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Les acides aminés et les protéines 1. Les acides aminés : ❖ Structure des acides aminés : Il existe 20 acides aminés « classiques » qui constituent les protéines naturelles. Certains acides aminés sont appelés indispensables ou essentiels, car le corps n’est pas capable de...

Les acides aminés et les protéines 1. Les acides aminés : ❖ Structure des acides aminés : Il existe 20 acides aminés « classiques » qui constituent les protéines naturelles. Certains acides aminés sont appelés indispensables ou essentiels, car le corps n’est pas capable de les fabriquer lui-même. Ils doivent alors être fournis via l’alimentation. Les acides aminés sont des molécules qui possèdent : - Une fonction acide carboxylique (-COOH) - Une fonction amine primaire (-NH2) Ces 2 fonctions sont portées par le même atome de Carbone, nommé Cα. Ce carbone porte également un atome d’hydrogène et une chaine latérale (-R). → Le Ph physiologique du corps humain est de 7,4 et la plupart des acides aminés sont des zwittérions. Zwittérion : C’est la forme de la molécule qui porte autant de charge positive que de charge négative. Lorsque l’on la somme des charges que porte la molécule, celle-ci est égale à 0. Les acides aminés peuvent être de 2 types : - Polaire (hydrophile) : L’acide aminé possède des fonctions qui peuvent potentiellement porter une charge. - Apolaire (hydrophobe) : L’acide aminé possède généralement une chaine carbonée aliphatique ou des cycles aromatiques. Aucune fonction ne peut donc porter de charge. Aliphatique : Se dit d’un corps gras à chaine ouverte (non aromatique). ❖ Classification des acides aminés : La classification des acides aminés peut se faire de 2 manières différentes : - Selon la nature de la chaine latérale - Selon la polarité de la chaine latérale (Voir annexe) La polarité de la chaine latérale est utile dans la structure tridimensionnelle des protéines et leur mode d’association avec d’autres molécules. On peut alors dire que :  Les acides aminés à chaine latérale non polaire participent dans des liaisons d’interactions hydrophobes.  Les acides aminés à chaine latérale polaire non ionisable prennent part à des liaisons hydrogènes.  Les acides aminés à chaine latérale ionisable sont impliqués dans des liaisons ioniques.  Tous les acides aminés peuvent contracter des liaisons de Van des Waals. 1 Polarité : C’est la façon dont les charges électriques positives et négatives sont réparties dans une molécule ou une liaison chimique. On considère qu’une liaison est polaire lorsque la différence d’électronégativité entre les atomes liés est de minimum 0,5. ❖ État d’ionisation des acides aminés : Acides aminés possédant un groupe R neutre : Les acides aminés sont des amphotères ou des ampholytes, c’est-à-dire qu’ils peuvent agir comme un acide ou comme une base. Diacide : C’est un acide aminé qui est totalement protoné, capable de libérer un H+ via sa fonction amine et via sa fonction acide. pKa : C’est la valeur de pH à partir de laquelle 50% des molécules sont sous forme déprotonée, et 50% des molécules sont sous forme protonée. Le pKa correspond à la « constante d’acidité » relative à la fonction concernée (acide ou base). → Les pKa des fonctions acides et basiques donnent l’ordre dans lequel l’acide aminé perd ses ions H+. En effets, la fonction ayant le pKa le plus petit va se déprotoner en premier. Si le pH est égal au pKa, cela signifie qu’il y a autant d’acide que de base conjuguée. pHi : Appelé pH isoélectrique, il s’agit du pH auquel toutes les molécules sont sous forme neutre (zwittérion). C’est le pH pour lequel la charge électrique nette de la molécule est nulle. Il correspond à la moyenne des différents pKa. 2 Cation : C’est un ion chargé positivement. → Toutes les fonctions sont protonées. Anion : C’est un ion chargé négativement. → Toutes les fonctions sont déprotonées. Exemple : équation de neutralisation et pHi de l’Alanine Acides aminés possédant un groupe R chargé : Ces acides aminés possèdent un 3e pKa, nommé pKR et correspondant à la « constante d’acidité » relative à la fonction de R. Le pHi correspond alors à la moyenne des 2 pKa entourant le forme zwittérionique. ❖ Dérivés des acides aminés dans le monde animal : Le tryptophane : C’est le précurseur de la sérotonine et de la mélatonine. Il s’agit d’un acide aminé essentiel qui se trouve dans les végétaux. Sérotonine : Il s’agit d’un neurotransmetteur dérivé du tryptophane, appelée « l’hormone du bonheur ». Elle intervient dans le contrôle de la satiété, la perception de la douleur, le sommeil, l’humeur (en cas de dépression, diminution de la production en sérotonine et diminution de l’appétit), et la thermorégulation. Cette hormone est utilisée comme anti-dépresseur. Mélatonine : Appelée « l’hormone du sommeil », elle est synthétisée à partir de la sérotonine. Il s’agit d’un neuromédiateur qui est synthétiser durant la nuit par l’épiphyse. Cette hormone possède 3 rôles importants :  Elle permet la régulation de l’alternance veille/sommeil  Elle régule la synthèse de certaines hormones, dont le cortisol  Elle possède un rôle antioxydant → Rôle protecteur contre le vieillissement du système nerveux central (SNC) : le groupement méthoxy est un piégeur de radicaux libres. 3 La taurine : Il ne s’agit pas d’un acide aminé à proprement parlé, mais il s’agit d’un acide sulfonique dérivé de la Méthionine et de la Cystéine. On la retrouve dans la bile du foie. En cas de carence, on pourra observer :  Une dégénérescence de la rétine  Des troubles de la reproduction  Une baisse du système immunitaire  Un dysfonctionnement cardiaque Acide biliaire + Taurine (ou Glycine) = Sels biliaires La Taurine est essentielle chez les félins car le foie n’en produit pas suffisamment. Elle est uniquement retrouvée dans les protéines animales, surtout que les félins sont carnivores strict. La Taurine est détruite par la chaleur, et il est donc obligatoire d’en rajouter dans l’alimentation industrielle. → Une alimentation végétarienne est impossible pour le chat, sinon il souffrira de carences qui perturberont son métabolisme de base. Cependant, il est possible de limiter la consommation de viande, pour alléger les reins par exemple. 4 Autres exemples : - L’Histamine des mastocytes et basophiles vient de l’Histidine. - Les catécholamines (dopamine, noradréaline et adrénaline) sont synthétisées à partir de la phénylalanine. - La créatine joue un rôle dans l’apport d’énergie aux cellules musculaires, et elle est synthétisée à partir de la Glycine et est éliminée sous forme de créatinine. - Les hormones thyroïdiennes, dérivées de la tyrosine, régulent le niveau d’activité du métabolisme. 2. Structure primaire : Les protéines sont une importante famille de macromolécules biologiques. Ce sont des polymères d’acide aminés (forme une chaine). On distingue plusieurs niveaux d’organisation dans la structure des protéines :  Structure primaire  Structure secondaire  Structure tertiaire  Structure quaternaire ❖ Liaison peptidique : La liaison peptidique est faite par la formation d’une liaison amide entre 2 acides aminés par condensation d’un groupe α-carboxyle et d’un groupe α-aminé. Peptide : C’est une protéine constituée de moins de 100 acides aminés. ❖ pH isoélectrique d’un peptide : La charge globale d’un peptide dépend des charges portées par :  Le C-terminal  Le N-terminal  Les chaines latérales 5  ❖ Peptides dans le monde animal : L’insuline et le glucagon : Ces hormones sont synthétisées par les îlots de Langhérans, dans le pancréas. L’insuline est hypoglycémiante et le glucagon est hyperglycémiant, et ils permettent la régulation du taux de glucose sanguin. Insuline Glucagon - Favorise la pénétration du glucose dans les Possède une structure simple → Peptide de 29 cellules périphériques acides aminés - Possède une structure ramifiée→ 2 chaines peptidiques : A (21 acides aminés) et B (30 acides aminés), réunies par des ponts disulfures Le glutathion : Il est présent dans presque toutes les cellules des vertébrés, et il permet de lutter contre l’oxydation cellulaire. Il s’agit d’un tripeptide : Glu-Cys-Gly ou GSH (-SH est la fonction thiol de la cystéine) Il existe sous 2 formes : GSH ou G-S-S-G (forme dimérique) → C’est la fonction SH qui peut former un pont disulfure est ainsi former G-S-S-G. Le glutathion a pour rôle d’éliminer les agents oxydants. Il permet également, au niveau des globules rouges, le maintient de l’ion fer sous sa forme Fe2+, indispensable pour le bon fonctionnement de l’hémoglobine. Pour pouvoir régénérer le glutathion, il est nécessaire d’avoir un agent réducteur (NADH + H+). Il doit également y avoir l’enzyme glutathion réductase. S’il y a une déficience du gène codant la synthèse de cette enzyme, il y aura une accumulation de radicaux toxiques, ainsi qu’une anémie hémolytique. Anémie hémolytique : C’est un dysfonctionnement du système immunitaire, produisant des anticorps qui attaquent et détruisent les globules rouges. Autres peptides : - La béta-endorphine : Elle possède une action analgésique et antalgique, produisant un effet euphorisant. - La pénicilline : C’est un antibiotique isolé d’un champignon (Penicillium chrysogenum), qui agit par mimétisme moléculaire à effet bactéricide. - L’ocytocine : C’est une hormone de 9 acides aminés, produite par l’hypophyse, stimulant les contractions utérines, la production de lait et le comportement maternel. - Tyroid releasing factor (TRF ou TRH) : C’est une hormone secrétée par l’hypothalamus et qui contrôle l’activité de la thyroïde. Elle est composée de 3 acides aminés, et c’est le plus petit peptide actif connu avec le glutathion. 6 Analgésique : Qui supprime ou atténue la sensibilité à la douleur (avant que celle-ci ne survienne). Antalgique : Qui permet de diminuer la douleur (lorsque celle-ci est déjà présente). 3. Conformation en 3D : Lien avec la fonction de la protéine : Chaque protéine va adopter une conformation en 3D unique, qui correspond à la « position » la plus confortable, appelée conformation native. L’activité biologique de la protéine va dépendre de cette conformation en 3D. → Toute altération de la conformation en 3D fera perdre à la protéine son activité biologique. Forme globale : - Protéine globulaire → molécule sphéroïde (enzymes, hormones, anticorps, …) - Protéine fibreuse → molécule filiforme (kératine, collagène, …) Composition chimique : - Holoprotéines : Constituées uniquement d’acides aminés - Hétéroprotéines : Constituées d’une partie protéique (apoprotéine) et d’une partie non- protéique (groupe prosthétique) Interactions intervenant dans le repliement des protéines : Les interactions hydrophobes : La chaine protéique a tendance à se replier de façon à regrouper les chaines latérales hydrophobes (non polaires) des acides aminés entre elles au centre de la molécule. Inversement, les acides aminés hydrophiles (polaires) ont tendance à se disposer à la périphérie de façon à être en contact avec l’eau. Les interactions ioniques : Les chaines latérales qui s’ionisent positivement forment des liaisons ioniques avec celles qui s’ionisent négativement. Les chaines latérales qui portent une charge de nature similaire se repoussent. Les liaisons hydrogènes : Se produit entre un doublet non liant porté par un atome et un atome d’hydrogène relié à un atome électronégatif (O, N ou F). Les forces de Van der Waals : C’est l’ensemble des 3 forces distinctes qui se manifestent à faible distance entre atomes ou groupements d’atomes. Il s’agit d’attractions mutuelles et non- spécifiques. Elles sont présentes en très grand nombre, car elles ont des rôles majeurs dans l’édification et la stabilisation des macromolécules. Les ponts disulfures : Deux cystéines peuvent former une liaison covalente entre elles par l’intermédiaire de l’atome de soufre du groupe thiol de leur radical. 7 Conformation incorrecte des protéines : On va parler de l’exemple connu des encéphalopathies spongiformes bovines (ESB), aussi appelée maladie de la vache folle, tremblante du mouton ou maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l’Homme. Il s’agit de maladies dégénératives du système nerveux central. Les zones atteintes possèdent un aspect spongieux, et la transmission de la maladie se fait par les prions. Les prions sont des particules infectieuses protéiques. Les prions infectieux (PrPsc) sont créés à cause d’une transition des hélices α en feuillets β, ce qui est à l’origine du pouvoir pathogène des prions. En d’autres termes, la chaine d’acides aminés reste la même, mais c’est la conformation en 3D qui change. → Une fois qu’un prion arrive chez un individu, il déclenche une cascade de transformation pour que de nombreux protéines soient modifiées en prions. 4. Structure secondaire : Il s’agit de l’organisation tridimensionnelle locale que peut adopter un polypeptide stabilisé par les liaisons hydrogènes entre des éléments du squelette peptidique. C’est une conformation répétitive régulière sur un fragment de la chaine polypeptidique ou sur son entièreté. Elle est due aux relations dans l’espace des résidus d’acides aminés proches les uns des autres. Les protéines fibreuses ne possèdent que ce niveau secondaire, alors que les protéines globulaires présenteront en plus une structure tertiaire. Il existe différents types de structures secondaires. ❖ Hélice alpha : Les ponts hydrogènes sont présents entre deux Chaines latérales groupements du peptide. La proline possède une orientées vers l’extérieur chaine latérale qui est reliée à la fonction amine. Il s’agit d’une hélice en pas de droit, c’est-à-dire que l’hélice tourne vers la droite. Ponts hydrogènes Ponts disulfures : Cystéine intra-caténaires ou intra-chaine Microfibrille 0,54 nm La kératine α : Il s’agit de 2 hélices α qui tournent sur elles- mêmes, et forme ensemble une hélice en pas de gauche. C’est notamment le phénomène présent pour la construction des cheveux. Protofibrille Superhélice 8 Exemple de récepteurs transmembranaire : 7 hélices α présentant des acides aminés hydrophobes, reliées par des boucles hydrophiles. Les 7 hélices délimitent une cavité qui permettra au messager extracellulaire de se positionner et d’interagir avec le récepteur transmembranaire. Membrane ❖ Feuillet plissé béta : Le feuillet est plissé par les liaisons hydrogènes, et la distance entre 2 acides aminés successifs est de 0,35 nm. Les chaines latérales sont en alternance entre le haut et le bas. Les ponts hydrogènes sont en intra-chaines pour les protéines globulaires, alors qu’ils sont inter-chaines pour les protéines fibreuses. Il existe 2 types de feuillets plissés : Parallèle Antiparallèle Le feuillet plissé béta dans la fibroïne : La protéine de la soie est produite par le ver à soie Bombix Mori. Il s’agit de feuillets β antiparallèles, riches en Gly et an Ala. Les chaines latérales sont toutes orientées dans le même sens, permettant la souplesse de la protéine. ❖ Coude béta : C’est une séquence de 4 acides aminés qui permet à la chaine de se replier sur elle-même. Elle est stabilisée par une liaison hydrogène entre le premier et le quatrième résidu d’acide aminé. Il n’y a jamais d’acide aminé apolaire, et la proline se trouve en deuxième position. 9  ❖ Boucle ou pelote statique : C’est une région de la protéine qui n’adopte aucune conformation particulière, et qui ne réalise donc pas de liaison hydrogène pour se stabiliser. La pelote statique peut être une zone souple facilitant la liaison avec une autre molécule. Structure mixte : La carboxypeptidase  Hélices α  Feuilles β  Boucles sans structure définie ❖ Hélice de collagène : Le collagène est la protéine fibreuse présente dans les tissus conjonctifs. Il s’agit de la protéine la plus abondante du règne animal (25 à 35% du poids des mammifères). Il existe 23 types différents de collagène aux fonctions variées (derme, os, tendons, vaisseaux sanguins, cornée, …). La structure primaire du collagène est la suivante : Glycine : 1/3 des résidus Proline : 10% 4-Hydroxyproline : Acide aminé peu courant Structure secondaire en hélice car la présence de la proline et de l’hydroxyproline entraine une déformation régulière de la chaine. Il n’y a pas de pont hydrogène intra-caténaire stabilisant, l’hélice est donc moins « tassée » qu’une hélice α (0,94 nm/spire). Ce sont donc les ponts hydrogènes inter-caténaires qui stabilisent la fibre. Les 3 hélices tournent en pas de gauche, et elles forment ensemble une hélice en pas de droit. Vue en plongée de l’axe de la triple hélice. La chaine latérale d’un résidu sur trois pointe à l‘intérieur de la triple hélice : il faut donc que ce soit une glycine en raison du peu d’espace disponible. 10 Carence en Vitamine C : La vitamine C est indispensable pour transformer la proline en hydroxyproline. En cas de carence de vitamine C (Scorbut), il y aura une laxité de toutes les structures du corps possédant du collagène. Symptômes : - Troubles dentaires et osseux - Fragilisation des parois des vaisseaux - Retard de cicatrisation au niveau des plaies - Troubles métaboliques et endocriniens :  Sensibilité au stress  Stérilité ou avortement  Troubles de l’absorption du fer et des graisses  Pigmentation des gencives  Carences vitaminiques associées - Moindre résistance aux infections et au froid 5. Structure tertiaire : C’est l’organisation spatiale globale de la chaine polypeptidique, correspondant au repliement de la molécule sur elle-même. Certains acides aminés, très distants dans la structure primaire, vont se retrouver au voisinage les uns des autres après reploiement de la protéine. Cette structure ne concerne que les protéines globulaires, et c’est elle qui confère sa fonction à la protéine. Elle est favorisée par des protéines chaperonnes et débute par l’élaboration de la structure secondaire. Stabilisation de la structure tertiaire : La stabilisation se fait grâce à des interactions entre les chaines latérales. La force majeure est l’effet hydrophobe : - Les groupes R non polaires (hydrophobes) sont entrainés vers le cœur de la protéine. - Les groupes R polaires (hydrophiles) restent orientés vers la surface de la protéine, en contact avec le milieu physiologique aqueux. Il y a d’autres interactions qui permettent la stabilisation de la structure tertiaire :  Des ponts hydrogènes entre les chaines R, ou entre une chaine R et l’eau  Des interactions ioniques entre les chaines R chargées  Des ponts disulfures entre Cys  Des liaisons de Van der Waals 11 Domaines et sites actifs : Domaines : S’il y a plus de 200 acides aminés, la protéine se replie en domaines. Il s’agit d’une fonction spécifique pour l’activité de la protéine (liaison à un substrat, catalytique, …). Sites actifs : Ce sont les replis et crevasses qui permettent la fixation de manière sélective et transitoire d’autre molécules. Un site actif peut contenir un cofacteur (groupe prosthétique). Dénaturation des protéines : La dénaturation correspond à une destruction de la conformation en 3D de la protéine, de manière à la rendre linéaire. Agents dénaturants :  pH → Ionisation des protéines (si le pH est inférieur à 5 ou supérieur 10)  Élévation de la température → Rupture des liaisons faibles, entrainant un dépliement de la protéine  Agents chimique chaotropes (ex : l’urée provoque l’afflux d’eau à l’intérieur de la protéine)  Détergents : Le SDS utilisé pour les électrophorèses. 12 6. Structure quaternaire : C’est l’agencement de plusieurs chaines peptidiques (monomères) entre elles dans l’espace. Cette structure est maintenue par des liaisons faibles entre des radicaux d’acides aminés appartenant aux différentes chaines (liaisons inter-chaines). → Cette structure quaternaire ne peut être présente que chez les protéines globulaires, et elles n’en possèdent pas toutes une. Structures et rôles de la myoglobine et de l’hémoglobine : Ce sont des protéines jouant un rôle dans le stockage et le transport de l’oxygène. Il s’agit d’hétéroprotéines globulaires, c’est-à-dire une apoprotéine combinée à un groupe prosthétique (l’hème), et permettant la fixation réversible de l’oxygène (stockage et distribution). → L’atome de Fer est primordial pour le fonctionnement de ces 2 protéines. La myoglobine : Elle est présente dans les muscles, et elle a pour but le stockage de l’oxygène dans les muscles. Il s’agit d’une fixation réversible de l’O2 sur l’hème. La myoglobine est composée d’une seule chaine protéique : 153 résidus d’acides aminés, 8 hélices α (A-H) et 1 hème. La myoglobine représente 8% des protéines musculaires des animaux plongeurs, leur permettant de tenir un maximum de temps sous l’eau. Courbe d’oxygénation des tissus → La couleur de la viande (rouge ou blanche) reflète la quantité de myoglobine présente dans le muscle de l’animal. Une viande de bœuf est plus rouge car elle possède 0,4% de myoglobine, alors que la viande de porc n’en possède que 0,005%. Degré de saturation en myoglobine : 13  L’hémoglobine : Elle est présente dans les globules rouges (3.108 molécules par érythrocyte), et elle permet le transport de l’oxygène des poumons vers les organes. Il s’agit d’un tétramère composé de 2 types de chaines de globine (2α et 2β). La chaine α est composée de 141 acides aminés, alors que la chaine β est composée de 146 acides aminés. Il y a 1 hème par globine, et les structures secondaires et tertiaires sont similaire à la myoglobine. Il y a une fixation réversible de l’O2 sur l’hème : il y a 4 hèmes au total, donc 4 O2 fixés. L’affinité de l’hémoglobine pour le CO est 200 fois plus grande que pour l’O2, ce qui signifie qu’une intoxication au CO arrive rapidement si celui-ci est présent en grande quantité. Courbe de saturation en oxygène L’hémoglobine possède 4 monomères : - Ce sont d’abord les 2 monomères α qui vont capter les molécules d’oxygène (l’un après l’autre). - Une fois que les 2 monomères α sont chargés en oxygène, les 2 monomères β vont changer leur conformation pour pouvoir également capter des molécules d’oxygène (les 2 en même temps). → Le rôle de la myoglobine et de l’hémoglobine dans l’organisme découle directement de leur affinité pour l’oxygène, même aux faibles pressions d’oxygène. 7. Analyse des acides aminés et des protéines : Le but est d’analyser un échantillon de départ (plasma, urine, LCR, …) dans lequel on retrouve un mix de molécules. Il faudra alors : - Séparer et purifier les différentes molécules - Identifier chacune d’elles - Quantifier une ou plusieurs d’entre elles - Analyser la structure d’une protéine → séquençage, identification des sites spécifiques, étude de la structure en 3D, … - Étudier les propriétés physico-chimiques de la molécule 14  ❖ Séparation des acides aminés et des protéines : Techniques basées sur la solubilité des protéines : Cette technique fonctionne sur les molécules qui possèdent beaucoup de chaines latérales ionisables, et plus il y a de charge plus la protéine est soluble en milieu aqueux. Influence du pH : À pHi (charge globale neutre), la solubilité de la protéine est minimale. Plus le pH est « extrême » (acide ou basique), plus la solubilité sera grande. Force ionique du milieu influencée par nature et quantité des sels dissous : La force ionique correspond à la concentration en sels dissous dans une solution. Cette force possède donc un double effet sur la solubilité des protéines. - À faible force ionique, la solubilité augmente avec la concentration en sel. Salting in : Les ions interagissent avec les chaines latérales et forment un écran qui empêche les interactions directes entre les protéines. - À force ionique élevée, la solubilité diminue avec la concentration en sel. Salting out : Les ions monopolisent le solvant qui devient indisponible pour la protéine dissoute. Il y a une déshydratation du milieu, les molécules de protéines vont interagir entre elles et précipiter. Par électrophorèse : Il s’agit de la séparation des espèces chargées d’après leur vitesse de migration dans un champ électrique. En fonction de la charge de la molécule, celle-ci s’orientera vers la borne positive ou vers la borne négative. → Une molécule sous forme zwittérionique (charge neutre) reste donc sur place et ne migre pas. Électrophorèse sur papier : Cette technique est uniquement utilisée pour doser les acides aminés. En pratique, des échantillons connus de différents acides aminés sont traités dans les mêmes conditions comme « marqueurs », afin d’établir leur localisation. 15 C’est le papier buvard qui fait la communication entre les 2 chambres. Le mélange d’acides aminés est positionné au centre du papier buvard, puis le courant électrique entre les 2 électrodes permettra la migration des molécules vers une charge. Les molécules chargées positivement migrent vers la borne négative, et inversement. → Le dosage se fait par coloration et colorimétrie. Plus un acide aminé est fortement chargé, plus il va migrer rapidement. Électrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE) : Cette technique est utilisée pour la séparation des protéines. La composition du gel est faite par polymérisation de monomères d’acrylamide et de bisacrylamide (agent pontant). La composition dépend de la taille des protéines à séparer (maillage plus ou moins serré) : plus les protéines à séparer sont petites, plus le gel doit posséder un maillage serré, et inversement. Il y a 2 paramètres qui vont influencer la migration des protéines :  La taille de la molécule → Plus la protéine est petite, plus elle migre vite.  La charge que la molécule porte → Une molécule fortement chargée négativement va migrer beaucoup plus rapidement. Lorsque 2 protéines se stabilisent au même endroit, il est impossible de pouvoir les différencier l’une de l’autre. Électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) : Il s’agit de la séparation des protéines uniquement en fonction de la taille. Le rôle du SDS (détergent) est de masquer les charges, et la protéine devient ainsi négative. Étant donné que les protéines sont toutes chargées négativement, elles vont migrer vers la cathode positive. Comme pour la technique précédente, le gel de polyacrylamide (PAGE) possède un rôle de tamis, qui sépare les protéines en fonction de leur taille. S’il y a également 2 protéines qui se stabilisent au même endroit, il peut s’agir de 2 protéines différentes possédant la même taille. 16 Électrophorèse bidimensionnelle (2D) : Électrofocalisation SDS-PAGE Sur un gel à gradient de pH, la séparation des La séparation des protéines se fait en fonction de protéines se fait en fonction du pHi. la taille de celles-ci. → Les protéines migrent jusqu’à atteindre leur pHi, puis elles se stabilisent. Révélation des gels d’électrophorèse : Révélation au Bleu de Coomassie Révélation au nitrate d’argent Par chromatographie : C’est une technique séparative analytique et/ou préparative qui consiste à faire migrer les constituants à séparer sur une phase stationnaire immobile, à l’aide d’une phase mobile, liquide ou gazeuse, de nature différente. Le support fixe est appelé phase stationnaire, alors que la solvant est appelé phase mobile. La vitesse de migration dépend de différents critères : taille, polarité, charge et affinité pour un substrat. 17  Chromatographie en couche mince (CCM) : Le support fixe est une plaque de silice très polaire, alors que le solvant est moins polaire que la silice. La vitesse de migration dépend donc de la polarité Chromatographie sur colonne : La phase stationnaire est composée de billes à l’intérieur de la colle. Le solvant (phase mobile) s’écoule dans la colonne. La vitesse de migration dépend donc de la propriété des billes et du solvant. On parle de notion d’élution, c’est-à-dire qu’on sépare les molécules de la phase stationnaire. Il existe 3 types de chromatographie sur colonne :  Chromatographie par échange d’ions  Chromatographie d’affinité  Filtration sur gel Par Finger Print : C’est une combinaison de 2 techniques de séparation : His électrophorèse (séparation selon la charge) et chromatographie Leu (séparation selon la polarité). Ser Thr Met Exemple : un mélange de Ser, Glu, Leu, His, Met et Thr. Glu ❖ Identification des acides aminés et des protéines : - Comparaison avec des étalons → Recueil d’informations selon la technique utilisée - Comparaison avec une base de données centrale ❖ Dosage des acides aminés et des protéines : Titrage des acides aminés acides et basiques : L’objectif est de déterminer la concentration d’une solution d’acide (ou de base) en mesurant le volume exact d’une solution de base (ou d’acide) de concentration connue qui réagira avec un volume exact de solution. 18 Méthode spectrophotométrique : C’est une méthode qui consiste à mesurer l’absorbance, généralement en solution, afin de déterminer la concentration de l’espèce colorée. Les molécules traversées absorbent une certaine partie du rayon. Le niveau d’absorbance correspond à la différence entre le rayon incident et le rayon transmis. Méthode de dosage :  Choix de la longueur d’onde () du rayon incident, correspondant au max de la molécule dosée  À max, l’absorbance (A) est proportionnelle à la concentration de la molécule (C)  Dosage quantitatif en appliquant la relation de Beer-Lambert : A = . C. l Méthode spectrophotométrique directe : Les acides aminés sont incolores, et il n’y a donc pas d’absorbance dans le domaine visible. Sauf pour les acides aminés aromatiques qui absorbent dans l’UV, et pour le tryptophane qui est fluorescent (émission). Méthode spectrophotométrique indirecte : La plupart des acides aminés sont incolores, et il n’y a donc pas d’absorption dans le domaine du visible. Une étape supplémentaire est donc nécessaire : - Une technique de coloration → Méthode de colorimétrie à la Ninhydrine (max = 570 nm) - Une association avec une molécule qui absorbe dans le domaine du visible → Méthode à l’isothiocyanate de phényle (max = 254 nm) → Méthode du Biuret (max = 540 nm) : Dosage colorimétrique des protéines totales (ex : sérum sanguin) 19  ❖ Séquençage d’un peptide : Composition en acides aminés : Les acides aminés peuvent être identifiés selon leur temps de rétention, et quantifiés selon la surface des pics. Détermination du résidu C-terminal : Méthode d’Akatori → L’hydrazine possède un tropisme pour la dernière liaison peptidique. Le C-terminal pourra donc être séparé de manière intacte, puis identifié. Détermination du résidu N-terminal : Méthode de Sanger → Le DNFB réagit avec la fonction amine (N- terminal) et hydrolyse la liaison par réaction acide. Fragmentation de la chaine polypeptidique : Plusieurs agents de clivage son utilisés pour fragmenter la chaine. 20 Dégradation d’Edman : Utilisée uniquement pour les petits peptides car les grandes chaines seront dégradées. Il y a une fixation de PITC sur le N-terminal, permettant la séparation et l’identification de l’acide aminé. → Un peptide traité à l’acide dilué à froid sera complètement hydrolysé. Recombinaison des fragments : Synthèse : 21