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FECONDAZIONE ARTIFICIALE NELLA BOVINA CICLO ESTRALE La bovina è un animale poliestrale a ciclo continuo, in condizioni di allevamento, quindi è possibile fecondarla tutto l’anno. In particolare il ciclo estrale in questa spec...

FECONDAZIONE ARTIFICIALE NELLA BOVINA CICLO ESTRALE La bovina è un animale poliestrale a ciclo continuo, in condizioni di allevamento, quindi è possibile fecondarla tutto l’anno. In particolare il ciclo estrale in questa specie ha una durata di 21 giorni: se l’animale torna in calore dopo questo periodo di tempo posso affermare che la fecondazione non è andata a buon fine. L’animale entra in pubertà a circa 11 mesi, parametro che varia molto in base a razza e gestione. La precocità è un fattore importante in un allevamento di bovine da latte, perché riduce il tempo di mantenimento, quindi il periodo in cui l’animale non è produttivo e non genera guadagno. La durata specifica dell’estro è in particolare di 12-18 ore, piuttosto corto e ovviamente variabile in base al singolo individuo. L’ovulazione avviene 10-12 ore dopo la fine dell’estro. Per questa ragione (e per il fatto che viene usato soprattutto seme congelato, che necessita una inseminazione vicina all’ovulazione) l’ideale è procedere con l’inseminazione circa mezza giornata dopo il momento di pieno estro del singolo animale, da individuare con la maggior precisione possibile per fecondare nel modo più efficiente. Il ciclo estrale è suddiviso in: - Fase follicolare, in cui la struttura predominante è quella del follicolo, l’ormone dominante sono gli estrogeni e comprende proestro ed estro. - Fase luteinica, in cui la struttura predominante è il corpo luteo, l’ormone dominante è il progesterone e comprende diestro e metaestro. ➔ Proestro 2-3gg; estro 12-18h; metaestro 3-5gg; diestro 12gg. Il ciclo della bovina è caratterizzato da 2/3 ondate follicolari, che esitano in un’unica ovulazione. L’ondata follicolare si compone delle seguenti fasi: - Reclutamento dei follicoli pre-antrali, strutture che ancora non presentano la cavità, quindi non si vedono in ecografia. - Deviazione, selezione di un gruppo di follicoli che tende a crescere maggiormente. - Dominanza, scelta di un follicolo dominante che si sviluppa e inibisce la crescita degli altri. - Atresia o ovulazione, in base ai livelli ormonali. Nella bovina quindi abbiamo due ondate follicolari:  - Nella prima ondata, viene selezionato un follicolo dominante (o anche di più), che a causa degli alti livelli di progesterone prodotti dal corpo luteo ancora attivo tende ad andare in atresia. - Nella seconda ondata cala la quantità di progesterone e il nuovo follicolo dominante riesce a proseguire con l’ovulazione. Tutto ciò ci è necessario nel momento in cui andiamo ad intervenire tramite ormoni per regolare il ciclo estrale dell’animale e capire su cosa stiamo andando ad intervenire. Nell’immagine seguente si vedono i diversi cali e aumenti ormonali e il comportamento del corpo luteo: - La bovina ovula in seguito al picco di LH - In seguito all’ovulazione a causa della deiescenza del follicolo si inizia a formare il corpo luteo, tra il 2°-4° gg - Tra il 5°-15° gg avremo il corpo luteo maturo, dotato dei recettori delle prostaglandine (se somministro prostaglandine prima del quinto giorno non avranno nessun affetto) - Attorno al 16°-20°gg il corpo luteo inizia a regredire - Riparte il ciclo con il follicolo dominante e il residuo di corpo luteo albicante. Il corpo luteo albicante in particolare è visibile all’esame anatomopatologico e non alla visita clinica e nemmeno tramite ecografia. PARAMETRI RIPRODUTTIVI Prenderemo in esame la tabella dei parametri riferiti alla razza Frisona. Bisogna tenere conto che in un animale da latte la gravidanza è essenziale per la lattazione. Attualmente nella razza Frisona si parla di una media di 2,35 parti per animale. Questo, oltre che al numero di bovine riformare in stalla, è anche legato alla selezione, che ha fatto diminuire la fertilità a discapito di una grande produzione lattea. L’ideale sarebbe avere il primo parto a 24 mesi, con la fecondazione da svolgere ai 15 mesi, con il primo ciclo a circa 12/13 mesi. Il valore reale indica che il parto avviene ai 26 mesi, quindi in realtà non ci si discosta molto. INTERVALLO PARTO - PRIMA INSEMINAZIONE ARTIFICIALE L’intervallo parto-prima inseminazione artificiale è un parametro che idealmente dovrebbe essere di circa 60-65 giorni. Il valore reale al giorno d’oggi si aggira attorno agli 80-85 giorni, ma in questo parametro sono gli allevatori che volontariamente selezionano il periodo di cui hanno più bisogno: questo avviene soprattutto in stalle in cui ci sono animali molto selezionati in grado di produrre anche fino a 50kg di latte al giorno, in modo da spostare il più possibile il periodo di asciutta dell’animale (animali che producono 50kg di latte al giorno nel picco di lattazione nel periodo che si avvicina all’asciutta sono comunque in grado di produrre 30-35 kg di latte giornalieri). Ovvio che in stalle piccole e con bovine che producono quantità inferiori di latte è un parametro che rimane attorno ai 60-65 gg circa. INTERVALLO PARTO -CONCEPIMENTO (O DAYS OPEN) L’intervallo parto-concepimento (o days open) è un parametro influenzato da quando andiamo a svolgere la prima inseminazione e idealmente si aggira attorno agli 85 gg. Bisogna però tenere conto che in media vengono svolte 2 inseminazioni prima di riuscire a fecondare l’animale e quindi questo parametro si sposta fino ad arrivare anche ai 127 gg. HDR (HEAT DETECTION RATE) Il valore HDR (heat detection rate) indica la percentuale di animali che vedo in calore rispetto al numero di animali che sono effettivamente in estro. Insomma, man mano che gli animali partoriscono ed escono dal periodo di attesa volontario vengono controllati per capire quando ricomincia il calore. L’ideale sarebbe l’80% anche se in realtà il valore reale si aggira attorno al 50-60%. CR (CONCEPTION RATE) Il parametro CR (conception rate) invece indica la percentuale di vacche gravide rispetto a quelle inseminate in un determinato intervallo di tempo (di solito 21 gg). È importante soprattutto in questo caso rilevare bene l’estro e riuscire così a fecondare nel momento giusto l’animale, mentre se diminuisce la precisione si avrà un minor numero di bovine fecondate a causa di questo errore di rilevamento. RIFORMA PER INFERTILITÀ Altro parametro da ricordare è la riforma per infertilità ideale sotto il 5% ma in realtà si attesta anche al 10-20- 30%, a causa di problemi come malattie infettive, mastiti (che impediscono all’animale di produrre) e zoppie gravi per cui l’animale fatica a camminare. EFFICIENZA RIPRODUTTIVA Ultimo parametro importante è l’efficienza riproduttiva, cioè la percentuale di gravidanze in quella determinata stalla, ottenuta moltiplicando HDR e CR. FATTORI CHE INFLUENZANO LA RILEVAZIONE DELL’ESTRO L’estro induce una serie di comportamenti caratteristici nella bovina, che spesso non sono visibili per: Pavimentazione e stabulazione non adatte all’animale (ad esempio un pavimento scivoloso) Problemi a gambe e piedi, che impediscono il movimento Numero di vacche presenti in eccesso o in difetto (se gli spazi sono molto ampi gli animali interagiscono di meno). Fattori esterni come temperature alte (heat stress, soprattutto nella bovina da latte), che fanno diminuire le manifestazioni estrale di giorno a favore della notte. Attività aziendali che distraggono gli animali (come il passaggio del carro miscelatore, il momento della mungitura, quando arriva il podologo, …). Alimentazione e alti livelli produttivi, che possono creare stress metabolico che ha influenza negativa su tutto l’assetto endocrino (infatti nella bovina il primo calore post partum è fisiologicamente silente). MISURA DELLA PRECISIONE DEL RILEVAMENTO DELL’ESTRO : - Rapporto tra animali idonei ad essere fecondati e animali effettivamente fecondati, che si calcola prendendo tutti gli animali non gravidi a più di 21 giorni dal parto e guardando la percentuale di fecondati tra questi, che deve essere almeno dell’80%. Una diminuzione di questo valore indica problemi nel rilevamento dell’estro.  - Intervalli fra le successive fecondazioni, che almeno nel 60% dei casi dovrebbe essere fra i 18 e i 24 gg, cioè quando l’animale torna in calore. Se abbiamo una percentuale inferiore vuol dire che in quella stalla molti animali vengono fecondati quando non sono in calore. - Rilevazione della concentrazione di progesterone, con kit utilizzabili sia sul sangue (meno usato e più scomodo) che sul latte. Bassi livelli di progesterone possono essere indicativi di estri in corso. Ovviamente sono costi aggiuntivi e non sono controlli di routine in tutte le stalle. FATTORI CHE INFLUENZANO CR – PERCENTUALE DI CONCEPIMENTO - Percentuale di precisione nel rilevamento dell’estro (che dovrebbe essere attorno al 60%), importante in quanto viene utilizzato soprattutto seme congelato, che deve essere usato nel momento più vicino possibile all’ovulazione. - Tecnica di inseminazione: nel caso di fecondatori inesperti, soprattutto a causa della tecnica di inseminazione resa un pochino difficile per le pliche della cervice. Col tempo tende a non influenzare più la percentuale di concepimento. - Fertilità del seme: il seme viene congelato dai centri specializzati che garantiscono la fertilità del seme, potrebbe però venir maneggiato in maniera scorretta e per questo diventare non fertile. Per esempio potrebbe essere manipolato male, le dosi potrebbe essere calcolate male, potrebbe essere scongelato in maniera scorretta, durante l’inseminazione si potrebbero fare manovre sbagliate, … - Fattori legati alla singola vacca o Malformazioni o Patologie (es. endometriti) o Squilibri endocrini (es. causati da stress) o Repeat breeders, cioè animali apparentemente sani che però non riescono a essere fecondati a causa di squilibri endocrini, ovulazioni ritardate, corpi lutei che non secernono bene progesterone, … - Fattori legati all’allevamento o Intervallo parto-1° inseminazione spostato in modo da avere volontariamente delle CR spostate o BCS, quindi basato sulla gestione e l’alimentazione (animali molto magri avranno difficoltà ad essere fecondati) o Difficoltà al parto o Squilibri di minerali e microelementi importanti quali vitamina E, A e selenio. COME RILEVARE L’ESTRO La bovina si fa montare, quasi non più utilizzato e basato sul monitoraggio visivo Iperattività e tendenza a montare altri animali: la bovina tende a montare quando è in proestro mentre si fa montare quando è in estro, anche se è un valore sfalsato banalmente da problemi della singola vacca come zoppie o anche comportamenti dominanti Muggiti frequenti: non preciso Tumefazione della vulva: difficile nella stabulazione libera, si nota di solito quando la si va a fecondare Perdita di peli alla base della coda: anch’essa visibile da vicino e causata dalla monta da parte di altre bovine Perdite di muco trasparente filante, limpido, che esce dalle labbra vulvari (non molto preciso) Diminuzione di assunzione di cibo e della produzione di latte LA RILEVAZIONE È IDEALE SE HO:  - Sorveglianza sufficientemente attenta - Identificazione dei singoli animali - Limitata ma sufficiente manodopera per abbattere i costi della stalla - Accuratezza di almeno il 95%, cioè che i casi individuati siano effettivamente in estro - Alta correlazione fra le manifestazioni estrali e l’ovulazione SISTEMI DI RILEVAZIONE DELL’ESTRO: Sono tutti sistemi che registrano l’aumentata attività fisica. Un primo esempio è il sistema visivo, col problema che impiega manodopera ed è da svolgere almeno 2/3 volte al giorno nei momenti di calma. Negli allevamenti con molti animali è piuttosto scomodo. Una volta era anche comune l’utilizzo di tori vasectomizzati per meglio vedere la monta, però è una cosa non più utilizzata per l’ipofertilità e tutti i fattori legati alla gestione dei tori. Sempre più utilizzati sono i sistemi di sensoristica che rilavano attività motoria, alimentazione, momenti di riposo dell’animale … Utilizzati al momento sono i podometri o i collari, entrambi con attività molto simile ai contapassi, con sistemi che periodicamente scaricano i dati a distanza. Una cosa utile è rilevare l’avvenuta monta, con diverse possibilità: ci sono metodi su base colorimetrica, come buste monouso che si mettono sulla groppa delle vacche e quando vengono schiacciate durante le monte liberano colore; sfruttano lo stesso meccanismo anche sensori simili che invece di liberare colore iniziano a lampeggiare. Sono molto usati negli animali al pascolo soprattutto all’estero anche sensori che inviano il dato pressorio a distanza. Altro metodo per rilevare l’estro come già detto sono le variazioni di ormoni durante il ciclo, come il progesterone (in cui il livello basso indica l’animale in estro, il livello alto indica il diestro). Esistono anche strumentazioni che rilevano la temperatura (poco accurato) oppure l’aumentata resistenza elettrica dei tessuti causata dalla produzione di muco (poco accurata, con molta variabilità individuale; inoltre serve controllare i singoli animali). Chiarimento: i tori vasectomizzati cono animali interi a cui sono stati tagliati i dotti deferenti. In questo modo non arriva l’eiaculato e la bovina non si feconda ma allo stesso tempo si può vedere con più precisione rispetto alle sole bovine quali animali si fanno montare e sono quindi in estro. Ovviamente come gestione è più complicata. MANIPOLAZIONE DEL CICLO ESTRALE La necessità di manipolare il ciclo estrale della bovina nasce congiuntamente alla messa appunto delle tecniche di embriotransfer. Quindi all’inizio i tentativi di regolarizzare i cicli erano stati fatti con la finalità di trasferire l’embrione da una donatrice ad una ricevente, in realtà poi la tecnica di sincronizzazione degli estri è stata applicata anche in ambiti diversi perché presenta diversi vantaggi: Aumento del controllo dell’attività riproduttiva: manipolando il ciclo si riesce a indurre l’estro nel momento desiderato e quindi a controllare anche la ciclicità degli animali. Si toglie il rilevamento dell’estro: risulta problematico per gli allevatori soprattutto quando era ancora esclusivamente visivo. Il fatto di indurre l’estro toglie il problema di doverlo rilevare, perché avendolo indotto si sa che l’animale andrà in calore in una certa finestra temporale. Non importa osservare l’animale. Ottimizzazione dell’inseminazione artificiale: avendo più animali da fecondare lo stesso giorno, da un punto di vista anche economico di gestione delle operazioni, si ottimizza il numero di interventi in stalla del veterinario. Concentrazione dei parti: avere animali che partoriscono nella stessa finestra temporale permette la possibilità di avere un’assistenza al parto migliore. Miglioramento della rilevazione di estri successivi: facendo una sincronizzazione degli estri anche l’animale a vuoto si sa che fosse in calore, quindi si saprà quando sarà il ritorno in calore. Trattamenti terapeutici tempestivi se necessario: se l’animale ha problemi riproduttivi si identifica piuttosto precocemente perché l’animale pur essendo sotto controllo non viene in calore, ovviamente dipende anche dalla routine aziendale perché se si fanno visite cliniche ogni settimana non serve questo controllo. Utilizzare però questo controllo in aziende, anche con molti capi, può avere questo vantaggio potendo intervenire tempestivamente sull’animale con problemi di ciclicità. Si hanno diverse fasi del ciclo in cui si può intervenire: - Intervenendo sul corpo luteo: regolando la regressione del corpo luteo si può indurre l’estro. o In questo caso si somministrano prostaglandine - Sincronizzazione della crescita follicolare: si può decidere quando far partire un’ondata follicolare sincronizzandola su più animali, avendo più animali nella stessa fase del ciclo. o Somministrati GnRH, progesterone ed estrogeni dove in Italia però gli estrogeni non sono utilizzabili legalmente. In America invece sono utilizzabili. - Induzione dell’ovulazione: si è in un punto particolare dell’ondata dove si ha un follicolo dominante e progesterone basso. o si utilizzano GnRH, estrogeni, LH e l’hCG Per ognuna di queste fasi si hanno diversi ormoni che si possono utilizzare: Prostaglandine: prodotte dall’endometrio, quindi dall’utero. In bovine e scrofa le prostaglandine dall’utero arrivano all’ovaio per meccanismo di controcorrente, mentre nella cavalla si ha un circolo sistemico, passando per il polmone, per poi arrivare all’ovaio. Questo è utile da sapere perché quando si somministra la prostaglandina, al di là di ricordarsi quando il corpo luteo è recettivo (nella bovina è dal quinto al quindicesimo giorno, considerando l’estro come giorno 0), bisogna considerarne i dosaggi. Anche se la cavalla è un animale più grosso, ha corpo luteo più sensibile alle prostaglandine: avendo biologicamente un metabolismo polmonare delle prostaglandine ha più recettori; nella bovina lo è di meno. C’è una finestra in cui il corpo luteo non è sensibile alle prostaglandine: in particolare il metaestro, ma anche durante il proestro-estro perché il corpo luteo si è già lisato fisiologicamente. Somministrando prostaglandine ad un animale gravido invece si può causare aborto, causando la lisi del corpo gravidico provocando quindi aborto.  GnRH: ormone stimolante le gonadotropine, prodotto dall’ipotalamo che stimola l’ipofisi, la quale libera FSH e LH. L’FSH serve per il reclutamento, l’LH è quello che in presenza di una quantità di progesterone idonea indurrà l’ovulazione. Progesterone: prodotto dall’ovaio in particolare dal corpo luteo. Il progesterone si può usare nella sincronizzazione della crescita follicolare perché, essendo un ormone prodotto dal corpo luteo, somministrandolo all’animale mimerà il diestro, interrompendo poi la somministrazione di progesterone si mimerà l’entrata in estro, quindi il calore. Si controllerà la ciclicità dell’animale in questo modo. Il progesterone sarà usato come simulatore di corpo luteo, la sua funzione quindi è quando lo si sospende. Avendo un feedback negativo a livello ipotalamo-ipofisario permette anche all’animale di rifare le scorte, per esempio avendo animali in post-parto dove devono riprendere l’attività follicolare. Solitamente presentano livello di gonadotropine basse, quindi non riescono a ripartire con la ciclicità, dando del progesterone si ripristinano i livelli normali partendo da un ormone che gli animali in post-parto per il momento non riescono a rivedere perché non ovulano. Estrogeni: nell’ondata follicolare entrano fisiologicamente in campo prodotti dal follicolo in particolare il dominante che ovulerà. Sono illegali in Italia ma fondamentalmente utilizzare gli estrogeni permette di mimare meglio, avendo animali con estri migliori, anche come manifestazioni. Inibiscono l’ondata follicolare del follicolo dominante ma danno manifestazioni estrali più accentuate LH: prodotto dall’ipofisi, il suo picco è il fattore scatenante che induce l’ovulazione, nella pratica LH non si troverà mai come farmaco essendo specie specifico. Ci possono essere anche LH ricombinanti ma da un punto di vista commerciale non è un ormone che si ritrova. Si preferisce usare prodotti che si possono usare su più specie, nella fattispecie l’hCG hCG: gonadotropina corionica umana, prodotta dalla placenta nella donna, è la stessa usata come test di gravidanza nella donna come marker. Si può usare sugli animali per indurre l’ovulazione perché avrà azione simile all’LH, ha azione LH simile quindi è un farmaco che si può usare per indurre l’ovulazione. Nella bovina si usa poco, mentre nella cavalla invece si usa tranquillamente anche l’hCG. PROSTAGLANDINE Le prostaglandine compiono lisi del corpo luteo per l’induzione dell’estro. Si può somministrare una singola dose o una doppia dose di prostaglandine. Per agire deve essere presente il corpo luteo, quindi l’animale deve essere fuori dal metaestro e dal proestro-estro, dal quinto al quindicesimo giorno del ciclo dell’animale. Somministrando prostaglandine ad un animale con il corpo luteo ci si aspetta che andrà in calore tra i 2 e 4 giorni (nella bovina solitamente dopo 3 giorni). Facendolo invece alla cieca, ipotizzando di sincronizzare gli estri su larga scala, si avrà solo un 50-60% di animali sincronizzati avendo le due code dove non si avrà risposta: dal giorno 0 al giorno 5 del ciclo dal giorno 15 fino al giorno 0 successivo La prostaglandina invece usata dopo visita dell’animale che sicuramente ha corpo luteo recettivo permette di ottimizzare il potere di sincronizzazione. Il problema è che spesso questi protocolli non sono usati dopo visita dell’animale, ma alla cieca evitando la visita di diversi animali. Nell’ottica di usare alla cieca per poter avere delle buone percentuali, si può fare una doppia somministrazione. Si somministra quindi la prostaglandina alla cieca, se si ripete a 11 gg di distanza gli animali che non erano in periodo ricettivo alla prima somministrazione saranno nella finestra giusta alla seconda. Sono segnati sulle slide un periodo di 11-14gg per una questione di comodità dove le somministrazioni vengono fatte settimanali e quindi dopo due settimane si esegue la somministrazione. Con le prostaglandine sarebbe meglio essere verso gli 11gg perché verso i 14 gg si è un po’ borderline. Facendo somministrazioni a 11 gg, al secondo giro saranno presi praticamente tutti gli animali, con un 80-90% di animali sincroni. Invece a 14 gg vi è una finestra di non recettività del corpo luteo che rimane. Per es. facendo la prima prostaglandina ad un animale in metaestro, quindi al giorno 3 del ciclo, passano 11gg e si sarà al giorno 14 quindi sarà ancora in tempo. Invece facendo passare 14 gg starà già venendo in calore naturalmente e quindi non sarà perfettamente sincronizzato con l’iniezione che viene fatta. Anche animali che presentavano il corpo luteo alla prima somministrazione, dopo 11gg saranno all’undicesimo giorno di ciclo e quindi recettivi. Per cui sono presi tutti gli animali. Tabella sul tempo di inseminazione: si manda l’animale in calore ma va monitorato l’estro per sapere quando inseminare. Quindi sincronizza l’estro ma non l’ovulazione. Lavorando sulle prostaglandine l’estro va comunque monitorato. Il vantaggio è economico, la somministrazione è facile perché visitando la vacca con un singolo trattamento si raggiunge l’obiettivo. Quindi con un trattamento si raggiunge l’obiettivo se l’animale è stato visitato e ha il corpo luteo. Lo svantaggio è che comunque vanno monitorati gli estri, non si può fare l’inseminazione a tempo fisso, non guardando l’estro e inseminando direttamente la vacca. Nella prostaglandina bisogna vedere qual è il momento migliore per l’animale, la maggior parte va in calore al terzo giorno però non è sicuro. Inoltre, un altro svantaggio, è che anche facendo a tappeto la doppia dose è comunque necessario avere degli animali ciclici. È previsto che quell’animale sia in grado di ovulare e formare un corpo luteo. Avendo animali con ciclicità irregolare con la prostaglandina non la recuperano. È invece possibile utilizzando altri protocolli come l’OvSynch. OVSYNCH È un protocollo che prevede il controllo anche dell’ondata follicolare: entrano in campo gli ormoni visti per il controllo dell’ondata follicolare, in particolare il GnRH. L’OvSynch è un protocollo che si basa su GnRH e prostaglandina. Viene chiamato OvSynch perché c’è anche una sincronizzazione dell’ovulazione. Quindi con questo protocollo si va a inseminare a tempo fisso, si risparmia il monitoraggio dell’estro. Ovviamente non è perfetto, ma fondamentalmente il principio prevede che alla cieca (quando si fanno protocolli di sincronizzazione l’obiettivo è farlo alla cieca altrimenti si perde il vantaggio) andrebbe fatto, sugli animali che si vogliono sincronizzare, un GnRH in quello che è definito il giorno 0. Quindi se si ha un animale con un’ondata follicolare con un dominante, si può indurre l’ovulazione e quindi la formazione di un corpo luteo accessorio perché, se si ha un dominante vuol dire che c’è già un corpo luteo fisiologico. Se l’animale non è ciclico si può indurre l’ovulazione del follicolo dominante o, se non è nella fase giusta, comunque si induce eventualmente una luteinizzazione. Con questo protocollo si riescono a recuperare anche animali che fisiologicamente ancora non ciclavano. Questo perché somministrando del GnRH in parte si induce la liberazione di gonadotropine, quindi magari la partenza della ciclicità. Il primo GnRH che si somministra serve per sincronizzare l’ondata follicolare. Si fa quindi a tutti gli animali, quelli che non ovulano o luteinizzano non succede niente perché non è il punto giusto e quindi continuano con il ciclo, quelli che ovulano avranno un corpo luteo in più. A questo punto dopo una settimana si somministra la prostaglandina. Quindi si lisa il corpo luteo ciclico presente o anche quello di cui si è indotta la formazione, questo perché dopo una settimana è recettivo. Facendo la prostaglandina quindi si induce l’estro. Si vuole però anche sincronizzare l’ovulazione, quindi, come prevede il protocollo, a due giorni dalla somministrazione della prostaglandina si somministra un altro GnRH. Questo secondo GnRH dovrebbe trovarsi nella situazione di avere un follicolo dominante pre ovulatorio, quindi si somministra il GnRH in modo da sincronizzare anche l’ovulazione degli animali. Di solito ovula dalle 24 alle 30 ore dalla somministrazione del GnRH, di conseguenza si potrà andare a fecondare il giorno dopo della somministrazione, un po’ prima rispetto quando si pensa che ovuleranno. Quindi si potrà andare a fecondare dalle 16 alle 24 ore dopo che è stato somministrato il GnRH. È possibile quindi gestirsi l’orario dell’inseminazione. I vantaggi in questo caso sono che l’estro non lo si monitora, ottimizzando il numero di volte in cui bisogna andare in stalla in quanto gli animali sono inseminati tutti in una volta sola. Inoltre la somministrazione si può fare a tutti gli animali anche quelli con ciclicità non evidente. Lo svantaggio è che vanno fatti 3 trattamenti agli animali. Quindi vanno effettuate 3 iniezioni all’animale, dove ogni intervento sugli animali è considerato uno svantaggio. Altro svantaggio è che con questo protocollo fatto alla cieca senza guardare bene quando si fa il primo GnRH, in realtà si hanno percentuali di concepimento simili a quelle che si avrebbero senza il protocollo di somministrazione e anzi, fra le due, servono più inseminazioni utilizzando il protocollo. L’efficacia del protocollo, e quindi la percentuale di concepimento che ne deriva, è comunque legata alla fase del ciclo dell’animale in cui si comincia. In realtà si è visto che se si inizia il protocollo in tardo diestro, quindi quando il corpo luteo sta per andare incontro a lisi, lì si avrà ondata del follicolo che ovulerà, si va a somministrare GnRH al giorno 15. Si ha quindi già un follicolo dominante, che andrà incontro al suo percorso normale, andando dopo una settimana a fare la prostaglandina. In realtà non si avrà più un corpo luteo recettivo, quindi quel follicolo andrà ad ovulare esattamente come avrebbe fatto inizialmente. Si avrà quindi l’animale che ovula prima. Facendo poi il GnRH e l’inseminazione programmata in realtà si è fuori tempo, non si ha un animale effettivamente sincrono. Quindi se si inizia il protocollo in tardo diestro non si ha l’animale effettivamente sincrono Altro problema è avere l’animale in metaestro, in teoria funzionerebbe tutto. Si va a fare il GnRH al giorno 2, stimolando la partenza dell’ondata e questo non crea grossi problemi. Andando però poi a fare la prostaglandina, in realtà si mantiene lo stesso follicolo fino all’ovulazione, il follicolo della prima ondata andrà ad ovulare. Il problema è che si andrà a fecondare un follicolo dominante che ha avuto dominanza per più di 5gg. Solitamente questi follicoli non saranno recettivi al secondo GnRH e quindi il più delle volte non ovuleranno perché sono troppo vecchi. Tutte le cellule della granulosa e recettori nel follicolo sono invecchiati, quindi non sono più recettivi agli ormoni. Se per caso ovulano tendenzialmente sono oociti che avranno una fertilità più bassa perché anche l’oocita all’interno è invecchiato. Quindi la possibilità di avere un embrione che si impianti avendo una gravidanza si abbassa. Quindi anche per l’OvSynch si ha un periodo ottimale avendo due code, trovando così animali non perfettamente sincronizzati. Quindi o è troppo tardi o hanno un follicolo invecchiato e magari non ovulano. L’OvSynch presenta un periodo ideale per farlo che va dal giorno 5 al giorno 12 del ciclo degli animali. Quindi per ottimizzarlo si hanno due possibilità: Dovrebbero essere visitate le vacche potendo così farlo nel periodo giusto, ma perderebbe di significato. Questo dovrebbe essere un protocollo che permetta di ridurre le visite Si presincronizza l’animale. Ovviamente è da adattare ad ogni situazione di allevamento: è ovvio che si si ha a che fare con un allevamento estensivo di animali da carne non è immaginabile effettuare 8 iniezioni, quindi si usano diversi protocolli Si hanno diversi protocolli, in particolare due protocolli sono passati più frequentemente in Italia, uno di moda qualche tempo fa e uno di moda adesso. Sono modificazioni dell’OvSynch nel senso in cui si unisce una presincronizzazione: PreSynch-OvSynch: usa il metodo più semplice di sincronizzazione visto che è la doppia prostaglandina in modo da sincronizzare il più possibile gli animali ciclici. Dopo 13-14 gg dalla seconda prostaglandina si inizia il classico protocollo di OvSynch, in modo da iniziarlo nella finestra giusta tra il quinto e il 15 gg del ciclo di tutti gli animali. Si ottimizza così la resa dell’OvSynch. Come svantaggio si ha che si fanno più trattamenti perché al classico protocollo di OvSynch si deve aggiungere la doppia prostaglandina, ma aumentano le percentuali di gravidanza perché effettivamente si sincronizzano più animali. Andando quindi a fare l’inseminazione a tempo fisso si hanno più animali effettivamente in calore e soprattutto con una sincronizzazione dell’ovulazione centrata. Double OvSynch: va di moda adesso in Italia, ereditandolo dagli USA. Si fanno due protocolli di OvSynch uno di seguito all’altro. Il primo giro di OvSynch lo si usa per sincronizzare il più possibile gli animali. A 7 giorni di distanza dal primo OvSynch si fa un secondo OvSynch per beccare anche quegli animali che al primo giro potevano essere nelle due finestre di non recettività. Quindi dopo il primo OvSynch non si feconda. Si insemina l’animale a seguito del secondo giro di OvSynch Esiste anche il ReSynch ma non è importante ai fini dell’esame quindi chi è interessato può cercarlo autonomamente. Sono tutti metodi per gestire la riproduzione in maniera ottimale. Da noi si usa il double OvSynch perché si hanno per lo più allevamenti a stabulazione libera, dove la vacca si gestisce abbastanza facilmente. È ovvio che un double OvSynch in allevamenti estensivi da carne con animali al pascolo non è facile perché andrebbero rincorsi gli animali per fare in totale 6 iniezioni, dove spesso inoltre nel protocollo in azienda la prostaglandina si duplica. Per ottenere la lisi del corpo luteo in maniera imponente si somministra una doppia prostaglandina. Quindi spesso la pratica di double OvSynch prevede 7 iniezioni. In un allevamento a stabulazione libera è relativamente semplice fare un’iniezione ad un animale, in altre condizioni invece si preferiscono altri tipi di protocolli. PROGESTERONE Fondamentalmente nella bovina, viene somministrato tramite dispositivi intravaginali, non tramite iniezione perché va mantenuto a lungo (per più giorni consecutivi) nell’animale se si vuole mimare il corpo luteo. Esistono delle somministrazioni a lento rilascio ma si è visto che non si raggiungono livelli ematici sufficienti, di conseguenza i dispositivi intravaginali risultano essere i più pratici. Nell’immagine sono rappresentati tutti i dispositivi che si possono trovare con varie forme. Probabilmente in Italia PRID e CIDR sono i dispositivi che si trovano maggiormente, dove il nome deriva dal termine inglese. Fondamentalmente sono dispositivi intravaginali di rilascio di progesterone. Hanno la stessa azione, cambia la forma. Esiste anche il delta PRID che in Italia però non viene usato, si vede di più in Francia, assomiglia al CIDR ma con forma triangolare. Le forme dipendono dal fatto che vada inserito in vagina e deve rimanere all’interno. La forma a spirale è la più semplice per rimanere all’interno della vagina, con un minimo di dilatazione della parete vaginale per rimanere incastrato. Il CIDR è a forma di T. I due braccini a T servono per bloccarlo all’interno della cavità vaginale. Il CIDR, non in Europa, ha scanalature di lato in cui può essere alloggiata una capsula. In questo caso viene chiamato CIDR E, dove quella E rappresenta gli estrogeni. Questo perché quando si sincronizza il progesterone se ci sono un pochino di estrogeni la sincronizzazione viene meglio. È presente all’estero mentre in Italia è vietata. Si ha quindi una capsula attaccata alla T, si può usare in Italia staccando la capsula di estrogeni. Il protocollo è a base di progesterone, l’impianto di progesterone è messo in vagina, si lascia per almeno 7 gg, almeno perché dipende a seconda dei casi in cui si utilizza. Questo perché si va a mimare un ciclo: se si mima in una bovina in anestro, che non ha ripreso l’attività ciclica, in realtà si lascia di più. 7 giorni è il minimo in animali ciclici, ma lavorando in animali non ciclici si lascia anche per 12-14 gg. Si mima effettivamente la durata di un corpo luteo. Il giorno prima della rimozione dell’impianto si somministra una prostaglandina, mettendolo alla cieca non si sa se l’animale in cui è stato messo avesse o meno un corpo luteo. La prostaglandina serve perché, quando poi si va a rimuovere l’impianto, se c’era un corpo luteo si lisa anche quello, così si ha l’induzione dell’estro. L’inseminazione è fatta sull’estro monitorato. Se viene tolto l’impianto il giorno 7 e la prostaglandina viene fatta il giorno 6 si sa che l’animale verrà in estro, in una finestra dal giorno 8 al giorno 11. È quindi previsto il monitoraggio dell’estro. Nelle immagini si vede come viene somministrato, verrà poi effettuato ad esercitazione e quindi studiato nella pratica. Fondamentalmente con la spirale è semplice: si prende in mano con i guanti, si entra in vagina, si lascia lì e si toglie la mano. Tutti gli impianti hanno un filo per andare poi a sfilare l’impianto. Per quelli a T è ovvio che non si possano inserire a T altrimenti non entra in vagina. Per questo motivo presentano una sorta di siringa di applicazione dove l’impianto è messo dentro a braccia chiuse, si spara in vagina come una siringa, poi quando esce in vagina apre le braccia e rimane lì. Anche questo ha un filo di colore blu che solitamente è accorciato così che se la bovina si corica non si ha il rischio che possa essere schiacciato da altre bovine, perché altrimenti quando poi la bovina si alza se lo sfilerebbe rischiando di trovare impianti in allevamento. Si accorcia il filo il minimo necessario per andarlo poi ad estrarre. È frequente avere una sorta di vaginite non infettiva con gli impianti al progesterone, perché si sta mettendo un corpo estraneo in vagina; quindi, estraendolo è frequente avere del muco sporco. Non inficia però sulla fertilità dell’animale. È una reazione locale che può essere interpretata male, potendo trovare del muco anche abbastanza purulento dovuto alla reazione dell’animale, ma in realtà non inficia sulla qualità dell’estro indotto. Bisogna sempre considerare che è normale avere del muco purulento quando si sfila l’impianto. WOOCLAP: Come indurresti l’estro in una bovina di 70 gg postpartum che alla visita ginecologica è in diestro? Prostaglandine: questo perché la bovina cicla, è in diestro, è stata visitata quindi è inutile fare l’OvSynch per indurre il calore. Si fanno le prostaglandine e viene in calore. Manze senza sensori di movimento e scarso monitoraggio visivo, come si possono sincronizzare gli estri? OvSynch: è sbagliato GnRH e hCG perché fatti singoli non hanno senso. Se sono animali in cui non si fa rilevamento degli estri in maniera accurata un protocollo di sincronizzazione fa comodo, ci sta investire in OvSynch su animali fertili. Si può anche considerare di fare una prostaglandina singola che però prevede una visita fatta singolarmente. Quindi si può usare la prostaglandina a fronte di controlli regolari sugli animali Come indurresti l’estro in una bovina non ciclica? Progesterone: l’hCG non c’entra niente essendo un sistema per sincronizzare l’ovulazione e dunque è una risposta ovviamente sbagliata. La prostaglandina singola e doppia non vanno bene in quanto la bovina non è ciclica, anche facendo delle prostaglandine con le prostaglandine serve un corpo luteo quindi non si troverà mai la bovina nella fase giusta. L’alternativa poteva essere un OvSynch ma non le prostaglandine. Il progesterone sicuramente può dare una risposta in un animale che non è ciclico. INSEMINAZIONE ARTIFICIALE DELLA BOVINA La bovina è la specie principale in cui viene effettuata. L’inseminazione artificiale è una delle tecniche di fecondazione assistita, ovvero tutte quelle tecniche dove si ottiene una gravidanza attraverso una manipolazione dei gameti. Nell’inseminazione artificiale si ottiene una gravidanza tramite l’operatore che mette del materiale seminale nell’utero, non segue la classica via della monta naturale. È la base quindi delle tecniche di fecondazione assistita. Inizialmente l’inseminazione artificiale, in particolare nel bovino, era stata messa appunto per motivi sanitari, per evitare il contatto tra maschi e femmine, quindi evitare la movimentazione di animali ma soprattutto la diffusione di malattie veneree. Adesso l’obiettivo principale dell’inseminazione artificiale è sicuramente la selezione genetica degli animali. I vantaggi dunque di scegliere l’inseminazione artificiale sono: La prevenzione da malattie infettive o contagiose che possono passare da un animale all’altro attraverso il contatto, per cui si ha il rischio di passaggio di patogeni anche non venerei ma di altre malattie infettive. Il motivo primario adesso è il miglioramento genetico legato in particolare nella bovina da latte alla produttività. Più che miglioramento genetico ad oggi si usa il termine genomico perché la selezione ad oggi è genomica. Distanza e tempo: con l’inseminazione artificiale si può fecondare un animale con semi di altre nazioni, non ci sono più limiti di distanza e soprattutto di tempo nella bovina, dove il seme è congelato, sta in azoto liquido a tempo indeterminato. Non ci sono limiti fisici o fisiologici: per esempio limiti legati al toro dove non riesce a compiere monta naturale, in passato era un problema. Con l’inseminazione artificiale si tolgono i problemi legati a ciò che poteva insorgere di fisico o anche comportamentale, per esempio con una vacca che calcia o con tori aggressivi o con problemi di libido. Ad oggi i problemi di libido con la selezione genetica praticamente non ci sono Altre biotecnologie riproduttive: in particolare riferito alla superovulazione embriotransfer Razze con pochi capi e specie in via di estinzione: permette di conservare il patrimonio genetico e soggetti delle popolazioni che hanno pochi capi Gli svantaggi dell’inseminazione artificiale sono: I diluitori in cui è conservato il seme contengono antibiotici: questo dà una garanzia sanitaria ulteriore, però un antibiotico non agisce su eventuali virus. L’inseminazione artificiale in questo caso presenta uno svantaggio, ma comunque i tori riproduttori sono testati per le malattie virali. Non esiste una dose seminale commercializzata che abbia la probabilità di contenere virus. Ovviamente però la diffusione del virus non è esclusa al 100% Presenza di batteri resistenti: nei diluitori se i batteri sono resistenti all’antibiotico si possono passare dal maschio alla femmina Calo della fertilità della bovina da latte e della cavalla: da quando si è iniziata ad utilizzare l’inseminazione artificiale si è assistito ad un calo della fertilità. Non tanto legato alla tecnica ma soprattutto legato alla perdita di variabilità genetica e al fatto che con un’inseminazione artificiale si inseminavano animali con pochi soggetti. Si ha quindi perdita di variabilità genetica e, nella bovina in particolare, si fertilizzava con determinati tori con una selezione per la produzione a discapito della fertilità. Nella cavalla non è tanto per la selezione, ma per il fatto che con il seme congelato si hanno percentuali di gravidanza più scarse rispetto alla monta naturale. Lo stallone magari è fertile, ma il seme è congelato no.  Perdita di variabilità genetica: se si semina con 4-5 tori si avranno poche linee di figlie e quindi meno variabilità genetica rispetto usando riproduttori meno selezionati. LEGISLAZIONE Da un punto di vista legislativo tutte le leggi vigenti adesso fanno capo alla legge 30 del 91 che disciplina la riproduzione animale. È stata recepita da diversi decreti e riadattata in base ai regolamenti europei. Questa legge regola tutto: dal singolo veterinario che effettua l’inseminazione fino anche i centri di riproduzione del seme e degli embrioni oltre che le stazioni di monta. Nell’arco del tempo sono stati fatti adeguamenti sanitari, con decreti, dove la base fondamentalmente è la stessa. Va tenuto presente da un punto di vista normativo, la normativa delle regioni. Di fatto i medici veterinari sono abilitati alla fecondazione, i non veterinari devono prendere il patentino. Per fare il fecondatore va comunicato alla regione che rilascerà il codice di fecondatore. Non è chiesto niente di particolare per il rilascio del codice, è sufficiente la laurea in veterinaria. Ogni regione ha poi delle piccole variazioni nella regolamentazione. In Italia esiste anche la figura del fecondatore laico presente sicuramente per bovini e suini, può capitare anche negli equini vedere non veterinari che fecondano. Spesso nei suini sono gli stessi tecnici di allevamento che lo fanno. Il veterinario in allevamento non si mette a fecondare le scrofe in fila ma è più nella parte gestionale, sono invece i tecnici che fecondano. IL SEME Nella parte di andrologia verrà poi approfondito meglio l’argomento. Il seme usato per l’inseminazione artificiale della bovina è seme congelato che si trova dentro delle piccole cannucce chiamate paillette, nome preso dal francese. La paillette è una piccola cannuccia con, da un lato il tampone per bloccare il liquido nella paillette, dall’altro si sigilla. Si chiudono in modo che non ci sia contatto con l’esterno e si congelano per poi essere stoccate in azoto liquido a -196 gradi dove rimangono a tempo indefinito. Queste paillette possono avere due volumi: 0.5ml e 0.25 ml, lunghe uguali ma le 0.25 sono più sottili, grosse la metà. Non cambia molto in termine di manipolazione dei due volumi, di solito è più frequente che quelli da latte siano in quelle da 0.5 mentre da carne da 0.25 ma non è una regola. Il seme sessato è sempre in paillette da 0.25 che va incontro a una procedura per scartare i maschi e tenere solo femmine, perché nella bovina da latte l’obiettivo è avere delle femmine che siano le rimonte. In seguito all’operazione non si mantiene il numero di spermatozoi in una paillette convenzionale ma è molto ridotto. Per legge, la dose inseminante nella bovina deve essere almeno di 6 milioni di spermatozoi mobili. In una paillette normalmente sono presenti 20 milioni di spermatozoi, è più abbondante. Quindi anche con un po' di perdita di spermatozoi nel congelamento, solitamente si ha una dose inseminante più alta per garantirsi il numero minimo. Il sessato per questioni logistiche va intorno ai 2 milioni di spermatozoi mobili. Con una dose così ridotta il sessato va utilizzato in maniera più opulata perché si ha più probabilità di avere vacca vuota. Viene usato principalmente sulle manze, in quanto hanno una maggior fertilità. Adesso sono state sviluppate tecniche che permettono di avere buone percentuali di gravidanza anche nelle vacche, posticipando di 4 ore l’inseminazione, quindi andando più vicino al momento di ovulazione. Adesso si hanno 2 tecnologie per la produzione del seme sessato, entrambe privatizzate:  Convenzionale: fa effettivamente una separazione dei maschi dalle femmine. Per sessare serve un citofluorimetro dotato di un laser, gli spermatozoi sono colorati con un colorante per il DNA, lo spermatozoo femmina emetterà una fluorescenza maggiore del maschio avendo più DNA, dato che nel maschio manca la gambetta della Y. In base all’emissione della fluorescenza gli spermatozoi sono caricati: negativamente le femmine e positivamente i maschi. Questi passano attraverso un campo magnetico che li devia, con separazione fisica degli spermatozoi, trovando a sx le femmine, a dx i maschi e al centro della spazzatura. Con questa metodica alcuni spermatozoi vanno persi: sono i morti e gli spermatozoi non perfettamente allineati quando passano nel laser. Lo spermatozoo non è perfettamente tondo: ha una faccia piatta; quindi, mettendosi di taglio il raggio non lo riesce a leggere. Da un eiaculato quindi si fanno meno dosi nel seme sessato rispetto ad un seme convenzionale, da un lato perché sono eliminati i maschi, dall’altro perché una parte comunque viene persa. Questa metodica per quanto velocizzata, impiega del tempo e fin tanto che il seme aspetta muore. Altra metodologia: si basa sempre sull’idea del citofluorimetro e della quantità di DNA ma è messo a punto un doppio laser. Un laser quindi distingue maschi e femmine: entra in gioco un secondo laser che taglia la coda ai maschi rendendoli non utili alla fertilizzazione. Nella paillette si avranno gli spermatozoi femmina e i maschi decapitati. Non sembra ci siano differenze di fertilità per la presenza di materiale seminale morto. Nella paillette ci sono spermatozoi femmina al 90-95%, però la probabilità che nasca un maschio su 10 rimane. È abbastanza accurata, ma non ha probabilità del 100% di spermatozoi femmina perché, basandosi sulla marcatura della femmina in base alla quantità di DNA, si ha un minimo margine di errore. Per quanto riguarda il momento dell’inseminazione, nella bovina si usa il metodo AM-PM ovvero metodo mattina- sera: si ha vacca in estro al mattino, si feconda la sera. Se la si rileva la sera, la si feconda la mattina del giorno dopo. È un metodo abbastanza semplice. Stessa cosa viene fatta se rilevata con sistemi di monitoraggio del movimento, dove si ha un picco in cui è pronta per essere inseminata. Nella bovina il tutto sta nell’individuare il momento dell’estro, poi non è difficile capire quando inseminarla. Nella bovina si insemina nel corpo dell’utero, sia con il seme normale che con il seme sessato. Anche nella bovina si può pensare con il seme sessato di fare un’inseminazione profonda mettendo nel corno, ma per fare un’inseminazione profonda serve una buona manualità. Si è visto che a parità di capacità degli operatori, andare all’apice del corno non migliorava l’inseminazione. Manipolare l’utero comporta il rilascio di prostaglandine, si può traumatizzare l’utero, quindi a meno che uno non abbia una buonissima manualità non conviene, in quanto le probabilità di gravidanza risultano simili. A parità di operatore che fa la fecondazione artificiale non c’è vantaggio. La tecnica sarà vista in dettaglio ad esercitazione ma fondamentalmente il materiale seminale congelato va scongelato a bagno maria con l’acqua a 37 °C per 30 secondi. Esistono dei protocolli che prevedono l’acqua a 60°C per 5 secondi ma risulta inutilizzabile se lasciata per più tempo. A 37°C va lasciata per 30 secondi, lasciando la paillette per qualche secondo in più non succede niente essendo questa una temperatura quasi fisiologica. In Italia fondamentalmente si usano bagno maria lunghi verticali, venduti nel kit di inseminazione, dove la paillette va immersa completamente, i quali sono tarati a 37 gradi. La paillette poi va asciugata, poi si carica sulla pistolet, una sorta di mini siringa d’acciaio, che funziona come una siringa, presentando quindi dietro il mandrino. Serve per svuotare la paillette nell’utero. Ovviamente va assemblata. Infilando una cannuccia con il tamponcino dentro alla pistolet senza niente, spingendo con il mandrino rimane fuori. Per svuotarlo quindi serve qualcosa sopra che la blocchi: la guaina. Le guaine sono fondamentalmente cappucci di plastica messi sopra la pistolet per bloccarla, ce ne sono vari modelli. Si blocca la paillette nella siringa d’acciaio, fondamentale è tagliarla potendolo fare sia con le forbici che con strumenti che la tagliano completamente dritta, va tagliata ben dritta. Nell’immagine a sx si vede una paillette tagliata dritta e una tagliata storta. Quella dritta quando il seme uscirà, uscirà dal foro anteriore della guaina, mentre se viene tagliata storta si può avere un reflusso, perché una parte rimarrà incastrata tra la guaina e la paillette. Sono state fatte anche delle guaine che hanno tappini di plastica che si incastrano sulla testa della paillette per ottimizzare la fuoriuscita senza che il seme vada disperso. Quindi si taglia, si mette la guaina, eventualmente si può coprire la guaina con le camicie sanitarie per aumentare l’igiene. Con l’embriotransfer è obbligatoria mettere la camicia sanitaria perché si sta entrando nell’utero di una vacca in diestro, con l’inseminazione artificiale sarebbe buona prassi ma non è utilizzato. Si usa la camicia per mantenere più pulita la pistolet e soprattutto perché si passa in vagina dove c’è l’urina, usando la guaina essa va rotta subito all’ingresso in cervice, con l’utilizzo delle camicie sanitarie si evita che si entri in utero con uno strumento che è passato nell’urina. Quindi così si protegge dalla flora batterica presente in vagina che non si vuole portare in utero. Usando la camicia è fondamentale romperla prima dell’entrata in utero. Si hanno alcuni suggerimenti per evitare lo shock da freddo e gli sbalzi termici. Fondamentalmente lavorando con il seme congelato d’inverno classicamente la pistolet sta a 4 gradi, deve entrare il seme a 37 gradi in una cannuccina sottilissima, bisogna ricordarsi che va portata a temperatura ambiente o comunque di scaldarla. Il modo più semplice è con il corpo. Per non fare raffreddare la temperatura ci sono anche delle valigette termostatate, altrimenti si usa il corpo mettendola all’interno di abiti puliti. Sulla temperatura va fatto a temperatura giusta e con un termometro per verificare che sia la temperatura giusta, per evitare di danneggiare il materiale seminale prima che arrivi nella bovina. Se non si ha il bagno maria si può utilizzare anche l’acqua del rubinetto ma è fondamentale avere il termometro. Sarebbe bene preparare una dose per volta, questo però ovviamente dipende dalla logistica che si ha in allevamento. Se si hanno vacche in stalla vicine si possono preparare anche 3-4 dosi per volta, essendo magari una vacca di fianco all’altra. Avendo invece animali distanti è meglio preparare una dose per volta perche andrebbe inseminato l’animale entro 15 minuti dallo scongelamento. Questo perché intanto il seme rimane in diluitori che contengono crioprotettori, i quali facevano comodo nel congelamento, ma che nel momento in cui si scongela il seme i crioprotettori sono sostanze citotossiche. Meno tempo rimane il seme dentro la paillette meglio è. Bisogna regolarsi sul numero di dosi da scongelare in una volta anche considerando il tempo che si impiega a inseminare le bovine. Si usa il metodo retto vaginale per fecondare: 1. La bovina viene catturata 2. Si pulisce la zona perineale, nella cavalla si pulisce bene, la bovina è più resistente. Normalmente si fa pulizia con carta secca, in corsia mettersi a lavare è un problema. Si vede solo nei video esplicativi dove si lava, ma non è la prassi. 3. In corsia si feconda mettendo una mano nel retto, la pistolet in vagina e si manovra la cervice dal retto. Questo perché la bovina presenta delle pliche cervicali quindi se si prova ad andare avanti la maggior parte delle volte ci si incastra in una plica cervicale, a meno che la vacca non è in pieno estro e presenta la cervice ben aperta. Si prende la cervice per far passare la pistolet attraverso la cervice. 4. Passata la cervice si deposita il seme nel corpo che nella bovina è corto. Appena uscita dalla cervice quindi si deposita il seme. Se ci si infila invece in un corno per sbaglio e non è quello con il follicolo preovulatorio bisogna far fare al seme ancora più strada per tornare indietro e passare al corno corretto. Scaricato il seme nel corpo diffonde a tutte e due le corna mentre se posizionato in un corno, nell’altro fa fatica ad arrivare. La camicia sanitaria va rotta quando si sta entrando in cervice, si passa in cervice con la pistolet non più inguainata evitando così l’ingresso di eventuali contaminanti. Inoltre così si ha già la pistolet libera evitando di lasciare il seme nella camicia sanitaria. FECONDAZIONE ARTIFICIALE DELLA BUFALA La bufala rispetto alla nostra bovina da latte è un animale che è stato meno addomesticato quindi mantiene la sua stagionalità del ciclo riproduttivo, è poliestrale stagionale a fotoperiodo decrescente cioè inizia la stagione riproduttiva in autunno. Il bufalo domestico prevede due sottospecie: quella di palude e quella di fiume, in Italia è più presente la seconda. Rispetto alla bovina ha una pubertà molto più tardiva: 24 mesi. Essendo un animale più tardivo bisogna tenere conto del costo extra per il mantenimento in allevamento per tutti quei mesi in cui non è in produzione. La durata del ciclo è come la bovina 21 giorni, l’estro è abbastanza variabile, in media 23h e non è così evidente cioè non presenta il classico comportamento estrale. Il segno più evidente nella bufala è l’accettazione del maschio; lavorando negli allevamenti intensivi in cui si applica la fecondazione artificiale questo costituisce un problema nell’identificazione delle bufale in estro. L’ovulazione avviene come nella bovina nel metaestro, 15-18 ore dalla fine dell’estro, quindi, è molto importante capire quando la bufala si trova in estro per fecondarla. Nel caso in cui abbia doppie ovulazioni, la seconda avviene più tardivamente rispetto a quello programmato ed è su questa che si deve programmare l’inseminazione artificiale, rendendola ancora più difficile. In media presenta 2 ondate follicolari e la gestazione è di 310 gg quindi più lunga della bovina. L'inseminazione è ancora poco diffusa negli allevamenti allo stato brado, è più comune invece negli allevamenti intensivi. Si potrebbe usare anche per la bufala il metodo a.m.-p.m. ma non è così preciso e si rischia di perdere l’ovulazione. Quindi per riassumere le problematiche principali per l’individuazione dell’estro nelle bufale sono: - Mancanza del comportamento estrale - La possibilità delle doppie ovulazioni - Le condizioni di allevamento: le bufale necessitano la presenza di acqua, negli allevamenti bufalini di solito sono presenti stagni o vasche d’acqua che rendono ancora più difficile per l’operatore osservare gli animali e capire quando sono in estro. Siccome l’unico segno estrale è l’accettazione del maschio per rilevare l’estro si può usare un maschio vasectomizzato che segnala le bufale in estro, una femmina androgenizzata con un marcatore che lascia il colore sulla groppa dell’animale in estro. C’è però il problema del fango e dell’acqua che possono andare a togliere il colore. Si possono usare dei rilevatori di monta o i podometri perché anche in questa specie c’è un picco di attività durante l’estro. Per quanto riguarda i parametri riproduttivi che si possono utilizzare per valutare l’efficienza della gestione della riproduzione sono simili a quelli per la bovina (Heat detection rate HDR, Conception rate CR...). I parametri più utilizzati per la bufala sono l’interparto e il tasso di concepimento (CR). Da tenere presente che quando si lavora con il seme refrigerato si hanno delle conception rate molto buone (50- 60%), con la monta naturale si supera il 60% e con il seme congelato si abbassa al 30%. N.B: La Conception Rate è la percentuale di animali gravidi sopra a quelli fecondati in un certo lasso di tempo. Per quanto riguarda l’interparto l’obbiettivo sarebbe 2 vitelli bufalini ogni 3 anni per gli allevamenti estensivi, in quelli intensivi invece con una buna gestione si riescono ad avere degli interparti di 14-15 mesi cioè 4 vitelli in 5 anni. DESTAGIONALIZZAZIONE DEI PARTI Andando ad analizzare la stagionalità della bufala questa produce il latte nel momento in cui sul mercato c’è la minor richiesta. Sicuramente la mozzarella di bufala rimane il prodotto più richiesto in questo settore e si consuma soprattutto d’estate quando però la bufala è fisiologicamente in anestro. Per cambiare i cicli di produzione agli animali sono stati messi a punto dei protocolli per la destagionalizzazione dei parti. Osservando il grafico vediamo che il primo anno corrisponde alla situazione normale in cui la maggior parte dei parti avviene alla fine dell’anno (autunno/inverno). Con questo processo di destagionalizzazione nei vari anni vediamo uno spostamento dei parti all’inizio dell’anno (inverno/primavera) fino ad arrivare alla completa mancanza di parti nei mesi autunnali. Questo porta ad una produzione di latte che copre anche i mesi estivi per far fronte alla maggior richiesta di prodotti. Per fare questo si deve fecondare la bufala intorno ad aprile-maggio, il problema è che fisiologicamente l’animale in questo momento è in anestro, quindi c’è un calo della fertilità. Per ovviare a questo problema si utilizzano dei protocolli di sincronizzazione del ciclo che ci aiutano a svolgere la fecondazione artificiale in animali che sono in anestro. MANIPOLAZIONE DEL CICLO ESTRALE Per manipolare il ciclo estrale delle bufale possiamo usare le prostaglandine, però l'animale deve avere ancora il ciclo produttivo, in particolare deve essere presente il corpo luteo. Si può fare una somministrazione singola o doppia nel caso in cui sia fatta alla cieca. Il protocollo è simile a quello della bovina, la cosa che cambia è che la bufala tende ad andare in estro più tardivamente rispetto alla bovina. Per quanto riguarda la sensibilità del corpo luteo alle prostaglandine: dopo il 5 giorno dall’ovulazione. OvSynch è una tecnica che prevede l’utilizzo in sequenza di GnRH analoghi e PGF2α per “sincronizzare” la crescita del follicolo, l’ovulazione e la luteolisi in modo da permettere di fecondare le bovine al “buio”, ossia a prescindere dal comportamento estrale. Si può utilizzare la stessa alternanza di giorni della bovina. PRID+ eCG : uno dei protocolli più utilizzati con l’utilizzo del progesterone perché mima la produzione del corpo luteo e quindi si può utilizzare anche sugli animali che stanno andando in anestro. Si dà il progesterone per 12 giorni, quindi, mimando la durata di secrezione del progesterone di un ciclo normale. Poi si rimuove l’impianto e con il calo del progesterone si va a mimare la lisi del corpo luteo e si somministra eCG: gonadotropina corionica equina. Quest'ultima è simile all’azione del FSH e ci aiuta a far partire un’ondata follicolare facendo entrare l’animale in estro. Con questo protocollo si fa una doppia inseminazione programmata a 48 e 72 ore. DOMANDE WOOCLAP - Quando entra in anestro la bufala? La risposta giusta è primavera, in particolare aprile-maggio. - Quando dovrò inseminare una bufala per poterla destagionalizzare? La risposta giusta è sempre primavera, la devo fecondare nel periodo in cui starebbe entrando in anestro. FECONDAZIONE ARTIFICIALE DELLA CAVALLA DOMANDE WOOCLAP: - La cavalla è un animale con ciclo? La risposta giusta è poliestrale stagionale. Le cavalle entrano in estro in primavera. - La durata media del ciclo estrale della cavalla è? La durata media del ciclo estrale della cavalla è 21 giorni. - Nella cavalla l’ovulazione avviene? L’ovulazione nella cavala avviene 1-2 giorni prima della fine dell’estro. Quindi è più difficile il momento della fecondazione rispetto alla bovina, la cavalla va visitata per monitorare l’estro e in particolare il follicolo. - Il primo calore post-partum della cavalla avviene? Il primo calore post- partum è circa a 9 giorni. L'altra specie che presenta il calore post-partum è il gatto. N.B. L’estro nella cavalla dura da 4 a 8-9 giorni. Essendo più lungo rispetto alle altre specie incide sulla difficoltà dell’inseminazione nel momento giusto. LA MORFOLOGIA DELL’OVAIO DELLA CAVALLA: É importante ricordarsi che nell’ovaio della cavalla corticale e midollare sono invertite rispetto alle altre specie, quindi la corticale è interna. Questo porta ad una maggior difficoltà durante la visita nell’identificare le strutture. Dall'esterno, a differenza delle altre specie come la bovina, non si riesce a palpare lo stigma perché la cavalla ovula nella fossetta ovulatoria e non sulla superficie. Grazie all’avvento dell’ecografo si è riusciti ad ovviare a questo problema e si riescono a distinguere follicoli e corpi lutei. Ormai la ginecologia della cavalla è impossibile senza ecografo invece quella della bovina si può fare tutta a mano. Il follicolo preovulatorio può raggiungere in media i 5 cm. Una particolarità della cavalla è che ha il picco delle LH subito dopo l’ovulazione. La cavalla è un animale stagionale poliestrale, la stagione di monta va da aprile a settembre più o meno. Con l’autunno si entra nella fase di transizione, poi c’è la fase di anestro stagionale durante l’inverno e prima dell’inizio del primo calore c’è una seconda fase di transizione. Quindi hanno 2 fasi di transizione: una primaverile e una autunnale in cui si ha un calo di tutti gli ormoni ma rimane alto il diametro follicolare dovuto a dei livelli di FSH non azzerati. L'ovaio quindi nella fase di transizione ha la classica conformazione a mora con i follicoli ingrossati. Durante l’anestro invece calano anche i livelli di FSH e di conseguenza i follicoli. COMPORTAMENTO ESTRALE Per quanto riguarda il comportamento estrale la cavalla presenta dei chiari segni nel periodo dell’estro: - Irrequietezza - Iniziale rifiuto del maschio seguito da marcato interesse in pieno estro. - La cavalla in presenza dello stallone solleva la coda, può fare dei getti d’urina e poi divarica le labbra vulvari esponendo il clitoride. - Lo stallone è utile per identificare le cavalle in estro perché avvicinandosi alle cavalle in estro assume l’atteggiamento del flehmen a causa dei feromoni. - Visitando la cavalla si nota l’edema vulvare e in alcuni casi anche la presenza di cristalli di carbonato di calcio derivati dal muco vulvare che ne è ricco. Per il rilevamento dell’estro è molto utile usare uno stallone, altrimenti si può osservare il loro comportamento con le altre cavalle ma non necessariamente manifestano. Il monitoraggio del ciclo attraverso la palpazione transrettale e l’ecografia rimane il metodo migliore per il rilevamento dell’estro. Nell'ecografia a sinistra c’è un follicolo preovulatorio e l’ecografia a destra è la sezione trasversale di un corno uterino con l’endometrio edematoso che si alza a pieghe e assume questo aspetto a fiore in sezione. Questo è il quadro tipico per definire che la cavalla si trova in pieno estro: follicolo pre- ovulatorio di circa 5 cm e endometrio edematoso. MANIPOLAZIONE DEL CICLO NELLA CAVALLA È abbastanza comune dover anticipare la ciclicità, quindi rimuovere l’anestro nelle cavalle. Abbiamo una opzione “naturale” ed altre opzioni farmacologiche. OPZIONE NATURALE La cavalla è sensibile all’accorciamento delle giornate; quindi, se noi la stimoliamo con una fonte luminosa e allunghiamo le ore di luce possiamo ottenere come risultato un anticipo nel ritorno della stagione riproduttiva. Per far questo dobbiamo esporre l’animale a 16 ore totali di luce al giorno, ovviamente nella fascia oraria normale. Solitamente la fonte luminosa viene posta al centro del box o attraverso la presenza anche di maschere a luce blu che vanno a stimolare attraverso il nervo ottico la corteccia cerebrale. Questa seconda metodica va a stimolare il singolo animale quindi lo svantaggio sorge nel momento in cui dobbiamo trattare gruppi più ampi di animali. È necessario stimolare l’animale per 60-70 giorni; ad esempio, se si vuole l’animale ciclico a febbraio si deve iniziare il trattamento almeno a fine novembre. È una soluzione che possiamo adottare solamente se abbiamo un margine di anticipo congruo con le tempistiche richieste. Se non si ha questo margine di anticipo siamo costretti ad agire tramite farmaci; l’esposizione alla luce può comunque essere accostata ai protocolli perché lo stimolo luminoso sicuramente sblocca i meccanismi ormonali ma ha un’azione a lunga durata. OPZIONI FARMACOLOGICHE: - GnRH o analoghi (buserelina, goserelina, deslorelina): in una fase di anestro in cui tutte le gonadotropine sono a livelli basali se si somministra del GnRH vado a stimolare la produzione di FSH e LH, quindi la ripresa dell’attività ciclica o quanto meno il passaggio alla fase di transizione. Vengono solitamente usati degli analoghi del GnRH perché sono più potenti ed hanno un’emivita maggiore. L’emivita è importante perché sennò dovremmo iniettarlo troppo frequentemente per cercare di mimare l’andamento del GnRH, mentre con l’emivita più lunga sono sufficienti 2-3 somministrazioni al giorno. Va mimato il fisiologico andamento di secrezione del GnRH, quindi è necessaria comunque sempre una manipolazione frequente degli animali. È possibile sennò andare ad usare degli impianti sottocutanei a lento rilascio che ci evitano di effettuare delle iniezioni tre volte al giorno. - Agire sulla prolattina: è la prolattina che si alza quando l’animale ritorna in estro. La prolattina in sé non è disponibile come farmaco ma abbiamo dei farmaci che possono stimolare il rilascio della prolattina e sono degli antagonisti della dopamina (sulpiride, domperidone). Il sulpiride è sia in versione iniettabile che in compresse; il domperidone esiste anche in pasta o in gel; quindi, si tratta solitamente di una somministrazione di tipo orale. Nei Paesi dove è ammesso fare un trattamento con estradiolo benzoato (quindi estrogeni) viene facilitata la risposta dell’animale ai farmaci siccome gli estrogeni hanno un’azione di feedback positivo nell’asse ipotalamo-ipofisi (in Italia però non è possibile utilizzarli). Rimosso l’anestro stagionale alcune cavalle potrebbero ciclare mentre altre potrebbero passare nella fase di transizione. Alcune superano la fase di transizione direttamente durante il periodo di trattamento che dura dalle due alle tre settimane. Se abbiamo invece una cavalla che dalla fase di anestro che passa alla fase di transizione, per farla passare alla fase ciclica abbiamo due ipotesi. La fase di transizione è caratterizzata dalla presenza di ovaie piene di follicoli di medie dimensioni. La rimozione si basa sulla simulazione del ciclo e il farmaco che maggiormente interviene in questo caso è il progesterone. Somministrando il progesterone si va a simulare la presenza di un corpo luteo, ottenendo un effetto di feedback negativo sull’ipofisi e quando lo si va a rimuovere porta alla cascata di eventi che portano all’induzione dell’estro e quindi all’ovulazione. Nella cavalla abbiamo diverse possibilità anche in termine di prodotti: - Iniettabile intramuscolo per 8-10 giorni; 150-200 mg/die - Dispositivo vaginale: la possibile reazione purulenta all’impianto non viene ben accolta dai proprietari. - Progestinico per bocca: “Regumate®” è altrenogest che è un potente progestinico che si somministra oralmente. Va somministrato una volta al giorno utilizzando dei guanti essendo a base ormonale; deve essere fatto per almeno 8-10 giorni ed alla sua sospensione dovrebbe partire il primo ciclo. Si può anche allungare ed effettuare una somministrazione fino a 12 giorni ed all’interruzione dovrebbe partire un’ondata follicolare con l’estro. La somministrazione dell’FSH: negli USA vi era la presenza di FSH equino per stimolare l’ondata follicolare dove si instaura la dominanza di un follicolo che poi andrà incontro ad ovulazione. Con l’avvento della West Nile Disease, patologia del sistema nervoso centrale, è stata bloccata la commercializzazione perché il farmaco veniva prodotto da ipofisi liofilizzate, quindi da tessuti del sistema nervoso centrale che potevano contenere il virus. Al momento abbiamo quindi a disposizione solo il progesterone. SINCRONIZZAZIONE DELL’ESTRO Se l’animale è già nella stagione riproduttiva. Per sincronizzare l’estro nella cavalla possiamo usare le prostaglandine; la cavalla inoltre va sempre visitata per sapere se vi è già o meno il corpo luteo. Prima opzione: non si visitano le cavalle e si vanno a effettuare le prostaglandine a distanza di due settimane. Anche nella cavalla l’estro inizia in media dopo 3 giorni, con una finestra dai 2 ai 4 giorni, e come media l’ovulazione avviene dopo 9 giorni, con un range di 8-10 giorni. Con una doppia prostaglandina la percentuale di sincronizzazione è bassa; nella cavalla di solito si sincronizzano gli estri solo per l’embriotrasfer perché non ho interesse ad avere più animali ad inseminare lo stesso giorno. L’estro nella cavalla è molto variabile quindi non è detto che una cavalla che presenta un estro corto in un determinato ciclo, durante il ciclo successivo presenti sempre un estro corto. Questo perché esistono molti fattori che possono modificare la durata. Quando si lavora con la prostaglandina nella cavalla è più semplice visitare l’animale, verificare la presenza del corpo luteo ed effettuare una singola prostaglandina; quindi, si va a lavorare sul singolo soggetto. Tipicamente nella cavalla andiamo ad utilizzare il cloprostenolo (250 μg), che è tra i più potenti quindi ci permette di ottenere la lisi in un tempo più efficiente con una singola dose. Ci sono alcune cavalle che possono avere reazioni alle prostaglandine e mimano la sintomatologia colica: animale irrequieto, inizia a sudare, crampi addominali, aumento della frequenza cardiaca, aumento della motilità gastro-intestinale, debolezza muscolare. Di solito si verificano entro 30 minuti dalla somministrazione, quindi, è facile andare a riconoscere e distinguere queste reazioni rispetto alla sindrome colica vera e propria. Se la cavalla è sensibile è importante ricordarlo per non confonderlo con una sindrome patologica; se sono sensibili al cloprostenolo in quelle cavalle si può provare a cambiare prostaglandina. Un’altra alternativa per la sincronizzazione, soprattutto se si hanno più cavalle da sincronizzare e non tutte hanno il corpo luteo nello stesso momento è intervenire con il progesterone. Si somministra progesterone per 10-14 giorni: in 14 giorni anche se le cavalle avevano appena ovulato il corpo luteo sarà nella fase finale. In ogni caso per sicurezza l’ultimo giorno di somministrazione del progesterone si somministra anche la prostaglandina per essere sicuri di lisare il corpo luteo (soprattutto se non si prolunga fino ai 14 giorni ma se lo si tiene solo per 10). Dopo questo processo la cavalla verrà in estro e saranno più o meno sincrone a seconda della durata del proprio estro. INDUZIONE DELL’OVULAZIONE Nella cavalla anche per i cicli normali si usa sempre l’induzione dell’ovulazione, dal momento che ovula prima dell’estro non sappiamo di preciso quando andrà ad ovulare. Inducendo l’ovulazione si comprende in maniera più precisa quando andare ad inseminare. Per fare l’induzione bisogna esser certi che il follicolo su cui lavoriamo sia recettivo ai farmaci, quindi sia recettivo all’LH. Il follicolo dominante è pronto quando ha almeno 35mm di diametro (nella pratica vanno considerati tutti gli altri segni, come l’edema). Ho due opzioni: - hCG endovenosa: ha azione LH-simile. Il dosaggio varia da 1000-3000 unità internazionali. Normalmente l’ovulazione avviene dopo 36h dalla somministrazione (nell’80% degli animali). Lo svantaggio è che alcuni animali possono sviluppare reazione anticorpale; la prima volta può  quindi andare bene ma se prolunghiamo il trattamento non si avrà più risposta perché gli anticorpi andranno a bloccare la molecola. - analoghi del GnRH (buserelina, deslorelina): sono molti più piccoli come molecole, quindi, difficilmente danno reazioni anticorpali e funzionano allo stesso modo. La somministrazione è endovenosa. La buserelina da ovulazione dopo 48h nel 70-80% degli animali. È importante conoscere la finestra temporale per intervenire correttamente con il materiale seminale; se ho il seme fresco ho una durata nell’apparato genitale più lunga, con il refrigerato si dimezza mentre con il congelato devo avvicinarmi il più possibile all’ovulazione. Con la deslorelina acetato sottocute o intramuscolo ho l’ovulazione a 41h dalla somministrazione. Ho la possibilità anche di utilizzare degli impianti (sono più utili nella fase di rimozione dell’anestro dal momento che sono utilizzati per il rilascio del principio attivo nel lungo termine). Se non viene rimosso continua a rilasciare GnRH e potrebbe interferire con il normale intervallo tra le due ovulazioni, quindi andrebbe messo e rimosso. Una modalità per andare a ritrovare facilmente ed estrarre l’impianto è di andarlo ad inserire in zone prive di pelo, come ad esempio la faccia interna del labbro vulvare. DOMANDE WOOCLAP - Come indurresti l’estro in una fattrice in diestro nel mese di aprile? La risposta corretta è “prostaglandina singola”. Se la fattrice è in diestro nelle ovaie avrà il corpo luteo. Essendo già ciclica e non dovendola sincronizzare con altre cavalle la cosa più facile da fare è indurre l’estro tramite la prostaglandina. - Come indurresti l’ovulazione in una cavalla in estro con un follicolo di 35mm di diametro? La risposta corretta è “hCG”. Un’ alternativa se la cavalla non risponde all’hCG perché ha sviluppato gli anticorpi è quella di utilizzare GnRh-simili. - Come sincronizzeresti l’estro di 3 fattrici? La risposta giusta è “progestinico”. Se volessimo una alternativa potremmo usare, visitando l’animale e verificando la presenza del corpo luteo, le prostaglandine. - Come rimuoveresti l’anestro di una fattrice a febbraio? A febbraio è più utile utilizzare analoghi del GnRH. Quando si è così a ridosso della fine della stagione è meglio andar ad agire con i farmaci. Una possibile alternativa è andare ad alzare la prolattina tramite gli antagonisti della prolattina. - Nella fase di transizione? Non viene secrto FSH/non viene secreto LH/non vengono secreti FSH e LH/FSH e LH hanno valori fisiologici. La risposta giusta è “non viene secreto LH”. Valori medi di FSH ci sono per la presenza di follicoli che però non ovulano. INSEMINAZIONE ARTIFICIALE Nel cavallo sicuramente le principali applicazioni sono: - Motivi sanitari: si evita di dover metter a contatto lo stallone con le fattrici, per cui possibili trasmissioni di malattie infettive e/o veneree.  - Motivi commerciali: nel cavallo non vi è la voce della selezione genetica come nella bovina (i riproduttori nel cavallo non necessariamente sono i migliori come qualità del materiale seminale). Il soggetto è selezionato in base alle proprie performance, che possono essere sia sportive che fenotipiche. - Recupero riproduttivo: in particolare può essere applicato al maschio. Vantaggi: Svantaggi: Maggiore sicurezza: stallone e fattrici Strumentazione extra non vengono in contatto, quindi possibili Capacità e conoscenze: anche solo la danni per entrambe le parti. gestione dell’estro della fattrice richiede Minor diffusione delle patologie competenze per decidere il momento infettive dell’inseminazione che non può essere Si possono fecondare più fattrici da un fatto dall’allevatore, ma esclusivamente eiaculato: no nel purosangue inglese, dal veterinario. dove è ammessa solo la monta naturale. Addestramento del stallone: alla Impiego di diluitori appositi per produzione del materiale seminale. materiale seminale: permette una Conservazione: in particolare per il maggiore longevità, per cui può essere materiale congelato vi è una parte di spedito. Permette il trasporto anche a stalloni il cui materiale seminale non si lunga distanza. congela bene, dove allo scongelamento Programmare la raccolta del materiale si hanno una vitalità e motilità basse. seminale e l’inseminazione: con la Questo comporta un calo della fertilità monta naturale non si riesce a del materiale rispetto al fresco. programmare e lo stallone deve essere Costi aggiuntivi messo a disposizione della fattrice per un arco di tempo maggiore. Non c’è necessità di movimentazione delle fattrici: invece lo stallone si deve muovere in ogni caso perché deve andare nella stazione di monta. Possibilità di congelamento: esistono ulteriori vantaggi perché ad esempio la durata della conservazione del materiale è maggiore ed anche il trasporto abbatte le barriere intercontinentali (può venire trasportato in tutto il mondo). Recupero riproduttivo degli stalloni. RECUPERO RIPRODUTTIVO Ci sono degli stalloni che in monta naturale non avrebbero possibilità di avere progenie per diverse situazioni come: - Contaminazioni batteriche dell’eiaculato: in realtà si può con i diluitori e diverse metodiche abbattere la carica microbica. In particolare, i diluitori contengono degli antibiotici che contribuiscono ad evitare l’azione negativa di batteri, ma in certi casi è possibile anche trattare il seme per abbassarne la carica batterica attraverso protocolli di centrifugazione, anche selettiva con passaggio del seme su un colloide (dove gli spermatozoi vengono puliti dal plasma seminale e dal suo contenuto, tra cui batteri). Dunque, o  con centrifugazioni successive o con passaggio su colloide si può rendere disponibile un materiale seminale che altrimenti sarebbe inutilizzabile. - Qualità dell’eiaculato non ottimale: se vi è azoospermia (mancano completamente gli spermatozoi nell’eiaculato) non si può fare nulla. Nei casi in cui si ha un basso numero di spermatozoi oppure un numero di spermatozoi motili scarso, si ha la possibilità di recuperare lo stallone. In questi casi si ha a disposizione l’adozione di selezione di spermatozoi di buona qualità in associazione alla inseminazione artificiale profonda, utilizzando un videoendoscopico (si posizionano gli spermatozoi il più vicino possibile all’ovidotto). Quindi anche con bassi numeri si riesce ad ottenere una gravidanza. - Animali con problemi di zoppie o treno posteriore indebolito: non riescono a saltare sulla cavalla. Hanno dei problemi al salto per cui può avvenire la raccolta anche in stazione quadrupedale, senza la necessità di un manichino. - Soggetti con problemi comportamentali: animali molto aggressivi con le fattrici per cui non sarebbero impiegabili per la monta naturale. Nel cavallo l’inseminazione artificiale si basa su: - Tipo di seme che si può impiegare - Il numero di spermatozoi per dose inseminante e in che volume vengono utilizzati - Momento dell’inseminazione in relazione all’ovulazione: si riferisce al fatto che se si usa del seme fresco. Questo avrà una vitalità nel genitale femminile più lunga rispetto ad uno refrigerato o tantomeno congelato, per cui bisogna essere ancora più vicini rispetto all’ovulazione della fattrice. - Luogo di deposizione del materiale seminale (tipo di IA): mentre nella bovina non ha senso andare a farla profonda, nella cavalla lo si può fare a seconda del materiale seminale. IL SEME Si hanno 3 tipologie di materiale seminale: - Seme fresco: può essere utilizzato puro (raccolto direttamente e suddivido in dosi) o diluito. Quindi viene prelevato e immediatamente inserito nella fattrice. - Seme refrigerato: nel cavallo vuol dire conservato a temperatura di frigorifero. - Seme congelato: vuol dire stoccato nelle paillettes e conservato in azoto liquido. SEME FRESCO Lo si prende dallo stallone e di solito, di prassi, di diluisce. Lo stallone e la fattrice devono essere nello stesso centro: - La dose inseminante nella cavalla è molto più alta rispetto che nella bovina: solitamente è 300-500 milioni di spermatozoi. - Questi spermatozoi devono avere una motilità progressiva (MP) >60% che è un valore che nel seme fresco non è di difficile raggiungimento. - Il volume in cui si devono avere questi spermatozoi è di 10 ml (anche se si può arrivare ad un massimo di 20 ml, però è meglio stare sotto i 15 ml). Questo perché la cavalla ha una reazione infiammatoria fisiologica contro gli spermatozoi, però con l’IA si toglie il passaggio della cervice che ci sarebbe in vivo (si entra direttamente in utero). Nella cavalla il pene non arriva all’interno dell’utero, infatti lo stallone eiacula in vagina e ha dei getti per cui favorisce l’ingresso in utero. Non tutto l’eiaculato entrerà in utero per cui si ha un minimo di selezione cervicale anche nella cavalla. Di conseguenza per evitare lo sviluppo di reazioni infiammatorie elevate si cerca di limitare il più possibile il volume di materiale seminale che si inserisce.  - Si utilizza la tecnica convenzionale: è molto più semplice rispetto alla bovina. Si va con il braccio direttamente in vagina (non serve la manipolazione dal retto), si sente con un dito la cervice e si infila così il catetere direttamente in utero. Si tratta di un metodo vaginale. Il seme viene di solito contenuto in siringhe senza silicone (è tossico per i gameti), si connette la siringa al catetere, il catetere va in utero e si spinge il contenuto nel corpo dell’utero. In generale si lascia sempre un po’ d’aria nella siringa così che alla fine si spinga anche l’ultima parte del materiale presente nel catetere (nel cavallo si utilizzano dei diluitori a base di latte scremato, ecco perché è bianco). Come si fa a sapere se si è nel corpo? Si va avanti con la punta del catetere finché non si sente che si scontra con un muro davanti che sarà il fronte dell’utero perché le corna della cavalla vanno in su (quindi si è alla base delle corna), per cui si va un po’ più indietro per essere sicuri di essere nel corpo. - Il punto è sapere quando inseminare: il seme fresco fornisce un range molto comodo nel senso che l’ovulazione deve avvenire entro le 36-48 ore da quando si è inseminato per cui anche se non si è indotta l’ovulazione, ma si è monitorato il ciclo, si hanno fino a 2 giorni per cui in teoria si possono inseminare delle cavalle anche senza l’induzione dell’ovulazione. Può essere poi ripetibile ogni due giorni però non bisogna farlo troppo spesso perché altrimenti la cavalla va incontro ad un’endometrite post- inseminazione e non è più inseminabile. - La fertilità per ciclo con il seme fresco va dal 50 al 70 %, ciò tiene conto sia della fertilità della femmina che del maschio. Però con una femmina con apparato genitale sano e buona fertilità del maschio la percentuale è maggiore. Il seme fresco nel cavallo è quello che dà percentuali di gravidanza più alte, il 50% è più legato al fatto che la finestra di inseminazione sia stata quella giusta. N.B. La cavalla è un animale molto sensibile, per cui anche l’igiene nella riproduzione è fatta in modo diverso rispetto alla bovina. Dunque, si fa un’accurata pulizia del perineo, si utilizza scrub con betadine, si usano anche dei disinfettanti: quindi è molto più minuziosa. Il guanto che si utilizza per entrare in vagina deve essere un guanto sterile: si deve evitare di portare dentro l’utero la contaminazione batterica che è in vagina. Il gel utilizzato è in dei tubetti più piccoli perché permette di mantenerlo più pulito per un tempo maggiore perché lo si finisce prima. Dunque, anche tutte le attrezzature come i cateteri devono essere sterili. SEME REFRIGERATO Permette di avere stallone e fattrice in 2 sedi diverse. Quindi bisogna spedire il materiale seminale, si possono avere diversi contenitori: - Nelle siringhe di inseminazione, chiusa con un tappino in cui non deve entrare aria perché l’ossigeno innesca dei processi metabolici. - Dentro piccole buste a cui si deve togliere l’aria e poi si gira un filo metallico per chiudere la confezione. Dopodiché vengono poste: o in contenitori dymer (apposta per la spedizione del seme ma va rispedito indietro poiché non è usa e getta) che può garantire la conservazione della temperatura anche fino a 72 ore. Solitamente viene utilizzato per spedizioni in posti più lontani, dove vi è il rischio di consegna dopo le 24 ore, in quanto mantiene la temperatura per più tempo. o Di prassi viene spedito dentro le classiche scatole di polistirolo con siberini che resistono al massimo per 48 ore. Però bisogna considerare che la stagione riproduttiva della cavalla va da aprile a luglio, di conseguenza, vi è minore efficacia. Quindi a seconda del contenitore si può conservare per 48-72 ore, però l’ottimale sarebbe utilizzarlo entro le 24 ore dall’arrivo del seme. - La dose è il doppio di quella per il seme fresco: 600 milioni-1 miliardo di spermatozoi, per cui si restringe il numero di fattrici che possono essere coperte nello stesso momento da uno stallone (si riesce a fare circa 10-15 dosi per stallone). - Anche qui MP>60%. - Con il seme refrigerato si utilizza sempre l’induzione dell’ovulazione perché deve avvenire in 24 ore. Dovendo prenotare il seme, che viaggia per 24 ore, bisogna sincronizzare l’ovulazione della cavalla perché si rischia che ovuli prima o che ovuli due giorni dopo l’inseminazione. Per questo la prassi è che il veterinario vede che la cavalla è pronta, induce l’ovulazione e nel momento in cui si induce si avvisa il proprietario di prenotare la dose del materiale seminale. È importante sempre prenotare la dose in concomitanza con la sincronizzazione dell’ovulazione (poiché negli stalloni il seme viene prelevato un giorno sì ed uno no). La maggior parte delle cavalle vengono coperte con il seme refrigerato. - La tecnica e il volume della dose inseminante: non cambiano rispetto al seme fresco. - la percentuale di fertilità per ciclo: si abbassa un po’, si arriva a 40-50% di fertilità, però questi dati considerano molto il fatto che si stringe la finestra di vicinanza all’ovulazione, dipendono anche da come è stata gestita la fattrice (bisogna fare correttamente i calcoli rispetto a quando ovulerà). Il seme fresco perdona di più gli errori di gestione, mentre un seme refrigerato un po’ di meno. SEME CONGELATO Con questa tipologia non occorre che stallone e fattrice siano nello stesso posto e neanche spedizioni. Congelando possiamo averlo direttamente a disposizione. Una dose di seme congelato deve contenere almeno 800 milioni di spermatozoi con almeno un 35% di MP. In realtà gli spermatozoi mobili che si ritrovano in una dose convenzionale di seme congelato sono molto più bassi paragonati al fresco e al refrigerato. - La MP richiesta è >35 %. È più bassa perché ci sono stalloni in cui il materiale seminale non si congela bene e quindi l’elasticità sulla motilità del seme è maggiore. Questi cut-off vi danno una indicazione di cosa dovrebbe essere o non essere commercializzato. Per esempio, una dose con MP 10% non dovrebbe essere commercializzata, però rispetto al bovino non c’è la stessa eticità nella commercializzazione del materiale seminale e quindi spesso si usa comunque. - Il volume della dose inseminante ha un range variabile. In media è 4 ml perché di solito il cavallo si congela con delle classiche concentrazioni di spermatozoi su 200 milioni/ml. Le paillettes nel cavallo esistono da 0,5ml, da 1ml, fino ad arrivare a 4. Per fare 800 milioni, se congelate 200 milioni/ml di spermatozoi, avete bisogno di 4 ml di materiale seminale. Questo è però un volume indicativo: o In alcuni stalloni dovete usare ad esempio 10 paillettes perché il numero di spermatozoi motili dentro una paillette è leggermente più basso e quindi dovete aumentare il volume. o Ci sono altre situazioni in cui vi troverete a inseminare con una sola paillette, ossia 0,5ml. Quando succede di solito non vi mettono realmente 200 milioni di spermatozoi nella paillette perché se uno stallone è fertile anche congelato i commercianti di seme, non essendoci le stesse regole del bovino, “spaccano” la dose. Ad esempio, vi danno solo 100 milioni/ml di spermatozoi. Ciò comporta che il veterinario debba essere bravissimo a monitorare il momento dell’ovulazione e debba andarli a mettere vicino all’ovidotto.  - L’induzione dell’ovulazione è obbligatoria: l’inseminazione deve avvenire dalle 12h prima a 6h dopo l’ovulazione. Ciò comporta visitare la cavalla più spesso. Di solito se inducete si fa il primo controllo alle 24h, passate queste si fanno controlli ogni 6h. - Tecnica: ▪ Nella teoria con i 4ml e la dose completa (come si usava una volta) si può depositare nel corpo dell’utero. ▪ Se vi danno 1 paillette o se la dose viene ridotta e quindi non abbiamo 200 milioni/ml di spermatozoi con motilità 35%, è necessaria l’inseminazione profonda. - Nonostante ciò, ormai quasi tutti vanno in profonda, anche quando volumi e dose ci permetterebbero di lavorare nel corpo dell’utero per ottimizzare. - Fertilità per ciclo 0-45%: dipende da come abbiamo gestito cavalla e dal metodo inseminazione. Lo 0 è per quando sbagliamo momento dell’inseminazione e la cavalla va vuota. Se si lavora con un buon materiale seminale, un 50% di fertilità per ciclo è buona. Ovviamente è diverso che lavorare con fresco o refrigerato. MATURAZIONE FOLLICOLARE Parametri per cui andare a fare induzione dell’ovulazione: - Diametro follicolo: 4-5cm. Palpabile alla mano e visibile in ecografia, ma è relativo. - Diminuizione della tensione della parete follicolare. È normale che vicino all’ovulazione la parete follicolare inizi ad essere più fluttuante. Come gradi di apprezzamento a mano (è importate che la stessa persona segua il ciclo) si parla di follicolo teso, poco fluttuante, fluttuante. Altro parametro che vi indica che vi state avvicinando all’ovulazione è la dolorabilità ovarica. Se palpando la cavalla vi dà un segno di discomfort, per esempio muove i posteriori, gira la testa, mostra una reattività maggiore, allora potrebbe essere un segno. Parametri valutabili in visita ecografica: - Forma: il follicolo vicino all’ovulazione tende ad assumere una forma “a pera” perché la parete è più fluttuante e si deforma, diventando più oblungo. - Spessore della parete: aumenta, si ispessisce. - Ecogenicità del liquido follicolare cambia. Il follicolo pre-ovulatorio può avere qualche spot all’interno. Ciò è dovuto alle cellule della granulosa che si staccano e si osserva un piccolo “sedimento”. - Edema endometriale: quando l’animale si avvicina all’ ovulazione siamo verso la fine del calore. Gli estrogeni ci sono, ma man mano che ci avviciniamo all’ovulazione, calano i livelli e l’edema dell’endometrio diminuisce leggermente (finezza che si apprezza osservando il ciclo della stessa cavalla e non è così evidente per tutte). È importante saper distinguere un edema patologico, dovuto a infiammazione in corso, da un edema fisiologico. TECNICHE NON CONVENZIONALI Il primo “pacchetto” di tecniche non convenzionali comprende l’inseminazione profonda: - IA profonda manuale - IA profonda manuale ecoguidata: è la stessa cosa della precedente solo che si usa l’ecografo per verificare di essere nel punto esatto. In realtà si riesce palpare bene anche a mano e infatti non si usa più. - IA profonda isteroscopica: per quando abbiamo materiale seminale di scarsa qualità o dose inseminante molto bassa. Spruzzo il seme direttamente contro la papilla uterotubarica che visualizzo con la videocamera dello strumento. Esistono tuttavia altre modalità che sono state impiegate nella specie suina ma che di fatto non trovano una applicazione commerciale: - IA intrafollicolare: ha dato scarsissimi risultati. Si inietta il seme dentro al follicolo preovulatorio. È stata provata per seme disponibile in basse quantità ma non ha mai preso piede perché non è molto efficace. - IA oviduttale: deposizione del seme nell’ovidotto, sempre per ottimizzare materiale seminale presente in bassissime dosi. Prevede un approccio chirurgico in quanto bisogna esteriorizzare ovaio e ovidotto. Molto poco usata. - GIFT (Gamet Intra- Fallopian Transfer): Trasferimento di gameti intratubarico. Per un periodo è stato utilizzato in una università del Colorado: si trattava di mettere l’oocita di una donatrice non fertile e il seme, in una cavalla fertile. Si tratta di un trasferimento di entrambi i gameti nell’ovidotto, una sorta di fertilizzazione in vitro fatta però nell’ovido