Biologia Molecolare 14.1 PDF - 4/12/2023

14.1 Biologia Molecolare 4/12/2023 Malattie mono geniche candidate alla terapia genica INGEGNERIA GENETICA Malattie ad alta mortalità candidate alla terapia genica Sbobinatore: O avia Pe...

14.1 Biologia Molecolare 4/12/2023 Malattie mono geniche candidate alla terapia genica INGEGNERIA GENETICA Malattie ad alta mortalità candidate alla terapia genica Sbobinatore: O avia Pescosta Revisore: Giovanni Tambone tt 14.1 Biologia Molecolare 4/12/2023 La ricerca in campo biologico sui meccanismi e sui processi di funzionamento ( e di manipolazione ) del DNA e del RNA ha permesso lo sviluppo di nuove procedure applicabili in campo biomedico: alcune dinamiche studiate dalla biologia molecolare ( come il funzionamento della polimerasi, la possibilità di creare in laboratorio molecole sintetiche di DNA ,tecniche di fusione cellulare e la manipolazione di tipi cellulari ed embrioni) sono state ingegnerizzate al fine di garantire uno sviluppo sia nella ricerca pura che applicata (in ambito agricolo e biomedico). Studiando quindi le applicazioni reali della biologia molecolare nella biomedica non si possono trascurare le tecniche introdotte dalla ingegneria genetica. L’ingegneria genetica consiste nello studio e nell’utilizzo di tecniche sperimentali che coinvolgono l’isolamento ,la manipolazione la reintroduzione di DNA o RNA all’interno di cellule eterologhe coltivate in vitro, o di embrioni , oppure di organismi presi come modello. Lo sviluppo di tali tecniche doveva far fronte inizialmente a necessità in campo agricolo, (in seguito a carenze alimentari in paesi in via di sviluppo), e in ambito farmacologico (si pensi alla produzione dell’insulina, che inizialmente veniva estratta dai cadaveri ed ora viene acquistata un’insulina sintetica ,prodotta in maniera ricombinate da cellule sintetizzate in laboratorio; anticorpi monoclonali usati nella terapia anti-neoplastica) TERAPIA GENICA La terapia genica prevede l’ingegnerizzazione in laboratorio di un trans-gene (un gene ricombinante), che possa essere reintrodotto all’interno di una cellula a scopo terapeutico ,al fine quindi di correggere mutazioni presenti all’interno del genoma della cellula ricevente e modificarne un comportamento patologico della cellula sia dal punto di vista metabolico che fisiologico. Non si può riuscire a correggere ogni patologia o mutazione cellulare : si può intervenire a fronte di malattie mono geniche (è l’applicazione più concettualmente immediata).Ultimamente è stato reso possibile applicare procedure di ingegneria genetica anche in patologie che non presentano caratteri prettamente di base genetica , ma con tassi di frequenza e mortalità elevati ,come tumori, malattie neuro-degenerative e patologie cardiovascolari. Questa procedura non è tuttavia esente da dei requisiti minimi per essere applicata: la terapia attuale è inadeguata e la sede principale del difetto deve essere accessibile. L’applicazione delle conoscenze in questo ambito è però molto costosa. Ad oggi, infatti, chi desidera sottoporsi a specifici trial clinici deve rivolgersi alle nazioni che investono nelle applicazioni della biologia molecolare. SVILUPPO DI UNA NUOVA TERAPIA GENICA Lo sviluppo di una nuova terapia genica inizia con la ricerca pre-clinica : si identifica una patologia, si studia il meccanismo molecolare che porta al fenotipo patologico ,e si formulano delle ipotesi che devono essere validate in laboratorio. Queste ipotesi di malfunzionamento sfruttano le cellule coltivate in vitro che, per essere validate, prevedono modelli in vivo che siano in grado di riprodurre i fenotipi patologici( roditori, maiali o primati, prima di passare all’uomo). Una volta che lo studio viene validato si passa alla formulazione di un’ipotesi terapeutica a cui segue la sperimentazione clinica ( trial ) ,che si articola in 4 fasi: Fase 1: prevede la validazione della sicurezza, il farmaco viene somministrato a pochi pazienti volontari per valutarne gli effetti avversi; una volta che il rapporto tra beneficio e danno è a supporto dei benefici si passa alla fase 2; Schema riassuntivo dello sviluppo di una nuova terapia genica: a Sbobinatore: O avia Pescosta sinistra sono rappresentati i passaggi riguardanti la ricerca pre Revisore: Giovanni Tambone clinica con la sperimentazione su soggetti presi come modello a cui segue ,a destra la sperimentazione terapeutica in campo clinico. tt 14.1 Biologia Molecolare 4/12/2023 Fase 2: viene approfondito e studiato il funzionamento del farmaco, si continuano gli studi sulla sicurezza su un numero di volontari più ampio; Fase 3: il farmaco è considerato sicuro ed è già somministrato ad un grande numero di pazienti volontari; Fase 4: riguarda la messa in commercio del farmaco (investimenti e analisi di mercato). TERAPIA GENICA: APPROCCI Si distinguono sono tre grandi approcci per la terapia genica: EX VIVO: si prelevano le cellule dal paziente, si manipolano in laboratorio per poi reintrodurle nel paziente. In questo caso il vantaggio è che le cellule sono le stesse del paziente e quindi non c’è rischio di rigetto immunologico.Il campo di applicazione si restringe fino alle patologie ematologiche e metaboliche. In questo caso è fondamentale che le cellule coltivate in vitro accolgano la molecola di DNA ricombinante : la trasduzione delle cellule deve essere il più possibile efficiente, proprio perché devo possedere un gran numero di cellule da reinserire nel paziente al fine di revertire il fenotipo patologico. Gli approcci successivi, IN SITU ed IN VIVO, sono due sfumature del concetto di EX VIVO. Quando si tratta con una molecola terapeutica ricombinante un tumore solido o un organo facilmente bersagliabile con, si parla di terapia genica IN SITU. L’operatore trasferisce direttamente la molecola ricombinante nell’organo affetto dalla patologia. Se invece la molecola ricombinante viene somministrata per via sistemica, allora si parla di terapia genica IN VIVO. Un tipo di approccio terapeutico che prevede quindi la somministrazione per via sistemica del transgene all’interno del corpo del paziente. il rischio di questo approccio si traduce in una dispersione del transgene stesso all’interno dell’intero organismo e la conseguente perdita di efficacia nel colpire il bersaglio del trattamento terapeutico, con eventuali effetti collaterali (la molecola ricombinante può andare a colpire cellule che non necessitano terapia). Questo trattamento, una volta che ne sia garantita la tessuto specifica (grazie a vettori virali o lipofezione) è utilizzato nelle patologie metaboliche a livello epatico. TERAPIA GENICA :TECNICHE DI TRASFERIMENTO GENICO l DNA sarà inserito nelle cellule mediante un vettore plasmidico dentro il quale è inserito un gene terapeutico ingegnerizzato in laboratorio (DNA nudo).Il vettore plasmidico perché esso ha un’origine di replicazione propria autonoma che permette la produzione in larga scala di questo tipo di molecola, può inoltre essere facilmente codificato e può raggiungere facilmente il livello di sicurezza che una molecola deve avere per essere utilizzata a scopo terapeutico. e molecole di DNA ricombinante venivano trasferite sfruttando tecniche che sfruttano: 1. metodi fisici : queste tecniche prevedevano l’utilizzo di macchinari che con onde d’urto riuscivano a far entrare le molecole di DNA all’interno delle cellule forando la membrana plasmatica. 2. le micelle lipidiche ingegnerizzate in laboratorio e costituite da un doppio strato di fosfolipidi del tutto simile a quelli presenti nelle membrane cellulari, in grado di fondersi con le membrane biologiche e di trasferire il proprio contenuto alle cellule. Queste sono tecniche sono dette di lipofezione, in quanto sfruttano la base biologica della endocitosi per veicolare all’interno della cellula il contenuto della micella dotata di tessuto-specificità(grazie all’inserimento di antigeni Sbobinatore: O avia Pescosta Revisore: Giovanni Tambone tt 14.1 Biologia Molecolare 4/12/2023 proteici sulla superfice). Il difetto della aspecificità delle micelle lipidiche è stato risolto grazie all’inserimento di questi antigeni. 3. vettori virali (adenovirus, virus adeno-associati, o AAV e lentivirus)che, a loro volta, devono soddisfare alcuni requisiti fondamentali: non devono esprimere alcuna delle proteine legate alla funzione patogenetica del virus, mantenendo esclusivamente l’espressione di quelle molecole che sono funzionali al trasporto del transgene; ogni vettore virale continuerà ad esprimere gli antigeni di membrana che conferiscono la tessuto-specificità ,ma il contenuto genico legato al virus verrà completamente eliminato.In sostanza deve essere sicuro ed invisibile dal punto di vista immunologico, senza esprimere nessuna proteina endogena del virus; devo essere di facile produzione e con un titolo virale (la sua concentrazione) estremamente alto; a seconda delle sue applicazioni, il vettore virale deve esprimere ad alta efficienza il transgene e per un periodo ben definito dall’operatore. deve essere selettivo nei confronti dei tipi cellulari; deve poter trasportare geni di dimensioni diverse; devono sapersi integrare in siti specifici del genoma e infettare sia cellule in divisione che cellule quiescenti. Per le cellule in attiva proliferazione il trattamento viene somministrato con l’utilizzo di retro o lenti virus, in grado di andare ad inserire il proprio genoma all’interno del DNA della cellula ospite ,garantendo la trasmissione alle generazioni successive del pro-gene. Per le cellule che non vanno incontro a proliferazione ,d’altro canto, possono mantenere le particelle virali all’interno del proprio citoplasma. Questo vettore rimane sempre in forma episomale (plasmidica) all’interno delle cellule bersaglio diventando così parte del genoma. Sbobinatore: O avia Pescosta Revisore: Giovanni Tambone tt