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Questions and Answers

¿Cuál es la función principal de la transferasa terminal?

  • Agregar nucleótidos a extremos 5'-OH
  • Sintetizar ARN a partir de ADN
  • Polimerizar ADN en sentido 3'-5'
  • Añadir nucleótidos a extremos 3'-OH sin un molde (correct)

¿Cuál de las siguientes afirmaciones describe mejor la transcriptasa inversa?

  • Se usa exclusivamente para la síntesis de ARN
  • Polimeriza ADN en sentido 5'-3' usando ARN como molde (correct)
  • Convierte ADN en ARN utilizando un molde de ADNc
  • Funciones similares a la ADN polimerasa I

¿Qué se utiliza para eliminar el ARN en el proceso de síntesis de ADNc?

  • Klenow
  • ADN polimerasa I
  • ARNasa H (correct)
  • Transferasa terminal

¿Qué técnica se utiliza para estudiar la expresión génica a partir de ARN?

<p>RT-PCR (B)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el propósito de añadir colas de homopolímeros a un fragmento de ADN?

<p>Facilitar la recombinación con otro ADN (D)</p> Signup and view all the answers

¿Qué se logra al utilizar Klenow o la ADN polimerasa I tras la síntesis de ADNc?

<p>Duplicación de la cadena simple de ADNc a una cadena doble (B)</p> Signup and view all the answers

Los virus que utilizan ARN como molde para sintetizar ADN son características de:

<p>Polimerasas dependientes de ARN (D)</p> Signup and view all the answers

¿Qué tipo de polimerasa se caracteriza por no requerir un molde?

<p>Transferasa terminal (B)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es una de las principales ventajas de los secuenciadores automáticos sobre los métodos tradicionales?

<p>Realizan la secuenciación de múltiples reacciones en un solo tubo. (C)</p> Signup and view all the answers

¿Por qué el método de secuenciación Sanger sigue siendo relevante a pesar de las nuevas tecnologías?

<p>Porque se necesita para secuenciar genes concretos y secuencias pequeñas. (D)</p> Signup and view all the answers

¿Qué color se utiliza en la marcación de los ddNTP en los secuenciadores automáticos?

<p>Un color específico asociado a cada ddNTP. (B)</p> Signup and view all the answers

¿Qué método se usaba anteriormente antes de la llegada de los secuenciadores automáticos?

<p>Secuenciación de Sanger sin automatización. (B)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre los secuenciadores automáticos es incorrecta?

<p>Los resultados son menos confiables que los obtenidos por métodos manuales. (A)</p> Signup and view all the answers

¿Qué técnica permite la lectura de fragmentos de ADN en los secuenciadores automáticos?

<p>Electroforesis capilar. (A)</p> Signup and view all the answers

La nueva tecnología de secuenciación NGS es ideal para:

<p>Proyectos de gran envergadura como genomas o transcriptomas. (C)</p> Signup and view all the answers

En comparación con el método Sanger, NGS generalmente presenta:

<p>Mayor rapidez y costo reducido por muestra. (B)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál es el equipo utilizado en la electroforesis microfluida para evaluar la integridad del ARN y ADN?

<p>Bioanalyzer (A)</p> Signup and view all the answers

En la electroforesis microfluida, ¿cuál es el umbral establecido para la integridad de las muestras?

<p>7,5 (B)</p> Signup and view all the answers

¿Qué técnica se utiliza para detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos en la hibridación molecular?

<p>Desnaturalización/renaturalización (A)</p> Signup and view all the answers

¿Cuál de los siguientes métodos se utiliza para marcar nucleótidos en la hibridación molecular?

<p>Nick translation (C)</p> Signup and view all the answers

¿Qué indicador es utilizado para evaluar el nivel de degradación de ARN en el Bioanalyzer?

<p>RIN/DIN (A)</p> Signup and view all the answers

Cuál es uno de los métodos indirectos usados para marcar sondas en la hibridación molecular?

<p>Marcaje enzimático (C)</p> Signup and view all the answers

Al analizar la electroforesis microfluida, ¿qué técnica es preferida para determinar la concentración de la muestra?

<p>Nanodrop o Qubit (C)</p> Signup and view all the answers

¿Qué importancia tiene el rigor en el proceso de hibridación?

<p>Aumenta la especificidad en la detección (B)</p> Signup and view all the answers

Flashcards

Secuenciación Sanger

Método estándar de secuenciación de ADN que sigue siendo necesario para secuenciar genes o regiones específicas de ADN.

Secuenciadores automáticos

Electroforesis capilar que usa láser para detectar ddNTP marcados con fluorescencia, automatizando el proceso de secuenciación de ADN.

ddNTP

Dideoxinucleótidos que detienen la reacción de polimerización, cruciales para la secuenciación Sanger.

Fluorescencia en secuenciación automática

Cada ddNTP tiene un color asociado; el secuenciador lo detecta, lo que permite leer la secuencia de ADN.

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Ventajas de secuenciadores automáticos

Automatizan la secuenciación, reduciendo el tiempo y los pasos necesarios, además de ser más cómodo que la técnica manual.

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Limitaciones de NGS

Métodos de secuenciación de nueva generación (NGS) no son adecuados para secuenciar genes específicos o regiones pequeñas de ADN; el método Sanger es más preciso para esas tareas.

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Electroforesis capilar

Técnica para separar fragmentos de ADN basada en el movimiento de los fragmentos a través de un capilar bajo un campo eléctrico.

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Análisis de secuenciación de nueva generación (NGS)

Tecnología de secuenciación que produce mayor cantidad de datos de secuenciación en menor tiempo útil en proyectros de genomas o transcriptomas.

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Polimerasa no dependiente de ADN

Una enzima que añade nucleótidos a extremos 3'-OH del ADN sin necesidad de un molde.

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Transferasa terminal (TDT)

Un tipo de polimerasa no dependiente de ADN que añade nucleótidos a extremos 3'-OH del ADN sin molde.

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Polimerasa dependiente de ARN

Enzima que sintetiza ADN a partir de un molde de ARN.

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Transcriptasa inversa

Una polimerasa dependiente de ARN que crea ADN a partir de ARN como molde.

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Síntesis de ADNc

Proceso de creación de ADN complementario de ARN usando transcriptasa inversa.

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RT-PCR

Técnica que usa transcriptasa inversa y PCR para amplificar ARN.

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RT-qPCR

Técnica que mide la cantidad de un ARN usando transcriptasa inversa y qPCR.

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Electroforesis microfluídica

Técnica que utiliza chips para separar fragmentos de ADN o ARN basados en su tamaño y carga eléctrica.

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Bioanalyzer

Equipo específico que se usa para la electroforesis microfluídica, útil para analizar la integridad del ARN y el ADN.

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RIN/DIN

Números que indican la integridad del ARN (RIN) o el ADN (DIN) en una muestra, con un rango de 1 (alto nivel de degradación) a 10 (muestra íntegra).

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Hibridación molecular

Técnica que utiliza sondas marcadas para detectar secuencias específicas de ADN o ARN.

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¿Qué es el rigor en hibridación?

Parámetros que se ajustan en la hibridación para controlar la afinidad de las sondas con las secuencias diana, siendo más astringente (se une solo a la secuencia específica) o menos estricto (que admite más variaciones).

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¿Cómo se marcan las sondas?

Las sondas se marcan con fluoróforos o mediante métodos enzimáticos para poder ser detectadas.

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Nick translation

Método de marcado de sondas que utiliza DNAsa I para generar mellas en el ADN, luego la ADN pol I va digiriendo y uniendo nucleótidos marcados.

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Desnaturalización/renaturalización

Proceso de separación de las hebras de ADN o ARN por calor o químicos, y posterior unión de las hebras complementarias.

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Study Notes

Técnicas Genéticas de Análisis Molecular

  • La ingeniería genética manipula el ADN, a menudo transfiriéndolo de un organismo a otro. Se utiliza para producción de fármacos y más.

Enzimología para la Manipulación de Ácidos Nucleicos

  • La ingeniería genética requiere cortar, modificar y unir ADN de diferentes fuentes para generar ADN recombinante, clonarlo e identificar las moléculas resultantes.

  • Enzimas clave incluyen enzimas de restricción (endonucleasas), nucleasas, polimerasas y ligasas. Estas enzimas actúan sobre el ADN de manera natural en virus y bacterias.

Enzimas de Restricción

  • Descubiertas por W. Arber, que identificaron su capacidad de cortar secuencias específicas de ADN.

  • Las enzimas de restricción son un sistema de defensa en procariotas contra ADN exógeno, como fagos o plásmidos.

  • Existen 4 tipos, diferenciándose en cómo se produce la metilación y la restricción, el mecanismo de reconocimiento y corte de secuencias.

  • El tipo II (más usado) corta ADN dentro de la secuencia reconocida, normalmente palíndromas de 4 a 8 pares de bases.

Secuencias Palindrómicas

  • Las enzimas de restricción reconocen secuencias palindrómicas de ADN; ej. 5'-GCATCC-3' y 3'-CCTAGG-5'.
  • El número de nucleótidos en la secuencia de reconocimiento afecta directamente el número de fragmentos que resulta de la digestión.

Isoesquizómeros

  • Son enzimas que reconocen la misma secuencia, pero pueden cortar de manera diferente dependiendo de la bacteria de origen.
  • Son útiles en investigación por su uniformidad en reconocimiento y variabilidad en corte.

Tipos de Corte

  • Algunos productos de la digestión son extremos romos, cortando ambos hilos en la misma base.

  • Otros producen extremos cohesivos (pegajosos o en escalera) cuando corta a diferentes niveles en cada hebra.

Aplicaciones de Enzimas de Restricción

  • Las enzimas de restricción son útiles para la digestión total o parcial del ADN en fragmentos más pequeños para generar mapas de restricción, lo que ayuda en la identificación de genes.

  • Son útiles en la digestión parcial del ADN para montar genomas.

Otras Nucleasas de ADN

  • ADNasa I: endonucleasa que digiere ADN libre de nucleosomas, preferentemente de doble cadena. Puede cortar de forma aleatoria dependiendo del cofactor (Mg²+ o Mn²⁺).

  • Nucleasa SI: endonucleasa de ácidos nucleicos (ADN y ARN) monocatenarios.

Polimerasas Dependientes de ADN

  • T4 ADN polimerasa: Polimerasa con alta fidelidad, capaz de eliminar extremos sobresalientes y sintetizar ADN.

  • T7 ADN polimerasa: Polimerasa para la polimerización de fragmentos largos de ADN.

  • Polimerasas termoestables: Son importantes para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estas enzimas son resistentes a altas temperaturas, lo que permite ciclos repetitivos de amplificación de ADN. Ej. Taq, Pfu, y Q5.

Polimerasa Terminal de ADN

  • Es una polimerasa que no necesita un molde para añadir nucleótidos a los extremos 3'-OH del ADN. Se usa a menudo para añadir colas de homopolímeros a los fragmentos de ADN para la recombinación.

Ligasas

  • Las ligasas, como la T4 ADN ligasa, unen fragmentos de ADN con extremos cohesivos o romos (mediante enlaces fosfodiéster) para crear una molécula de ADN completa.

Enzimas Modificadoras (ej. Fosfatasa alcalina)

  • Fosfatasa alcalina: Elimina grupos fosfato de los extremos 5' del ADN. Esto evita la autoligación del ADN e interfiere con la acción de las ligasas. Usualmente, la quinasa lo utiliza para marcar.

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