1조. Understanding Molecular Mechanisms of Biologics Drug Delivery and Stability from NMR Spectroscopy PDF

Understanding molecular mechanisms of biologics drug delivery and stability from NMR spectroscopy 1. Introduction 1. 바이오로직스의 한계점 1) 물리적 특성의 한계 - 분자량 크고 친수성 높음=> 세포막의 소수성 코어 통과하기 어려움 2) 구조적, 안정성 한계 - 유연한 구조와 동적 특성 가...

Understanding molecular mechanisms of biologics drug delivery and stability from NMR spectroscopy 1. Introduction 1. 바이오로직스의 한계점 1) 물리적 특성의 한계 - 분자량 크고 친수성 높음=> 세포막의 소수성 코어 통과하기 어려움 2) 구조적, 안정성 한계 - 유연한 구조와 동적 특성 가짐=>단백질 응집 경향 증가 - 약물과 부형제 간의 상호작용 => 안정성 문제 - 방부제=> 생화학적 불안정성과 단백질 응집 유발 ∴ 안정적 부형제 선택과 메커니즘 필요 2. 바이오로직스의 해결 방안 => 바이오로직스 수송체: CPP(Cell-Penetrating Peptides) - 세포 침투 펩타이드: 세포막을 파괴하지 않고 세포로 들어가 물질 전달 가능 - 자신보다 60배 큰 물질 운반 가능 - 단점: 표적 특이성 낮음, 효소 분해에 취약 - 예시: LNP(Lipid-Based Nanoparticles) but, 국소적인 전달만 가능하다는 한계점 2. NMR 연구의 필요성 - 약물 전달과 단백질 약물 안정성 담당하기 위해 구조적 속성 파악 필요 => NMR은 단백질 구조를 옹스트롬 수준에서 결정할 수 있는 주요 기술 - 목표는 NMR 기반의 분석을 통해 세포막과 약물 또는 약물 수송체 분자가 상호작용하는 메 커니즘을 이해하고, 이를 최적화해 바이오로직스 약물 전달 시스템을 개발 2. Structural Investigation of Drug Delivery 2.1 Cellular membrane as the permeation barrier [생체 이용률의 중요성] - 생체 이용률: 약물이 변형되지 않은 상태로 전신 순환계에 도달하는 비율 - 세포막과 같은 생물학적 장벽을 효과적으로 투과하는 것 => 약물의 흡수, 분포, 생체 이용률에 중요 - 대부분의 약물: 세포 내부에 치료 표적 있음/수용성/분자량 큼 => 소수성 세포막 통과 어렵 [세포막의 역할] - 외부 물질로부터 세포 보호 - 선택적으로 특정 화학 물질과 지용성 분자 투과 허용 - 막투과: 수동 확산이나 수송체에 의해 발생=> 분자의 크기와 극성이 중요한 영향 미침 - 통과 가능: 비극성 기체, 작은 분자(물, 에탄올) - 통과 불가: 큰 분자, 수용성, 전하 띤 분자 [CPP의 막 삽입 메커니즘] CPP(세포 침투 펩타이드): 약 40개 미만의 아미노산 잔기로 이루어짐 양전하를 가진 아르기닌(Arg)과 라이신(Lys) 잔기 포함 => ① CPP의 양전하 잔기+인지질의 음전하 그룹 간 이온 결합/수소 결합 ② CPP와 물 분자 간 상호작용 ③ 이동성↑ 막 투과 효율 ↑ [지질막과 막 단백질의 상호작용] - 지질막: 수용성 분자, 단백질 수동 확산 차단 but 특정 전하 띤 분자나 펩타이드는 선택적으로 투과시킴=> 이 관계를 이해하는 것이 약물 전달 시스템 설계에 중요하다~ - 세포막의 구성 요소: 다양한 지질(구성은 세포마다 다름) + 다양한 막 단백질 - 막 지질: ① 인지질 ② 당지질 ③스테롤 - 인지질: 이중층 형성, 외부는 친수성 머리/ 내부는 소수성 꼬리 - 막 지질 구성은 세포 기능, 조직에 따라 다름: -포유류는 외부엔 PC/내부엔 PE&PS 많음(비대칭적) 예시 1) 암세포: 포스파티딜세린(PS)이 세포 외부 많음 => 면역 시스템이 암세포를 인식하지 못하게 함 예시 2) 콜레스테롤: 모든 동물 세포막의 주요 성분 세포막의 밀도를 높이고 유동성을 줄임 항암제 내성 암세포: 콜레스테롤 조절로 막의 유연성 조절해 암세포 잘 전이되게 함 세포막에는 콜레스테롤X-> 표적 약물 전달 시스템 개발에 유용 [CPP와 NMR 분석] NMR 분광법: CPP와 같은 물질이 세포막에 삽입될 때의 구조와 동역학을 분석할 수 있음 별로 안 중요해 보임.. 1) HIV-1 외피 당단백질 등 막 결합 펩타이드 분석해 막 결합 구조, 펩타이드-지질 상호작용 분석 2) 인플루엔자 M2 단백질의 콜레스테롤 결합 부위 분석 -> 아만타딘(인플루엔자 치료제)이 M2 채널에 결합하여 바이러스 탈외피를 방해하는 메커 니즘 확인 3) 31P NMR 분광법으로 막의 구조 분석 -막의 곡률: 세포막이 특정 생물학적 과정에서 가지는 곡률인데 약물 확산 및 투과에 영향 줌 ex) 특정 곡률의 막은 약물 더 잘 통과하거나 어떤 위치에 도달하기 쉽게 함 - 라멜라와 Hexagonal phases: - 라멜라: 막이 층층이 배열된 구조(첫 번째 그림&그래프) - 헥사고날 상: 기둥형 구조, 특정 조건에서만 형성(세 번째 그림&그래프) => 이 두 가지 구조는 31P NMR에서 고유의 비등방성 패턴(anisotropic) 나타남 - 작은 소포와 미셸은 반대로 등방성 패턴 나타남(두 번째 보라색 그래프) 4) 멜리틴: 양이온성 용혈 펩타이드 -static 31P NMR을 통해 멜리틴이 지질 이중층 구조를 변화시키고 분해하는 것 알아냄 => NMR 기술은 약물 전달 시스템의 최적화를 위해 구조를 분석하는 데에 활용될 수 있고 차 세대 약물 전달 시스템 개발에도 기여할 수 있다! (NMR 기술의 유용성을 말하고 싶은 거임) 2.2 Membrane interaction of cell-penetrating peptides 이 챕터에서는 CPP의 특징을 알아내기 위한 실험이 주구장창 나옴 [CPP(Cell-Penetrating Peptide)의 특징과 역할] 1. CPP란? - CPP: 세포막을 통과하여 약물을 세포 내부로 전달하는 펩타이드 - 필요성: 대부분의 약물은 크기가 너무 크거나 친수성 때문에 세포막 투과 효율이 낮음. 이 를 극복하기 위해 CPP와 같은 운반체 시스템이 필요 - 구조적 특징: CPP는 약 40개 미만의 아미노산 잔기로 구성되며, 주로 양전하를 띤 아미노 산인 아르기닌(Arg)과 라이신(Lys)을 포함 2. CPP가 세포막을 투과할 수 있는 이유 1) 양이온 전기적 상호작용: - CPP의 양이온 아미노산(아르기닌, 라이신)이 세포막 인지질의 음전하를 띤 머리 부분 (PO₄⁻)과 강력한 이온 결합 및 수소 결합을 형성 2) 수소 결합 가능성: - 양전하 아미노산 잔기와 물 분자 사이의 수소 결합이 CPP의 투과성을 높임 3) 높은 이동성: - CPP는 유연한 구조와 높은 이동성을 가지고 있어 막을 빠르게 통과할 수 있음 3. CPP의 세부 특성 및 실험 결과 (여기 나오는 실험들은 다 위에 CPP가 막을 통과할 수 있는 이유를 증명하려고 하는 거임) [실험 1] 아르기닌과 인지질의 상호작용 B. 아르기닌-인산염 핵 간 거리 C. 라이신-인산염 핵 간 거리 - 아르기닌-인산염 간의 평균 거리: 4.2Å - 라이신-인산염 간의 평균 거리: 4.0Å → 이 두 잔기는 짧은 거리를 유지하며 강력한 이온 결합 및 수소 결합을 형성 - 대조군(중성 아미노산인 이소류신과 인산염의 핵간 거리): 6.9Å(길다)→ 상호작용이 약함 아르기닌&라이신은 인지질의 인산염과 강력한 상호작용함 [실험 2] 구아니디늄과 다이메틸 구아니디늄 치환 실험 - 구아니디늄 그룹(Guanidinium): 아르기닌의 작용 그룹 인산염과의 수소 결합에서 중요한 역할(→이번 실험으로 보여주마.) 왼쪽은 구아니디늄 그룹(수소결합 O) 오른쪽은 다이메틸 구아니디늄 그룹(수소 결합X) - 구아니디늄 그룹을 다이메틸 구아니디늄으로 치환 시 인산염과의 결합 효율 약 95% 감소 → 수소 결합 기회가 감소했기 때문 - 아르기닌을 라이신으로 치환한 경우에도 결합 효율 감소 → 아르기닌의 구아니디늄 그룹이 더 많은 수소 결합을 형성할 가능성을 제공하기 때문 아르기닌의 구아니디늄 그룹+인지질의 결합 => CPP의 막 투과성과 안정성에 중요 [실험 3] 아르기닌의 동적 특성과 안정성 - S-값(질서 매개 변수): CPP와 막 간의 상호작용 강도를 나타냄 =>S값 높을수록 막과 상호작용 강함(안정성이 높은 거임) - 구아니디늄 그룹 S-값(빨간 동그라미): 0.3 (가장 높음)→ 막과 상호작 용 강함 - 나머지 잔기는 S-값 낮음=> 더 유연하고 자유도 높음 - 아르기닌의 구아니디늄 그룹이 막 투과 과정에서 중요한 안정성을 제 공  아르기닌의 구아니디늄 그룹 덕분에 CPP가 막에 안정적으로 결합하고 막 투과성도 높 아짐 [실험 4] TAT 펩타이드 (TAT 펩타이드가 세포막에 어떻게 위치하고 있는지 알아내고자 함) TAT 펩타이드란? - TAT는 대표적인 CPP, 세포막을 투과하며 아르기닌과 라이신 잔기를 포함 - Cα, Cβ, Cγ, Cδ 관찰 (Cα, Cβ, Cγ, Cδ는 탄소 원자 위치 나타낸 거) - X축은 탄소 원자의 화학적 이동값 Y축은 해당 탄소에 연결된 수소 원자 신호 - 빨간 선(H2O): 물 분자와 상호작용하는 부분 파란선 (Lipid CH₂): 세포막 내부 지질층과 상호작 용하는 부분 - 그래프에서 빨간 선과 파란 선 부분에서 모두 피크가 관찰됨 => 물과 지질층 모두와 상호작용함 TAT 펩타이드는 세포막 외부(물)과 내부(지질층) 모두와 상호작용하며 세포막의 경계 부분에서 안정적으로 존재한다.(+그래서 세포막 내외부 모두 투과 가능) [실험 5] 망가니즈 이온 실험 (Paramagnetic Relaxation Enhancement, PRE) (CPP가 세포막 내부/외부 양쪽에 위치할 수 있음을 확인하고자 함) - 망가니즈 이온(Mn²⁺): 상자성 이온, 근처 원자핵의 NMR 신 호 억제 - 빨간 선: 망가니즈 이온이 외부에 있을 때 까만 선: 망가니즈 이온이 외부/내부에 있을 때 1. 망가니즈 이온을 세포막 외부에만 배치: - 세포막 외부의 펩타이드 신호가 억제됨. 2. 망가니즈 이온을 세포막 내부와 외부 모두에 배치: - 세포막 내부와 외부의 신호가 모두 억제됨 →CPP가 세포막 전체에 침투했다! CPP 펩타이드는 세포막의 인지질 양쪽(내부와 외부) 모두에 침투 가능 =>CPP는 약물 전달 과정에서 세포 내외로 물질 운반 가능하다 4. CPP의 응용 가능성 1) 혈액-뇌 장벽(BBB): CPP는 BBB를 통과할 수 있어 중추 신경계 표적 약물 전달에 적합 2) 경피 약물 전달: CPP는 각질층을 효율적으로 침투하여 경피 약물 전달 시스템에서도 활용 가능 2.2에서 하고 싶은 말 - CPP는 세포막을 안정적으로 투과할 수 있는 효율적인 약물 전달 매개체로, 다양한 생물학 적 환경에서 약물 전달 효율을 극대화할 가능성이 있음 - 특히, BBB와 각질층을 포함한 난투과성 장벽을 극복하는 데 유용하며, 신약 개발 및 나노 약물 전달 시스템에서 중요한 역할을 할 수 있음 2.3 Structural Basis of Cellular Uptake as revealed by comparing membrane-active molecules (이 챕터에서는 CPP와 유사한 AMP에 대해 알아보고 그 예시인 PG-1에 대한 내용) 1. AMPs(Antimicrobial Peptides)란? - 항균 펩타이드 - 세균 세포를 선택적으로 공격 - CPP와 유사하게 세포막에 삽입될 수 있음 [CPP vs AMP] CPP AMP Ÿ 1차 서열이 유사함 Ÿ 아미노산이 40개 미만인 아르기닌 풍부한 펩타이드 공통점 Ÿ 아르기닌-인산염 / 라이신-인산염 상호작용 함 Ÿ 세포막에서 생물학적, 치료적 활동 수행 주요 기능 세포 내로 물질 운반 병원체 공격, 파괴 일시적 침투 세포막과 상호작용 비가역적으로 세포막 파괴 세포막 파괴X 차이점 무질서하거나 코일 β-헤어핀 같은 정형화 된 구조 형태(유연함) 2차 구조 분자 유동성 상대적으로 높음 상대적으로 낮음 2. AMPs의 예시 1) PG-1이란? - PG-1(Protegrin-1): 세포막을 관통해 막에 구멍을 형성하는 AMPs의 한 종류 - 막의 수직 방향으로 관통하면서 막에 구멍 냄 => 그 구멍이 트로이드형 포어 (toroidal pore) - 트로이드형 포어: PG-1에 의해 세포 막의 인지질 이중층이 일그러지며 형성 - PG-1 머리는 양전하 아미노산 풍부 인지질 머리: 음전하 => 전기적 상호작용 하며 세포막으로 진입 2) PG-1의 특성을 파악하기 위한 실험=>전부 막 파괴하는 것 확인하는 거임 [실험 1] 망가니즈 PRE NMR 실험 (PG1이 세포막에서 어떻게 위치하고 작용하는지 확인하기 위함) - PG1의 양쪽 끝은 세포막의 양쪽 표면에 위치 => PG1은 막의 양쪽 면에 걸쳐 작용 - PG1의 중간 베타 헤어핀 구조가 세포막 깊숙이 삽입 =>PG1이 막을 관통하고 막의 구조를 교란하는 데 핵심적 13 [실험 2] C-31P REDOR NMR 실험 (PG1의 특정 아미노산 잔기가 세포막의 인산기(PO₄⁻)와 상호작용하는 정도를 확인) - PG1은 세포막 중심까지 관통하며 transmembrane(막의 수직 방향) 구조 형성 =>PG1이 세포막을 완전히 뚫고 지나가며 막을 파괴할 수 있음 확인 [실험 3] 31P NMR 실험 (인지질 이중층이 파괴될 때 발생하는 신호 변화를 관찰) 1. 정상적인 인지질 이중층: - NMR 신호에서 넓게 퍼진 이방성(anisotropic) 신호 2. 인지질 이중층 파괴: - PG1에 의해 세포막이 파괴되면, 뾰족한 신호(isotropic peak)가 관찰됨 => 세포막이 분리되고 붕괴되는 과정을 나타냄 NMR 신호를 통해 PG-1이 세포막 파괴한다는 사실 확인 3) AMPs와 유사한 다른 약물 예시 ① PMX30016 - PMX30016: 소분자 항균 아크릴아마이드 약물 - AMP처럼 세포막 파괴를 통해 병원체 공격 - 독특한 막 파괴 메커니즘 가짐 19 [실험 1] F NMR 실험 (PMX30016의 구조와 세포막 삽입 메커니즘 분석) 1. 분자 축의 방향성: - 긴 분자 축: 세포막 평면과 평행하게 놓임 - 짧은 분자 축: 세포막에 약 20도 기울어져 삽입 2. 분자 칼날 효과: - PMX30016은 세포막에 삽입되면서 칼날처럼 회전하 여 막을 파괴 => 세포막의 안정성을 붕괴시키고 구조를 교란 PMX30016은 분자 칼날 효과에 의해 세포막 파괴함 2.4 Nanoparticle Vehicles that enable and enhance drug delivery (약물 전달체로서 나노입자가 좋다고 제안하는 내용) 1. 나노 입자 기반 약물 전달 시스템 1) 나노입자의 필요성 - 기존 생체 치료제: 세포에 도달하기 전에 분해될 가능성이 높음 => 나노입자를 약물 전달체로 사용 2) 나노입자의 장점 - 부피 대비 표면적이 큼 - 생체 적합성, 안정성 우수 - 생체 이용률과 표적 특이성 높음 - 혈중 순환 시간이 길어 약물 전달 효율 증가 2. 나노입자 설계 시 중요 요소 - 조성, 모양, 크기, 표면 특성, 표면 전하 등이 조절 가능해야 함 - 약물이나 표적에 따라 구성 요소를 최적화하여 약물 전달 효과를 극대화 3. Nanoparticle surface modifier(표면 수정) - 나노입자를 최적화 시키기 위한 방법으로 나노 입자 표면을 수정할 수 있음 1) Hydrophilic steric-stabilizing lipid - 나노입자 표면에 친수성 머리를 가진 지질을 코팅 - 면역계의 인식을 줄이고 안정성 높임 - 친수성이어서 생체 내에서 잘 분산되고 입자 간 응집을 방지 - 약물이 접근하기 어려운 표적의 접근성 높임 2) 포도당 - BBB 극복하기 위한 방법 - 뇌 모세혈관 내피세포에 포도당 수용체(GLUT-1)가 풍부하게 발현됨(에너지 공급 받아야 돼 서) - 나노입자 표면에 포도당을 부착하면 GLUT-1이 이를 인식해 BBB를 통과시킴 3) PEG - 가장 일반적인 surface modifier - 입자 간 응집을 줄이고 약물 전달체의 안정성 높임 2.4.1. Lipid-based nanoparticles (이제부턴 나노입자 중에서 지질 기반 나노입자를 주구장창 소개할 거임) 2.4.1.1. Liposome 1. 리포좀(Liposome) - 나노 크기의 구형 소포 - 하나 또는 여러 개의 인지질 이중층으로 구성 - 내부에는 친수성 핵을 가짐 => 소수성 약물은 지질층에, 친수성 약물은 내부 공간이나 이온성 머 리 부분에 캡슐화됨 - 구성 성분: - 인지질: 약물 보호 - 콜레스테롤: 약물 누출 감소 - PEG-lipid: 안정성 및 혈중 순환 시간 증가 - 문제점: - PEG-lipid가 특정 농도 이상일 경우 미셸을 형성하여 리포좀을 용해시킴 => 최적화가 필요하며, 이를 연구하기 위해 NMR 기술 활용됨 2. 리포좀 최적화 연구(NMR 이용) 1) PEG-lipid 최적 농도 확인 - PGSE NMR과 static 31P NMR을 이용해 연구 - PEG와 리포좀 핵의 인지질이 유사한 길이를 가지는 경우, PEG-lipid가 8%일 때 가장 효 율적인 약물 전달 가능 2) 약물 전달 및 캡슐화 효율 분석: - NOESY 및 PRE NMR을 통한 연구 - 친수성 분자가 인지질 머리 부분에 존재한다는 사실 밝혀냄 - Ex. Resveratrol(친수성 약물)이 인지질 머리 부분에 위치함을 확인 3) 캡슐화 효율 평가: - 약물이 나노입자 전달체에 얼마나 봉입 됐는지 확인하고자 함 but, 기존 방법(크로마토그래피, 원심분리, 투석)으로는 약물이 들어간 전달체 부서질 가능 성↑ - NMR을 이용하여 캡슐화 효율을 정확히 계산: [방법 1] 수소 신호 변화 측정 - 리포좀 내부 약물은 pH 변화에 둔감, 외부 약물은 민감 - pH 민감 분자인 호모카르노신의 NMR 신호 변화를 통해 리포좀 내부 약물 양을 확인 - Ext. 부분이 리포좀 외부에 있는 약물의 피크 Int. 부분이 리포좀 내부에 있는 약물의 피크 - pH가 변화함에 따라 Ext의 피크 위치는 계속 바뀜 but, Int의 피크 위치는 거의 그대로 => 이를 이용해 캡슐화된 약물의 비율 계산 가능 [방법 2] 표준 물질(Pyridine)과 신호 비교 - 약물의 신호를 정량화하여 정확한 캡슐화 효율 계산 - 외부 환경의 영향을 받지 않는 피리딘을 내부 표준 물질로 사용 - MTX(Methotrexate): 약물 이름 - 아래 그래프에서 1,2,3(피리딘 고리의 수소들) 피크가  8.5~6.5ppm에서 관찰됨 - 아래 초록색 숫자: 각 그래프의 적분 값 - 피리딘 분자 10개 당 하나의 약물 분자 있음 피리딘 신호와 약물 신호의 적분 면적을 비교해 약물의 양 정량화 가능 3. 리포좀의 단점 해결(->리포실로 변형) 1) 리포좀의 한계: - 위장관 통과 시 약물이 분해되거나 리포좀이 약해짐 2) 해결 방안: Liposil로 만들기 - Liposil: 리포좀을 실리카로 코팅한 것 - 리포좀 강도 증가 및 pH로 인한 약물 분해 방지 - 경구 투여에 적합 4. 실리카와 리포좀의 상호작용 분석 31 1) P ssNMR을 이용해 liposil 구조와 계면 분석 - 물과 결합한 DPPC가 실리카에 의해 고정됨 DPPC는 지질 이름 - 온도 변화 실험: (결론) 저온에서 실리카와 리포좀의 결합력이 더 강함 2) 추가 실험들 결론만 - 리포좀과 실리카 껍질은 물리적으로 가까이서 상호작용함 - 실리카와 리포좀은 물분자를 통해 연결됨, 실험적/이론적으로 모두 검증함 - 나노입자는 약물 전달체로서 다양한 가능성을 가지고 있음 - 특히, 리포좀과 같은 지질 기반 전달체는 생체 적합성과 안정성이 우수하며, 경구 투여와 같은 새로운 방식으로 활용 가능 - 실리카 코팅과 NMR 연구를 통해 리포좀의 약물 전달 효율을 최적화하고 새로운 응용 가능 성을 열 수 있음 2.4.1.2 Lipid nanoparticles(LNP) 1. siRNA와 LNP의 필요성 - small interfering RNA(siRNA): - 유전자 발현 억제 및 mRNA 분해를 통해 질병 치료에 사용 - 높은 선택성을 가지고 모든 유전자를 표적으로 삼을 수 있는 잠재력을 지님 - 문제점: - 크기가 크고 음전하로 인해 세포막을 통과하여 세포 내 작용 부위로 도달하기 어려움 - 구조적 안정성이 낮아 체내 환경에서 분해 가능성 높음 ∴ siRNA같은 핵산 치료제를 전달하기 위한 수단이 필요함=>그거슨 지질 나노입자! 2. LNP(Lipid Nanoparticle) - 구성 ① 이온화 가능한 양이온성 지질: 형질 내 이동 효율을 향상시키며 면역원성과 독성을 낮춤 ② 인지질: 구조적 안정성↑ ③ 콜레스테롤: 입자의 안정성을 높이고 약물 누출 감소 3. LNP의 구조 및 안정성 분석 1) DNP(동적 핵분극, Dynamic Nuclear Polarization)-enhanced NMR - LNP에 약물(siRNA/mRNA)이 들어있는지에 관계없이 LNP의 구조 분석 - 극성을 전달하여 LNP의 표면 및 내부의 구조적 변화를 분석 - 결과: - siRNA가 포함되지 않은 LNP, 50% 설포네이트된 LNP, 100% 설포네이트된 LNP를 비교 - siRNA가 완전히 포함되었을 경우 내부에 위치 - 부분적으로 설포네이트된 경우 siRNA는 표면과 내부 모두에 존재 2) cryo-TEM & SAXS - 특징: - 크라이오 트랜스미션 전자현미경(Cryo-TEM)과 소각산란 X선(SAXS) 분석을 통해 LNP 구조의 계층 모델 제안 - 결과: - LNP의 외부는 PEG와 인지질(DSPC)로 구성 - 내부는 서브코어와 코어 레이어로 나뉨: - 서브코어: 양이온성 지질과 siRNA가 결합 - 중심부: 콜레스테롤과 혼합된 중성 지질로 이루어짐 3) PEG 방출 동력학 분석 (PGSE NMR) - PEG 탈락의 중요성: - PEG가 지질막에서 떨어져 나가야 세포막과 상호작용 가능(PEG-shedding) - 짧은 PEG 꼬리를 가진 LNP는 빠르게 방출되며, 긴 꼬리를 가진 LNP는 더 오래 안정성 을 유지 - 결과: - PEG의 길이에 따라 LNP의 방출 효율과 안정성을 조정 가능 4. LNP의 연구 의의 - siRNA 전달 효율 개선: - NMR과 구조 분석 기법을 통해 LNP의 구조와 안정성을 최적화 - 다양한 조건에서 siRNA 전달을 제어하고, 특정 장기나 세포로의 분포를 유도 - 다른 장기 표적화: - 기존 간 표적 전달 한계를 극복하기 위한 연구가 진행 중 - 구조적 설계와 PEG 방출 조절로 조직 특이적 전달 효율 증가 가능 - LNP는 siRNA 치료제를 체내에서 안정적으로 전달하는 핵심 기술 - 다양한 분석 기법(DNP NMR, Cryo-TEM, SAXS 등)을 통해 구조와 기능을 세밀히 조정하 고, siRNA의 효과적인 전달과 조직 특이적 분포를 가능하게 함 2.4.1.3 Solid Lipid Nanoparticles 1. Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) - SLN: 실온에서 고체 상태의 결정 구조를 유지하는 고융점 지질 - 주요 성분 ① 지방산 ② 스테로이드 ③ mono-/di-/tri-글리세라이드 ④ 왁스 등 장점 단점 Ÿ 약물을 싣는 데에 제한 있음 Ÿ 높은 약물 안정성 Ÿ 약물 방출에 제약 있음(고제 지질의 다형 Ÿ 약물 방출 오랫동안 지속됨 성 전이로 인해) - 개선 방법 1) NLC (Nanostructured Lipid Carriers): 액체 지질을 포함해 SLN의 단점을 보완 2) Calixarene-Based SLNs: 특수 화합물을 이용해 SLN의 성능 개선 2. Nanostructured Lipid Carriers (NLCs) - 고체 지질 껍질 내부에 중쇄 중성 지방 등 하나 이상의 액체 지질 포함된 구조 - 장점: - SLN보다 약물 로딩이 더 용이 - 약물 방출 속도를 조절 가능 3. SLN과 NLC의 구조적 특징 분석 방법 1) NMR Relaxation Measurements =>약물의 균일성 측정 - 균질 혼합물: 동일한 스핀 격자 이완 시간 (Spin-Lattice Relaxation Time, T1q) - 상 분리 상태: 이완 시간 서로 다름 2) 1H NMR으로 각 구성 성분의 이동성 확인 -Tripalmitin(고체 지질 코어): 1H NMR에서 신호 없음 → 코어의 고정화 상태 확인 - PEG 사슬: 좁은 1H 선폭과 긴 이완 시간(T1, T2) → PEG 사슬의 높은 유동성 확인 => 나노입자의 표면은 역동적이고 코어는 고체(고정됨) 3) Diffusion-Oriented Spectroscopy (DOSY) - PEG chain이 SLN의 외부 수성 상과 혼합되지 않고 표면에 부착되어 있음을 확인 4) Chemical Shift 측정 - 1H 선폭 변화 측정 - NLC 내 액체 지질의 유동성 및 물리적 상태를 평가 온도가 높아지면 유동성이 증가 => 낮은 온도일 때는 고체 지질과 상호작용해서 고정되고, 높은 온도일 때는 유동성 높아짐 + 액체 지질(oil) 함량이 증가하면 유동성 증가 5) Continuous Flow Hyperpolarized 129Xe NMR - Calixarene 기반 SLN: - Xenon 가스를 이용해 빈 공간(host cavity) 탐색 - 염화메틸렌 가스와의 경쟁 흡착 → 구조적 변화 확인 - Xenon 신호가 증가하면 SLN 내부와 표면에서 구조 안정성을 확인 2.4.2. Biodegradable polymeric nanoparticles 1. 천연 및 합성 폴리머 기반 나노입자 1) 천연 폴리머 - 구성: 단백질 기반(알부민, 콜라겐) 및 다당류(키토산, 덱스트란, 알지네이트 등) 장점 단점 Ÿ 자연에 풍부 Ÿ 분자량 변화 크고 변동성 높음 Ÿ 생분해성, 생체 적합성↑ → 조직 축적 위험↑, 약물 방출에 영향 Ÿ 독성 낮음 2) 합성 생분해성 및 생체 흡수성 폴리머 - 예시: PLA, PGA, PCL, PLGA 등 - 특징: - 생분해성 및 생체 흡수성 - 분자량이 클수록 축적 가능성이 높지만, PEG를 결합해 안정성 증가 가능 - NMR 활용 - PEG-PLA 및 PEG-PLGA의 구조적 특성 확인 - 수성 환경에서 소수성 코어 형성 여부 평가 2. Core-Corona 구조 - 내부 코어: 소수성 폴리에스터가 약물을 안전하게 캡슐화 외부 코로나: 친수성 PEG 사슬이 혈액 순환 시간을 연장 - 장점: - 약물의 혈중 안정성 증가 - PLGA-PEG의 PEGylation으로 혈장 단백질과의 상호작용 최소화 3. 나노입자의 크기와 표면 - 다양한 표적, 질병 등에 대한 전달체 개발에 중요 - 직경 200nm 이상은 비장에서 걸러질 수도 - 유동성↑: 분해 속도, 크기, 모양 조절 - 3중 구조 3. PEI (Polyethyleneimine)의 특성과 활용 - 분해되지 않는 합성 고분자, DNA와 결합해 유전자 전달에 기여 - 과량의 PEI는 세포 독성을 유발(분해되지 않기 때문에 과하게 생성될 수도)→ 정량화 필수 - NMR 활용: - 내부 표준 물질과 비교해 free polymer와 polyplex 농도 정량화 가능