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Questions and Answers
¿Cuál es la función principal de la transferasa terminal?
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¿Cuál de las siguientes afirmaciones describe mejor la transcriptasa inversa?
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¿Qué se utiliza para eliminar el ARN en el proceso de síntesis de ADNc?
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¿Qué técnica se utiliza para estudiar la expresión génica a partir de ARN?
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¿Cuál es el propósito de añadir colas de homopolímeros a un fragmento de ADN?
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¿Qué se logra al utilizar Klenow o la ADN polimerasa I tras la síntesis de ADNc?
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Los virus que utilizan ARN como molde para sintetizar ADN son características de:
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¿Qué tipo de polimerasa se caracteriza por no requerir un molde?
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¿Cuál es una de las principales ventajas de los secuenciadores automáticos sobre los métodos tradicionales?
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¿Por qué el método de secuenciación Sanger sigue siendo relevante a pesar de las nuevas tecnologías?
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¿Qué color se utiliza en la marcación de los ddNTP en los secuenciadores automáticos?
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¿Qué método se usaba anteriormente antes de la llegada de los secuenciadores automáticos?
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¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre los secuenciadores automáticos es incorrecta?
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¿Qué técnica permite la lectura de fragmentos de ADN en los secuenciadores automáticos?
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La nueva tecnología de secuenciación NGS es ideal para:
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En comparación con el método Sanger, NGS generalmente presenta:
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¿Cuál es el equipo utilizado en la electroforesis microfluida para evaluar la integridad del ARN y ADN?
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En la electroforesis microfluida, ¿cuál es el umbral establecido para la integridad de las muestras?
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¿Qué técnica se utiliza para detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos en la hibridación molecular?
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¿Cuál de los siguientes métodos se utiliza para marcar nucleótidos en la hibridación molecular?
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¿Qué indicador es utilizado para evaluar el nivel de degradación de ARN en el Bioanalyzer?
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Cuál es uno de los métodos indirectos usados para marcar sondas en la hibridación molecular?
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Al analizar la electroforesis microfluida, ¿qué técnica es preferida para determinar la concentración de la muestra?
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¿Qué importancia tiene el rigor en el proceso de hibridación?
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Study Notes
Técnicas Genéticas de Análisis Molecular
- La ingeniería genética manipula el ADN, a menudo transfiriéndolo de un organismo a otro. Se utiliza para producción de fármacos y más.
Enzimología para la Manipulación de Ácidos Nucleicos
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La ingeniería genética requiere cortar, modificar y unir ADN de diferentes fuentes para generar ADN recombinante, clonarlo e identificar las moléculas resultantes.
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Enzimas clave incluyen enzimas de restricción (endonucleasas), nucleasas, polimerasas y ligasas. Estas enzimas actúan sobre el ADN de manera natural en virus y bacterias.
Enzimas de Restricción
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Descubiertas por W. Arber, que identificaron su capacidad de cortar secuencias específicas de ADN.
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Las enzimas de restricción son un sistema de defensa en procariotas contra ADN exógeno, como fagos o plásmidos.
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Existen 4 tipos, diferenciándose en cómo se produce la metilación y la restricción, el mecanismo de reconocimiento y corte de secuencias.
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El tipo II (más usado) corta ADN dentro de la secuencia reconocida, normalmente palíndromas de 4 a 8 pares de bases.
Secuencias Palindrómicas
- Las enzimas de restricción reconocen secuencias palindrómicas de ADN; ej. 5'-GCATCC-3' y 3'-CCTAGG-5'.
- El número de nucleótidos en la secuencia de reconocimiento afecta directamente el número de fragmentos que resulta de la digestión.
Isoesquizómeros
- Son enzimas que reconocen la misma secuencia, pero pueden cortar de manera diferente dependiendo de la bacteria de origen.
- Son útiles en investigación por su uniformidad en reconocimiento y variabilidad en corte.
Tipos de Corte
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Algunos productos de la digestión son extremos romos, cortando ambos hilos en la misma base.
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Otros producen extremos cohesivos (pegajosos o en escalera) cuando corta a diferentes niveles en cada hebra.
Aplicaciones de Enzimas de Restricción
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Las enzimas de restricción son útiles para la digestión total o parcial del ADN en fragmentos más pequeños para generar mapas de restricción, lo que ayuda en la identificación de genes.
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Son útiles en la digestión parcial del ADN para montar genomas.
Otras Nucleasas de ADN
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ADNasa I: endonucleasa que digiere ADN libre de nucleosomas, preferentemente de doble cadena. Puede cortar de forma aleatoria dependiendo del cofactor (Mg²+ o Mn²⁺).
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Nucleasa SI: endonucleasa de ácidos nucleicos (ADN y ARN) monocatenarios.
Polimerasas Dependientes de ADN
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T4 ADN polimerasa: Polimerasa con alta fidelidad, capaz de eliminar extremos sobresalientes y sintetizar ADN.
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T7 ADN polimerasa: Polimerasa para la polimerización de fragmentos largos de ADN.
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Polimerasas termoestables: Son importantes para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estas enzimas son resistentes a altas temperaturas, lo que permite ciclos repetitivos de amplificación de ADN. Ej. Taq, Pfu, y Q5.
Polimerasa Terminal de ADN
- Es una polimerasa que no necesita un molde para añadir nucleótidos a los extremos 3'-OH del ADN. Se usa a menudo para añadir colas de homopolímeros a los fragmentos de ADN para la recombinación.
Ligasas
- Las ligasas, como la T4 ADN ligasa, unen fragmentos de ADN con extremos cohesivos o romos (mediante enlaces fosfodiéster) para crear una molécula de ADN completa.
Enzimas Modificadoras (ej. Fosfatasa alcalina)
- Fosfatasa alcalina: Elimina grupos fosfato de los extremos 5' del ADN. Esto evita la autoligación del ADN e interfiere con la acción de las ligasas. Usualmente, la quinasa lo utiliza para marcar.
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