CM4 : Introduction aux maladies génomiques PDF

RF Clara Schmitt RF Solène Kygo CM4 : Introduction aux maladies génomiques Plan I. Quelques définitions II. Pathologies chromosomiques III. Pathologies géniques IV. Exemple d’étude d’un variant génomique détecté par Whole Génome sequencing I....

RF Clara Schmitt RF Solène Kygo CM4 : Introduction aux maladies génomiques Plan I. Quelques définitions II. Pathologies chromosomiques III. Pathologies géniques IV. Exemple d’étude d’un variant génomique détecté par Whole Génome sequencing I. Quelques définitions Les maladies génétiques regroupent les pathologies qui résultent d’une altération des gènes. Elles font partie des maladies rares c'est-à-dire des maladies qui atteignent moins d’une personne sur 2 000 soit, pour la France, moins de 30 000 personnes malades par pathologie. On estime qu’environ 80% des maladies rares sont d’origine génétique. Remarque : la trisomie 21 n’est pas une maladie rare (1/700 naissances). En France, les maladies rares représentent un enjeu de santé publique car les 8 000 maladies rares identifiées à ce jour atteignent plus de 3 millions de personnes soit 4,5% de la population. Elles concernent dans la moitié des cas des enfants de moins de 5 ans et sont responsables de 10% des décès entre 1 et 5 ans. 10% des maladies monogéniques ne sont découverte qu’à l’âge adulte. Les maladies rares font l’objet de Plans Nationaux Maladies Rares : - PNMR1 (2005-2008) - PNMR2 (2011-2015) - PNMR3 (2018-2022) Ces plans nationaux permettent d’effectuer des actions spécifiques au niveau européen. Un grand nombre de ces maladies font également partie des maladies orphelines c’est-à-dire des maladies pour lesquelles il n’y a pas de traitement. présente dans le zygote: c'est-à-dire au tout début de la fécondation. Cette anomalie est donc présente dans toutes les cellules de l'organisme, y compris A. Les maladies génétiques dans les cellules reproductrices (gamètes). Cela implique que la mutation est transmise à toute la descendance et affecte l'intégralité du corps. Il existe 6 grands types de maladies génétiques : - Constitutionnelles : présentes dans le zygote et dans toutes les cellules de l’organisme - Homogènes ou en mosaïques (il existe une ou plusieurs populations cellulaires avec une anomalie chromosomique survenue dans les premières divisions embryonnaires) - Létales avant la naissance - Congénitales : présentes à la naissance (mais toutes ne sont pas d’origine génétique : ex la rubéole) - D’apparition après la naissance (ex : Maladie de Huttington) - Acquises : qui se produit plus tard dans les cellules qui ont muté et ont acquis un avantage, prolifèrent et se transforment en cancer  B. Classification des maladies génétiques - Maladies héréditaires à transmission mendélienne : maladies dont l’apparition est conditionnée par la mutation d’un seul gène situé dans le noyau. On parle également d’ « hérédité monogénique nucléaire ». - Maladies par aberration chromosomique : maladies dues à une anomalie de nombre ou de structure des chromosomes. - Maladies mitochondriales (cytopathies mitochondriales) : maladies dues à une mutation du génome mitochondrial et dont l’hérédité est maternelle. Il est à noter que des cytopathies mitochondriales peuvent être la conséquence de mutations du génome nucléaire. La transmission est alors mendélienne C. Pathologies génétiques : anomalies chromosomiques et/ou génétiques Anomalies chromosomiques : correspond à un gain ou une perte de tout un chromosome, d’un segment chromosomique contenant un ou plusieurs gènes (taille > 50bp) ou à un repositionnement de segment chromosomique à l’intérieur d’un chromosome ou entre plusieurs chromosomes. Point de cassure : translocation/délétion, inversion, insertion Anomalie génique : mutation ou insertion/délétion de moins de 50pb La modification de l’expression des gènes peut avoir des conséquences pathologiques 2  II. Pathologies chromosomiques Il existe deux types d’anomalies : - Les anomalies de nombres - Les anomalies de structures o Ségrégation méiotique d’une translocation équilibrée o Microremaniements Il existe d’autres anomalies de structures mais on va étudier que ces 2 la dans le cours ! A. Les anomalies de nombre des chromosomes : pathologie de la mitose et de la méiose Définitions - Ploïdie : 23 chromosomes = n - Diploïdie : 2n = 46 chromosomes - Aneuploïdie : 2n +/- a (avec a = nombre de chromosomes) o 47, XX, +21 : trisomie 21 (47 = 2n+1 donc a=1, on a 1 chromosome en plus) o 45, X : monosomie X (45 = 2n-1 donc on il manque 1 chromosome) - Polypoloïdie : multiple de n> (a)n o Hyperploïdie / Hypoploïdie : pathologie de la fécondation Pathologie de la mitose À CHAQUE DIVISION CELLULAIRE La répartition du matériel génétique doit se faire à l’identique entre les deux cellules filles Le point de départ est le début de phase S S’il y a des problèmes au niveau de la mitose, cela peut aboutir à des cancers ou des anomalies chromosomiques dans les embryons avant l’implantation. Dans des lignées cellulaires, il y a la perte d’un chromosome toutes les 250 à 20.000 divisions Ségrégation des chromosomes La ségrégation des chromosomes consiste à séparer les deux chromatides sœurs pendant la mitose. Pendant l’anaphase, les 2 chromatides sœurs vont se séparer pour former 2 cellules filles identiques. Le dernier point de contrôle du cycle cellulaire (Spindle Checkpoint) se déroule pendant la métaphase. Il permet de vérifier le bon alignement des chromosomes sur la plaque métaphasique afin d’éviter des anomalies de nombres dans la cellule fille. 3 Rappel sur les points de contrôle de la mitose Il y a 3 points de contrôle pendant la mitose qui permettent de s’assurer du bon déroulement de la synthèse à la division. - Le 1er point de contrôle est au début du cycle mitotique, entre la phase G1 et S - Le 2ème point est en G2, il vérifie la phase S et empêche le passage en mitose s’il y a des anomalies (cassures du brin…) - Le 3ème point de contrôle correspond au Spindle Checkpoint : il est situé pendant la mitose entre la métaphase et l’anaphase. Il s’assure que tous les chromosomes sont bien attachés au fuseau mitotique sur la plaque métaphasique avant la séparation des chromatides Anomalies de la mitose Schéma des différentes anomalies de nombre possible avec la mitose Instabilités chromosomiques dans les premières mitoses embryonnaires et mosaïques embryonnaires Pour rappel, la cellule-œuf passe du stade de zygote, à morula puis au blastocyte à J6 qui va pouvoir s’implanter à la membrane de l’utérus. Comment le génome du zygote de s’active qu’à J3, il va utiliser dans les premières divisions les protéines maternelles mais elles ne sont pas assez puissantes pour que les checkpoints soient efficaces. Il y a donc une instabilité génétique dans 90% des cas ! On va alors avoir un embryon mosaïque dû aux anomalies de la ségrégation chromosomiques dans les mitoses 1, 2 et 3, il est composé d’échantillons chromosomiques différents Différents types de mosaïques embryonnaire - 15% mosaïque aneuploïdique - 50% des cas : mélange de cellules normales et de cellules aneuploïdes - trisomie après la fécondation N = Nullosomie pour la paire chromosomique concernée => monotonie après la fécondation H = Haploïdie => cellule normale après fécondation Les anomalies de la méiose maternelle sont importantes : Elles concernent 20% à 25% des ovocytes (1- 2% chez la souris et 1/10000 chez la levure) et augmentent avec l’âge maternel. Elles sont non mosaïques. Les chromosomes particulièrement touchés sont les numéros 15, 16, 21 et 22 et les gonosomes. Les anomalies de la méiose maternelle ont pour conséquences des fausses-couches précoces (représente 75% des Fausses couches précoces). En additionnant les anomalies méiotiques et les anomalies mitotiques des premières divisions mitotiques, on n’obtient que 25% de grossesses par zygote conçu. Le pouvoir reproductif des humains est donc faible. Fréquence des anomalies de nombre de chromosomes à la naissance DI = déficit intellectuel 5  B. Les anomalies de structure Les anomalies de structures sont liées à des cassures double brins dans le génome. Ces cassures de l’ADN sont liées à différents types de stress comme le stress génotoxique, les radiations, les substances chimiques, le stress oxydatif (dérivés réactifs à l’oxygène (ROS) toxique pour l’ADN). Chaque jour, 2x104 atteintes de l’ADN surviennent chez un individu à cause des ROS et environ 10 cassures doubles brins par cellule !!! Les anomalies de structures peuvent être : - Déséquilibrée : gains ou pertes génomiques (délétions, duplications, amplification…) - Equilibrée : pas de perte chromosomique (en général, n’entraine pas de phénotype) mais attention aux pathologies des points de cassures - Non récurrente (le plus souvent dans les pathologies constitutionnelles) - Récurrentes : liées à des structures particulières de l’ADN ou à un avantage prolifératif dans les cancers Les anomalies de structures sont détectables au microscope (>5Mb) ou microremaniements Les différentes techniques pour visualiser les anomalies de structure Le caryotype - Cellulaire - Microscope - Limites o Résolution : 5 à 10 Mb o Nécessité d’avoir des mitose o Examen morphologique o Pas de rapport phénotype - génotype moléculaire FISH : Hybridation in situ CGH - Cellulaire array - Résolution de la taille d’une sonde >20 kb - Limites : Étude non globale du génome CGH array - Examen d’étude globale du génome - Automatisable : étude en population - Rapport Phénotype - Génotype moléculaire - Détection de CNV (SV déséquilibrées) - Limites : Non détection d’anomalies équilibrées et Mosaïcisme (limite 15% d’anomalies) Whole Genome Sequencing - Examen d’étude globale du génome - Plan France Médecine Génomique 2025 - Automatisée : étude en population - Rapport Phénotype - Génotype moléculaire - Détection de tous les SV - Limites : Mosaïcisme (limite 15% d’anomalies) 6 Ces remaniements peuvent inclure des délétions, des duplications ou des réarrangements génétiques à l'échelle moléculaire.ces modifications infra-microscopiques peuvent causer des dysfonctionnements génétiques, interrompant des gènes ou affectant leur régulation. Ségrégation méiotique d’une anomalie équilibrée, l’exemple des translocations : 1/3 des couples ont une anomalie chromosomique équilibrée, les anomalies chromosomiques les plus courantes sont les translocations. Les translocation réciproques correspondent à l’échange de fragments de chromatides entre chromosomes non homologues. Elles peuvent être équilibrées ou s’accompagner de remaniements infra - microscopiques au niveau des points de cassure. Le plus souvent le point de cassure survient dans une zone non codante (> 95% du génome) et donc dans la très grande majorité des cas, elles ne génèrent pas de phénotype. Elles peuvent avoir des conséquences en pathologie constitutionnelles : 1 individu sans phénotype de RM et de malformation congénitale sur 500-600 est porteur d’une translocation équilibrée Un exemple de translocation réciproque est t(10;17)(q26;p11.2), un « échange » entre un bout du chromosome 10 et 17. Dans notre exemple des translocation, on étudie le diagramme quadrivalent des ségrégations au moment du pachytène (troisième stade de la prophase de la première division de la méiose). Pour permettre cet appariement, les quatre chromosomes forment une structure en "quadrivalent" afin de maximiser les zones homologues qui s'alignent. Les différentes possibilités de ségrégation alterne Ségrégation alterne Ségrégation adjacente 1 Ségrégation adjacente 2 Ségrégation 3/1 On va obtenir des Pour le lot 1, on va obtenir une Pour le lot 1, on va obtenir une Il y a un déséquilibre gamètes trisomie A et une monosomie B trisomie C et une monosomie D important normales/équilibrées Pour le lot 2, on aura une Pour le lot 2, on aura une Il existe 4 configurations trisomie B et une monosomie A trisomie D et une monosomie C possibles Il y a un déséquilibre dans les Le déséquilibre porte sur les fragments transloqués segments concentriques S’il y a des déséquilibres différents, on va obtenir des phénotypes différents 7 Etude des phénotypes différents avec un arbre généalogique On peut voir sur l’arbre généalogique qu’une maladie se transmet dans la famille mais avec des phénotypes différents (caractérisée par les carrés remplis avec différentes couleurs) Cela évoque une maladie chromosomique due à une translocation réciproque avec une ségrégation. Les microremaniements récurrents Les microremaniements présentent une taille inférieure à 5 MB, ils ne sont donc pas visibles au caryotypes. On parle de microremaniements récurrents pour les anomalies dont la fréquence est plus élevée que ne le voudrait le hasard. Ces anomalies sont médiées par l’existence de séquences ou de structures particulières de l’ADN comme les translocations Robertsoniennes, les translocations liées aux séquences palindromiques ou autres et les microremaniements liés à l’existence des duplications segmentaires Rappel sur les duplications segmentaires ou low copy repeats La taille des duplications segmentaire varie entre 1 à 400 kb et elles présentent 97% d’identité. Elles sont présentes dans les gènes, dans des clusters de gènes, des pseudo-gènes, des séquences rétro-virales et autres. On les retrouve localisées près des centromères et des télomères. Les duplications segmentaires ont accompagné l’évolution de l’Homme. Elles participent à notre diversité MAIS elles peuvent avoir un impact négatif sur notre phénotype. Le taux d’expression des gènes dans les duplications segmentaires différents pour les gènes situés dans les duplicons. 8  Les conséquences des duplications segmentaires en méiose Lors de la méiose, il va y avoir un appariement et une recombinaison allélique entre les chromatides. Les microremaniements peuvent entrainer des délétion et de duplication à cause des duplications segmentaires. Comme les séquences sont quasiment identiques, elles vont s’apparier mais pas au bon endroit. On va avoir un appariement et une recombinaison homologue non allélique (NAHR). Cela aboutira donc à une recombinaison qui ne sera pas équilibrée (2 allèles b sur la 1ère chromatide et pas d’allèle b dans la 2ème) Un exemple de ce phénomène est le syndrome de DiGeorge avec des délétion et des insertions. III. Pathologies géniques A. Pathologies du génome nucléaire Définitions Homozygotes : les individus portent sur les deux chromosomes homologues le même allèle. Hétérozygotes : les individus portent sur les deux chromosomes homologues deux allèles différents Hétérozygote et Hémizygote : Pour les locus portés par le chromosome X, seules les femmes sont hétérozygotes, les hommes étant hémizygotes. Hétérozygote composite : individu qui porte à un locus donné deux allèles différents et différents de l’allèle « normal » ou « sauvage » Double hétérozygote : individu qui porte à deux locus différents deux allèles différents Hété composite : C'est une personne qui, pour un gène donné (un locus), possède deux versions différentes (allèles) de ce gène. Mais, contrairement à l'état classique, ces deux allèles sont tous deux anormaux ou mutés, donc différents de la version « normale » ou « sauvage. pour un gène précis, l'allèle « normal » est absent, et la personne a deux mutations différentes à ce même endroit. Mode d’hérédité autosomique récessif Il faut avoir les 2 copies du gène portant le même allèle pour que la personne soit malade. Il y a donc 3 possibilités - 1 homozygote indemne (aucune allèle malade) : ¼ - 2 hétérozygotes indemne mais porteur (porte 1 allèle) : ½ - 1 homozygote atteint, il est malade Ex : la drépanocytose, il faut avoir les deux allèles pour être Hétérozygote double Définition : C'est une personne qui a deux gènes (ou locus) différents et qui possède pour chacun deux allèles différents, donc deux variantes pour chaque gène. 9 (une du Explication : Cela signifie que, sur deux gènes distincts, la personne ne possède pas les deux copies identiques père et une de la mère), mais plutôt des versions différente malade, avoir 1 seul allèle protège du paludisme. Mode d’hérédité autosomique dominant Il suffit d’une seule allèle pour être malade Le risque d’être malade est donc de 50% Ex : Neurofibromatose de type 1 Les maladies autosomiques dominantes peuvent entrainer différents types de phénotypes avec une expression variable de la maladie. Il existe des variabilités inter-familiale, intra-familiale ou les 2 La pénétrance est le rapport de probabilité du phénotype sur le génotype. En fonction des maladie, la pénétrance peut être plus ou moins importante Si la pénétrance est de 100%, l’individu sera malade. Cependant, si la pénétrance est plus faible, l’individu pourra être sain malgré le fait qu’il porte l’allèle malade ou avoir une forme nuancée. La pénétrance incomplète peut entrainer des sauts de génération de la maladie puisqu’elle ne s’exprime pas toujours de manière visible et forte. L’évaluation de la pénétrance dépend des moyens que l’on se donne pour la mener et de l’âge auquel on l’étudie Mode d’hérédité liée au chromosome X Exemple de la myopathie de Duchenne de Boulogne/Hémophilies : C’est une mutation qui est portée par le chromosome X Elle va etre transmise par la mère (pas malade) à son fils qui va lui etre malade car il n’a qu’un seul X. Dépistage des femmes conductrices 1/ Analyse extensive de l’arbre généalogique 2/ Recherche de signes cliniques mineurs (cf. inactivation de l’X) 3/ Recherche de signes biologiques mineurs (CPK, Facteur VIII,..) 4/ Analyse de génétique moléculaire (inactivation du chromosome X) B. Pathologies du génome mitochondrial L’ADN mitochondriale présente une taille de 16,5 kb et il y a entre 5 et 10 copies d’ADN Mt par mitochondries. Comme il y a entre 500 à 1000 mitochondries par cellules, on estime qu’il y a 5000 copies d’ADN par cellule. L’ADN mitochondrial code pour 37 gènes dont les 13 protéines de la chaine respiratoire (le reste, environ 500 est codé par l’ADN nucléaire) Le code génétique pour l’ADN mitochondriale est légèrement différent de celui de l’ADN nucléaire (4 codons interprétés différemment) et il y a une structure différente car il n’y a pas d’intron et de séquences répétées. 10 Rappels sur la chaine respiratoire Les différents complexes : 1. Complexe 1 : NADH réductase 2. Complexe 2 : Succinate -Q reductase 3. Complexe 3 : Ubiquinol/ cytochrome c. réductase 4. Complexe 4 : Cytochrome C Oxydase 5. ATP synthase Certaines pathologies sont liées à l’ADN mitochondrial : l’arbre généalogique est très différent puisque les mitochondries ne sont transmises que par la mère. Les cytopathies mitochondriales vont se refléter sur les organes qui consomment beaucoup comme les muscles ou le cerveau. Lors de la mitose, le nombre de mitochondries « malades » ne sera pas forcément séparée équitablement entre chaque cellule. Certaines cellules auront plus de mitochondries « malades » que d’autres. Dans le cas d’une cytopathie mitochondriale cela peut mener à une hétéroplasmie. Présentation clinique des cytopathies mitochondriales 1) Association inexpliquée de signes 2) À début précoce 3) D’évolutivité progressive 4) Impliquant des organes apparemment dénués de liens : - Embryologiques ou anatomiques - Fonctionnels Comment connaitre la présence d’une cytopathie mitochondriale ? 1/ Investigation métabolique in vivo : lactate, pyruvate, corps cétoniques rapport redox cytoplasmiques et mitochondriaux enzymologie 2/ Étude ADN Stratégies d’études devant la découverte d’un variant génomique 11  IV. Exemple d’étude d’un variant génomique détecté par Whole Génome sequencing A. Variations nucléotidiques : SNV Les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) n’ont pas d’effet phénotypique et le MAF (Minor Allele frequence) est supérieur à 1%. Chaque personne a environ 4 millions de SNPs par rapport à un génome de référence et il y en a environ 1 tous les 4,8 paires de bases Il existe une base de données : https://gnomad.broadinstitute.org/ à partir de 15,708 génomes de témoins Certaines fréquences alléliques peuvent être spécifiques de groupes ethniques B. Variations structurales : SN Il y a des variations structurales dues : - Aux CNV, ce sont des variations du nombres de copies. - des délétion, des duplications, CNV à allèles multiples (MCNV) - Insertions - Inversions - Translocations - Complexes Il y a environ 250 000 SV détectés - 3505 délétions, 220 MCNV - 723 duplications, 328 MCNV - 2612 insertions (Alu, LINE1) - 14 inversions - 37 translocations C. Variations de séquences d’ADN : polymorphisme, variant rare ou mutation ? Comment savoir à quoi correspond cette variation : 1/ Arguments « bio-informatiques » : bases de données, HGMD, … 2/ Arguments moléculaires : Nature et situation : mutations « tronquantes » Vs. faux-sens Logiciels de prédiction 3/ Arguments génétiques : - Ségrégation familiale - Variation de novo ou héritée - Étude de témoins 4/ Argument de génomique comparative et conservation (phylogénie) : - Conservation entre espèces / dans une famille protéique 5/ Arguments fonctionnels in vitro : Tests fonctionnels : transcrit, tests cellulaire, biochimique, immunologique,... 12 6/ Arguments fonctionnels in vivo : Modèle animal (spontané ou expérimental)  Le prof s’est arrêté diapo 85, il n’a pas fait la partie sur le whole génome sequencing QUESTIONS Q1. Quels sont les 6 grands types de maladies génétiques ? Q2. Enoncez les différentes techniques pour visualiser les anomalies de structure Q3. Quelle est la différence entre le mode d’hérédité autosomique récessif et le mode d’hérédité autosomique dominant ? Q4. Cocher la ou les réponse(s) exacte(s) A. Les maladies dont l’apparition est conditionnée par la mutation d’un seul gène situé dans le noyau sont des maladies par aberration chromosomique. B. Les maladies dues à une mutation du génome mitochondrial sont toujours des maladies héréditaires à transmission mendélienne. C. Une anomalie génique est une mutation ou insertion/délétion de moins de 50pb. D. Les anomalies de nombre des chromosomes sont des pathologies qui concernent la mitose et la méiose. Q5. Cocher la ou les réponse(s) exacte(s) A. L’absence de disjonction méiotique en MI entraine une non séparation des chromosomes homologues. B. L’absence de disjonction méiotique en MII entraine une disomie et une nullosomie. C. Malgré les anomalies méiotiques et les anomalies mitotiques des premières divisions mitotique, le pouvoir reproductif des humains est reste très fort. D. Les anomalies de structures sont liées à des cassures simple brin dans le génome. Q6. Cocher la ou les réponse(s) exacte(s) A. Le code génétique pour l’ADN mitochondriale est identique à celui de l’ADN nucléaire. B. les mitochondries ne sont transmises que par la mère. C. On peut reconnaitre la présence d’une cytopathie mitochondriale grâce à une investigation métabolique in vivo ou une étude de l’ADN. D. Lorsqu’on a une SNP (Single Nucleotide Polymorphism), on a forcément une pathologie associée. 13  Réponses : Q1. Les 6 grands types de maladies génétiques - Constitutionnelles - Homogènes ou en mosaïques - Létales avant la naissance - Congénitales - D’apparition après la naissance - Acquises Q2. Les différentes techniques pour visualiser les anomalies de structure - Le caryotype - FISH : Hybridation in situ - CCG array - Le Whole genome sequencing Q3. Dans le mode d’hérédité autosomique récessif, Il faut avoir les 2 copies du gène portant le même allèle pour que la personne soit malade, tandis que dans le mode d’hérédité autosomique dominant Il suffit d’un seul allèle pour être malade ; le risque d’être malade est donc de 50% Q4. Cocher la ou les réponse(s) exacte(s) A FAUX - Ici il ne faut pas confondre : Les maladies dont l’apparition est conditionnée par la mutation d’un seul gène situé dans le noyau sont des maladies héréditaires à transmission mendélienne B FAUX – les maladies dues à une mutation du génome mitochondrial sont des maladies héréditaires à transmission mendélienne uniquement lorsqu’elles sont la conséquence de mutations du génome nucléaire. C VRAI D VRAI Q5. Cocher la ou les réponse(s) exacte(s) A VRAI B VRAI C FAUX - Le pouvoir reproductif des humains est faible car si on additionne les anomalies méiotiques aux anomalies mitotiques des premières divisions mitotiques, on n’obtient que 25% de grossesses par zygote conçu. D FAUX - Les anomalies de structures sont liées à des cassures double brins dans le génome. 14 Q6. Cocher la ou les réponse(s) exacte(s) A FAUX - Le code génétique pour l’ADN mitochondriale est légèrement différent de celui de l’ADN nucléaire (4 codons interprétés différemment) et il y a une structure différente car il n’y a pas d’intron et de séquences répétées. B VRAI C VRAI D FAUX - Les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) n’ont pas d’effet phénotypique et le MAF (Minor Allele frequence) est supérieur à 1%. Chaque personne a environ 4 millions de SNPs par rapport à un génome de référence 15