Hemostase Primaire - 2022-2023 PDF

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Clara GUILLAUME Année universitaire 2022-2023 DFSGP2 HEMOSTASE PRIMAIRE 1. THROMBOCYTES. 1.1 Morphologie. Contraste de phase : au repos ce sont des cellules anucléées et discoïdes avec un diamètre de 2-4µm et un volume de 7-10 fl. Après activation elles deviennent sphériques et émettent des pseudopodes. MGG : au centre on a des granulations et des granulomères. Dans le cytoplasme on retrouve des hyaluromères. Nombre : 150-450 G/L = 150 000-450 000 /µL En microscopie électronique on observe : - La membrane qui s’invagine à l’intérieur. Système canaliculaire ouvert vers l’extérieur « SCOE » : fusion avec les granules puis délivrance du contenu granulaire vers l’extérieur. - Les granulations cytoplasmiques : o Granules α : nombreuses, grande taille. Elles sont le réservoir de protéines destinées à l’hémostase. o Granules denses δ : rares, petite taille. Elles sont le réservoir de principes activateurs (agonistes) : ADP, Ca2+, ATP, sérotonine. - Un système tubulaire dense (STD) qui permet le stockage de Ca2+ intracellulaire (métabolisme plaquettaire) et la synthèse des prostaglandines. - Le cytosquelette sous-membranaire : microtubules, microfilaments, etc qui permettent la contractilité cellulaire. 1.2 Composition. La membrane est composée d’une double couche lipidique asymétrique et de prolongations interne du SCOE. De protéines intrinsèques de membrane ancrées (cytosquelette) qui peuvent se déplacer et se redistribuer vers le SCOE, ou s’enrichir à partir des protéines membranaires de granules α véhiculées par le SCOE. De glycoprotéines de membrane : - Complexe GP Ib-IX-V o GP Ib à Gp IX : récepteur du facteur Willebrand qui permet l’adhésion plaquettaire ➔ lien plaquette- paroi, conditions de cisaillement élevées, liaison quand l’activité canal calcique > l’activation cellulaire. o Gp V : clivée par la thrombine après l’activation cellulaire. - Complexe Gp IIb-IIIa (intégrine α2b, β3) : o 2 états : native, ou réarrangée par le Ca2+ o Etat natif (plaquette au repos) : liaison au facteur Willebrand ➔ étalement plaquettaire (post- adhésion). o Activation par le Ca2+ ➔ changement de structure : nouveau site de fixation dépendant de IIb et de IIIa ; liaison du fibrinogène plasmatique (parfois d’autres protéine adhésives), à motif peptidique Arg- Gly-Asp, « RGD » : fibrinogène, Willebrand, fibronectine ; agrégation plaquettaire. - Gp Ia/IIa (intégrine α2 β1) et Gp VI : récepteurs du collagène (adhésion). - Gp IV : récepteur de la thrombospondine (agrégation) et récepteur du collagène Autres récepteurs : - Récepteurs pour agonistes primaires d’activation plaquettaire à 7 domaines transmembranaires : récepteurs à l’ADP, à la thrombine, au TXA2, à la sérotonine, etc. - Récepteurs de haute affinité pour la thrombopoïétine (c-Mpl) - Récepteur pour Fc des IgG (isoforme Fcγ RIIa) - Récepteur pour l’u-PA - ICAM-2 : interagit avec CD11a/CD18 des leucocytes. Allo-Ag: HLA-I, ABH, lewis, P, MN Granules α : - Protéines spécifiques : facteur plaquettaire 4 (PF4). - Molécules adhésives : fibrinogène, Willebrand, thrombospondine - Facteurs de coagulation : facteur V - Inhibiteurs de la fibrinolyse : PAI-1, antiplasmine - Facteurs de croissance : PDGF (platelet derived growth factor), TGFβ - Facteurs angiogéniques : VEGF, angiostatine  - Membranes des granules α : récepteurss P-sélectine (CD 62P) et Gp IIb/IIIa 2. THROMBOCYTOPOÏESE. Cellule(s) souche(s), progéniteurs : Cf. Hématopoïèse Différentes phases : - Prolifération cellulaire : cellules souches et progéniteurs - Endoréplication de l’ADN (2 à 5 endomitoses nucléaires) : o Précurseurs : mégacaryocytes polyploïdes o 4 stades de précurseurs : MGC I (Mégacaryoblaste), MGC II (Mégacaryocyte basophile), MGC III (Mégacaryocyte granuleux), MGC IV (Mégacaryocyte plaquettogène). - Maturation (MGC II et III) - Libération des cellules matures (MGC IV) : Thrombocytes = plaquettes Le mégacaryocyte est une grande cellule de 20 à 60 µm. Son noyau possède des lobulations progressives et on observe une condensation de la chromatine. Son cytoplasme passe de la basophilie à l’acidophilie. Il y a une membrane de démarcation : dérivée de l’ergastoplasme, en continuité avec l’espace extracellulaire, division du cytoplasme en territoires plaquettaires (granulations). Facteurs de croissance positifs : - Les facteurs non spécifiques sont nombreux : SCF, IL-3, GM-CSF... - Spécifique : Thrombopoïétine (Ex du ligand de c-Mpl). La thrombopoïétine (TPO) : - Découverte : o Homologue oncogène v-MPL : proto-oncogène humain c-Mpl ▪ Présent dans les progéniteurs, les MGC, les plaquettes et l’endothélium ▪ Homologue aux récepteurs des cytokines ▪ Activation de c-Mpl : implication dans la mégacaryocytopoïèse o Ligand de c-Mpl : facteur de croissance de la lignée MGC – plaquette. - TPO sur le chromosome 3, 322 acides aminés, très glycosylé o 50% d’homologie avec l’EPO o Production dans le foie, les reins et la moelle osseuse o Régulation de la production de TPO par la masse des MGC reflétée par la production plaquettaire ▪ TPO se lie à son récepteur plaquettaire (200 par plaquette) ▪ TPO circulante non liée aux plaquettes induit la différenciation, la croissance et la maturation des MGC (TPO libre est la-e reflet de la masse plaquettaire). Les effets de la TPO : - Sur les MGC : o Polyploïdisation, augmentation de la taille des cellules, maturation. o Expression des glycoprotéines de membrane, des granules et des membranes de démarcation permettant la fragmentation du cytoplasme. - Sur les progéniteurs érythroblastiques en synergie avec EPO, stimulation de la croissance et de l’expansion Régulation négative de la mégacaryocytopoïèse : - Inhibition non-spécifique par les produits de libération des cellules immunitaires accessoires : TNF, IFN α et β - Inhibition spécifique : o Produits de libération plaquettaire : PDGF, TGF et FP4. o Inhibition de la prolifération et de la maturation des progéniteurs des MGC et de la maturation des MGC. 3. PHYSIOLOGIE PLAQUETTAIRE. 3.1 Grandes étapes. Activation plaquettaire : 2  - Par un agoniste se liant à son récepteur membranaire spécifique. - Par la liaison d’un récepteur d’adhésion / ligand spécifique : o Lien moléculaire plaquette - surface moléculaire démasquée, ou plaquette - CEV, ou plaquette – leucocyte. o Adhésion plaquettaire puis étalement plaquettaire - Transmission d’information de l’extérieur vers l’intérieur qui permet l’activation cellulaire. Explosion métabolique et conséquences : - Changement de forme grâce aux pseudopodes. - Réarrangement des phospholipides membranaires : activité pro-coagulante plaquettaire et émission de microparticules par bourgeonnement de la membrane. - Contraction : fusion des granules avec SCOE = sécrétion plaquettaire qui permet l’amplification de l’activation et la mise à disposition de molécule adhésives. - Réarrangement du récepteur de l’agrégation Gp IIb IIIa ➔ transmission de l’intérieur vers l’extérieur. Agrégation plaquettaire : lien moléculaire spécifique plaquette activée - plaquette activée, Gp IIb IIIa dépendant. Activation : agoniste/récepteur et/ou molécule adhésive/récepteur spécifique. 3.2 Activation plaquettaire. Ligands circulatoires solubles : - Hormones : Adrénaline, vasopressine, angiotensine II, facteur natriurétique atrial (PAN). - Autacoïdes : ADP (récepteurs : P2Y1, P2Y12), ATP (P2X1) ; eicosanoïdes : TXA2, PGG2, PGH2, PAF, sérotonine. - Enzymes : thrombine IIa (PAR1), plasmine. Molécules adhésives sous l’endothélium : facteur de Willebrand, collagènes, microfibrilles, fibronectine, vitronectine. Inhibiteurs : NO et Autacoïdes (Prostacycline PGI2). 4. DIALOGUE PLAQUETTES-VAISSEAU. Endothélium, plaquettes et tonus vasculaire Système des eicosanoïdes : - Cellules endothéliales vasculaires (CEV) versus plaquettes - Prostaglandines (PG) dérivées de l’acide arachidonique (AA) - CEV : synthèse PGI2, prostacycline : o Relaxation des cellules vasculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire ➔ vasodilatation. o Inhibition de l’adhésion et de l’agrégation plaquettaire. - Plaquettes : synthèse TXA2. o Contraction CML ➔ vasoconstriction. o Renforcement de l’activation plaquettaire. CEV : synthèse PGI2, prostacycline : - A partir des phospholipides membranaires, génération d’AA : o Action des cyclo-oxygénases : COX1 constitutive, sensible à l’AAS COX2 inductible, insensible à l’ASS ➔ Génération d’endo-peroxydes, PGG2 et PGH2, substrats de la PGI2 synthase ➔ génération de PGI2 - PGI2 : action sur les CML et les plaquettes : activation de l’adénylate cyclase et augmentation d’AMPc. Plaquettes : synthèse de TXA2. - Métabolisme très similaire mais quelques variations : n’ont qu’une COX1, non régénérable (pas de noyau) ➔ Endo-peroxydes produits : action d’une TXA2 synthase - TXA2 : action sur les CML et les plaquettes ➔ Inhibition de l’adénylate cyclase et diminution d’ AMPc. Effets de l’AAS : - Acétyle et inhibe irréversiblement la COX1 : o Inhibe la synthèse plaquettaire de TXA2 : pas de noyau dons pas de néosynthèse. 3  o Conserve la synthèse endothéliale de PGI2 dépendante de la COX2 inductible - Effet global antiagrégant plaquettaire mais 30% d’échecs Synthèse transcellulaire d'eicosanoïdes. Apres l’action de l'ASS, seul COX 2 est actif et libère PGI2 : production endo-peroxydes qui diffusent en dehors de l'endothélium puis récupérés par les plaquettes et utilisés pour terminer la synthèse de TX2A. Système du NO : - Synthèse endothéliale : o Nombreux agonistes : biochimiques (Acétylcholine, histamine, thrombine, sérotonine) et physiques (pression, cisaillement, hypoxie). o A partir de la L-arginine du cycle de l’urée : NO synthase (NOS). Isoformes endothéliale, constitutive, inductible. - NO : activation de la Guanylate cyclase soluble ➔ augmentation du GMPc intracellulaire o Au niveau des CML : relaxation, vasodilatation, effet très bref (quelques secondes). o Sur les plaquettes et les leucocytes : inhibition de l’adhésion cellulaire et anti-activation cellulaire. - Action courte et d’adaptation du tonus en temps réel, synergique avec la PGI2. Système EDHF : - Petites artères. - H2O2 permet l’activation du guanylate cycla et ma majoration du GMPc intra-CML ➔ relaxation et vasodilataion. Système des Endothélines (ET). Antagonistes de NO. Rôle d’ET1 : - Peptide synthétisé par l’endothélium de la famille des conotoxines. Précurseurs : o Pré-proET (212 AA), ProET (38AA) puis ET1 (21AA) o Enzymes de conversion de l’endothéline - Sécrétion grâce à de nombreux inducteurs : cisaillement, hypoxie, thrombine, adrénaline, IL-1. Inhibiteurs : PGI2, NO, PAN. - ET1 sécrétée : divers récepteurs dont récepteur de Type A, (ETA) : o CML, fibroblastes, cardiomyocytes ventriculaires o Contraction intense et prolongée (~1 h.) o Effets mitogènes Vasodilatation Vasoconstriction Les ERDF (endothelium derived relaxng factors) : PGI2, Les EDCF (e,dothelium derived contracting factors) : NO, EDHF TXA2, ET1, LTC4 leucocytaire. En cas de dysfonction endothéliale, la première fonction perdue est la sécrétion adaptée de NO : - Perte de la relaxation endothélium-dépendante en réponse à l’acétylcholine/bradykinine et augmentation du flux. - La réponse musculaire lisse directe aux dérivés nitrés persiste. - Parfois il y a une réaction paradoxale à type de vasoconstriction induite par l’acétylcholine. En cas de lésion mécanique de l’endothélium : - Perte de la sécrétion de NO et PGI2, action courte - Persistance de l’action de longue durée de l’ET1 o Induction d’une vasoconstriction si plaie vasculaire pour limiter le saignement et permettre une accumulation locale de plaquettes et de facteurs de coagulation. o Levée de l’effet anti-activation plaquettaire et leucocytaire donc activation des acteurs cellulaires circulants de l’hémostase primaire. 5. INTEGRATION. Deux grandes modalités : - Rupture de la barrière endothéliale ➔ structures moléculaires sous-endothéliales dévoilés (reconnaissance par les récepteurs plaquettaires). 4  - Activation endothéliale sans lésion cellulaire : exposition des motifs moléculaires endothéliaux ou liaison à la membrane de motifs plasmatiques (reconnaissance par les récepteurs plaquettaires) ➔ réaction inflammatoire, sepsis, etc. 6. EXPLORATION DES FONCTIONS PLAQUETTAIRES. Temps de saignement : différentes méthodes - Ivy-trois points, Ivy-incision : avant-bras, contre pression veineuse 40 mm Hg. - Manque de sensibilité et de spécificité. Test de filtration plaquettaire in vitro : Dispositif PFA100 - Cartouches-filtre : collagène + un agoniste (ADP ou adrénaline). - Temps d’occlusion de la cartouche-filtre par plaquettes du sang total anti coagulé envoyé à travers la cartouche. - Détecte les maladies plaquettaires majeures et le déficit en facteur Willebrand. Fonctions pro-coagulantes plaquettaires : permet de savoir si nos plaquettes sont capables d’accueillir les réactions de coagulation. - Consommation de la prothrombine (F II) qui permet la coagulation du sang total. Dosage du facteur II résiduel : o Normal si < 15% o Déficit si pas de coagulopathie et si > 15%. - Etude de l’exposition plaquettaire membranaire des phospholipides électronégatifs par cytométrie de flux o Stimulation par l’agoniste, génération de microparticules o Marquage par l’annexine V fluorescente Plaquettes au repos : la sonde ne se lie pas. Plaquettes actives et PL électronégatifs : la sonde se lie. Agrégation plaquettaire : Plasma riche en plaquettes prélevé sur citrate - Injection d’un agoniste : ADP, collagène, AA, ristocétine, adrénaline, etc. - Enregistrement des variations de transmission lumineuse à travers l’échantillon o Phase initiale paradoxale de diminution de transmission = changement de forme plaquettaire. o Puis augmentation de transmission = création des agrégats plaquettaires. Marquage immunologique des principaux récepteurs plaquettaires par cytométrie de flux qualitatif et quantitatif. Protéines adhésives circulantes. - Fibrinogène - Facteur Willebrand VWF : o Présence physique : utilisation Ac, donc antigène : VWF Ag (ELISA, etc.) o Fonctionnel : ▪ Cofacteur de la ristocétine : VWF Rco ▪ Liaison au collagène : VWF CB ▪ Transport du FVIII, facteur anti-hémophilique A : VWF FVIIIB 5