulla RNAsi.Inoltre quest’ultima contiene 4 ponti disolfuro,date 8 cisteine. Dunque, per un dato numero di cisteine presenti nella sequenza si può creare un determinato numero di ponti disolfuro con un determinato numero di combinazioni diverse – esempio: date 4 cisteine possono formarsi 2 ponti disolfuro seguendo 3 combinazioni diverse, ecc. LEVINTHAL PARADOX Nel 1968 Levinthal dimostra, attraverso procedimenti matematici e statistici, che il folding delle proteine non avviene a caso: se si considera una proteina con 101 amminoacidi, questa potrebbe esistere in 5x10^47 configurazioni diverse. Se il folding fosse casuale e la proteina dovesse provare tutte le configurazioni possibili prima di giungere alla sua struttura nativa unica e finale, impiegherebbe 10^27 anni. Levinthal inoltre aggiunge delle restrizioni nel suo studio > considerando per ogni amminoacido “l’intorno” amminoacidico, ovvero tutte le interazioni amminoacidiche, si può ridurre il tempo di folding, che diventa così compatibile con la vita. Il folding è un processo TERMODINAMICAMENTE FAVORITO, quindi la proteina foldata risulta stabile perché ha un contenuto energetico minimo. Biologia 2 #lezione 2 – prof. Tiziana Anelli – Folding delle proteine nella via secretoria Pag. 2 a 10 Il folding è guidato dalle interazioni elettrostatiche, idrofobiche e ponti a idrogeno. La proteina talvolta può misfoldare perché (a differenza dell’RNAasi che, nell’esperimento di Anfinsen foldava isolata in provetta), nella cellula si possono avere interazioni pericolose tra tutte le proteine presenti che foldano contemporaneamente. Le proteine unfoldate e misfoldate possono aggregare, perché espongono residui idrofobici che si legano a quelli delle altre proteine che si devono ancora foldare. L’aggregato è molto pericoloso per la cellula, perdipiù essendo termodinamicamente più stabile della proteina foldata correttamente, è molto difficile da rimuovere. Il danno pertanto è dovuto sia all’aggregato in sé, sia dal fatto che questo lega altre proteine “innocenti”, inserendole nell’aggregato. CHAPERON MOLECOLARI La cellula utilizza delle proteine che assistono il folding di altre proteine. Esse sono presenti sia negli eucarioti che nei procarioti ( E.Coli). Generalmente sono suddivise in : - HOLDING - FOLDING - UNFOLDING Esiste però un’altra suddivisione basata sulla loro struttura e funzionamento molecolare - HSP60 > CHAPERONINE - HSP70 - HSP90 - HSP100 HSP sta per “HEAT SHOCK PROTEINS”. Esse sono state scoperte per la prima volta sottoponendo una cellula a shock termico. La cellula viene portata a 45° (temperatura superiore a quella a cui viene coltivata normalmente). Si osservano dunque le proteine (bande nere) prodotte: molte proteine smettono di essere sintetizzate, altre invece vengono attivate e prodotte abbondantemente. Queste sono, infatti, le proteine attivate in risposta allo shock termico che servono ad evitare il misfolding di altre proteine>HSP. Biologia 2 #lezione 2 – prof. Tiziana Anelli – Folding delle proteine nella via secretoria Pag. 3 a 10 HSP60 : CHAPERONINE Sono proteine presenti solo nel citosol e nella matrice dei mitocondri. Agiscono come un polimero. Formano una struttura cilindrica, costituita da due camere, in cui viene accolta la proteina che deve foldare, e un coperchio. FUNZIONAMENTO: Ogni subunità presenta all’interno del cilindro una regione idrofobica, che interagisce con la proteina, il coperchio si chiude, avviene un cambiamento conformazionale di queste ultime che induce il folding della proteina. Le due camere lavorano separatamente e ciclicamente sfruttando ATP. Con questo meccanismo non possono foldare tutte le proteine, ma dipenderà dalla sua dimensione (che deve essere limitata) o dalla sua solubilità. HSP70 È costituita da tre domini: uno lega ATP, uno il substrato e l’ultimo funge da coperchio. FUNZIONAMENTO Quando lega l’ATP viene esposto il sito attivo, e quindi può legarsi il substrato. Successivamente avviene: idrolisi di ATP ad ADP, il cambiamento conformazionale di tutta la molecola e infine la chiusura del coperchio sul substrato che induce il folding. Infine serve un nucleotide exchange factor che scambi ADP con ATP in modo far riaprire l’HSP70 che rilascia la proteina foldata e può ricominciare il ciclo. Questa struttura, a differenza della precedente, può agire anche su proteine più grandi, foldando un dominio alla volta. Biologia 2 #lezione 2 – prof. Tiziana Anelli – Folding delle proteine nella via secretoria Pag. 4 a 10 SECRETORY PATHWAY Essa comprende l’insieme dei compartimenti della cellula che servono per sintesi, folding e trasporto delle proteine destinate ad essere esposte sulla membrana, essere secrete o far parte della via secretoria stessa. La via secretoria ha inizio nel reticolo endoplasmatico. L’ingresso delle proteine in quest’ultimo è un processo co-traduzionale (simultaneo alla sintesi), a differenza dell’ingresso delle proteine nel nucleo, nei perossisomi o nei mitocondri che è un processo post- traduzionale. Ma come fa la cellula a capire che alcune cellule devono essere indirizzate al reticolo endoplasmatico? È stato condotto un esperimento: si sintetizza una proteina in vitro su ribosomi liberi e un’altra su ribosomi associati alla membrana del reticolo. Si osserva che se l’RNA e sintetizzato su ribosomi liberi, si ottiene una proteina di 25kDa. Se l’RNA e utilizzato per sintetizzare la proteina su ribosomi associati a membrana, si ottiene un prodotto più piccolo, di 21kDa. Questo perché la prima parte della proteina serve da segnale per portarla alla membrana, una volta entrata, quella parte viene tagliata via. Protein synthesized on free ribosomes Protein synthesized on membrane associated ribosomes Dunque, se sintetizzo la proteina in assenza delle membrane, obbligo il ribosoma a sintetizzarla ma la prima parte non viene tagliata perché manca l’enzima che normalmente è dentro la membrana deputato a ciò. Se la proteina è sintetizzata in una cellula che non è capace di trasportarla all’interno del reticolo endoplasmatico quella prima sequenza viene degradata. Questa sequenza viene detta “SIGNAL SEQUENCE” o “LEADER PEPTIDE” e serve ad indirizzare le proteine al RE e si trova nell’N-terminale, per questo costituisce la prima parte della proteina che uscirà dal ribosoma. È caratterizzata da alcuni aa carichi positivamente, una regione idrofobica seguita da una regione con aa polari non carichi. Infine, c’è il sito di taglio su cui agirà la signal peptidasi. Non è una sequenza ben specifica ma basta che rispetti queste caratteristiche. IL RETICOLO ENDOPLASMATICO RUVIDO Il reticolo endoplasmatico ruvido presenta dei ribosomi che stanno sintetizzano le proteine che devono entrare nel RE. Quando finiscono di sintetizzarle si staccheranno da esso. Quando viene esposta nel citsol, la leader peptide della proteina che si sta sintetizzando viene riconosciuta da SRP (signal recognition particle) che si lega al ribosoma, blocca la sintesi proteica e trasporta tutta la Biologia 2 #lezione 2 – prof. Tiziana Anelli – Folding delle proteine nella via secretoria Pag. 5 a 10 struttura alla membrana del reticolo endoplasmatico. Su questa c’è un recettore chiamato SRP receptor, che lega l’srp; il ribosoma a questo punto si appoggia ad un canale, che permette il passaggio della proteina all’interno del RE. SRP si stacca, va via e la sintesi proteica riprende. PERCHÉ IL RIBOSOMA SI DEVE ASSOCIARE AD UN CANALE ? Perché la proteina per entrare nel reticolo endoplasmatico deve passare attraverso la membrana, e dunque attraverso il doppio strato fosfolipidico, e per farlo serve un canale proteico. Nel 1987 viene condotto uno studio riguardo a questo canale, prendendo in esame i lieviti, perché a partire da questi è più facile creare mutanti. Come abbiamo visto se parto da proteina sintetizzata in vitro a partire da ribosomi liberi (IVT) questa avrà un certo peso molecolare, mentre se questa venisse prodotta su ribosomi di membrana avverrebbe l’ingresso della proteina nella membrana e poi il taglio della signal peptide, che giustificherebbe il peso molecolare minore della proteina. Se tutto cio avviene in un lievito, che ha tutta la via secretoria integra, la proteina entra nella membrana, subisce il taglio, e successivamente viene processata, glicosilata e così via. Durante lo studio è stata effettuata la mutagenesi dei lieviti e in base alle diverse mutazioni è stata creata una library, e dalle singole cellule mutate sono state create delle popolazioni. Successivamente si è osservato il comportamento della proteina (neosintetizzata) nel momento in cui viene espressa in ciascuno di questi mutanti. Pertanto, se si ha un mutante in cui la proteina non riesce a entrare nel reticolo, ci si aspetta di trovare un fenotipo simile a quello che ho quando si traduce la proteina in vitro. A questo punto è stato sequenziato il mutante per capire quale gene è stato mutato. Il gene in questione è stato chiamato Sec61(dove “sec” sta per secretion, in quanto se la proteina, come detto prima, non riesce ad entrare nel reticolo, non verrà mai secreta). Biologia 2 #lezione 2 – prof. Tiziana Anelli – Folding delle proteine nella via secretoria Pag. 6 a 10 SEC61 Sec61 è dunque un canale localizzato sulla membrana del RE su cui si siede il ribosoma che sintetizza la proteina, che successivamente entra nel RE. La struttura, che si può aprire anche lateralmente, è composta da una serie di alpha eliche di membrana, che costituiscono un cilindro con un poro centrale. Inoltre, è presente una sorta di chiusura, importate per evitare il flusso di ioni non controllato(es.calcio). IN SINTESI, l’SRP lega il ribosoma che sta sintetizzando la proteina che deve entrare nel RE, lo porta su RE associato al canale composto da Sec61, questo si apre, il ribosoma sintetizza la proteina, essa entra nel reticolo endoplasmatico dove verrà foldata. Quando il ribosoma ultima la sua funzione, si stacca e se ne va, mentre Sec61 viene richiuso. Ovviamente oltre a Sec61 esistono molti altri trasportatori, utilizzati sulla base di diverse affinità e specificità. TRASLOCAZIONE DI PROTEINE SOLUBILI Fino ad ora è stata analizzata la modalità di ingresso di una proteina solubile nel reticolo. In realtà nel RE devono entrare anche proteine che saranno esposte in membrana, e che saranno dunque insolubili transmembrana. Ma come faranno ad essere inserite in quest’ultima ?Il processo avviene a livello del RE, durante la sintesi. Esistono diversi tipi di proteine di membrana : - PROTEINA DI MEMBRANA DI TIPO I (single pass come il recettore tirosin -chinasico dell’insulina): ha un N-terminale nel lume del reticolo, che poi verrà esposto nello spazio extracellulare, e il C-terminale nel citosol. Questa proteina dunque può presentare la signal sequence sull’N-terminale, che viene riconosciuta dall’ SRP, come nelle proteine solubili, il ribosoma viene portato a SEC61 ( per le proteine solubili il canale che permette la loro entrata nel reticolo endoplasmatico è detto traslocone), successivamente la leader sequence viene tagliata, cosicché la sintesi possa proseguire. Nel momento in cui viene sintetizzata la regione transmembrana, che sarà un alpha elica idrofobica, sec61 si apre LATERALMENTE, permettendo lo spostamento laterale della regione di transmembrana nella membrana. Quindi la regione di transmembrana funge da STOP della TRASLOCAZIONE, la sintesi proteica prosegue e la proteina è infine inserita in membrana. - Biologia 2 #lezione 2 – prof. Tiziana Anelli – Folding delle proteine nella via secretoria Pag. 7 a 10 - PROTEINA DI MEMBRANA DI TIPO II : ha l’N-terminale nel citosol e il C-terminale nel lume del RE; la sequenza segnale in questo caso ha caratteristiche diverse, ma soprattutto è la stessa che funge da transmembrana, per cui non verrà tagliata. Essa porta il ribosoma con la proteina nascente al RE, qui non viene tagliata, nel momento in cui prende contatto con Sec61 viene direttamente fatta traslocare lateralmente e la sintesi prosegue. Qui, dunque, non scorre l’N-terminale ma il C- terminale che poi verrà esposto. - PROTEINA DI MEMBRANA DI TIPO III : questa ha la stessa tipologia della proteina di tipo I, dunque l’N-terminale nel lume de RE e il C-terminale nel citosol, ma la signal sequence, non viene tagliata ed è usata come regione di transmembrana come in quella di tipo II. - PROTEINA DI MEMBRANA DI TIPO IV : ne sono un esempio le GPCR, recettore con 7 Alpha eliche transmembrana. Anche qui la regione transmembrana funziona da stop dello scorrimento della proteina attraverso il traslocone. Per esempio: la prima transmembrana viene inserita, la proteina viene sintetizzata e scorre, entra la seconda transmembrana che viene traslocata lateralmente, continua la sintesi proteica ma ora la proteina non scorre più con i trasloconi. Poi viene inserita un’altra transmembrana e così via. Biologia 2 #lezione 2 – prof. Tiziana Anelli – Folding delle proteine nella via secretoria Pag. 8 a 10 TAIL ANCHORED PROTEINS Sono proteine associate alla membrana del reticolo solo con il C-terminale, che hanno uno specifico meccanismo di inserzione che sfrutta specifici enzimi: il complesso GAP3. La proteina viene sintetizzata completamente nel citosol, viene riconosciuta da un apposito sistema che la inserisce nelle membra del RE. FOLDING NEL RE Una volta entrata nel reticolo, qui la proteina giungerà alla sua struttura finale nativa. Il folding nel Re è però più complesso rispetto a quello del citosol, perché una volta entrate, le proteine subiscono varie modificazioni covalenti come il taglio della leader peptide, la glicosilazione, ponti disolfuro, ecc. Inoltre nel reticolo c’è un’altissima concentrazione proteica che renderà ancora più difficile il folding ,date le innumerevoli interazioni tra proteine. Per questo servono chaperon ed enzimi appositi, alcuni per il folding generale di tutte le proteine, e altre “private” per proteine complesse come il collagene. CHAPERON BiP È la proteina chaperon più abbondante nella cellula, e fa parte delle HSP70. Ha un dominio ATPasico e un dominio con la regione di binding al substrato. È stata isolata perché lega con alta affinità le immunoglobuline ( da qui il nome Immuncoglobulin Binding Protein). È stato infatti condotto uno studio per osservare cosa si legasse agli anticorpi mentre foldavano, attraverso la tecnica dell’immunoprecipitazione. In generale per isolare la proteina di interesse,si unisce all’estratto proteico un anticorpo che agisce in modo specifico riconoscendola; se a questo anticorpo si associa una biglia di resina, e poi si centrifuga, si avrà sul fondo la proteina d’interesse, legata alla biglia e all’anticorpo che poi verranno rimossi. Nell’esperimento è stato immunoprecipitato un anticorpo con un anticorpo, chiamato poi BiP. Se si immunoprecipita l’anticorpo, nel precipitato si troverà più l’anticorpo che BiP, perché non tutto reagirà con esso, e vicersa. BiP, non serve solo per il folding degli anticorpi ,ma anche per quello della maggior parte delle proteine entrate nel RE. BiP riconosce le regioni idrofobiche esposte della proteina che deve foldare, le lega, induce il folding, le regioni idrofobiche vanno all’interno, e BiP si stacca con il NUCLEOTIDE EXCHANGE FACTOR (come prima). Biologia 2 #lezione 2 – prof. Tiziana Anelli – Folding delle proteine nella via secretoria Pag. 9 a 10 MODIFICAZIONI COVALENTI NEL RE Esse servono a stabilizzare la struttura delle proteine, e a permettere di svolgere la loro funzione: - Taglio della leader peptide, attraverso la signal peptidasi - Glicosilazione - Formazione di ponti disolfuro - Attacco di un GPI - Idrossilazione GLICOSILAZIONE È sempre una N-glicosilazione perché nel RE lo zucchero è sempre attaccato al residuo laterale di asparagina delle proteine, ovvero NH2. Non di tutte le asparagine ma solo di quelle nella sequenza Asn-X-Ser/Thr. Lo zucchero non è un monosaccaride ma è composto da 2 N-acetylglucosammine, 9 mannosi, 3 glucosi; questo viene sintetizzato prima nel citosol, in parte associato ad un lipide di membrana che poi viene trasportato all’interno del reticolo.Succesivamente l’oligosaccariltrasferasi trasporta lo zucchero sull’asparagina. Processing Viene tagliato il primo glucosio, poi il secondo e la proteina che ha lo zucchero con UN SOLO GLUCOSIO e tutti i 9 mannosi viene riconosciuta dalla calnessina (chaperon di membrana) o da calreticolina (chaperon solubile), entrambe lectine. Queste lavorano con ERp57 che serve per la formazione di ponti disolfuro. Se la proteina a questo punto riesce a foldarsi agirà la glucodidasi II che taglia l’ultimo glucosio, e la calnessina o calreticolina ,perdendo affinità la rilasceranno. Se non folda correttamente invece viene riconosciuta dall’enzima UGGT che aggiunge di nuovo un glucosio, per essere di nuovo riconosciuta dalle lectine che la rifolderanno. Ma se la proteina non può proprio foldare, agirà l’enzima mannosidasi che taglia il mannosio centrale.In questo modo UGGT non riconosce più la proteina, che verrà pertanto portata ad essere degradata. C’è un vero proprio timer per il folding delle proteine per evitare di occupare inutilmente la via. Biologia cellulare e molecolare #3 – Prof.ssa T. Anelli – Folding proteico nella via secretoria Pag. 1 a 7 Biologia Cellulare e Molecolare #3 Folding proteico nella via secretoria N-glicosilazione: Lo zucchero viene attaccato sottoforma di polisaccaride sulla proteina che si sta foldando, su un residuo di asparagina. Il polisaccaride non si forma man mano. Esso infatti si forma su un lipide della membrana che è rivolto verso il citosol, tramite poi una flippasi si affaccia nel reticolo, finendo la costruzione. Infine la oligosaccaride transferasi stacca l’oligosaccaride dal lipide e lo attacca sulla proteina nascente. La formazione dei ponti disolfuro: Ci concentriamo sulla formazione dei ponti disolfuro. Le proteine che sono foldate completamente e hanno la loro struttura nativa non hanno cisteine esternamente. La via secretoria è in continuità con l’esterno della cellula, un ambiente ossidante. Affinchè la proteina non interagisca con altre proteine, essa scorre con le cisteine ossidate. L’ambiente esterno è più ossidante dell’ambiente intracellulare. La formazione dei ponti disolfuro può avvenire all’interno della stessa catena polipeptidica, e quindi otteniamo un ponte intracatene, o si può formare un ponte disolfuro tra due proteine, e quindi si parla in questo caso di legame intercatena. Gli enzimi, che catalizzano la formazione dei ponti di solufro e il loro rimodellamento, fanno parte delle ossidoreduttasi. Il più importante è il PDI che è un enzima essenziale. È il più abbondante ed importante. Questi enzimi non solo catalizzano la formazione dei ponti ma anche la loro riduzione e isomerizzazione. Meccanismo di formazione del ponte disolfuro: Abbiamo una proteina che si deve foldare e ha 3 cisteine ridotte: SH. Questa proteina deve foldarsi per arrivare nello stato in cui otteniamo un ponte tra due cisteine. Interviene una ossidoreduttasi che è ossidata. Le cisteine delle ossidoreduttassi possono formare un ponte disolfuro (essere in forma ossidata) o essere in forma ridotta. Bisogna avere una ossidoreduttasi con il sito attivo in forma ossidata: ponte disolfuro. Biologia cellulare e molecolare #3 – Prof.ssa T. Anelli – Folding proteico nella via secretoria Pag. 2 a 7 Nella formazione del ponte disolfuro nella proteina, si forma un intermedio covalente in cui abbiamo un ponte disolfuro tra la proteina e l’enzima. La proteina si stacca e avrà il suo ponte disolfuro. L’enzima di fatto ha donato il suo ponte disolfuro alla proteina. L’enzima alla fine è ridotto e per ritornare a funzionare deve essere ossidato. Possiamo avere un altro tipo di reazione. La nostra proteina che si deve foldare ha formato un ponte disolfuro sbagliato. L’enzima in forma ridotta attacca il ponte disolfuro, forma un intermedio covalente e così facendo permette alla proteina di arrivare nella sua forma corretta. Alla fine l’enzima ritorna in forma ridotto. Quello che è successo è che il ponte disolfuro viene ricollocato nella posizione corretta. Abbiamo una isomerizzazione. In un’altra casistica, la proteina con il ponte disolfuro sbagliato va incontro a degradazione, la proteina deve essere linearizzata. La proteina deve essere ridotta per rompere il ponte disolfuro. Gli enzimi ossidoreduttasi possono trovarsi in varie forme: ossidata o ridotta. Rigenerazione dell’enzima ossidoreduttasi: Ogni enzima sarà in una condizione di equilibrio diversa e potrà trovarsi in forme diverse. L’enzima una volta che ha catalizzato la formazione del ponte disolfuro nella proteina deve essere rigenerato. PDI: l’enzima inizialmente è ossidata, dona il suo ponte disolfuro alla proteina e si riduce. Ero1 ricarica PDI, dona il suo ponte disolfuro e lo riossida. Ero1 sarà ridotto e si può ricaricare, donando i suoi elettorni all’ossigeno. Ha un sito attivo tale per cui scarica gli elettroni riducenti formando H2O2, perossido di idrogeno, una molecola altamente reattiva. Essa viene usato come molecola di segnale: per ogni ponte disolfuro che si sta formando, si forma una molecola di H2O2. Esso può indicare un segnale riguardante la formazione di proteine foldate con ponti disolfuro. Le ossidoreduttasi possono lavorare successivemante, ossidano velocemnete le proteine e altre isomerizzano i ponti disolfuro. L’azione concentrata di tutti gli enzimi garantisce la corretta formazione di proteine foldate. Ancoraggio delle proteine alla membrana tramite attacco a GPI: L’ultima modificazione covalente: l’attacco di una GPI. Il GPI è un lipide di membrana con associato uno zucchero che viene attaccato da alcune proteine. Ci sono proteine che nascono con una regione transmembrana. La loro parte luminale viene spostata dalla regione transmembrana verso questo lipide associato alla membrana. Biologia cellulare e molecolare #3 – Prof.ssa T. Anelli – Folding proteico nella via secretoria Pag. 3 a 7 I lipidi di membrana non sono distribuiti in modo uniforme. Io posso fare che queste molecole si possano associare a dei microdomini, esempio: la proteina viene portata alle lipid rafts. Si può tagliare la proteina e renderla solubile tramite l’azione di un altro enzima rispetto ad una proteasi che la taglia. Meccanismo di controllo-qualità delle proteine: La via secretoria produce e sintetizza quelle proteine che vengono esposte all’esterno. È importante l’informazione che viene trasmessa, la precisione dell’informazione che viene passata. Le proteine che la cellula sercene o che espone sulla membrana, sono le “parole” che la cellula usa per interagire con l’esterno. La maggior parte degli ormoni sono proteici e vanno a colpire dei target specifici. La cellula attua dei sistemi stringenti di qualità. La cellula deve secernere ed esporre solo proteine native. Riconosce ancora quelle che non sono ancora nella struttura nativa, cioè quelle che non sono ancora completamente foldate. Le chaperon e gli enzimi sono specifici per le proteine non correttamemte foldate. BiP lega le proteine finchè non sono correttamente foldate. Questo è un controllo di qualità che avviene affinchè procedano oltre il RE solo le proteine completamente e correttamente foldate. Ci sono proteine che agiscono sotto forma di struttura terziaria, altre sottoforma di polimero e devono raggiungere una struttura quanternaria. Un esempio è l’IgM, sottoforma di pentamero, è un anticorpo formato da 21 catene polipeptidiche diverse, contiene 51 zuccheri diversi e 100 ponti disolfuro. Affinchè la proteina IgM fuoriesca, i polipeptidi devono essere correttamente strutturati. Gli anticorpi legano un’antigene. Il binding è riconosciuto sul legame catena pesante e catena leggera. Se io avessi solo un braccio della strututra, avrei la capacità di biding all’antigene, ma non saprei svolgere in toto la funzione. Deve dunque fuoriuscire solo la struttura intera. Nel RE viene controllato il folding delle proteine monomeriche e una volta che ci si è assicurati che il folding è corretto, fuoriescono. Nel RE è controllato il folding e la formazione dei complessi. Biologia cellulare e molecolare #3 – Prof.ssa T. Anelli – Folding proteico nella via secretoria Pag. 4 a 7 Per le proteine polimeriche di membrana c’è un secondo step di controllo. Una volta foldate, le proteine monomeriche proseguono, si assemblano a livello del Golgi e c’è un altro step di controllo. Se non sono correttamente strutturate non fuoriescono. Ciò vale anche per proteine che lavorano come proteine multimeriche. Dal punto di vista biochimico le proteine transmembrana sono idrofobiche e contengono delle cariche. Una volta formato il complesso, le cariche vengono nascoste. Se il complesso non è formato, le cariche saranno esposte e verranno riconosciute da proteine che riportano indietro queste strutture. Si prenda l’esempio di 2 proteine con cariche opposte che lavorano in coppia assieme. Se si trovano isolate l’una dall’altra, esiste una proteina che le riconosce e non le fa uscire. Mantenimento dell’integrità dell’apparato di folding delle proteine del RE: La via secretoria è un ambiente in cui proteine entrano, vengono sintetizzate e poi secrete. Si è trattato di enzimi che lavorano nel RE, nel Golgi. Tutte le chaperon sono enzimi solubili. Com’è che le proteine cargo possono andare via mentre gli enzimi e le chaperon rimangono? Sono tutte proteine solubili, alcune se ne vanno e altre no. Perchè è importante che rimangano lì? È importante che rimangano lì per la loro funzione. La via secretoria è paragonabile ad una fabbrica in cui ogni componente svolge in serie la propria funzione. C’è una compartimentarizzazione delle funzioni e ciò aiuta il fatto che le modifiche avvengano sequenzialmente. L’enzima riconosce il substrato solo dopo che esso è stato complessato ad un precedente enzima. Perchè non si possono muovere? C’entrano anche i recettori. Questi enzimi non lavorano singolarmente, ma in squadra. Nel RE gli enzimi lavorano insieme, formando un complesso sovramolecolare. Hanno delle affinità e formano un grosso complesso che non riesce ad uscire. Si può considerare il RE come una colonna cromatografica, tecnica usata per separare delle sostanze. Si possono utilizzare diversi tipi di cromatografia. Si utilizza una colonna con una resina e fasi faccio passare l’insieme di molecole. Quelle che hanno un’affinità per la resina rimangono intrappolate. Le chaperon e gli enzimi possono essere considerati come la resina, mentre la proteina come le molecole che scorrono. Una volta foldate, le proteine possono fuoriuscire e scorrere. Si ottiene un foldosoma. Biologia cellulare e molecolare #3 – Prof.ssa T. Anelli – Folding proteico nella via secretoria Pag. 5 a 7 C’è un ulteriore controllo per evitare la fuoriuscita delle chaperons. Le proteine solubili presentano sul C terminale, gli ultimi 4 aa, che formano una sequenza fatta da KDEL. Se dovessero uscire, nel Golgi si trova un recettore che le cattura e le riporta indietro. Si chiama KDEL receptor. Le proteine di membrana nella loro regione citosolica presentano una doppia lisina e una doppia fenilalania: KKFF. Se dovessero arrivare nel Golgi, si complessano con COPI e quindi vengono riportate indietro. Quale può essere il vantaggio di avere un meccanismo così? Si deve avere una sicurezza a posteriori. Un meccanismo così permette ad alcuni enzimi di fuoriuscire e complessarsi ad alcuni coenzimi e ritornare indietro. Alcune di queste chaperon svolgono delle funzioni anche all’esterno della cellula: le KDEL, ad esempio, sono importanti per alcuni step della coagulazione. Ciò ci permette di garantire la possibilità a queste chaperon di fuoriscuire. Il KDEL receptor non è solo un recettore ma manda anche dei segnali riguardanti la via secretoria. Riassumendo: si è trattato del protein folding, le chaperons molecolari, si è discusso delle varie modificazioni covalenti, del controllo qualità e si è parlato dell’integrità del reticolo endoplasmatico e dell’inserimento delle varie proteine di transmembrana. Quando le proteine non vengono fondate correttamente, la cellula si potrebbe trovare in una situazione di stress. Le proteine possono essere dunque degradate. Degradazione delle proteine: ubiquitina-proteasoma La cellula degrada proteine misfoldate e proteine di cui bisogna regolare l’attività, un esempio sono le cicline. Parlando di ciclo cellulare, vedremo come molti step sono dovuti alla degradazione di proteine di diversi step. Bisogna identificare le proteine da degradare, bisogna essere specifici e coordinati. Bisogna parlare di uno dei sistema più importanti, il meccansimo dell’ubiquitina, uno dei modi con cui si possono identificare le proteine da degradare. L’ubiquitina è composta da 75 amminoacidi, è espressa in tutte le cellule e in tutti gli eucarioti, è una proteina conservata evolutivamente. Gli amminoacidi più importanti sono la lisina 63 e la lisina 48. L’ubiquitina serve a marcare le proteine che devono essere degradate: essa si lega covalentemente alle proteine che bisogna degradare. Il C terminale, la glicina 76 della proteina da degradare, viene legata con la lisina 63. L’NH2 del residuo laterale della lisina si lega al COO- della glicina, il legame è fra il residuo laterale di un amminoacido e il COO della glicina. Il legame è catalizzato da un enzima E1, E2 e E3. Il primo enzima E1 prende l’ubiquitina, la lega e la attiva, E1 passa l’ubiquitina ad E2 e poi E2 con un’azione coordinata a E3 la lega con i residui di glicina. Si ha nella cellule solo un’isoforma di E1, mentre si hanno diverse isoforme di E2 e molte di E3: le ubiquitine ligasi, E3, sono presenti in molte isoforme. Non si lega una sola ubiquitina, ma una serie di ubiquitine. La proteina così viene marcata. Si hanno delle poliubiquitine sul residuo di lisina 48. Questo permette di agire in modo specifico solo sulle proteine che devono essere degradate. Le proteine solubili marcate vengono indirizzate al proteosoma. Ciò è stato descritto nel 1977 da Goldberg. Biologia cellulare e molecolare #3 – Prof.ssa T. Anelli – Folding proteico nella via secretoria Pag. 6 a 7 Questi lavori derivano da uno studio a cura di basic cell Biology. Viene posta la domanda sul come le proteine sintetizzate venissero degradate. Con gli inibitori del proteasoma si cura quasi completamente il mioma multiplo. In clinica ha un ruolo importante. Il proteasoma: Si stavano studiando degli eritrociti immaturi e c’era una struttura proteolitica che lavorava a pH 7,8 dipendetemente dai lisosomi. Questa struttura è il proteasoma, un complesso multiproteico, un cilindro con una subunità centrale e 2 laterali, in cui viene fatta entrare la proteina da degradare. Questa è la struttura tridimensionale del proteasoma. Dividiamo il proteasoma in una subunità 20S e una 19S. La 20S è formata da 4 anelli da 7 subunità ciascuna. Alcune delle subunità hanno attività proteasica con un taglio dopo un glutammato, dopo le arginine e lisine e una attività che taglia dopo i residui aromatici. La proteina che entra all’interno della struttura verrà attaccata da questi siti proteolitici che la riducono in residui minori. Questa struttura deve essere completamente lineare. Le 19S sono formate da diverse subunità, ricordiamo la Rpn 2 e AAA ring. Si vede che la proteina che sta entrando che è completamente linearizzata, nella 20S verrà framentata. La Rpn 11 taglia l’ubiquitina che verrà riusata per targettare altre proteine. Questa è una struttura esamerica in cui ogni monomero può idrolizzare ATP, tramite idrolisi di ATP subisce un cambiamento conformazionale. I vari monomeri agiscono in serie, l’uno dopo l’altro e il cambio sequenziale dei monomeri porterà ad un movimento della proteina che sta entrando. A turno i vari monomeri legano ATP e subiscono dei cambiamento conformazionali. Nel mezzo abbiamo la catena polipeptidica che sta entrando all’interno del proteasoma. Il proteasoma con vari cambiamenti conformazionali e movimenti delle subunità porta all’interno la proteina da degradare. I siti protoelitici nella 20S degradano la proteina in vari frammenti di amminoacidi. L’attività proteasomale serve a degradare proteine di cui vogliamo controllare l’attività, è importante per regolare anche lo studio del controllo della qualità. Biologia cellulare e molecolare #3 – Prof.ssa T. Anelli – Folding proteico nella via secretoria Pag. 7 a 7 Proteine del RE: per essere degradata la proteina deve anche essere retrotraslocata fuori dal RE. La proteina viene riconosciuta da delle chaperon, viene unfoldatata e i ponti disolfuro vengono ridotti, poi viene portata ad un traslocatore che la fa uscire dal RE. Si ha un E3 e la proteina può essere portata al proteasoma. Questo meccanismo si chiama ERAD e vale non solo per le proteine solubili, ma anche per le proteine transmembrana, in cui vengono usate delle chaperon specifiche. Anche le proteine di transmembrana vengono degradate così. Nel RE vengono degradate proteine che non si foldano correttamente ma ciò vale anche per le proteine citosoliche. Il proteasoma è importante per il funzionamento del sistema immunitario, MHC di classe 1 è una proteina di transmembrana esposta da ogni cellula, e serve a segnalare che la parte della cellula che espone fa parte dell’organismo, (è quindi self). Alcuni dei peptidi generati dal proteasoma vengono importanti nel RE tramite un trasportatore TAP, nel RE grazie a ERAD, vengono legati al dominio extracellulare MHC di classe 1 che quindi va in superficie esponendo alla superficie frammenti di proteine che la cellula sta producendo. Se una cellula è infettata da un virus, inizia a produrre proteine del virus. La cellula espone frammenti di amminoacidi di proteine del virus e informa il sistema immunitario che quella cellula è infettata. Il proteasoma può essere una sorgente di amminoacidi per starvation, le proteine possono essere ridotte ad amminaocidi singoli e riusati per riformare proteine nuove. Un aggregato per essere eliminato per via del proteasoma deve essere smantellato. Spesso l’aggregato è più stabile rispetto allo stato nativo. Fin dove è possibile, il proteasoma li degrada tramite autofagia. Chaperon mediated autophagy: KFERC. Nel momento in cui una proteina che presenta questa sequenza nascosta nella struttura la espone, essa verrà legata da delle chaperon specifiche che la portano al lisosoma. Nel lisosoma le chaperon prendono contatto con una proteina transmembrana, LAMP 2, creando un canale per far entrare la proteina e che permette la degradazione tramite delle proteasi del lisosoma. Se non si riesce a degradare le proteine misfoldate si formano aggregati. Un primo segnale di ciò è un aumento dello stress. Biologia cellulare e molecolare #19 – Prof. E. Milan – Traffico Intracellulare Pag. 1 a 7 Biologia cellulare e molecolare Traffico di membrana Prof. E.Milan – 15/04/2024– Autore: Bossi Ludovica – Reviewer: Sandrini Anna – linea Verde 2029 Oggi vedremo tutto quello che avviene tra il trans golgi network e la membrana plasmatica sia in entrata che in uscita. Vediamo gli endosomi, i lisosomi e le vescicole secretorie. Dal Golgi ai lisosomi Nel golgi passano le proteine dal reticolo al golgi. Il golgi ha varie cisterne ognuna con una funzione diversa. Le proteine vengono glicosilate con N glicosilazione o O glicosilazione. Le proteine della superficie o proteine della matrice extracellulare dal trans golgi network (TGN) vanno direttamente nella cellula. Per altri tipi di proteine tipo ormoni o neurotrasmettitori vengono incamerati o concentrati in vescicole secretorie per una secrezione di tipo regolato, da segnali, come impulsi elettrici, carenza di zuccheri. La vescicola secretoria si accumula sotto la membrana plasmatica per il rilascio del cargo a seguito del segnale opportuno. Dal trans golgi network alcune proteine non devono andare fuori dalla cellula (anche se la maggior parte sì) ma devono andare nei lisosomi, cioè fanno la funzione del lisosoma. Queste proteine sono idrolasi acide, sono enzimi che tagliano facendo idrolisi e sono di vario tipo; acide è perché a pH acido nei lisosomi possono funzionare, degradando tutto quello che entra nel lisosoma. All’interno del lisosoma può esserci qualsiasi tipo di struttura cellulare, cellule intere, patogeni dall’esterno o organelli. Queste proteine del lisosoma vengono sintetizzate nel RER, poi vanno nel golgi, poi il trans golgi network deve capire come selezionarle e mandarle al lisosoma attraverso gli endosomi. Lungo tutta questa via di secrezione, c’è un gioco di pH da parte della cellula, che aumenta via via il pH sia per affinità recettore-ligando, sia per controllo di queste idrolisi. Le idrolasi non devono degradare nel citosol, ma solo in questa camera chiusa limitata chiamata lisosoma, organello a singola membrana. Il pH viene generato perché aumenta sulla superficie degli organelli la concentrazione di pompe atpasiche, cioè pompe protoniche contro gradiente che prendono idrogeni e li portano nel lisosoma. Il lisosoma è l’organello più acido della cellula poiché ha il maggior numero di queste pompe atpasiche e solo lì le idrolasi possono funzionare bene. Le idrolasi sono altamente glicosilate così che più difficilmente vengano autodigerite dalle proteasi. Lisosomi I lisosomi sono pieni di idrolasi acide. L’endosoma porta il materiale da degradare, si fonde con un lisosoma esistente e si forma l’endolisosoma che degrada il materiale. Quando finisce il ciclo avrà degradato tutto quello all’interno e si riformerà di nuovo il lisosoma da solo pronto per fondersi con un altro endosoma. Attraverso l’endosoma arrivano anche nuove idrolasi per rimpiazzare le vecchie, quindi c’è continuo ciclo di queste idrolasi. A seconda della fase del ciclo se guardiamo le cellule al micorscopio vediamo che i lisosomi hanno dimensioni diverse, più o meno grandi, a seconda della fase. Queste idrolasi vengono portate al lisosoma per la degradazione attraverso un segnale Biologia cellulare e molecolare #19 – Prof. E. Milan – Traffico Intracellulare Pag. 2 a 7 specifico, dice al trans golgi network di non mandarla fuori dalla cellula, sarebbe pericoloso. C’è una sequenza proteica specifica che fa sì che queste proteine vengono riconosciute nel golgi l’enzima N-acetilglucosammina fosfotransferasi, sui mannosi esterni attacca un fosfato in posizione 6 e questo gruppo fosfato crea un segnale semplice è quindi la fosforilazione di questi mannosi da parte dell’n acetil glucosammina, per cui la proteina deve finire nel lisosoma. Il segnale viene trasferito grazie a questo enzima che in due fasi prima attacca un gruppo fosfato, trasferisce quindi la glucosammina da UDP-N Acetilglucosammina fosfato nell’acetilglucosammina fosfato su questo mannosio 6 fosfato, che poi in una seconda fase nel TGN l’n acetil glucosammina viene tagliata e rimane il mannosio 6 fosfato che è il segnale. La funzione del trans golgi network è lo smistamento in uscita, le tgn idrolasi con mannosio 6 fosfato legano recettori che hanno il ruolo di reclutamento di proteine adattatrici che direzionano la vescicola all’endosoma precoce. Si formano quindi vescicole che contengono le idrolisi che vanno poi a gli endosomi. L’endosoma ha un pH acido (a differenza del golgi che ha ph più basico) per la concentrazione crescente di pompe che dicevamo prima. Nell’endosoma il pH cambia e il recettore si stacca dalle idrolasi perdendo affinità e viene riportato subito indietro e riciclato. Normalmente le idrolasi vanno mantenute inattive perchè sono pericolose. La cellula ha fatto in modo di stabilire che una quota di recettore m6p vada all'esterno della cellula in funzione di recupero delle idrolasi che scappano fuori dalla cellula. Così ora le idrolasi sono nel lisosoma. Dentro il lisosoma finisce un po’ di tutto, cellule intere, batteri, patogeni, aggregati proteici e qualsiasi struttura cellulare. Il lisosoma porta queste idrolasi di molteplici varietà che devono degradare zuccheri, membrane degli organelli, un sacco di materiale. Se abbiamo mutazioni sulle singole idrolasi lisosomiali, la cellula mangia dall’esterno determinati componenti che però non possono essere degradati perché abbiamo mutazioni genetiche. Esistono molte malattie dette “da accumulo lisosomiale”, se non abbiamo l'enzima per degradare gli zuccheri legati alle glicoproteine che vengono endocitate, si accumulano i glicosamminoglicani nel lisosoma e avremo una malattia che sarà una mucopolisaccaridosi, ovvero non riesco a degradare le mucine che si accumulano nelle cellule e le danneggiano. Queste malattie sono per lo più recessive cioè devo perdere entrambe le coppie, se ne ho anche solo una, funzionerebbe almeno parzialmente. Queste malattie sono più di 40. Solo 2 non sono recidive ma sono X linked e sono la malattia di Hunter e quella di Fabry. Manca un enzima lisosomiale e il lisosoma non riesce a degradare quel determinato substrato. Esempi mucopolisaccaridosi I (Hurler) e II (Hunter). Nelle malattie in cui i lisosomi non funzionano le cellule hanno moltissimi aggregati poiché non riescono a degradare il contenuto e creano “inclusion cell” cioè cellule con inclusioni di materiale lisosomiale di tutti i tipi che non può essere degradato. La particolarità di questa malattia è che ci sono alcuni tessuti, come gli epatociti, che riescono comunque a portare le idrolasi al lisosoma mentre la maggior parte dei tessuti non riesce. Queste mutazioni non toglierebbero la funzione all’idrolasi lisosomiale, basta una mutazione che espone magari un residuo idrofobico e questo fa sì che nel politic control del reticolo endoplasmatico queste proteine vengono riconosciute come non corrette impedendogli di uscire dal RE. Un esempio non lisosomiale tipico del politic control è anche la fibrosi cistica, in alcune mutazioni manca un canale per il cloro che serve per dare fluidità ai nostri polmoni ed evitare le infezioni, in alcuni casi il canale cloro potrebbe funzionare ma il problema é che non arriva proprio in membrana perché non riesce ad uscire dal RE. Queste malattie da accumulo lisosomiale sono causate dalla mancanza di un enzima, il lisosoma degrada tutto tranne una specie che si accumula e degrada la cellula. Se il lisosoma funziona bene i singoli costituenti vengono portati fuori dai lisosomi e riutilizzati. Con l’invecchiamento perde un po 'di questa efficienza e si formano dei granuli di lipofuscina insolubili di scarti per lo più lipidici, ma contenenti anche anche residui peptidici e metallici. Ci sono casi in cui la cellula è stressata e avviene l’esocitosi lisosomiale, cioè il lisosoma si fonde con la membrana e butta fuori tutto. Questo, tuttavia, non è la norma tranne che nei melanociti, cellule che producono la melanina, la quale viene portata al lisosoma (i lisosomi contenenti melanina sono chiamati melanosomi). I melanosomi non degradano la melanina ma fanno esocitosi lisosomiale, si fondono con la membrana dei melanociti che buttano fuori la melanina. La melanina a questo punto viene presa dai melanociti della pelle, che fanno endocitosi e si colorano. L'albinismo non è altro che mutazioni nei geni che causano questa endocitosi dei melanosomi. Nelle piante il lisosoma si chiama vacuolo e ha diverse funzioni, mentre nella cellula animale ha una funzione per lo più degradativa. Nelle piante non solo occupa il 70% del volume delle piante, ma ha anche funzione di storage, cioè accumulo di nutrienti. Può contenere anche tossine e soprattutto ha funzione idrostatica. Quando manca acqua il vacuolo riconosce che manca acqua e rilascia per mantenere l’equilibrio, questo meccanismo si chiama pressione di turgore, idrostatica. Biologia cellulare e molecolare #19 – Prof. E. Milan – Traffico Intracellulare Pag. 3 a 7 Al lisosoma arrivano le proteine da degradare, tramite 4 vie principali: - autofagia - endocitosi (endosoma) - fagocitosi (fagosoma) - macropinocitosi Arrivano sempre attraverso la fusione di un lisosoma preesistente con un organello che arriva. Il lisosoma é piccolo quando è vuoto, molto denso e ricco di idrolasi e si fonde con una vescicola a seconda di dove arriva (fagoosma, endosoma, autofagosoma); il lisosoma mette le idrolasi mentre la vescicola mette il materiale da degradare, così il primo inizia a degradare il contenuto. Le proteine che arrivano dal golgi, non vanno degradate, in quanto sono appena state sintetizzate. Dal trans golgi network arrivano le idrolasi, dalle altre vie arrivano i substrati da degradare. -Autofagia (Dall’interno al lisosoma). La cellula si “automangia”, se togliamo i nutrienti alla cellula deve mangiare del suo contenuto. La cellula in questo modo crea organelli a doppia membrana, cioè una membrana a doppio strato lipidico; l’autofagia può degradare ribosomi, mitocondri, perossisomi… tutto quello che è degradato viene inglobato nell’organello a doppia membrana chiamato autofagosoma e fonderà col liososma. -Endocitosi (Dall’esterno all’interno). Il materiale portato all’interno passa per organelli intermedi, l’endosoma precoce, che poi cambierà la sua forma per diventare endosoma tardivo, e si fonderà col lisosoma facendo sì che questo degradi il contenuto dell’endosoma. Ciò che viene endocitato sono ad esempio complessi recettore ligando, nutrienti e trasportatori, componenti matrice cellulare, extracellulare o detriti cellulari. Tutti questi componenti poi devono essere degradati da lisosoma. L’endocitosi può essere di 2 tipi, o generale (pinocitosi= “cellula che beve”) o regolata da recettori (endocitosi da recettore) che selezionano qualcosa di specifico portandolo all’interno della cellula. Esempio: La cellula ha bisogno di colesterolo per fare nuove membrane, nel circolo sanguigno il colesterolo é legato alle LDL. La cellula mette fuori un recettore per le LDL e quando ha bisogno di colesterolo lo porta all’interno. La pinocitosi e l’endocitosi da recettore avvengono mediante vescicole ricoperte da clatrina. Sulla superficie della cellula si forma del fosfatidil inositolo 4,5 , arrivano le proteine, legano recettori per il cargo e la clatrina, si forma la vescicola da clatrina, che si fonde con l’endosoma precoce. Costantemente nella nostra cellula si formano delle invaginazioni all’interno, ricoperte da clatrina. La cellula senza recettore beve un pezzo del fluido extracellulare appunto chiamata pinocitosi. Le vescicole che si formano si fondono con l’endosoma precoce. Lì il cargo viene subito smistato: quello che é stato introdotto per sbaglio nella cellula vengono riciclati e portati in membrana oppure Biologia cellulare e molecolare #19 – Prof. E. Milan – Traffico Intracellulare Pag. 4 a 7 nell’endosoma di riciclo. Nel frattempo l’endosoma precoce inizia il processo di “maturazione” che fa sì che l’endosoma che prima era sotto la membrana plasmatica, si sposti verso il nucleo, cambiando forma mentre i recettori tornano sulla superficie. Allo stesso tempo dal golgi iniziano ad arrivare le idrolasi e la pompa atpasi. Quello che doveva essere degradato per evitare che venga riciclato viene racchiuso in vescicole intraluminali, all’interno del lume dell’endosoma. Così prende il nome di endosoma tardivo, passando da rab 5 a rab 7. Questo corpo multivescicolare con le vescicole con all’interno il materiale da degradare si può fondere col lisosoma e finire il suo ciclo. A seconda della cellula ogni minuto il 3% della superficie viene endocitata. Questo ciclo di endocitosi continuo è sempre regolato con uno di esocitosi, alcune vescicole entrano e alcune escono. Esistono pochi casi in cui la dimensione della cellula è costante. Abbiamo più vescicole che fanno nuove membrane rispetto al contrario. La membrana aumenta in caso di citochinesi oppure in casi di rottura per riparare (aumento calcio), oppure in casi come lo sviluppo embrionale dei moscerini (cellularizzazione, ogni nucleo viene circondato da una membrana, sintesi di lipidi e sintesi di membrane). L’endocitosi ha bisogno anche di sistemi più specifici —>i recettori, che concentrano in un posto il materiale che deve essere portato all’interno, interagire con la clatrina per formare le vescicole endocitiche. Una vescicola può contenere fino a 1000 recettori diversi che hanno il compito di concentrare questo carico e far sì che venga portato all’interno. All’interno ci sono 3 destini possibili: 1) il carico viene degradato e il recettore viene riportato in membrana (caso colesterolo), 2) sia carico che recettore riescono a sfuggire alla degradazione così da venire riciclati senza passare dal lisosoma (caso del ferro), 3) sia recettore che ligando vengono degradato 1. l’esempio classico è quello del colesterolo, preso con la dieta e sintetizzato nel fegato. Il trasporto nel sangue avviene tramite LDL (lipoproteine a bassa densità), che circola nel sangue se non viene preso dalle cellule (colesterolo cattivo). È necessario per le nostre membrane ma se rimane in circolo forma le placche aterosclerotiche che provocano ostruzione dei vasi sanguigni. Le LDL legano i lipidi e creano esteri con le molecole di colesterolo. Le cellule che hanno bisogno di colesterolo mettono sulla superficie recettori per le LDL. Il recettore si associa al fosfatidil inositolo 4,5 bifosfato, recluta le proteine ap2 e clatrina e viene endocitato. Finisce nell’endosoma precoce, cambia il ph, è più acido, il recettore perde affinità per le LDL e va riportato in membrana, l’LDL viene degradata e il colesterolo usato per la cellula. Esistono malattie in cui ci sono mutazioni di questi recettori che vengono chiamate ipercolesterolemia familiare, le LDL rimangono in circolo e si rischiano infarti. Il recettore nell’endosoma si stacca e viene riciclato in membrana, quindi il recettore viene riciclato e le LDL degradate. 2. Il caso opposto è quello del ferro, trasportato legato alla proteina transferrina (apotransferrina se non è ancora legata al ferro, transferrina quando legata al ferro). La transferrina lega il ferro (che è esterno alla cellula) in condizione ossidata Fe3+. Sulle nostre cellule ci sono recettori per la transferrina, legano ancora una volta la transferrina al ferro, attivano la clatrina e si forma la vescicola che andrà all’endosoma precoce. Nell’endosoma precoce ancora una volta c’è un cambio di pH, il ferro viene Biologia cellulare e molecolare #19 – Prof. E. Milan – Traffico Intracellulare Pag. 5 a 7 ridotto a Fe2+ perdendo affinità per la transferrina, esce dal lisosoma e si lega con la ferritina che lo riossida a Fe3+. La transferrina poi è riportata fuori dalla cellula. Tutto smistato e riciclato nell’endosoma precoce, niente di degradato. 3. Terzo caso, sia il recettore che la molecola target vengono portati al lisosoma come per esempio di alcuni recettori come i fattori di crescita. La cellula ha sulla superficie dei recettori “EGF recettor” fattori di crescita per l’epidermide, segnala che la cellula deve proliferare, ma è pericoloso per rischio di tumori se segnala senza un ligando. Bisogna quindi spegnere il segnale, non va bene un prolungato segnale di crescita. Nell’endosoma precoce tutti e due (sia fattore di crescita dell’epidermide che del recettore di crescita dell’epidermide) vengono sequestrati nelle vescicole intraluminali per la degradazione. Questo fenomeno avviene anche per i recettori degli oppioidi, ma man mano che li stimoliamo vengono degradati. Chi è dipendente da oppioidi ne deve assumere sempre di più perché la cellula degrada i recettori. La cellula vuole evitare una sovraesposizione a segnali. Il segnale per la degradazione è l’ubiquitinazione. I recettori vengono monoubiquitinati e portati alla degradazione. Vengono reclutate dal PI3P delle proteine chiamate ESCRT, proteine di vari complessi che vanno da 0 a 3; queste riconoscono sia il fosfatidil inositolo 3P che, allo stesso tempo, l'ubiquitinazione del recettore così da staccarlo e metterlo nelle vescicole intraluminali. In questo modo il recettore è intrappolato nella vescicola intraluminale e non può essere riciclato e riportato in membrana, per cui deve per forza finire nell’endosoma dove verrà degradato. Maturazione dell’endosoma Fase in cui cambia forma in modo dinamico e da endosoma precoce diventa tardivo. Dalle parti esterne la parte tubulare gemma e torna in membrana, via via l’endosoma cambia la sua forma, cambia pH arrivano le idrolasi, si formano le vescicole, cambia forma, diventando endosoma tardivo. Rab 5 attiva rab 7 che inibisce rab 5, quindi cambia anche la molecola di segnale. Rab 7 dice che l’endosoma è pronto a fondersi col lisosoma per la degradazione. Il processo di maturazione è irreversibile. Endosomi di recupero Esistono un terzo tipo di endosomi, detti “di recupero”, che accumulano le vescicole di riciclo dove si accumulano recettori in attesa che la cellula li metta sulla superficie. I trasportatori per il glucosio sono in questo endosoma di riciclo in modo che la cellula li rimetta sulla superficie quando ha bisogno di recuperare un determinato carico. L’endosoma di recupero ha la funzione di mediare la distribuzione nelle cellule polarizzate. Le cellule polarizzate hanno da un lato una membrana che fa una funzione e da un altro un’altra. Per esempio le cellule nell’epitelio dell'intestino hanno una parte apicale che deve assorbire i nutrienti mentre ha una parte basale che invece è legata alla lamina basale sotto che è in comunicazione con il flusso sanguigno per mettere in circolo questi nutrienti. C’è una membrana nella parte basolaterale che non è uguale a quella apicale. L’endosoma di recupero smista il materiale. Il fenomeno di endocitosi che va da un lato (membrana apicale) all’altro (membrana basolaterale) si chiama transcitosi. Il neonato non ha un sistema immunitario pronto e per le difese immunitarie prende gli anticorpi del latte materno, lo fa perchè sulle sue cellule dell'intestino ci sono dei recettori per gli anticorpi che verranno endocitati sempre per la clatrina, arrivano all’endosoma di riciclo e quest’ultimo li manda verso la membrana basolaterale. Dalla membrana basolaterale vengono mandati fuori nel circolo sanguigno, il cambio di pH fa sì che l’anticorpo si stacchi dal recettore e dia la difesa immunitaria al neonato. La cellula lo fa attraverso giunzioni strette che fanno sì che non si mischino lipidi e proteine di membrane. Può avvenire per smistamento diretto (segnali specifici). Le membrane sono completamente diverse sia per contenuto lipidico che proteico a seconda dove dobbiamo andare. Esistono altri 3 meccanismi attraverso cui la cellula prende le cose e le porta dall’esterno all’interno senza clatrina e sono caveole, macropinocitosi ed fagocitosi. Biologia cellulare e molecolare #19 – Prof. E. Milan – Traffico Intracellulare Pag. 6 a 7 - Caveole: dalle microscopie elettroniche si è visto che alcune cellule hanno attaccate alla membrana delle zone ricche di zattere lipidiche dove si formano queste vescicole particolari che si chiamano appunto caveole (proteine strutturali che ripiegano questa invaginazione chiamate caveoline) e in tutti questi anni non si sa bene il loro ruolo fisiologico. Alcuni virus tra cui il papilloma virus utilizza le caveole per entrare nelle cellule e quindi poi riesce ad infettarle. - Macropinocitosi: no clatrina. Dal nome “cellula che beve in grande”. In maniera aspecifica in seguito ad alcuni stimoli la cellula tira fuori una protusione guidata dall’actina detta “ruffle”, che si richiude su se stessa inglobando un volume cellulare molto più grande. La cellula mette fuori questo ruffle che si chiude su se stesso e porta dentro in maniera indistinta tutto. Fondono poi con endosomi tardivi - Fagocitosi: contrario pinocitosi, dal nome cellula che mangia. Mentre la macropinocitosi prende nutrienti, la fago non è di nutrizione, è un fenomeno più immunitario. Le cellule che fanno fagocitosi sono per lo più immunitarie, neutrofili e macrofagi, mangiano patogeni, detriti cellulari di cellule apoptotiche e cellule tumorali. È molto più studiata delle caveoline per tumori virus etc. I neutrofili mangiano i batteri, i macrofagi cellule senescenti, apoptotiche e tumorali. L’apoptosi è la morte cellulare controllata pulita delle cellule tumorali senza scatenare un'infiammazione, per cui i resti spariscono in maniera pulita. I resti (corpi apoptotici) sono mangiati dai macrofagi. Riconoscono cosa degradare tramite segnali (EAT ME signal e DO NOT EAT ME signal). Il segnale della cellula che sta bene e il segnale di non mangiarla è cd47 (proteina di membrana). I segnali più famosi che la cellula va mangiata dai macrofagi sono la fosfatidilserina; la calreticulin (chaperon) sulla membrana plasmatica; presenza anticorpi legati all’esterno della cellula, la cellula non è self. Quando i segnali di mangiami vincono attivano chinasi che fanno sì che si formi il fosfatidil inositolo 3,4,5 trifosfato che è il segnale che scatena l’actina che comincia a polimerizzare. Si forma il fagosoma che si fonderà col lisosoma per la degradazione. Ci sono due patogeni che cercano di truffare la cellula, cercando di sfruttare la fagocitosi: Mycobacterim tuberculosis entra per fagocitosi ma inibisce la fusione con il lisosoma e Listeria Monocytogenes distrugge integrità mebrana lisosomiale e riesce a fuggire nel citosol. Tutti i virus usano un recettore per indurre endocitosi ed entrare nella cellula. Esocitosi Dal golgi all’esterno della cellula attraverso due metodi: -dirette attraverso una secrezione costitutiva non regolata oppure attraverso -secrezione regolata (le cose da degradare prime in vescicole secretorie). Le vescicole secretorie si fondono tra di loro concentrando il carico, e hanno 3 funzioni principali: concentrare il cargo, essere pronte al rilascio post stimolo e di sicurezza (es. le idrolasi non devono tagliare nel reticolo e nel golgi). La cellula oltre a concentrare il cargo, è il carico pronto al rilascio, sintetizza i segnali (per risparmiare) come una molecola molto lunga che poi verrà tagliata poiché servono numerosi informazioni della sequenza per direzionale questo carico. Per esempio del pre pro opiomelanocortin, Biologia cellulare e molecolare #19 – Prof. E. Milan – Traffico Intracellulare Pag. 7 a 7 prodotta dall’ipofisi, è sintetizzata come una lunga proteina con un peptide segnale, che poi viene via via durante il suo percorso tagliata in tanti altri neurotrasmettitori e proteine. Le vescicole secretorie concentrano il cargo e devono stare pronte all’impulso, questo può essere rilascio ormoni, elettrico o aumento di calcio. Vescicole sinaptiche Le vescicole sinaptiche si trovano nelle sinapsi e contengono diversi tipi di neurotrasmettitori. Possono essere formate dal golgi e trasportate oppure formarsi direttamente per endocitosi. Vanno rilasciate velocemente, esempio mano sul fuoco, deve essere veloce. La maggior parte delle vescicole sinaptiche vengono riciclate a livello della sinapsi. Ci sono quindi cicli continui di secrezione del neurotrasmettitore e contemporaneamente viene ri-recuperato dalla sinapsi, mandato all’endosoma di riciclo, si formano nuove vescicole a livello della sinapsi e poi possono rispondere a un nuovo impulso. Il riciclo deve avvenire velocemente. Queste vescicole non solo sono già cariche e pronte,ma hanno già fatto pre docking, priming con la membrana. Queste vescicole si fondono grazie alle proteine della famiglia SNARE: queste sono le vSNARE=sinaptobrevina e tSNARE=sintaxina e SNAP25. Prima dell’ impulso elettrico queste vescicole già fanno un priming, ma non è ancora avvenuto l'avvolgimento che causano la fusione. Le proteine “complessine” bloccano ripiegamento, fusione e rilascio della vescicola. Lo stimolo arriva al neurone, aumento di calcio, attivazione della sinaptotagmina, rimuove le complessine e permette la fusione delle snare. La vescicola sinaptica rilascia immediatamente, appena rilasciata parte il ciclo endocitico-esocitico e il neurotrasmettitore attiva il neurone a valle ma allo stesso tempo viene subito recuperato per fare nuove vescicole. Tutto questo perché tempismo e rapidità sono fondamentali nei neuroni. Quando arriva l’impulso solo le vescicole pronte possono fondersi, quelle che non hanno pre docking e priming no. Biologia cellulare e molecolare – Prof. Enrico Milan– Tecniche di laboratorio Pag. 1 a 8 Biologia cellulare Tecniche di laboratorio Prof. Enrico Milan– 16/04/2