Técnicas Genéticas de Análisis Molecular PDF

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 Tema 7: Técnicas genéticas de análisis molecular La ingeniería genética es la metodología que usa muchas técnicas...

a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 Tema 7: Técnicas genéticas de análisis molecular La ingeniería genética es la metodología que usa muchas técnicas moleculares distintas para manipular el ADN. La mayoría de las veces transferimos este ADN de un organismo a otro. Implica mezclar cosas que antes no estaban juntas, y transferirlo a otros organismos (deleciones, inserciones, transferencia de genes de un organismo a otro…). Puede usarse con fines de producción, fármacos… ENZIMOLOGÍA PARA LA MANIPULACIÓN DE AC NUCLEICOS La ingeniería genética necesita ser capaz de cortar, modificar y unir ADN de diferentes fuentes para producir ADN recombinante, clonarlo e identificar las moléculas recombinantes. Para esto va a emplear enzimas extraídas de organismos que las presentan de manera natural, sobre todo son virus y bacterias. Enzimas clave: enzimas de restricción (endonucleasas), enzimas que modifican el ADN (nucleasas, polimerasas y enzimas que modifican a término) y ADN ligasas. 1 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Descubiertas por W. Arber, quien ya propone que reconocen secuencias específicas y las cortan. Smith confirma lo que propuso Arbert y D. Nathans es el primero que aplica las enzimas de restricción y lo hará para crear mapas de restricción. Las enzimas de restricción son sistema de defensa que tienen los procariotas para defenderse de ADN exógeno, bien fagos o bien plásmidos. Este sistema es un sistema dual que consiste en una endonucleasa (enzima de restricción) y una metilasa: la metilasa metila el ADN de la bacteria en una secuencia específica que reconoce la endonucleasa. La metilación entonces sirve para proteger el ADN endógeno (de la bacteria), pues la endonucleasa digiere la secuencia por el esqueleto azúcar-fosfato cuando esta no está metilada (normalmente). Hay hasta 4 tipos de enzimas de restricción que se van a diferenciar en cómo se lleva a cabo la metilación y la restricción (si lo lleva a cabo un sistema único o dos separados), en cómo reconocen la secuencia si la hay, en cómo cortan (si es dentro de la secuencia o no), en los cofactores que utilizan, etc. - Hasta ahora hemos visto la de tipo II (son las que más se usan): está separada de la metilasa, reconocen una secuencia entre 4 y 8 pares de bases (palíndromos) y cortan dentro de ella. - La I y la III están en el mismo complejo proteico que la metilasa y no van a cortar dentro de la secuencia, sino que lo harán al azar fuera (la III a 21-25 pb de la secuencia y la I a cientos de pares de bases). - La IV tiene muy poca especificidad y solo corta cuando hay metilación. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN TIPO II (ENDONUCLEASAS DE ADN) Nomenclatura: Las 3 primeras letras se sacan del género y especie de la bacteria por lo que están en cursiva (la primera letra es del género y va en mayúscula y las otras dos se corresponden con las de la especie y van en minúsculas). A continuación, puede haber una letra que indica la cepa. 2 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 En último lugar se indica el número de la enzima Las enzimas de restricción van a reconocer secuencias palindrómicas de 2-8 nucleótidos → ej: 5’-GCATCC-3 3’-CCTAGG-5’ Esto va a influir en el número de fragmentos que van a resultar tras la digestión (cuantos más nucleótidos más fragmentos). La probabilidad de encontrar una diana EcoRI se calcula elevando 4 al número de nucleótidos de la secuencia de reconocimiento (4n). Isoesquizómeros: enzimas que reconocen la misma secuencia, que se han extraído de distintas bacterias (en algunos casos actúan igual), pero que no siempre cortan igual. - SmaI y XmaI tienen la misma diana y cortan igual, pero al proceder de diferentes bacterias se llaman diferente. - NarI y KasI tienen la misma diana, pero no cortan igual (cortan a distinto nivel). Tenemos toda una batería de enzimas de restricción muy amplia que podemos usar según nuestro interés. Uno de estos intereses es el tipo de corte que se genera: Tipos de corte Hay enzimas que van a cortar a la misma altura en ambas hebras dando lugar a extremos “blunt, abruptos o romos”. Y hay otras van a cortar a distinto nivel en cada hebra (dejando dos cadenas monocatenarias) y formando los “sticky ends, extremos pegajosos o en escalera”. Para clonar nos interesan los “sticky ends” porque ya por complementariedad se van a unir los dos fragmentos de ADN y solo nos quedaría sellar. Aplicaciones Digestión total: cuando se secuenciaban los genomas con Sanger era necesario fragmentar el ADN y una manera era usar las enzimas de restricción (para genomas grandes utilizaremos enzimas con dianas con más pb). 3 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 Digestión parcial: si cortamos el genoma a distintos tiempos no se corta en todas las dianas (no se ha dado tiempo para ello) y obtenemos fragmentos solapantes (están formados por 2 o más fragmentos de la digestión total). La digestión parcial a la hora de montar un genoma nos facilita las cosas porque sabemos genes que están al lado (si tenemos una digestión total no sabemos qué genes están al lado). Mapas de restricción: consiste en digerir fragmentos de ADN con distintas enzimas y localizar las dianas. RFLPs (polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción): no todos tenemos las mismas dianas con lo que los podemos usar para identificarnos. Se usó en su momento para diagnóstico (si la mutación que causaba la enfermedad caía en una diana podía eliminar esa diana o por otro lado podía transformar un fragmento que no era diana en una nueva diana → los enfermos tienen una diana de más o de menos). ADN recombinante (cortar ADNs de distinto origen y unirlos). OTRAS NUCLEASAS DE ADN DNASA I - Es una endonucleasa que digiere ADN libre de nucleosomas (preferentemente cadena doble pero también pueden digerir ADN monocatenario). - Dependiendo del cofactor que utilice va a haber distintos cortes: si utiliza Mg2+ el corte es al azar, mientras que si usa Mn el corte es casi completamente romo. - La ADNAsaI es la que se va a utilizar para tener ARN libre de ADN. También se va a utilizar para marcar sondas (Nick translation) y para detectar ADN libre. NUCLEASA SI - Endonucleasa de ácidos nucleicos (ADN y ARN) monocaternarios (si ponemos muchísima concentración de la enzima podemos digerir ADN y ARN de cadena doble). 4 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 - Sirve para la eliminación de extremos monocatenarios, generando extremos romos. En el caso de ácidos nucleicos de cadena doble sirve para eliminar los extremos protuberantes. CAS9 Forma parte del sistema CRISPR junto con el array CRISPR, una región del genoma de la bacteria que tiene fragmentos de ADN de fagos o plásmidos con los que tuvo en contacto, lo que le genera una memoria inmunológica (respuesta inmune adaptativa de procariotas). Array está formado por secuencias repetitivas palindrómicas intercaladas con ADN espaciador (ADN exógeno, de secuencia heterogénea - ya que cada espaciador procede de un organismo diferente -, pero de tamaño constante). Delante del array hay un leader con un promotor para transcribir todo el array y asociado a ese leader, van a estar los genes para las CAS. ¿Qué hacen estas moléculas de ADN exógeno? Se va a transcribir todo el array y el ARNm inmaduro se procesa y se fragmenta, de manera que vamos a tener los espaciadores con un trozo de secuencia repetida. Esto se va a asociar con la CAS y si vuelve a haber una infección, el ARN guía a la CAS para que digiera (si hay homología, el ARN se une y la CAS digiere) → sistema de defensa. Este es el sistema natural de la bacteria y nosotros lo hemos modificado para usarlo en la edición genética. De esta manera, la CAS9 es una endonucleasa muy importante en ingeniería genética, concretamente en edición. 5 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 EXONUCLEASAS Digieren los extremos del ADN. exonucleasa III - Digiere cadenas de ADN doble e híbridos ADN-ARN en sentido 3’→ 5’. - Se usa para formar extremos protuberantes o eliminar el ADN (aunque para esto se suele usar la DNAsaI). Nucleasa Bal 31 - Digiere las dos hebras del ADN y ARN de cadena doble en ambos sentidos: desde 3’-OH (sobre todo) y 5’-P). - También podría ser endonucleasa de ADN de cadena sencilla. - Se usa para el acortamiento del ADN y el ARN (normalmente usamos la DNAsaI o una nucleasa de ARN). NUCLEASAS DE ARN ARNASA H - Endo y exonucleasa que corta el en ambos sentidos de ARN en híbridos. - Muy importante → se utiliza para la síntesis de ADNc ya que va a degradar el ARN de los híbridos ADN-ARN. Se va a usar en análisis de expresión génica en los que vamos a analizar el ARN, pero es muy lábil, con lo que para trabajar con él vamos a pasarlo a ADNc (cuando ya se ha sintetizado al cadena de ADNc se elimina el ARN con la ARNasa H y se duplica la cadena de ADNc, de manera que tendremos ADNc de doble cadena muy estable). ARNASA A/I - Endonucleasa de ARN que corta en sentido 3’→5’. - Cuando queremos obtener ADN libre de ARN vamos a incubar las muestras con esta enzima → preparación de ADN genómico y plasmídico libre de ARN. 6 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 POLIMERASAS DEPENDIENTES DE ADN ADN POLIMERASA I/ E. COLI - Actividad polimerizadora 5’-3’. - También tiene actividad exonucleasa en 5’-3’ y 3’-5’ (esta última es la correctora: la enzima va polimerizando, pero puede volver hacia atrás y corregir). - Se usa para marcar sondas (método de Nick translation) o para eliminar extremos 3’ protuberantes y rellenar huecos. Nick translation La técnica de marcaje consiste en generar una mella con la DNAsaI e incubamos con la ADN polimerasa que va a ir digiriendo y polimerizando con nucleótidos marcados que le vamos a aportar nosotros (va a digerir los nucleótidos de la cadena original y los va a sustituir por nucleótidos marcados) → marcar sondas. Fragmento de Klenow Sin embargo, hay veces que no nos interesa que la enzima tenga la función exonucleasa y podemos quitarle esta función porque tiene varias subunidades, entonces si le quitamos la subunidad que le da la capacidad exonucleasa 5’-3’ obtenemos lo que es el fragmento de Klenow (ADN polimerasa I sin la función exonucleasa 5’-3’). - Polimeriza 5’-3’ - Exonucleasa 3’-5’ (correctora) Lo vamos a usar para marcar sin necesidad de digerir, para la síntesis de ARN complementario junto con la ARNasa H, para eliminar extremos protuberantes, para marcaje interno sin ser Nick translation, etc. Se va a usar en todas estas funciones porque lo que va a hacer es coger el extremo 3’-OH y polimerizar. A mayores puede digerir este extremo protuberante y obtener un extremo romo si es necesario o nos interesa. 7 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 T4 ADN POLIMERASA - Actividad polimerasa 5’-3’ - Actividad exonucleasa 3’-5’ Procede de los virus y tiene una serie de características muy interesantes a nivel de ingeniería genética, la principal es que es mucho más fiel que la ADN polimerasa I (incluido el fragmento Klenow) → cuando queremos sintetizar ADN y que no haya errores, usamos la T4 ADN polimerasa. Como tiene función exonucleasa 3’-5’ también la podemos usar para eliminar extremos sobresalientes y para la síntesis de sondas que sean muy correctas. T7 ADN POLIMERASA - Actividad polimerasa 5’-3’ - Actividad exonucleasa 3’-5’ (correctora) Procede del virus T7 y se utiliza para polimerizar fragmentos muy largos (altamente procesiva: síntesis continua de fragmentos largos de ADN). Antes se usaba mucho la secuenasa que procede de ella (se le quita la actividad exonucleasa). POLIMERASAS TERMOESTABLES - Actividad polimerizadora 5’-3’ a partir de ADN monocatenario cebado - Actividad exonucleasa 5’-3’ - Muy importantes en secuenciación y PCR Ej: Taq (la que más se usa) Pfu Q5 DNA polimerasa: tiene una fidelidad 280 veces mayor que la Taq (para cuando necesitamos hacer amplificación de un fragmento y necesitamos que no haya ningún error). Son polimerasas que proceden de bacterias que viven a altas temperaturas, con lo que las enzimas están adaptadas a esas temperaturas y van a aguantar los cambios de temperatura → estables a altas Tª. Fueron super útiles para la PCR porque permitieron hacer el proceso mucho más rápido y cómodo (antes había que añadir las polimerasas cada vez que se subía la temperatura y no se podían alcanzar temperaturas tan altas porque si no se desnaturalizaban): permiten alcanzar los 90ᵒC y aguantan varios ciclos. 8 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 POLIMERASAS NO DEPENDIENTES DE ADN TRANSFERASA TERMINAL / TERMINAL DESOXYNULEOTIDYL TRANSFERASE (TDT) Hasta ahora hemos visto que las polimerasas necesitaban un molde (ADN) y un extremo 3’-OH, pero existen polimerasas que no necesitan de un molde como es el caso de la transferasa terminal. - Adición de nucleótidos a extremos 3’-OH de ADN sin necesidad de un molde. Esto nos va a interesar para marcar o bien para añadir colas de homopolímeros a un fragmento para después permitir su recombinación con otro (ej: a una cadena se la añaden timinas y a la otra, adeninas, con lo que se van a unir por homología). POLIMERASAS DEPENDIENTES DE ARN TRANSCRIPTASA INVERSA - Polimeriza ADNcs en sentido 5’-3’ a partir de ARNcs - Síntesis de ADNc, RT-PCR, RT-qPCR Viene de los virus y usa de molde ARN para sintetizar ADN (ambos de cadena simple). Va a ser muy útil para estudiar los ARNs celulares pasándolos a ADNc para poder trabajar con el ADNc. Para esto se va a tratar la muestra de ARN de interés con la transcriptasa inversa, después se trata con la ARNasa H para eliminar el ARN y así tener el ADNc libre. Muchas veces, a mayores se va a duplicar la cadena simple de ADNc para tener una cadena doble que va a ser más estable (con Klenow o la ADN polimerasa I) → muy importante para el análisis de expresión génica. La enzima que está en los retrovirus tiene capacidad RNAsa H, pero a las comerciales le quitan esta capacidad para que no esté digiriendo a la vez que está sintetizando (manejamos nosotros todo el proceso: añadimos la transcriptasa inversa para copiar el ARN en ADN, digerimos y sintetizamos la segunda cadena de ADN usando la primera como molde, obteniendo el ADNc). LIGASAS Hasta ahora hemos visto enzimas que nos han permitido preparar los fragmentos, pero después vamos a tener que unirlos. 9 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 T4 ADN LIGASA En laboratorio usamos sobre todo la T4 ADN ligasa que permite establecer un enlace fosfodiéster entre el extremo 5’-P y 3’-OH. Es por esto que va a ser fundamental para la reparación, clonación y toda la ingeniería genética. Permite unir tanto ADN como ADRN de cadena doble o híbridos ADN-ARN. T4 ARN LIGASA Hay otra, que es la T4 ARN ligasa que va a unir ADN y ARN de cadena simple (también en doble, pero es más difícil). Se va usar en el marcaje de ARN y en la circularización de moléculas monocatenarias. ENZIMAS MODIFICADORAS A veces antes de unir vamos a necesitar modificar antes de unir. FOSFATASA ALCALINA Se usa mucho en clonación porque elimina el grupo fosfato del extremo 5’, impidiendo la unión de moléculas y entonces va a inhibir la acción de las ligasas. Va a participar también en la recircularización y en el marcaje del extremo 5-P junto con una quinasa. POLINUCLEÓTIDO QUINASAS Reestablece el grupo fosfato eliminado por la fosfatasa alcalina (añade un fosfato al extremo 5’) bien con la finalidad de unir (ligasa) o con la finalidad de marcar el extremo 5’-P(primero se usa la fosfatasa para eliminar el fosfato normal y luego con la polinucleótida quinasa se añade un fosfato marcado). METILTRANSFERASAS O METILASAS Metilan el ADN transfiriendo un grupo metilo para protegerlo e impedir que se digiera con una enzima de restricción, por ejemplo. Utilizan como sustrato el SAM. 10 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 AISLAMIENTO DE AC NUCLEICOS MUESTRA TOMA DE MUESTRAS La toma de muestras, etiquetado, transporte, procesado y almacenamiento puede afectar los resultados del estudio (calidad y cantidad) → es muy importante hacerlo bien. Para el etiquetado es preferible hacerlo con lápiz porque si lo hacemos con rotulador, al trabajar con alcoholes, se borrará. Para la toma de la muestra hay que tener en cuenta el organismo, el tejido y el ac. nucleico con el que queremos trabajar. - Plantas: son muy diversas entre ellas y complicadas → cada una es un mundo (hay que cambiar todas las condiciones al cambiar de planta). - Animales: no suele haber problemas menos algún tejido dentro de cada especie (ej: el hígado que es más graso en unas especies que en otras). Los moluscos son bastante complicados. Cuando la muestra es sangre se suele usar EDTA como anticoagulante para el ADN porque para este nucleótido es mejor que la heparina. ¿Qué muestra tomar? - Para el ADN vale casi cualquier muestra porque sirven casi todas nuestras células (excepto linfocitos), con lo que podremos llevar a cabo un método no invasivo siempre (ej: células de epitelio con un hisopo en humanos y un cachito de aleta en peces). - Para el ARN (análisis de expresión génica) muchas veces los muestreos invasivos no van a ser posibles y además la inestabilidad va a influir en la toma de la muestra. Hay que tener también cuidado a la hora del material que vamos a usar pues el ADN va a ser muy estable y como acabamos de comentar, el ARN es muy inestable. CONSERVACIÓN Para conservar el ADN se suele meter en alcohol 95-100% y puede estar a 4ᵒC durante mucho tiempo (también se puede congelar sin necesidad de añadir etanol). Puede haber degradación del ADN y aunque hay que evitarla, hay veces que no influye. En el caso de las plantas, la muestra que se toma son hojas que se secan bien y no se van a meter en alcohol. En cuanto al ARN hay que ser muy rápidos, tener todo listo y asegurarnos de trabajar en un medio libre de ARNasas (se compra o se trata). El ARN es muy inestable y en cuanto hay 11 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 degradación ya estamos perdiendo datos. Es muy importante que el tejido esté fresco y que todo el material esté frío. Para la conservación se suelen usar 3 opciones: - RNAlater (RT): se trata de una solución que compramos, en la que vamos a meter el tejido y a dejar a 4ᵒC toda la noche y después la congelamos a ≤ 20ᵒC para una conservación indefinida. Sin embargo no vale para todos los tejidos, pues hay tejidos como en el caso de los huesos y los tejidos cerosos de las plantas, en los que no va muy bien (para estos es mejor usar el N2 líquido). - N2 líquido: está muy frío y las muestras que metamos se van a congelar. Una vez congeladas, las vamos a conservar a -80ᵒC. - Solución monofásica de fenol y tiocianato de guanidina (trizol): es una solución que a veces vamos a usar para extraer el ADN y conservar solo si vamos a usar la muestra después (si no, existen otros métodos para extraer). La conservación también se va a hacer a -80ᵒC (se suele conservar a -80ᵒC excepto en el caso del RNAlater). EXTRACCIÓN ADN 1. Lisis celular: muchas veces implica homogeneización del tejido y sobre todo hay que inactivar las nucleasas (DNAsas o RNAsas). a) Física: en un mortero, sistemas comerciales para homogeneización, sonicación, choque osmótico, etc. b) Química: agentes quelantes (EDTA), detergentes iónicos (SDS), etc. *Quelación: los agentes quelantes secuestran a los cationes, de manera que les estamos quitando a las nucleasas los cofactores y entonces estaremos protegiendo los ácidos nucleicos. * Detergentes iónicos: para actuar en los lípidos. c) Enzimáticos: proteasas (proteinasa K, lisozima, tripsina, etc.) 2. Extracción: separación de los ácidos nucleicos del resto de componentes. Hay muchas maneras de hacerlo y la que elijamos va a depender de si necesitamos un material perdurable y bueno (no podremos usar ciertas técnicas) o si no vamos a necesitar guardar el material y entonces nos da igual. Cuando queremos ADN bueno, íntegro y que vamos a guardar, nos tenemos que ir o a una extracción orgánica o con un kit comercial. a) Orgánica: fenol:cloroformo (1:1) → tóxico (cada vez se usa menos). 12 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 Después de añadir el fenol, centrifugamos y obtenemos 3 fases: una superior acuosa (ADN y ARN), una intermedia blanca (proteínas) y la inferior donde están los restos celulares → nos quedaremos con la acuosa. b) Precipitación selectiva: de alta concentración salina (NaCl) y pH bajo. Al añadir una sal a alta concentración (saturante) van a precipitar las proteínas porque aumenta la fuerza iónica. Después de centrifugar, el ADN va a estar arriba, en la fase acuosa. c) Unión a soporte sólido o uso de microesferas magnéticas: matrices de sílice o resinas de intercambio iónico (kits comerciales) → problema: son muy caros. d) Resinas quelantes: capta los cationes necesarios (cofactores) para las nucleasas, impidiendo que actúen. Es muy sucia (no nos permite medir cuánta cantidad de ADN tenemos) pero muy barata y rápida. 13 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 Las 3 primeras (a, b y c) van a dar lugar a un ADN íntegro y perdurable mientras que la d) la vamos a usar cuando solo vayamos a necesitar el ADN para un PCR o para analizarlo. La extracción va a depender también del tipo de ADN, pues hay tipos de extracción que van a necesitar ADN súper íntegro (alto peso molecular), de manera que la técnica que usemos tiene que afectar muy poco a la integridad (muchas veces no es fácil conseguir un ADN tan íntegro). **Tratamiento con ARNasas Queremos trabajar con ADN y que no haya ARN que nos pueda interferir, y para eso vamos a usar la ARNasa A (la H es para los híbridos). 3. Purificación y concentración: una vez que tenemos el ADN separado del resto de lo que había en la célula, vamos a precipitarlo con alcohol (para poder quedarnos solo con el ADN). Precipitamos el ADN con alcohol porque compite por el agua que tiene el ADN disuelto: la va a secuestrar y el ADN ya no va a estar interaccionando con el agua y precipita. Se usan alcoholes fríos porque precipitan mejor. - Etanol: se usan 2.5 volúmenes frente al volumen que hay (ej: si tenemos 100 μL, echamos 250 μL de etanol). - Isopropanol: llega con una cantidad (ej: 100 μL – 100 μL) Se hace un primer lavado con el alcohol absoluto, se centrifuga y se hace un segundo lavado con etanol al 70% para eliminar los restos de sales que puedan quedar (después del segundo lavado volvemos a centrifugar). 4. Disolución: H2O libre de DNAsas, TE (Tris-EDTA). Si usamos un kit comercial este va a traer su propio buffer de elución. *TE: como lleva EDTA, protege el ADN de las nucleasas (lo vimos antes). 5. Conservación: muy estable con lo que se puede conservar a -20ᵒC indefinidamente (a 4ᵒC aguanta pero tiende a evaporarse, con lo que es mejor congelarlo y usar una temperatura de -80ᵒC no tiene sentido). 14 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 ARN Es mucho más complicado que trabajar con el ADN ya que las ribonuleasas (ARNasas) son muy estables y activas y el ARN se va a degradar con mucha facilidad. Hay que tener material para extraer ADN y ARN y a ser posible en salas separadas para que no haya interferencias. Todo el material que use para el ARN tiene que estar esterilizado y libre de RNAsas (comprado o tratado con DEPC al 0,1% y después se autoclava). Hay que trabajar rápido y en frío, con guantes dobles y cambiarlos frecuentemente, no hablar y mantener los tubos cerrados. Lisis, extracción, purificación y disolución: a) Orgánica: extraemos el ARN con una solución orgánica llamada trizol (fenol con tiocianato de guanidinio) que va a inhibir a las RNAsas* porque es un potente desnaturalizante de proteínas. Tiene el mismo problema que el fenol, que es tóxico. Se sigue el mismo procedimiento que para el ADN y vamos a tener 3 fases: acuosa superior (ARN), intermedia (ADN) y la inferior con todos los compuestos orgánicos precipitados. *Mientras tengamos la muestra en trizol no pasa nada, pero en cuanto la saquemos podrá haber degradación. b) Unión a soporte sólido: hay otro método usando kits comerciales (hay muchos que están dirigidos al ARNm con su cola poli-A). ** Tratamiento con DNAsas En cualquier análisis de transcriptómica hay que tratar el ARN con DNAasas ya que el ADN puede interferir en los análisis. Se va a usar la DNAsa I. 15 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 Una vez extraído el ARN, hay que conservar a -80ᵒC. Cuando trabajamos con ARN hay que mantenerlo en hielo y no puede estar mucho tiempo, hay que volver a ponerlo a -80ᵒC cuanto antes porque si no también habrá degradación → ARN muy lábil ( se degrada). No se debe congelar y descongelar continuamente porque eso le afecta, entonces es mejor hacer alícuotas (para no andar congelando y descongelando). CUANTIFICACIÓN CANTIDAD Y CALIDAD (PUREZA E INTERGRIDAD) ESPECTROFOTOMETRÍA UV Puede usarse la espectrometría UV para determinar la concentración y pureza (no integridad) Es sencillo, rápido y barato. Los ácidos nucleicos absorben a 260 y los compuestos aromáticos (proteínas, fenol trizol,...) a 230-280, entonces se va a medir a estas 3 longitudes de onda para ver si en la muestra tenemos cosas que no son ácidos nucleicos. La cantidad se mide con la absorbancia a 260nm y la calidad con la ratio A260/280. Ratio A260/280: Cuando hay ratios menores al valor ideal hay contaminación que puede deberse a que hemos arrastrado proteínas (280nm) o fenol-trizol (230/270 nm)de haberlo usado. Otra ratio que se va a usar es A260/230, donde vamos a tener posible contaminación por sales, fenoles, carbohidratos (típico de plantas) EDTA,... En A260/230 tenemos una pureza óptima en 1.8-2.2 y por debajo de este valor habrá contaminación por alguno de compuestos de los que hemos mencionado. 16 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 Tabla resumen para el ADN En el laboratorio para la cuantificación usamos el nanodrop, que nos permite medir la concentración y las ratios sin cubeta con 1 μL (pueden llegar a usarse 0,5 μL pero es complicado). Es muy fácil de usar y muy rápido. El problema es que mide más cosas a parte del ADN (suele hacer sobre estimas), entonces no se puede usar para cuantificar la cantidad exacta de ADN. Cuando queremos hacer esto usamos un fluorímetro. 17 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 FLUORIMETRÍA Añadimos a la muestra un colorante (fluoróforo) que se va a unir específicamente al ácido nucleico. Fluoróforos: Picogreem, y SYBR-Green para ácidos de doble cadena (ADN) y Ribogreen, para ácidos nucleicos de una cadena (ARN). Fluorimetría: para determinar la concentración e integridad (no pureza). Es preciso y sensible (nos da una medida precisa) pero es más caro y laborioso. Para medir la fluorescencia en el laboratorio usamos el Qubit. La relación al nanodrop es inferior a 1 (la medida del nanodrop a veces es el doble de la que nos da el qubit → el nanodrop sobreestima). ELECTROFORESIS Electroforesis de agarosa: concentración e integridad. Barato. Se usa principalmente para ver la integridad (hasta ahora hemos visto pureza y cantidad) porque podemos tener mucho ácido nucleico pero que esté roto y que entonces no nos sirva. Se trata de una electroforesis hecha en agarosa (matriz) en la que se van a generar poros a través de los cuales se van a mover los ácidos nucleicos (hacia el polo positivo) en función de su tamaño. Para poder ver el ADN tenemos que añadirle al gel un producto comercial y entonces lo podr emos ver con luz UV. Lo mismo ocurre con el ARN. ADN ARN Marcador de peso molecular 18 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 A veces en la propia migración, el ADN se degrada, entonces es muy bueno para ver la calidad del ADN. Electroforesis microfluidica: concentración e integridad. Preciso y sensible, pero caro y laborioso. La electroforesis tiene lugar en un chip. El equipo que se usa asociado a la electroforesis es el Bioanalyzer y resulta muy útil para ARN, aunque también sirve para ADN. El equipo nos da un número RIN/DIN que nos indica la integridad del RNA/DNA siendo un 1 (alto nivel de degradación) y 10 (muestra íntegra) → ponemos el umbral en 7,5 (no usamos muestras con una puntuación a no ser que sea estrictamente necesario. Vamos a usar la electroforesis microfluida para mirar la integridad, a la concentración no le hacemos mucho caso (preferimos nanodrop o qubit). HIBRIDACIÓN MOLECULAR Desnaturalización/renaturalización: permite detectar secuencias concretas de ácidos nucleicos o dianas mediante el empleo de sondas marcadas. Rigor: parámetros que usamos en la hibridación para que sea más astringente o no (que se una a otras regiones o solo a la que nos interesa). Para esto usamos sondas marcadas, para lo que podemos usar distintos métodos: nucleótidos marcados con fluoróforos, de manera indirecta (enzimática), etc. ¿Cómo podemos marcar? a) Nick translation: si usamos la DNAsa I para hacer una mella y después con la ADN pol I que va digiriendo (actividad exonucleasa 5’-3’) y a la vez va a ir uniendo los nucleótidos marcados (vamos generando una hebra marcada). Después podemos desnaturalizar y quedarnos solo con la hebra marcada). a) Random priming: generamos cebadores que se van a ir uniendo al azar a distintas regiones del ADN y con la klenow añadimos nucleótidos marcados. b) Primer extensión/PCR (lo que ocurre en la PCR): sabemos qué región queremos y creamos un primer específico para esa región, entonces con la Klenow añadimos nucleótidos marcados. 19 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 c) Fosfatasa alcalina/quinasa: primero elimina el fosfato del final y luego la quinasa añade un fosfato marcado. d) Transferasa terminal: esta enzima era capaz de añadir nucleótidos sin moldes. Entonces si le proporcionamos nucleótidos marcados esta los va a añadir al extremo 3’ de una molécula, marcándola. e) Marcaje terminal por relleno: con una enzima de restricción generamos extremos cohesivos y con la polimerasa o la klenow rellenamos los huecos que quedan con nucleótidos marcados. 20 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 f) Marcaje indirecta biotina: la sonda está unida a biotina o digoxigenina y va a ser reconocida por una reacción secundaria (hay otra molécula/reacción secundaria que va a reconocer a la biotina o a la digoxigenina): en el caso de la biotina se usa la estreptavidina que va a estar marcada con un fluoróforo o con una reacción molecular que usa un sustrato que dará un color cuando la estraptavidina está presente (reacción colorimétrica); en el caso de la ribosigenina se usa una molécula o un anticuerpo. Se ha usado mucho, sobre todo en hibridación in situ de cromosomas porque podemos hacer que la señal aumente muchísimo haciéndose una reacción múltiple (la señal se va a detectar mucho mejor). En resumen, los métodos de detección pueden ser directos (radioactividad con fósforo 32 y fluorescencia) o indirectos (fluorescencia o colorimetría). En los métodos directos lo que más se usa es la fluorescencia, el fósforo 32 ya casi no se usa. 21 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 HIBRIDACIÓN EN FASE LÍQUIDA Tenemos el ácido nucleico en medio líquido: desnaturalizamos y ponemos en contacto con la sonda marcada y vemos si hay hibridación (moléculas de doble cadena) y entonces detectamos si está la región de interés. Hoy en día casi no se usa. HIBRIDACIÓN EN MEDIO SÓLIDO Es la que más se usa. HIBRIDACIÓN IN SITU - FLUORESCENTE (FISH) Se hace en la molécula; es la que más conocemos. La más famosa es la hibridación in situ de los cromosomas, que se utiliza para saber en qué cromosoma está cierto gen/regiones particulares (podemos detectar el núcleo). Es la que se usa para hacer los cariotipos: vamos a tener las preparaciones cromosómicas en el portaobjetos, y ahí es donde se hibrida la sonda. Se usa también para ver aberraciones cromosómicas en el cáncer: marcamos cada par con una sonda para poder localizarlo y observamos traslocaciones, inversiones, etc. 22 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 También lo vimos en el tema de regulación en la inactivación del cromosoma X: localizamos en el núcleo del cromosoma X inactivado (Xi) el tránscrito de Xist, que es ARNnc (rojo en la imagen). Mientras, en el X activado (Xa, no hay expresión y en ambos vamos a ver en amarillo el ADN. En el tema de desarrollo lo vimos también para localizar los ARNm de bitcoid, nanos, etc. HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO Permite la transferencia de ADN, ARN o proteínas de un gel a un soporte sólido (membrana). Southern Northern Western Transferencia ADN ARN Proteínas Detección (sonda) ADN ADN Anticuerpo Proceso: Se corre en un gel el ADN, ARN o las proteínas (en estas últimas el gel es vertical y de poliacrilamida, mientras que en ADN y ARN usamos sobre todo agarosa) y después de hacer la electroforesis colocamos una membrana encima del gel y transferimos. La transferencia se hará por capilaridad: se pone el gen en un soporte que consta de una cubeta con un buffer y después se pone la membrana encima del gel y papel encima de la membrana, y entonces por capilaridad va a ir subiendo y se va a transferir a la membrana. Después se fija a la membrana con un cross- linking con UV y entonces hibridamos con la sonda. 23 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 Hay otro tipo de soporte sólido que es el microarray, un portaobjetos en el que nosotros no vemos nada pero que tiene múltiples copias de una región del genoma (puntitos de la imagen). Cada uno de los puntitos es una sonda para un gen y la usamos para saber si el gen se ha expresado o no en la muestra (para detectar tenemos que hibridar las sondas). En un micorarray podemos analizar miles de genes a la vez. Tenemos también chips de snips para genotipar. En estos chips hay miles de snips que se van a usar para saber que genotipo tiene el individuo para cada uno de esos loci de snips (es lo que más se usa ahora). REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Nos permite amplificar una molécula a miles de copias con las que trabajaremos después. Para realizar esta ampliación necesitamos tener información previa para poder diseñar los primers (ahora podemos secuenciar el genoma, pero antes se usaba la secuenciación de las proteínas → con la secuencia de aminoácidos sabemos los codones posibles y en base a ello diseñamos los primers). La CPR es exponencial, y cada vez que finaliza un ciclo vamos a tener 2n copias/amplicones, y se hace con el mismo mecanismo que se hace la replicación en las células con lo que necesitamos aportar: - muestra - primers (forward y reverse), - dNTP - polimerasa (polimerasas termoestables: Taq, Pfu polimerasas, Q5 DNA polimerasa) - magnesio (cofactor). Material: Los tubos que usamos para hacer la PCR son de plástico ultrafino para poder transmitir bien y rápido los cambios de temperatura → la PCR se conoce como clonación in vitro porque ocurre en un tubo de ensayo. El termociclador se programa para que lleve a cabo la desnaturalización, la unión de los primers, etc. En el programa de PCR se cambia la temperatura de anillamiento de los primers porque cada pareja de primers tiene su temperatura adecuada. El proceso comienza con una desnaturalización inicial, a la que le sigue todo el bloque de ciclos de amplificación, y finaliza con una polimerización adicional por si quedara alguna polimerización incompleta en algún ciclo. Cada ciclo consta de 3 fases: 24 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 1. Desnaturalización del ADN (95ᵒC) 2. Anillamiento de los primers (55ᵒC - 60ᵒC). 3. Polimerización (72ᵒC) Parámetros que podemos modificar: Nos interesa diseñar primers con temperaturas más altas (60ᵒC) porque son más astringentes y así evitamos que se unan a regiones que no queremos → cuando diseñamos primers tenemos que elegir los que tienen una temperatura más alta. La polimerasa usa el magnesio como cofactor y podemos jugar con la cantidad de magnesio para modular la especificidad. Muchas veces que hay que jugar con todos estos parámetros, incluso con la cantidad de polimerasa, ya que los primers llega un punto en el que, si se sube mucho la temperatura, no se van a pegar. Otro parámetro que se puede cambiar es el tiempo. Para fragmentos más largos habrá que dejar más tiempo de incubación para que la polimerasa pueda actuar sobre todo el fragmento. La PCR/clonación in vitro sustituyó en gran muchos procedimientos a la clonación in vivo (sigue siendo necesaria) porque es mucho más sencilla, rápida y muy sensible. El único problema es que necesitamos los primers. Las polimerasas termoestables han facilitado muchísimo la PCR y en función de lo que queramos amplificar nos vamos a una Taq o a una Q5 DNA polimerasa, porque la Taq comete errores. Tenemos distintos tipos de PCR: PCR normal: a partir de ADN sintetizamos ARN. RT-PCR: PCR a partir de ARN, con lo que primero habrá que transcribir el ARN a ADN de cadena doble (retrotranscriptasa). QPCR (PCR cuantitativa): en las anteriores PCR no estamos cuantificando, solo amplificando. Para cuantificar cuánto se está produciendo tenemos que añadir algo que identifique las 25 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 moléculas que se están produciendo y hay que añadirlo cada vez que se hace un ciclo. Entonces, en la QPCR se cuantifica en cada ciclo las moléculas que se están generando, lo que nos permite cuantificar lo que había al inicio. Q-RT-PCR: PCR cuantitativa a partir de ARN. Nos sirve para saber cuánto se estaba expresando un gen a partir del ARN. Muchas veces cuando se habla de QPCR se están refiriendo a este tipo. PCR digital: se está haciendo ahora muchísimo y que sustituye a la QPCR/Q-RT-PCR porque es más sensible y precisa → se hace una cuantificación absoluta (en la Q-PCR hay que comparar) dividiendo la muestra en miles de submuestras, de manera que en cada submuestra habrá una o ninguna copia del gen de interés. Después se hace una PCR de cada una de las submuestras (donde esté el gen habrá amplificación) y se compara cuántas submuestras son positivas y entonces sabemos cuánta cantidad había en un principio. EQUEMA RESUMEN 26 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 Por último, comentar que podemos hacer PCR simples, en las que se amplifica un solo fragmento (singleplex), o amplificar a la vez en el mismo tubo varias regiones (multiplex), añadiendo todos los cebadores a la vez. SECUENCIACIÓN SANGER Se basa en el uso de nucleótidos modificados (dideoxinucleótidos, ddNTP): en la posición 3’ de la base hay un H en lugar de un OH, con lo que una vez que se une un dideoxinucleótido no se van a poder unir más nucleótidos a él y se para la secuenciación. En la mezcla de reacción se van a añadir muchos nucleótidos normales y unos pocos ddNTP y entonces a veces se unirá un nucleótido normal (la secuenciación sigue) y otras uno dideoxi (la secuenciación se para). → secuenciación dideoxi. En un tubo vamos a tener varias copias del fragmento de interés y el dd que estemos usando en ese tubo (ddT, ddA, ddC o ddG) se unirá en cada fragmento en una posición diferente. Haremos esto en varios tubos, uno para cada ddNTP (van a estar marcados para diferenciarlos de los nucleótidos normales). Luego correremos todos los fragmentos en un gel de poliacrilamida y tendremos la secuenciación del fragmento → la dirección del gel es 5’ (abajo) – 3’ (arriba): el fragmento que esté más abajo será el primero de la cadena molde (más pequeño) y si este es una C, en el gel veremos una ddG y así con el resto de los fragmentos. 27 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 SECUENCIACIÓN DE SANGER AUTOMÁTICO Los secuenciadores automáticos son electroforesis capilares que tienen un láser, de manera que si marcamos los ddNTP con fluorescencia (un color asociado a cada ddNTP) van a ser detectados cuando pasen por el secuenciador, que va a leer los fragmentos y hace la conversión (ej: A→T) y al final nos da la secuencia de la cadena molde (hace lo que nosotros hacíamos antes). A parte de que hace el trabajo por nosotros, es también más cómodo porque antes necesitábamos 4 tubos diferentes (uno por cada reacción /dideoxinucleótido), pero ahora se hace todo en un tubo. A parte también había que tratar los geles con AgNO3. En los secuenciadores automáticos nosotros simplemente tenemos que meter la muestra y el primer (la máquina se va a encargar de hacer la reacción) y luego ponerla en el secuenciador. SANGER VS. NGS La nueva secuenciación es una gran ventaja, pero Sanger sigue siendo necesaria porque necesitamos secuenciar genes concretos y cosas pequeñas, y los nuevos equipos que se usan para grandes proyectos de genomas o transcriptomas no valen para eso. Además, aunque las nuevas tecnologías de secuenciación están mejorando, Sanger tiene menos error → el método estándar de secuenciación sigue siendo Sanger. La primera generación de secuenciadores llega con Sanger que es una técnica que implica clonar in vivo y lleva mucho tiempo y es muy cara (capacidad de secuenciación muy pequeña → se tardó 10 años en secuenciar el genoma humano). 28 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 Gracias al avance tecnológico se consiguió abaratar muchísimo la secuenciación a través de la secuenciación masiva paralela (hacemos miles de secuencias a la vez, en una sola carrera). El mayor salto fue pasar de la clonación in vivo a la clonación in vitro (PCR) → mucho más rápido. En la segunda generación de secuenciadores vamos a juntar las dos cosas (muchas secuencias a la vez y PCR), abaratando muchísimo el coste y reduciendo mucho también el tiempo. El problema de los secuenciadores de primera y segunda generación es que para poder secuenciar necesitamos amplificar y trocear (hacemos secuencias muy pequeñas): no somos capaces de secuenciar un genoma de corrido y necesitamos amplificar para tener señal suficiente para poder leer. Esto se soluciona con la tercera generación de secuenciadores (vamos a poder leer el ADN directamente) → hay dos tecnologías (secuenciación de moléculas en tiempo real): - Una lee el ADN directamente - La otra polimeriza a partir de una sola copia (no hay que amplificar) Ambas son capaces de leer fragmentos muy largos (4,2 MB) de corrido, aunque todavía no somos capaces de leer un genoma entero. Esto facilita muchísimo el montaje, en especial de genomas grandes. 29 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10910559 Tema 8: Clonación in vivo En la naturaleza tenemos clones: los gemelos y todos los organismos con reproducción asexual. De manera artificial, tenemos 3 maneras de clonación: 1. Clonación genética: vamos a generar copias de un gen o un fragmento. Es la que vamos a ver con la clonación in vivo. 2. Clonación reproductiva: consiste en conseguir organismos genéticamente idénticos. 3. Clonación terapéutica: utiliza los