Biologie moléculaire BIO1101 Session automne 2024 PDF

Biologie moléculaire BIO1101 Session automne 2024 Rim Marrakchi [email protected]  Chapitre 4: La réparation de l’ADN et la transposition 4.1. Le code gé...

Biologie moléculaire BIO1101 Session automne 2024 Rim Marrakchi [email protected]  Chapitre 4: La réparation de l’ADN et la transposition 4.1. Le code génétique et les mutations a) Mutations ponctuelles (modifications simples b) Modifications profondes 4.4. La cassure bicaténaire d’ADN c) Différents effets des mutations 4.5. La transposition 4.2. Les erreurs durant la réplication: a) Transposons à ADN les mutations ponctuelles et les microsatellites b) Les rétrotransposons viraux a) Les mésappariements c) Les rétrotransposons poly-A (non viraux) b) Les microsatellites d) Impacts sur le génome 4.3. Les altérations chimiques des bases: 4.6. Les enzymes de restriction “spontanées” et “environnementales” a) Spontanées b) Environnementales c) Les systèmes de réparation 4.1. Le code génétique et les mutations Dans le cytoplasme, les ARNt transportent les a.a. vers les ribosomes qui traduisent le message de l’ARNm encrypté sous forme de triplets de ribonucléotides en une série d’a.a. attachés par des liaisons peptidiques. Génon(1):3 désoxyribonucléotides consécutifs du brin matrice de l’ADN. Il est transcrit en codon. Codon(2): 3 ribonucléotides consécutifs d’une molécule d’ARNm complémentaires à un génon. * et 3 désoxyribonucléotides du brin codant de l’ADN complémentaire au génon. Anticodon(3): 3 ribonucléotides consécutifs d’ARNt complémentaires à un codon spécifique de l’ARNm. Les séquences sont nommées de 5' vers 3’. Les séquences complémentaires sont antiparallèles. il est complémentaire a Passage d'un brin a l'autre 4.1. Le code génétique et les mutations Un triplet de nucléotides(UAC, AUG, etc.) code pour un acide aminé: possibilité de coder 64 acides aminés (4 bases azotées différentes en triplets: 43= 64) mais il n’y a que 20 acides aminés. Pour cette raison plusieurs triplets de nucléotides codent pour le même acide aminé: redondance, dégénérescence du code génétique. Cadre de lecture: Les codons sont lus sans chevauchements.  Si une mutation substitue un nucléotide par un autre, alors un seul codon est affecté. S’il y avait chevauchement, 3 codons seraient affectés.  Le cadre de lecture indique comment il faut lire la séquence : On le trouve en identifiant le codon de départ (AUG = a.a. méthionine) sur la séquence (la recherche se fait du 5’ vers 3’). 4.1. Le code génétique et les mutations Codon 4.1. Le code génétique et les mutations Les divers types de codons Codons d’initiation: marquent le début de la lecture de l’ARNm. o Tous: AUG méthionine pour les eucaryotes et N-formyl-méthionine pour les procaryotes) o Autres possibilités chez procaryotes: GUG (valine) et UUG (leucine). Codons des acides aminés: codent pour les 20 acides aminés Codons de terminaison (STOP): indiquent la fin de la lecture de l’ARNm. UAG, UAA et UGA Pour trouver un cadre de lecture, il faut chercher (sur l’ARNm ou sur l’ADN codant 5’ vers 3’) le premier codon «AUG» (ou «ATG»). À partir de lui, la séquence codante se poursuit, par triplets, sans chevauchement, jusqu’au codon «STOP». 4.1. Le code génétique et les mutations Le code génétique Pour quel acide aminé le codon 5’-CAG-3’ code? Pour quel acide aminé le codon 5’-UAA-3’ code? 4.1. Le code génétique et les mutations Les mutations ≡ tous les changements de la séquence de l’ADN. Classées de trois manières : o Selon l’effet sur la structure (d’ADN) : simple (small-scale)ou profond (large-scale) o Selon l’effet sur la fonction (de la protéine) : perte-de-fonction, gain-de-fonction o Selon l’effet sur la valeur adaptative: néfaste, bénéfique, neutre. Conséquences selon le type cellulaire affecté:  Dans la cellule germinale(production des gamètes): affecte les générations suivantes  Dans la cellule somatique: affecte l’individu (ex: mutations dans la régulation du cycle cellulaire= cancer) 4.1. Le code génétique et les mutations a) Mutations ponctuelles (modifications simples) Substitution de nucléotides. o Pendant la réplication o Modification de la structure chimique d’un nucléotide déjà présent. Indels: insertion/délétion d’une paire de nt. illustration de différents types de mutations 4.1. Le code génétique et les mutations b) Modifications profondes o Insertion ou délétion larges (une séquence et non 1-2 nt) o Réarrangement chromosomique : modification de l’organisation d’une large région chromosomique (change l’ordre des gènes). Translocation, recombinaison aberrante, inversion, déplacement des transposons… o Amplification génétique: répétitions anormales de régions de l’ADN suite à la réplication. Duplication de gène complet, de partie de chromosomes ou extension des séquences répétées (microsatellites) o Anomalies chromosomiques (ex. trisomie). http://www.vce.bioninja.com.au/aos-3-heredity/molecular-genetics/mutations.html 4.1. Le code génétique et les mutations c) Différents effets des mutations Un changement dans la séquence qui code une protéine  une protéine différente dont la forme, l’activité ou l’association à d’autres protéines a été changée. Exemple : Anémie falciforme 4.1. Le code génétique et les mutations c) Différents effets des mutations Un changement dans la région régulatrice de l’expression génique ou dans la structure globale de l'ADN.  la protéine n’est pas modifiée, mais elle n’est plus produite au moment adéquat ou n’est plus produite du tout. Exemple : Syndactylie Le phénotype est héréditaire et plusieurs mutations génétiques peuvent mener à la syndactylie  les protéines nécessaires pour l’apoptose ne sont pas présentes et/ou actives au bon moment durant le développement fœtal. mutation dans les séquences régulatrices = pas de doigts les séquences non codantes sont importes dans le génome. 4.1. Le code génétique et les mutations c) Différents effets des mutations À la base du polymorphisme, des allèles, de l'évolution et de certaines maladies. Étude de la migration de l’homme via les séquences mitochondriales (et leurs mutations). Couleur des yeux Le gène HERC2 contient un élément régulateur qui, lorsque muté, inhibe l’expression du gène OCA2. Ce dernier code la «protéine P» qui est impliquée dans la fabrication du pigment mélanine par les mélanocytes. La quantité de mélanine détermine la couleur. La mutation d’un nucléotide dans le HERC2 serait responsable des yeux blues chez 97% des gens (moins de mélanine produite). Eiberget al. (2008) 4.1. Le code génétique et les mutations c) Différents effets des mutations Les mutations permettent la variation génétique nécessaire à l’évolution.  Les mutations peuvent être bénéfiques et permettent une meilleure adaptation à l’environnement. Exemple : le gène d’une bactérie qui code pour une protéine cible d’un antibiotique est muté = l’antibiotique n’a plus d’effet et la bactérie survit. Bactéries sensibles Bactéries résistantes 4.1. Le code génétique et les mutations c) Différents effets des mutations Les origines possibles des Les effets possibles des mutations mutations o Les erreurs de la réplication: o Un changement dans la séquence codant une mésappariement(mutations ponctuelles, 1 nt protéine (une protéine différente dont la forme, à la fois) ou glissement de l’ADN polymérase l’activité ou l’association à d’autres protéines a été (microsatellites) changée) o Un endommagement chimique de l’ADN o Un changement dans la région régulatrice de (l’ADN a une stabilité limitée): les altérations l’expression génique (la protéine est plus/moins spontanées (hydrolytiques) ou présente ou présente à un moment différent du environnementales (agents mutagènes et développement ou dans des circonstances différentes.) radiations) o Un changement dans la structure de l’ADN qui o La transposition des séquences d’ADN empêche la réplication et la transcription. 4.2. Les erreurs durant la réplication: les mutations ponctuelles et les microsatellites a) Les mésappariements Les substitutions : le mésappariement d'un nucléotide. La réplication suivante assure ensuite d'intégrer la modification de manière permanente sur les deux brins. Impliquent les mécanismes de réplication de l'ADN :  une erreur est introduite pendant la réplication et n'est pas réparée.  une modification de la structure chimique d’un nucléotide déjà présent induit une erreur de lecture de la polymérase qui associe la mauvaise base azotée. Deux classes: o La transition d’une pyrimidine à une autre (C à T) ou d’une purine pour une autre (A à G) o La transversion d’une pyrimidine pour une purine (T pour A ou G) ou le contraire Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène. Pearson. 4.2. Les erreurs durant la réplication: les mutations ponctuelles et les microsatellites a) Les mésappariements RÉPARATION DES MÉSAPPARIEMENTS–DNA MISMATCHREPAIR(MMR) La réparation doit identifier l’erreur, identifier le brin qui contient l’erreur, corriger et tout cela très vite, avant la prochaine réplication. E. coli : la méthylation de l’ADN et les protéines Mut o La méthyltransférase Dam reconnaît la séquence «GATC» sur l’ADN et y ajoute un groupe méthyl (CH3) sur l’adénine. Les «GATC» sont fréquentes (1/256 pb).  Avant la réplication, l’ADN parentale est méthylé. o Lors de la réplication le brin matrice demeure méthylé et le nouveau brin ne l’est pas encore (la nouvelle molécule d’ADN db est hémi-méthylée). o Ainsi, s’il y a une mutation ponctuelle la machinerie enzymatique reconnait le nouveau brin (celui sans CH3) et le corrige. « Mécanisme mémoire » 4.2. Les erreurs durant la réplication: les mutations ponctuelles et les microsatellites a) Les mésappariements RÉPARATION DES MÉSAPPARIEMENTS–DNA MISMATCHREPAIR(MMR) Chez E. coli o La MutS parcourt l’ADN et détecte les distorsions de la charpente (causées par les mésappariements).  MutS s’y attache: induction d’un changement de conformation de la protéine et échange ADP → ATP.  Ainsi MutS recrute la protéine MutL. o Ensemble, MutS-MutL vont glisser sur l’ADN pour chercher la MutH qui clive le brin d’ADN non-méthylé, ce qui met fin à la partie“mut”. o Par la suite, une hélicase spécialisée(UvrD) s’attache au point de césure et ouvre l’ADN. o Une exonucléase élimine les nts à partir de la césure et jusqu’au-delà du mésappariement.  Le tout est réparé par l’ADNpol I et la ligase. 4.2. Les erreurs durant la réplication: les mutations ponctuelles et les microsatellites a) Les mésappariements RÉPARATIONDESMÉSAPPARIEMENTS–DNA MISMATCHREPAIR(MMR) Chez E. coli La MutH o Peut couper du côté 3’ de l’erreur ou de 5’:  L’Exo VII ou Rec j dégradent le brin dans la direction 5’-3’.  L’Exo I dégrade dans la direction 3’-5’. o Se lie aux séquences GATC temporairement hémiméthylées suite à la réplication.  Reste sa forme inactive jusqu’à l’arrivée de MutS-L.  La MutH activée clive le brin d’ADN non méthylé au site –GATC-. 4.2. Les erreurs durant la réplication: les mutations ponctuelles et les microsatellites a) Les mésappariements RÉPARATIONDESMÉSAPPARIEMENTS–DNA MISMATCHREPAIR(MMR) Chez E. coli DNA Repair(Amst). 2014 Aug; 20: 82–93. 4.2. Les erreurs durant la réplication: les mutations ponctuelles et les microsatellites a) Les mésappariements RÉPARATIONDESMÉSAPPARIEMENTS–DNA MISMATCHREPAIR(MMR) Chez E. coli L’activité exonucléase des polymérases permet d’améliorer la fidélité de réplication d’un facteur 100 et le système de réparation des mésappariements augmente encore cette fidélité par 1000 En bref, La réparation doit identifier l’erreur, identifier quel brin contient l’erreur, corriger et tout cela très vite, avant la prochaine réplication. 4.2. Les erreurs durant la réplication: les mutations ponctuelles et les microsatellites a) Les mésappariements RÉPARATIONDESMÉSAPPARIEMENTS–DNA MISMATCHREPAIR(MMR) Chez les eucaryotes Homologues de MutS et MutL(chez humain MSH et MLH).  Recrutés par la PCNA (clamp euca).  Les eucaryotes semblent avoir dupliqué le gène MutS pour former des hétérodimères MSH. Les différentes sous-unités peuvent reconnaitre des mutations différentes. Pas d’homologue MutH.  À la place, une RNase H fait une coupure au niveau de l’amorce (cette enzyme reconnait un hybride ARN-ADN).  MutL se fixe par-dessus la coupure et les exonucléases enlèvent le fragment situé entre MutS et MutL.  Au lieu de RNase H, les exonucléases peuvent aussi utiliser les césures temporaires entre les fragments d’Okasaki ou le bout 3’ du brin avancé. Le mécanisme de la méthylation n’est pas utilisé.  Les fragments d’Okazaki et l’amorce indiquent quel brin est «nouveau» (toute proportion gardée, il y a plus d’Okazaki chez les eucaryotes, car plus courts). Fragment Okasaki permet de différencié les anciens brins des nouveaux 4.2. Les erreurs durant la réplication: les mutations ponctuelles et les microsatellites b) Les microsatellites Les microsatellites sont des motifs de 2 à 10 nucléotides hautement répétés ex: CTTCTTTT … engendre des mécanismes de o Selon les séquences, possibilité d’appariement simple brin en ‘épingle’. glissement o Les enzymes de la réplication copient difficilement les microsatellites avec fidélité et effectuent des ‘dérapages’ : Augmentation ou diminution du nombre des répétitions présentes  Polymorphisme. Mécanisme de glissement réplicatif : les insertions ou les délétions apparaissent par un "appariement décalé" de séquences répétées. Polymérase va se tromper = échapper le système de réparation Fan et Chu (2207) 4.2. Les erreurs durant la réplication: les mutations ponctuelles et les microsatellites b) Les microsatellites Le système Mut-homologue des eucaryotes détecte les dérapages de polymérase et les corrige.  Sans réparation, certaines pathologies peuvent apparaître. Elles sont associées à l’expansion des triplets répétés à l’intérieur des gènes. Exemple : La Maladie de Huntington (neurodégénérescence) Un microsatellite «CAG» dans le gène HD qui code la protéine HTT (CAG = codon glutamine)  une élongation de la HTT par ajout de plusieurs glutamines. Les individus sains ont 10-26 répétitions du triplet. Les porteurs de la maladie ont 40+ répétitions. La maladie est génétiquement dominante et le nombre de répétitions tend à augmenter d’une génération à l’autre. 4.2. Les erreurs durant la réplication: les mutations ponctuelles et les microsatellites b) Les microsatellites Exemple : La Maladie de Huntington (neurodégénérescence) HTT est un facteur de transcription qui régule l’expression d’un récepteur de neurotransmetteur dans les neurones. Il utilise ses glutamines pour interagir avec la machinerie de transcription donc leur nombre est important. La protéine HTT avec plus de glutamines se replie mal, et n’a donc pas la bonne configuration: Modifie le niveau Agrégation des protéines dans la cellule, Clivage protéolytique des protéines d’expression de gènes affectant son fonctionnement normal mutantes (bris en plusieurs impliqués dans : Formation de ponts H entre les morceaux non fonctionnels) la réception de protéines mutantes HTT Les morceaux clivés de HTT sont neurotransmetteurs Provoque un détachement de la dynéine importés dans le noyau la signalisation intracellulaire des microtubules → mauvaise Induit la mort cellulaire des conduction des vésicules neurones 4.3. Les altérations chimiques des bases: “spontanées” et “environnementales” a) Spontanées Plusieurs modifications chimiques des bases surviennent spontanément en présence d’eau et peuvent entraîner des altérations dans la séquence d’ADN.  Altérations spontanées = altérations hydrolytiques La déamination (perte d’un NH3) 2 cas fréquents: -La cytosine devient uracile(a) -La cytosine-CH3 devient thymine (c)  La méthylation de C est un mécanisme répandu de l’inhibition transcriptionnelle chez les vertébrés  Altération la plus fréquente chez l’humain. Vitesse de déamination de la cytosine = indicateur de la vitesse de la perte d’information génétique La dépurination (coupure du lien glycosidique reliant purine-sucre)  un site apurique(AP) (b) 4.3. Les altérations chimiques des bases: “spontanées” et “environnementales” b) Environnementales Les altérations chimiques peuvent également être provoquées par les facteurs environnementaux: o les substances mutagènes (agents chimiques qui augmentent le taux de mutations) o les radiations. Les mécanismes de mutagènes: o Alkylation: ajout de gr. chimiques sur les bases Résultat: mésappariement/pas d’appariement. Ex: G + CH3= incapacité à faire des liens H o Oxydation: ajout d’un “O” ou perte d’un “H”. Résultat: un mésappariement. Ex: Oxo-G fait un lien avec A.  Une des mutations les plus communes dans le cancer humain. 4.3. Les altérations chimiques des bases: “spontanées” et “environnementales” b) Environnementales Les altérations chimiques peuvent également être provoquées par les facteurs environnementaux: o les substances mutagènes (agents chimiques qui augmentent le taux de mutations) o les radiations. Les mécanismes de mutagènes: o Analogue de base: une autre molécule remplace une base et l'appariement se fait selon la molécule ajoutée. Exemple: 5-Bromouracil o Agent intercalant : une molécule s’insère entre les bases de l'adn (intervient dans réplication/transcription). Exemple: bromured'éthidium 4.3. Les altérations chimiques des bases: “spontanées” et “environnementales” b) Environnementales Les altérations chimiques provoquées par les radiations o Les rayons UV: la lumière proche de 260 nm (ondes) est fortement absorbée par les bases. Cela cause la fusion photochimique de deux pyrimidines adjacentes sur le même brin (formation d’anneau cyclobutane entre T et T).  Ces dimères sont impossibles à apparier et provoquent l’arrêt de la polymérase. 4.3. Les altérations chimiques des bases: “spontanées” et “environnementales” b) Environnementales Les altérations chimiques provoquées par les radiations o Les radiations ionisantes (rayons γ et X)  directement, en s’attaquant au sucre (désoxyribose) : cassure double brin de l’ADN (DSB),  Indirectement en favorisant l’apparition des radicaux libres (agents oxydants: O2-, H2O2, OH ). débordassions des mécanismes de réparation = mutations qui restent 4.3. Les altérations chimiques des bases: “spontanées” et “environnementales” c) Les systèmes de réparation o L’inversion directe (la « vraie » réparation): reconnaitre la base modifiée (enzymes différentes pour chaque type d’altération) et défaire l’altération pour revenir à une base normale. o La réparation par excision d’une base: reconnaître la base modifiée (enzymes différentes pour chaque type d’altération), l’enlever (site AP) et la remplacer par une 1 brin altéré et l’autre autre. sert de matrice pour la réparation o La réparation par excision d’un fragment d’ADN sb: reconnaitre la distorsion dans l’hélice (mêmes enzymes pour plusieurs types d’altérations),enlever une partie d’un brin dans la région de la déformation et combler la brèche. o La réparation par recombinaison homologue: utiliser la chromatide sœur pour 2 brins altérés reconstituer la bonne séquence. ou cassés o La réparation translésionnelle: l’altération n’a pas été réparée à temps et durant la réplication, une polymérase spécialisée réplique l’ADN sans respecter les appariements. 4.3. Les altérations chimiques des bases: “spontanées” et “environnementales” c) Les systèmes de réparation Inversions directes des altérations: des enzymes spécialisées sont capables de reconnaître directement les bases altérées et de les «corriger». La photolyase (proca et euca): o Reconnaît les dimères de pyrimidine (causés par UV) et se lie sur eux. o Lors de l’exposition suivante à la lumière, elle clive l’anneau de cyclobutane. La méthyltransférase (humain et souris) : o Reconnaît G-CH3 (causé par une alkylation par un mutagène) et catalyse le transfert du CH3 de l’O6- méthylguanine vers une de ses cystéines. o Réaction irréversible, l’enzyme ne peut pas être réutilisée. 4.3. Les altérations chimiques des bases: “spontanées” et “environnementales” c) Les systèmes de réparation La Réparation par Excision d’une Base, la voie BER (proca et euca): Les ADN glycosylases parcourent l’ADN et analysent le sillon mineur. Elles peuvent détecter une base altérée et/ou une base qui a été insérée par mésappariement avec une base altérée.Une enzyme spécifique par type d’altération (8 enzymes différentes identifiées chez l’humain).  Lorsqu’une base altérée est détectée, la glycosylase lui fait un «flip-out» (la sort de l’autre côté de la charpente) et clive son lien glycosidique. Cela donne un nucléotide apurique ou apyrimidique(AP).  L’endonucléase AP/exo enlève l’AP (2 coupures: endo en 5’ et exo en 3’).  L’ADN polymérase et l’ADN ligase peuvent ensuite réparer la brèche (besoin d’un brin intact comme matrice). on expose- on coupe- on répare- on lie 4.3. Les altérations chimiques des bases: “spontanées” et “environnementales” c) Les systèmes de réparation La réparation par excision d’un fragment d’ADNsb, la voie NER (proca et euca): Chez E. coli, les protéines Uvr: o Le complexe UvrA-UvrB parcourt l’ADN et lorsqu’une déformation d’hélice(différentes altérations et particulièrement celles dues aux UV) est détectée : le UvrA quitte le complexe. o UvrB peut alors séparer les deux brins et de recruter l’UvrC qui coupe le brin contenant une altération à 2 endroits : Le segment produit est dissocié par UvrD. o ADN pol et ADN ligase réparent la brèche en se servant du brin intact comme matrice. Même mécanisme chez les eucaryotes, mais avec 25 protéines différentes. Si ces protéines sont elles-mêmes mutées, le cancer de la peau se développe (UV!). 4.3. Les altérations chimiques des bases: “spontanées” et “environnementales” c) Les systèmes de réparation La réparation translésionnelle ( proca+ euca): dernier recoure Durant la réplication, lorsque la progression de la polymérase normale est bloquée par une altération non réparée, l’ADN polymérase translésionnelle réplique l’ADN sans respecter les appariements  Utilise la matrice que pour s’attacher(un processus forcément mutagène, mais mieux qu’une réplication incomplète du chromosome). Certaines polymérases translésionnelles sont spécifiques à un type d’altération et répliquent l’ADN correctement.  Exemple : Reconnaitre les dimères T*T et ajoute AA en face. Chez E. coli cette polymérase n’est pas présente tout le temps. Elle est synthétisée seulement lorsque la bactérie subit TROP de mutations (partie de la réponse SOS). 4.4. La cassure bicaténaire d’ADN Prérequis Les coupures db ne peuvent pas être réparées en utilisant un brin comme matrice. La réparation peut se faire via : o Le mécanisme de la recombinaison homologue (HR) o La ligature directe des extrémités non homologues. La voie HR (proca+ euca) o Réalisée par les enzymes recombinases (Rad51, RecA). o L’information perdue est récupérée de la deuxième copie du chromosome concerné (la chromatide sœur). o Ce mécanisme n’est possible que si le chromosome a déjà été répliquée (phases S et G2) et la réparation est quasi à 100%.  On peut également se servir de la recombinaison si les deux brins ne sont pas cassés, mais altérés. recombinaison avec la chromatide sœur, non ce n'est pas un crossing over 4.4. La cassure bicaténaire d’ADN Ligature directe des extrémités non homologues: un mécanisme présent durant tout le cycle cellulaire. Il aboutit souvent à la perte d’un fragment du chromosome (processus mutagène). Chez euca (moins fréquemment chez bactéries): La Voie NHEJ (non homologue end joining) o Après une cassure db, l’ADN est rapidement dégradé par les exonucléases. o Les protéines Ku70 et Ku80 reconnaissent la cassure et se lient par-dessus pour protéger l’ADN. o Elles recrutent les kinases (DNA-PKcs) qui rapprochent les extrémités d’ADN et activent une endonucléase Artemis.  Coupures franches(prépare les extrémités d’ADN) pour permettre la soudure par la suite (ligase IV). reconnaissance. coupure franche, liaison avec la ligase * DNA-PKcs: DNA-dependentproteinkinase 4.4. La cassure bicaténaire d’ADN La voie NHEJ est impliquée dans la production des anticorps.  Recombinaison V(D)J: Système de recombinaison des gènes codant les anticorps. Des bris doubles brins sont induits intentionnellement selon un processus spécifique aux lymphocytes B (cellules productrices des anticorps). La voie NHEJ permet ensuite de recombiner et réassocier des segments V, D et J de manière aléatoire :Large éventail de chaines lourdes et légères, qui reconnaîtront divers antigènes. Boyd SD, Joshi SA. Microbiol Spectr. 2014; Watson et al. (2009), figure 11.35  alternative= séquences complémentaires = séquences répétées 4.4. La cassure bicaténaire d’ADN Intermédiaires entre les voies HR et NHEJ: o SSA (non conservative single-strand annealing) o alt-NHEJ (alternative-NHEJ). Ces voies utilisent les homologies trouvées à l’intérieur du chromosome cassé:  Les séquences répétées situées de part et d’autre de la cassure, sont complémentaires et s’hybrident ensemble. Ces processus impliquent une perte d’information. Jasin M,& al.,Cold Spring Harb Perspect Biol. 2013 4.4. La cassure bicaténaire d’ADN Les gènes suppresseurs de tumeurs  Les protéines suppresseurs de tumeurs sont impliquées dans la protection du génome contre les cassures db d’ADN. Chez l’humain: BRCA1/2 sont actifs lors de la réplication. Les mutations dans ces deux gènes augmentent de 50-80% les risques de développer un cancer du sein et 30-50% des ovaires. Interagissent avec : o Autres suppresseurs de tumeurs o Protéines de réparation (voie HR et NHEJ) o Régulateurs du cycle cellulaire  Différents rôles 4.5. La transposition La recombinaison génétique : permet un échange génétique et/ou un réarrangement chromosomique. o Recombinaison homologue (“crossing over”): un échange d’ADN entre deux chromosomes de la même paire, l’ordre des gènes est conservé:  Réparation de la cassure bicaténaire: entre 2 chromatides sœurs.  Méiose : entre 2 chromosomes homologues (1 maternel et 1 paternel) o Transposition: un réarrangement d’ADN par le déplacement d’un segment, l’ordre des gènes peut changer. 4.5. La transposition Les transposons peuvent être : o Réplicatifs, ils se dupliquent, une copie est laissée derrière et la nouvelle copie s’intègre à une autre place dans le génome. o Non réplicatifs, une seule copie voyage dans le génome). 3 classes principales de transposons o Transposons ADN (non réplicatifs) o Rétrotransposons viraux (avec LTR) intermédiaire ARN o Rétrotransposons non viraux (poly-A) 4.5. La transposition Deux catégories majeures : o Type I, ou rétroéléments, dont la mobilisation fait intervenir un intermédiaire ARN o Type II, ou transposons à ADN, qui utilisent un intermédiaire ADN pour leur transposition. eLS © 2015, John Wiley & Sons  4.5. La transposition a) Transposons à ADN o La partie centrale du transposon code pour une transposase o Autres gènes: régulation de la transposition, fonctions utiles pour la transposition ou pour l’organisme. o Aux extrémités :  2 sites de recombinaison : 2 répétitions inversées TIR ayant un site de reconnaissance pour la transposase.  2 répétitions directes (DRs, “target site duplications”): produits durant la transposition 4.5. La transposition a) Transposons à ADN Mécanisme de transposition (Couper-Coller) : 1 Le gène «transposase» est transcrit et traduit. 2 La transposase reconnaît-lie les séquences inversées aux extrémités du transposon. 3 L’ADN est clivé par la transposase(entre les répétitions directes et inversées), la coupure génère les extrémités 3’OH. 4 Les 3’OH s’attaquent à l’ADN sur un nouveau site (à une distance de qqs nt l’un de l’autre): réaction de transestérification. 5 Le transposon s’insère à un nouveau site. 6 La réparation d’ADN s’occupe du reste. Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène. Pearson. 4.5. La transposition b) Les rétrotransposons viraux ≡ Les rétrotransposons avec LTR ≡ Longues répétitions terminales o Structure proche de celle des rétrovirus. o Promoteur interne localisé dans le LTR en 5’ o Transcrits en ARN par l’ARN Pol II. o Entre les deux LTRs situés aux extrémités 5’ et 3’:  Le gène Gag code pour une pseudo-particule virale (Virus-like particles, VLP) dans laquelle la transcription inverse a lieu.  Le gène Pol code pour plusieurs fonctions enzymatiques : une protéase permettant de couper les polyprotéines en plusieurs segments, une transcriptase inverse (avec un domaine ribonucléase H à l'extrémité C-terminale) qui permet de transcrire l’ARN en ADN complémentaire et enfin une intégrase qui permet l’intégration du segment d’ADN produit dans le génome hôte  Le gène Env code pour des protéines d’enveloppe. 4.5. La transposition b) Les rétrotransposons viraux 2 LTR –“long terminal repeat” (sites de recombinaison) avec des segments fonctionnellement distincts  U3 (unique 3’, contient un promoteur), R permettant les “sauts” d’amorces(R -repeat) et U5 2 répétitions directes (“target site duplications”): duplications courtes de site cible flanquant les insertions de rétrotransposons LTR.. 4.5. La transposition b) Les rétrotransposons viraux Mécanisme de rétrotransposition avec LTR : 1 Les gènes «transcriptase inverse » et «intégrase» sont exprimés. 2 Un nouvel ARNm du transposon est généré et intercepté par la rétrotranscriptase. 3 La rétrotranscriptase utilise cet ARN comme matrice pour produire un cADN. 4 Le cADN est reconnu par l’intégrase. Elle le clive un peu pour générer les bouts 3’OH «en escalier». 5 Les 3’OH s’attaquent à l’ADN sur un nouveau site (à une distance de qqs nt l’un de l’autre): réaction de transestérification. 6 Le transposon s’insère à un nouveau site. 7 La réparation d’ADN s’occupe du reste, cela génère les répétitions directes aux bouts. Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène. Pearson. 4.5. La transposition c) Les rétrotransposons poly-A (non viraux) ≡ Les rétrotransposons : sans LTR Rétrotransposons non viraux (poly-A) contiennent  Génome humain : transposons “LINE” (Longs éléments nucléaires intercalés) o Deux cadres de lecture :  Un gène codant ORF1: une protéine (RBP) capable de lier ARN.  Un gène codant ORF2: une protéine à la fois transcriptase inverse (RT) et endonucléase. o Une séquence 5’UTR:un site contenant un promoteur à son 1er nt. o Une séquence 3’UTR: avec un signal de polyadénylation (AATAAA) suivi de(A)n). o 2 répétitions directes (“target site duplications”): produits durant la transposition. 4.5. La transposition c) Les rétrotransposons poly-A (non viraux) ≡ Les rétrotransposons : sans LTR Mécanisme de rétrotransposition : 1 Les gènes «ORF1» et «ORF2» sont transcrits, traduits et restent attachés à leur ARNm. 2 Le complexORF1-2-ARN retourne au noyau. 3 Le complexe ARNm-protéines se lie à un site riche en T de l’ADN cible et y fait une coupure: le 3’OH obtenu lui servira d’amorce pour la rétrotranscription de l’ARN. 4 Au début de la rétrotranscription, le tout est stabilisé par l’hybridation produite (l’appariement entre la région Poly-A de l’ARN et la séquence poly-T de l’ADN). 5 L’ARN est rétrotranscrit en cADN = 1brin ADN. 6 Génération du 2ième brin d’ADN et l’intégration du bout non-attaché dans le génome. 7 La réparation d’ADN génère les répétitions directes aux bouts. Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène. Pearson. 4.5. La transposition c) Les rétrotransposons poly-A (non viraux) ≡ Les rétrotransposons : sans LTR Longs éléments nucléaires intercalés (Long interspersed nuclear elements, LINEs) Petits éléments nucléaires intercalés (Short interspersed nuclear elements, SINEs) o Les LINEs contiennent tout le matériel génétique nécessaire à la production de leurs enzymes de rétrotransposition o Les SINEs ne codent aucune enzyme. Ces derniers parasitent en fait la machinerie des LINEs. eLS © 2015, John Wiley & Sons 4.5. La transposition Résumé des mécanismes : Les transposons ont 3 catégories: “ADN”, “LTR” et “poly-A”.  Les processus de transposition dans les 3 cas.  Lequel peut aider la transposition des autres ? 4.5. La transposition d) Impacts sur le génome La transposition est la source majeure de mutations, et près de la moitié du génome humain est composée de séquences dérivées d’éléments transposables Les génomes des organismes complexes contiennent beaucoup de transposons ou éléments similaires (quantité variable selon organisme).  Leur persistance (et augmentation )au sein du génome, indique une sélection favorable par l’évolution. Les séquences en vert représentent des transposons ou des séquences ressemblantes. Watson et al. (2009) Biologie moléculaire du gène. Pearson. 4.5. La transposition d) Impacts sur le génome Mise en évidence du concept de transposition par Barbara McClintock et ses impacts dans le génome du maïs (McClintock, 1953).  La première femme à recevoir le prix Nobel de Physiologie et Médecine en 1983. Le gène codant une enzyme de la voie de synthèse d’anthocyanin(pigment) contient un transposon (TE).  La présence du transposon empêche la transcription : la graine a un phénotype « jaune ». Si le transposon se déplace, la transcription se fait, l’enzyme est produite et l’anthocyanin est synthétisé  la graine a un phénotype «brun» (cellule germinale) ou «taches brunes» (cellule somatique). Feschotte, et al. (2002) 4.5. La transposition d) Impacts sur le génome Durant l’intégration des transposons dans l’ADN génomique: o Ils peuvent interrompre les gènes (ex. maïs) ou les régions régulatrices des gènes. o Ils peuvent devenir des introns o Ils peuvent entrainer le déplacement d’autres éléments génomiques (a et b).  Les transposons sont une source importante de mutations. L’insertion de l’élément transposable Alu représente ≈ 0.1% de toutes les maladies génétiques humaines. Quelques exemples : neurofibromatose, l'hémophilie, le cancer du sein, syndrome Apert, la déficience de la cholinestérase … 4.5. La transposition d) Impacts sur le génome La recombinaison homologue non-allélique ou enjambement inégal Les transposons peuvent également participer lors la recombinaison homologue de la méiose ou de la réparation de type HR.  Le mécanisme de la recombinaison homologue est guidé par les gènes ayant les mêmes séquences… Mais, la présence de séquences similaires ou identiques à plusieurs endroits sur le génome augmente les risques de recombinaison entre des chromosomes non homologues (non-allélique) ou un enjambement inégal sur le même chromosome avec des sections mal appariées d’un gène., ce qui résulte en des duplications ou des délétions importantes. 4.5. La transposition d) Impacts sur le génome La recombinaison homologue non-allélique La recombinaison se fait entre 2 régions d’ADN n’ayant pas les mêmes gènes (peut- être même 2 chromosomes de type différents), mais qui ont les mêmes transposons. Ex. éléments Alu : Transposon de type polyA o 300 pb o Spécifique aux primates o Environ 1 million de copies dans le génome humain (≈ 11% du génome) o Vaste majorité inactive par modifications épigénétiques (méthylation ou condensation de la chromatine) 4.6. Les enzymes de restriction ≡ Ciseaux moléculaires Pour étudier un gène particulier ou un segment défini d’un ADN chromosomique, la longue molécule d’ADN doit d’abord être coupée en fragments d’une taille exploitable.  endonucléases de restriction. Exemple : Les chromosomes humains vont d’environ 50 000 000 pb(50 Mb) pour les chr. 21 et 22 à plus de 248 Mb pour le chr. 1. Ces enzymes sont capables de reconnaître une séquence spécifique d’ADN, site de restriction, et de la cliver (coupure db). 4.6. Les enzymes de restriction Proviennent des bactéries qui les utilisent pour éliminer (restreindre) tout ADN étranger.  Leur ADN est protégé par la méthylation (ajout du CH3 par une méthylase) sur les sites de restriction.  Un site de restriction est spécifique à une enzyme donnée. Les noms des enzymes de restriction font référence à l’organisme duquel elles ont été isolées.  Si enzymes sont issues du même organisme, des chiffres romains pour les différencier: EcoRI et EcoRV de Escherichia coli BamHI provient Bacillus amyloliquefaciens Hind III coupe toujours au site «5’-TTCGAA-3’» et la coupure se produit toujours de la même façon ‘en escalier’. © 2008 Brooks/Cole, CengageLearning 4.6. Les enzymes de restriction Les sites de restriction: Composés de 4 à 8 nucléotides et la plupart sont des palindromes Les sites de restriction étant très courts, ils ont de fortes chances d’être présents plusieurs fois dans un génome. La probabilité qu’une suite particulière survienne dans le génome est égale à: 4 nucléotides = 1 pour 44(1/256), 6 nucléotides = 1 pour 46(1/4096), 8 nucléotides = 1 pour 48(1/65536).  En moyenne, les enzymes coupant à des sites de restriction de 4 nucléotides produiront des fragments de quelques centaines de paires de bases, tandis que des sites de restriction de 6 ou 8 paires de bases produiront des fragments beaucoup plus longs (Kb). 4.6. Les enzymes de restriction La coupure produite par les enzymes de restriction est double brin et peut être de 2 types: franche ou cohésive Les enzymes de restriction découpent le génome, mais elles sont également utiles pour souder 2 séquences d’ADN ensemble… 4.6. Les enzymes de restriction Les coupures cohésives produisent des extrémités libres compatibles entre elles et cela facilite leur soudure (stabilisation des fragments par les liens H augmente l’efficacité de la ligation 100X). Deux possibilités pour souder deux molécules d’ADN (A et B) ensemble : 1) Utiliser la même enzyme de restriction sur chaque molécule. Lors de la soudure, le site de restriction est reproduit. 2) Utiliser 2 enzymes différentes, qui produisent des extrémités compatibles. Lors de la soudure, le site de restriction n’est pas reproduit. 4.6. Les enzymes de restriction Les extrémités cohésives assurent aussi un clonage directionnel: l’incorporation du fragment doit suivre les règles d’appariements des nucléotides et est possible dans une direction seulement. Deux molécules d’ADN à souder ensemble: la A est un gène et la B contient un promoteur à gauche de la coupure Le promoteur pourrait se Le promoteur et le gène sont trouver à la fin d gène correctement alignés © 2024 Integrated DNA Technologies, Inc. 4.6. Les enzymes de restriction La ligation de coupures : Les ligases sont utilisées pour catalyser l’insertion de fragments (coupés par les enzymes de restriction) à l’intérieur d’un vecteur (ex. plasmide). Elles forment les liaisons phosphodiesters entre les nucléotides. Selon l’enzyme utilisée et le type d’extrémités produites, la ligation pourra être dirigée (dans un seul sens) ou non (non directionnelle). Shuman (2009) 4.6. Les enzymes de restriction Visualisation des fragments de restriction: o Séparation des fragments par électrophorèse. o Migration de l’ADN dans un gel d’agarose, qui agit comme un tamis moléculaire o Séparation des fragments selon la longueur : Plus les molécules d’ADN sont longues, plus elles migrent lentement.  Une bande = fragments de même longueur Agarose: polysaccharide formant un long polymère sous forme d’hélice. Lorsque solidifiées, ces fibres forment un maillage tridimensionnel La distance parcourue par la molécule d’ADN est inversement proportionnelle à sa longueur. 4.6. Les enzymes de restriction Pour visualiser l’ADN sur le gel, on utilise des composés tel le bromure d’éthidium, capable de s’intercaler entre les bases de la double hélice. Lorsqu’il est exposé à des UV, il devient fluorescent. 4.6. Les enzymes de restriction Cartographie de restriction: Un ADN coupé par une enzyme de restriction donne toujours les mêmes fragments de restriction ( sauf si mutation au niveau du site de restriction). ? Cartographie des plasmides : Il est important de faire le lien entre le nombre de sites de restriction et le nombre de fragments produits.