Lipid Nanoparticle Characterization Methods PDF

1) Introduction - 수용성 코어가 있는 submicron 캡슐 (ex. Liposome) - 지질층으로 둘러싸여 안정화된 고체 또는 비정질 (amorphous) 코어 (ex) doxil: 항암 치료 림포좀 / Onpattro: siRNA 전달 -> FDA 승인 인지질의 머리 성분: PA, PG, PE, PC 등으로 나뉨 - 체내 pH: PA, PS, PG 음...

1) Introduction - 수용성 코어가 있는 submicron 캡슐 (ex. Liposome) - 지질층으로 둘러싸여 안정화된 고체 또는 비정질 (amorphous) 코어 (ex) doxil: 항암 치료 림포좀 / Onpattro: siRNA 전달 -> FDA 승인 인지질의 머리 성분: PA, PG, PE, PC 등으로 나뉨 - 체내 pH: PA, PS, PG 음성 / PC, PE 중성 인지질 꼬리 성분: alkene이 존재하면 고체에서 액체로의 전이 온도 낮아져 불포화지질이 리포솜 형성 촉진 음전하 띠는 RNA, DNA: 인산염 그룹이 없는 합성 양이온성 지질과 복합화 (ex) DMG-PEG / Dlin-MC3-DMA 3. 크기와 구조 SUV (small unilamellar vesicles): 20-50nm / 체내 특정 조직에 쉽 게 흡수되며 짧은 시간 동안 약물 전달 유리 LUV (Large unilamellar vesicle): 100nm 이상, 리포솜 제형 MLV (Multilamellar vesicle): 캡슐화 내용물을 외부 환경 보호 MV (multivesicular vesicle) 마이크론 크기. 국소 진통용 마취제 등 전달 GUV (giant unilamellar vesicle): 세포 모방 모델 시스템으로 사용 4. 해결해야 할 과제 장점: 안정성과 효율적인 약물 전달 단점: 복잡한 물리화학적 특징과 제조 과정 FDA에 400개 리포솜 의약물 분석 - 품질 문제 중 47% 리포솜 특정된 것 - 41% 제품 사양 / 27% 지질 구성체와 의약품 품질 문제 2018년 FDA에서 산업 지침 발행 및 CQA (critical quality attributes) - 지질 종의 식별 및 정량화 - API: 총 API의 정량화 - 나노 입자: 형태, 구조, 입자 크기 분포 등으로 특성화 - 안정성: 물리적, 화학적 안정성 - 약물 방출: 시험관 내 동력학 2) Identification and quantification of lipid species: NMR, MS, Raman, TLC 등 2.1. Identification of lipid molecules - - - Mass spectrometry - - - Raman spectrometry - - - - 2.2. Lipid quantification by chromatography approaches 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC) 얇은막 크로마토그래피 (TLC) - - 기체 크로마토그래피 (GC) - - 2.3. Lipid quantification by colorimetric and fluorometric assays Colorimetric 방법 - Fluorometric 방법 - - 3) Quantification of drug encapsulation: RP-HPLC, CE, FFF (AF4) 방법 1. REV (Reverse-Phase Evaporation, 역상 증발) 2. Remote Loading Method (원격 로딩 방법) 3. 캡슐화되지 않은 약물 정량 - 펌프로 압력을 줘서 이동상 움직이게 함 Liquid sample을 지나게 하고 detecting 진행 고체상 추출 (SPE, Solid phase extraction) 사용 목적: SPE: RAM column 사용 (methylcellulose가 고정된 octadecylsilylated silica) -> 저분자 잡아두지만 고분자나 리포솜 제외 Doxil: 리포좀 약물 / DOX: 독소루비신 / I=Injection, P=pump, D=detector, V=Valve (아래 그림에서) 3.2. Capillary electrophoresis (CE, 모세관 전기영동) 3.3. Field-flow fractionation (FFF) FFF: FFF의 구조 - 적절한 membrane 소재와 MWCO (molecular weight cutoff) MWCO: 최적화 과정 (알고리즘) 다른 기술과의 사용 Semi-preparative AF4 + HPLC-UV-CAD → AF4+LC-MS → AF4+MALS, DLS 𝑅𝑔 𝑅ℎ 𝑅𝑔 /𝑅ℎ 4.1. Nanoparticle morphology identified by microscope techniques: TEM, SEM, AFM TEM (투과 전자 현미경, transmission electron microscopy) SEM (주사 전자 현미경, Scanning electron microscopy) ESEM (환경 SEM) AFM (Atomic force microscopy) -> 옆의 사진 4.2. Nanoparticle lamellarity: NMR, SAXS&SANS, 현미경 31P-NMR 4.3. Nanoparticle size determined by light scattering techniques: DLS, NTA, TRPS 등 1. DLS (동적 광산란, Dynamic Light Scattering) - - - ⚫ ⚫ ⚫ - - - - - - - -  - 4.4. Nanoparticle size measured by size exclusion chromatography (SEC) 소재 - - - - - - - - - - 4.5. Nanoparticle surface charge (zeta potential) = PALS Nanoparticle surface charge - - - PALS (Phase analysis light scattering) - -  제타 포텐셜과 리포좀 - - - - 4장 요약: Lipid nanoparticle (LNP) 특징을 아는 것이 약물 전달 시스템에 필수적임 5) Stability: Lipid nanoparticle formulation 안정성 측면 5.1. Physical stability: DSC, 현미경 등 3. 현미경 기법으로 시각화: cryo-TEM 4. DLS나 UV-vis spectroscopy - 5.2. Chemical stability: RP-HPLC, TLC 등 :    산화:   분석 기법 RP-HPLC (역상 HPLC) + ELSD (Evaporative light scattering detection)    TLC    LC-MS (liquid chromatography-Mass spectrometry) 7) Summary = 앞에 언급했던 기술들 장단점 정리된 표 / 논문에 표 있는데 일단 발표에 언급된 내용만 정리 Analytical Mechanism Advantages Challenges techniques 31-P NMR 인지질 낮은 민감도 구분 가능 비싼 기기 제한된 on-line 1H-, 13C-, detection and 31P-NMR 두 가지 NMR 기법을 2차원적 분석 – mixture 구성 : 원하는 인지질의 구성, 조성을 알 수 있음 높은 민감도 시료 내 불순물 및 지질 구조의 보존 배경 성분 간섭 가능 크로마토그래피와 결 사용 가능 용매 범위 합 가능 제한 ESI-MS ESI-MS (좌), MALDI-TOF (우) ESI: MS 분석을 하기 전 전하를 걸어주는 방법. 모세관에서 고전압 을 걸어주면 용매가 에어로졸로 방출 -> 용매가 방울 형태로 나오며 전하가 부여 -> 용매가 증발되며 남은 입자에 전하 밀도 증가 MALDI-TOF: 레이저를 통해 이온화를 시켜서 MS에 넣음 -> MALDI-TOF: 큰 질량의 분석에 한계가 있음 -> ESI-MS: 다중 이온 만들 수 있어 큰 전하, 질량 가능 에너지 조사했을 때, 조사된 빛보다 라벨이 필요 없음 순수한 지질 성분 스 작거나 더 큰 에너지의 빛이 방출 단일 입자 분석 가능 펙트럼 미리 알고 있 -> 분자 간의 결합 에너지의 진동 샘플의 상태 (고체 어야 가능 Raman 에너지에 따라 에너지가 방출됨 등) 상관 없이 분석 지질 아닌 성분 간섭 Spectrometry -> 구조 분석 가능 가능 가능 분자의 병진, 회전에 의한 스펙트럼 얻기 어려움  리포좀 내 DNA가 들어 있는 경우 : DNA와 DORMA lipid 분석해서 리포좀의 크기와 DNA 확인 가능 다양한 컬럼을 사용 높은 압력 하에서 입 해 고해상도로 물질 자 파괴될 수 있음 분리 및 정량화 고가의 장비 필요 미봉입 약물, 봉입 약 RP-HPLC 물 동시에 분리 및 정량화 높은 효율성 좌: 리포좀 내 각 성분 검출 우: 봉입된 약물의 정량화 높은 민감도 각 지질 성분에 대해 HTS 가능 비특이적 높은 정량화 정확도 별도의 기질 및 시약 요구 Colorimetric, fluorometric 좌: 인산의 양에 따른 발광 밀도 (인산+실험 물질 -> 파란색) 우: 지질의 종류 및 농도에 따른 DPH 형광 자유 약물의 분리 및 캡슐화 효율성 정량화 (3.) 나노 입자를 온전히 중성 입자 분석의 어 보존 가능 려움 입자 크기와 전하를 재현성을 확보하기 CE 동시에 측정 가능 위한 실험 조건 최적 화의 어려움 전하를 띤 나노 입자와 유리된 약물이 크기와 전하에 따라 분리 나노 입자를 온전히 시간이 오래 걸림 보존 가능 실험에 관여하는 전통적 크로마토그래피 별도의 컬럼 사용 X parameter 많아 방 한계점 극복 DLS 등 Mw와 크기 법론 개발이 복잡 AF4 1. 높은 전단력으로 인 분석 가능 한 손상 -> 확산 2. 고정상에 시료 흡착 -> 고정상 없음 해상도가 매우 높음 Direct visualization 시료 준비 복잡성 A: 원시 이미지 신호 크기 분포 분석 B: 필터 적용: FFT (Fast Fourier 고해상도의 입자 구 Transform) 및 여러 필터를 통한 노이즈 조 분석 가능 Microscopy 최소화 및 신호 증폭 technique C: 세분화: MATLAB 이용한 나노 입자 식별 D: 입자 경계 검토 E: 세분화 마스크 생성: 최종 경계 결정 F: 입자 식별 및 데이터 출력: 형태, 크기  paramagnetic 높은 민감도 특수 probe 필요 이온과 결합 시 정량적 분석 (다층) 용매와 probe 농도 외부 인지질에서 영향 정량화 낮음 31P-NMR 나오는 신호 확인 빠른 Complexation 지질 층 사이에서 아 및 형광 quenching 미노 지질 또는 형광 1. TNBS: 외부/전체 아미노 지질과 결합할 때 흡광도 증가 반응 표지 지질의 균일한 분광 방법 2. 막 비투과성 Sodium Dithionite: 외부/전체 NBD 표지 지질의 형 간편한 정량화, 동역 분포 필요 광 감소 학 분석 탁도 및 빛 산란에 적은 양의 표지 지질 의한 간섭 방지 로 강력한 정량화 빠르고 간단한 측정 입자가 구형임을 가 자동화 및 HTS 가능 정 큰 입자나 응집체에 용매 특성이나 온도 도 예민하므로 물리 영향 DLS 적 안정성 확인 가능 Heterogenous particle 경우 정량화 분석 한계 DLS보다 높은 해상 보정을 위해 입자 기 도 준 필요 개수 기반 크기 분포 입자 농도, 이미지 배 및 입자 농도의 동시 경 (NTA), 막의 기공 NTA/TRPS 측정 크기 (TRPS) 등 최 TRPS에 의해 제타 적화 방법 복잡 포텐셜 동시 측정 낮은 처리량 NTA: 단일 입자의 이동 경로 추적해 입자 크기 측정 TRPS: 얇은 막의 작은 기공을 통과하는 입자의 이온 전하 측정 나노입자의 분석적 고정상 (SEC), 막 정량화 및 예비 분획 (AF4)과 입자의 상호 (fractionation) 작용 SEC/AF4 입자 크기에 따라 분리 MALS/DLS detection 없다면 외 부 기준 필요 간단한 준비와 빠른 Ph, 온도, 이온 강도 PALS 전기적 이동하는 나노 입자의 제타 전위 측정 분석 등 용액 조건 영향 다른 지질을 혼 라벨링, 외부 물질 추 민감도가 낮음 합하여 새로운 가 필요 없이 비파괴 복잡한 샘플 준비 상전이 상태 확 적 관찰 가능 DSC 인 실시간 관찰 가능 탐침 융합할 지질막 매우 적은 Probe로 내에 균일 분포 Fluorophore Quenching, dequenching, FRET 확인 높은 민감성 labeling 정량화  간단한 물리적 측정 반정량적 방법으로 다른 입자 정량화 어려움 입자 물질의 흡광 Turbidity 방해 assay 400-600nm 파장에서 흡광도 증가 이 외에도 위에서 언급된 SS, DM, CF 등 다양한 방법 논문 표에 정리되어 있음 ! 8) Conclusions and future perspectives 지질 나노 입자의 약물 전달 강점 - CQAs (주요 품질 특성) 분석의 중요성 - - 산업적 관점에서의 필요성 - - 개선 방향 - -