Biochimie – AA et Protéines (PDF)

BIOCHIMIE – AA ET PROTEINES : 2. LES PROTEINES Les protéines = importante famille de macromolécules biologiques, ce sont des polymère d’AA, pouvant avoir plusieurs niveaux d’organisations : structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaires. STRUCTURE PRIMAIRE La structur...

BIOCHIMIE – AA ET PROTEINES : 2. LES PROTEINES Les protéines = importante famille de macromolécules biologiques, ce sont des polymère d’AA, pouvant avoir plusieurs niveaux d’organisations : structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaires. STRUCTURE PRIMAIRE La structure primaire = série d’AA, liés entre eux par une liaison peptidique. LA LIAISON PEPTIDIQUE La liaison peptidique = liaison covalente : formation d’une liaison amide entre 2 AA par condensation d’un groupe α-carboxyle et d’un groupe α-aminé → 2 AA = 1 dipeptide + 1 H2O. - Peptides = protéines constituées de – de 100 AA - Oligopeptides = - de 20AA, dipeptide = 2AA, tripeptide = 3AA, … LE PH ISOELECTRIQUE D’UN PEPTIDE La charge globale d’un peptide dépend des charges portées par le C-terminal, le N-terminal et par les chaines latérales. Détermination du pHi d’un peptide : 1. Ecrire le peptide avec ces chaines R, ainsi que le NH3+ en N-terminal et le COOH en C-terminal, afin de visualiser la molécule et ces charges. 2. Rapporter dans un tableau les pKa des AA portant une ou plusieurs charges o Seul la fonction NH3+ du 1e AA et la fonction COOH du dernier AA porte une charge car les autres sont impliquées dans les liaisons peptidiques. o Les AA avec fonction NH3+ ou CCOH + un groupe R chargé → 1ligne/charge pKa COOH pKa NH3+ pKa R Arg / 9,0 12,5 Asp / / 3,9 Val / / / Cys 1,9 / 8,4 3. Dresser un tableau d’ionisation en fonction du pH : o Pour les AA ne portant aucune charge → 0 partout o Pour les AA portant une charge → faire leur équation de neutralisation o Pour les AA avec fonction NH3+ ou COOH + groupe R chargé → 1 ligne/charge 4. Faire le total des charges, et déterminer ou se trouve la forme zwittérionique (=2pKa entre 0) 1,9 3,9 8,4 9,0 12,5 Arg NH3+ +1 +1 +1 +1 0 0 Arg NH2+ +1 +1 +1 +1 +1 0 AspCOOH 0 0 -1 -1 -1 -1 Val 0 0 0 0 0 0 Cys SH 0 0 0 -1 -1 -1 Cys COOH 0 -1 -1 -1 -1 -1 TOTAL +2 +1 0 -1 -2 -3 5. Calculer le pHi = moyenne des 2 pKa/2 𝟑, 𝟗 + 𝟖, 𝟒 𝒑𝑯𝒊 = = 𝟔, 𝟏𝟓 𝟐 LES PEPTIDES DANS LE MONDE ANIMAL L’insuline et le glucagon : - Hormones synthétisées par les îlots de Langherans du pancréas. - Hormones régulant le taux de glucose dans le sang L’insuline = favorise pénétration du glucose dans les cellules périphériques, - Hypoglycémiante, diminue taux de glucose sanguin. - Structure ramifiée : 2 chaines peptidiques A (21AA) et B (30 AA), réunies par pont disulfure Le glucagon = stimule la sortie du glycose (lors chute glycémie) - Hyperglycémiante, augmente taux de glucose sanguin - Diabète : cellule résistante à l’insuline ou n’en produisant pas - Structure simple : peptide de 29 AA Le glutathion : - Présent dans presque toutes les cellules des vertébrés - Lutte contre l’oxydation cellulaire - Tripeptide : Glu – Cys – Gly ou GSH (-SH = fonction thiol de la cystéine) - Existe sous 2 formes : GSH ou G-S-S-G (forme dimérique) Rôle = - Eliminer les agents oxydants : H2O2 (OH-) : 2 G-SH + H2O2 → G-S-S-G + 2 H2O - Globule rouge : maintien l’ion fer sous forme Fe2+ (indispensable pour bon fonctionmnt hémoglobine) Recyclage : - Nécessite agent réducteur (NADPH + H+) pour le régénérer : GS-SG + NADPH + H+ → 2GSH + NAPD+ - Nécessite enzyme glutathion réductase (si déficience du gène codant sa synthèse, accumulation de radicaux libre dans sang et/ou anémie hémolytique = manque GR) Autres peptides : - Bêta-endorphine : action analgésique (↘ douleur) et antalgique (X douleur), effet euphorisant. - Pénicilline : antibiotique isolé d’un champignon (Pencillium chrysogenum), agit par mimétisme moléculaire à effet bactéricide - Ocytocine : hormone de 9AA, produite par hypophyse, stimule contraction utérine, production lait, comportement maternel. - Tyroid releasing factor TRF ou TRH : hormone sécrétée par hypothalamus, contrôle activité thyroïde. Composé de 3AA, + petit peptide actif connu avec glutathion. CONFORMATION EN 3D Chaque protéine adopte une conformation 3D unique (la + confortable) = conformation native → l’activité biologique (=fonction) de la protéine dépend de celle-ci. Toute altération de cette conformation 3D fait perdre son activité biologique a la protéine ! Forme globale : - Protéine globulaire : molécule sphéroïdes (enzymes, hormones, anticorps, …) - Protéine fibreuse : molécule filiforme (kératine, collagène, …) Composition chimique : - Holoprotéines = constituées uniquement d’AA - Hétéroprotéines = 1 partie protéique (apoprotéine) + 1 partie non protéique (groupe prosthétique) INTERACTIONS INTERVENANTS DANS LE REPLIEMENT DES PROTEINES Les interactions hydrophobes : - Regroupement des groupes R hydrophobes (non polaire) des AA entre eux au centre de la molécule - Les AA hydrophiles (polaires) se disposent à la périphérie pour être en contact avec l’eau Les interactions ioniques : - Formation liaisons ioniques entre groupe R s’ionisant positivemt et groupe R s’ionisant négativemnt - Groupe R portant une charge de nature similaire se repoussent Les liaisons hydrogènes : - Formation entre doublet non liant porté par 1 atome et 1 atome d’H relié à atome électronégatif Les forces de Van Der Waals : - Ensemble de 3 forces distinctes, se manifestant à faible distance entre atomes ou groupes atomes - Attraction mutuelle et non spécifiques - Très grand nombre → rôle majeur dans édification et stabilisation macromolécules Les ponts disulfures : - 2 cystéines peuvent former une liaison covalente entre elles par intermédiaire de l’atome de soufre du groupe thiol de leur radical. CONFORMATION INCORRECTE DES PROTEINES Exemple : Encéphalopathies spongiformes bovines ESB → maladie de la vache folle, tremblante du mouton (scrapie), maladie Creutzfeldt-Jakob ➔ Maladie dégénérative du SNC : o Aspect spongieux des zones atteintes o Transmission de la maladie par prions Prion = particule infectieuse protéique - Transformation PrPc (prion normal) → PrPsc (prion infectieux) - Transition de l’hélice α en feuillet β = origine du pouvoir pathogène du prion STRUCTURE SECONDAIRE La structure secondaire = organisation 3D locale que peut adopter un polypeptide, stabilisé par les liaisons hydrogènes entre des éléments du squelette peptidique. - Conformation répétitive régulière sur un fragment de la chaine polypeptidique ou sur son entièreté - Due aux relations dans l’espace des résidus AA proches les uns des autres (=locale) - Protéines fibreuse → uniquement structure secondaire (protéine globulaire → 3R et 4R) - Différents types/formes de structures secondaires L’HELICE ALPHA Hélice = chaine de résidus AA, présentant les chaines latérales vers l’extérieur. - Stabilisé par pont H entre résidus du squelette = pont H intra caténaire (pas avec chaine R !!) - Hélice en pas droit → main droite en position fusil, faire 90° (paume face nous puis face sol) - Proline peut perturbée = AA avec structure particulière (R relié a fonction amine) LA KERATINE ALPHA Kératine = 2 hélice alpha, formant 1 superhélice (tournent ensemble), qui s’associe à une autre superhélice formant une protofibrille → 8 protofibrilles forment 1 microfibrille, et les microfibrilles ensemble forment macrofibrilles (reliée ensemble par pont disulfure→ formant ensemble le cortex du cheveux). - Hélice alpha → superhélice → protofibrille → microfibrille → macrofibrille → cheveux - Les cheveux = hélice alpha de pas de droit enroulées ensembles. EXEMPLE DE RECEPTEURS TRANSMEMBRANAIRES Récepteurs transmembranaires = cylindre dont les parois sont composées d’une molécule protéique (prot. transmembranaire) - 7 hélices α présentant AA hydrophobes, reliées par boucle hydrophiles - Les 7 hélices délimitent une cavité qui permet au messager extra-cell de se positionner et d’interagir avec le récepteur transmembranaire → communication int/ext + maintien du canal au sein membrane LE FEUILLET PLISSE BETA Feuillet plissé β = suite d’AA qui se plisse, comme une structure en accordéon, relié par pont H entre les éléments du squelette de chaine R Caractéristiques : - Feuillet plissé par les liaisons H - Distance entre 2AA successifs = 0,35 nm - Chaines latérales tantôt vers le haut, tantôt vers bas - Pont H intra-chaine = entre portion de la même chaine polypeptidique → protéine globulaire - Pont H inter-chaine = entre 2 chaines polypeptidique différentes → protéines fibreuses - Antiparallèle = 1 chaine de C-term vers N-term et l’autre de N-term vers C-term - Parallèle = les 2 chaines dans le même sens, formant une boucle entre les 2 FEUILLET PLISSE BETA DANS LA FIBROÏNE - Protéine de la soie produite par le ver à soie Bombix Mori - Feuillets β antiparallèles - Riches en Gly et Ala : chaine R toutes orientées dans même sens, souplesse de la protéine LE COUDE BETA Le coude β = séquence de 4AA reliés entre eux formant coudes, permettant à la chaine de se replier sur elle- même, stabilisé par liaison H entre le 1e et le 4e résidu d’AA. - Jamais d’AA apolaire - Proline en 2e position (induit le coude) !!! BOUCLE OU PELOTE STATIQUE Boucle ou pelote statique = régions de la protéine qui n’adoptent aucune conformation particulière (pas de structures secondaire) : - Pas de pont H pour les stabiliser - Pas figer dans zone statique → peuvent être zone souple facilitant liaison avec autres molécules La carboxypeptidase = structure mixte avec : hélice alpha (mauve), feuillet béta (flèche vert), et boucle sans structure définie (reste vert, hors flèche). HELICE DE COLLAGENE L’hélice de collagène = exception, c’est une protéine fibreuse des tissus conjonctifs (la + abondante du règne animal = 25 à 35% poids des mammifères) → il existe 23 types de collagènes différents selon fonction (variées) - Composé de Gly (1/3), de Pro (10%) et de 4-Hydroxyproline (peu courant, proline avec fonction OH) - Hélice de pas gauche Structure en hélice présente grâce : - Présence proline et hydroxyproline → déformation régulière de la chaine - Pas de pont H intra-caténaires stabilisants → hélice – tassée - Pont H inter-caténaires stabilisent la fibre Structure en fibre de collagène : - Il faut 3 hélices de collagènes en pas de gauche - Celles-ci stabilisées ensemble par pont H - Celles-ci s’emmêlent entres elles pour former une fibre de collagène de pas droit ! CARENCE EN VITAMINE C La vitamine C est indispensable pour transformer proline → hydroxyproline, une carence (scorbut chez le cobaye) peut entrainer : - Troubles dentaires, osseux, fragilisation paroi des vaisseaux, retard cicatrisation au niveau plaies - Troubles métaboliques et endocriniens : sensibilité au stress, stérilité, avortement, trouble absorption fer et graisses, pigmentation gencives, carences de vitamines associées - Moindre résistance au froid et aux infections STRUCTURE TERTIAIRE Structure tertiaire = organisation spatiale globale de la chaîne polypeptidique : la molécule se replie sur elle- même et certains AA éloignés dans structure primaire se rapprochent. - Ne concerne que protéine globulaire !!! - Chaines R qui prennent le pas sur le repliement → interaction entre chaine R induit conformation 3D - Rôle structure 3R = délimiter les domaines, conférer le rôle de la protéine ! - Favorisée par protéines chaperonnes Stabilisation : - Fait appel a interactions entre chaines R - Force majeur = effet hydrophobe : o Groupe R non polaire entrainés vers cœur protéine = cœur hydrophobe o Groupe R polaire orientés vers surface protéine = surface hydrophile, en contact avec milieu physiologique aqueux - Autres interactions : o Pont H : entre chaines R ou entre chaine R et eau o Interactions ioniques : entre chaines R chargées o Pont disulfure : entre Cys o Liaisons de van der Waals Domaines et sites actifs : - Si > 200 AA → protéine se replie en domaines = fonction spécifique pour l’activité de la protéine (liaison à un substrat, catalytique, …) - Sites actifs = replis et crevasses dans la protéine, permettant la fixation de manière sélective et transitoire d’autres molécules, peut contenir cofacteurs (groupes prosthétiques = non protéique) Dénaturation de la protéine : Dénaturation = destruction de la conformation 3D, rendre linéaire, détruire toutes interactions permettant de maintenir la conformation 3D - Il est possible de renaturer si bonnes conditions + protéines chaperonnes (rare, complexe) - Il faut agents dénaturants : o pH : ionisation des protéines → si charge diff, relation ionique change !! o Elévation température → rupture liaison faible, déplisse protéine o Agents chimiques chaotrope (ex : urée provoque afflux d’eau à l’intérieur protéine→ cœur plus hydrophobe) o Détergents : SDS utilisés pour électrophorèses STRUCTURE QUATERNAIRE Structure quaternaire = agencement de plusieurs chaines peptidiques (monomères) entre elles dans l’espace, structure maintenue par des liaisons faibles entre des radicaux d’AA (=chaine R) appartenant aux différentes chaines (liaisons interchaines) → ATTENTION, uniquement certaines protéines globulaires. STRUCTURES ET ROLES DE LA MYOGLOBINE (PAS DE 4 E ) ET HEMOGLOBINE (STRUCTURE 4) Ce sont des protéines jouant un rôle dans le stockage et le transport de l’oxygènes. Elles sont des hétéroprotéines globulaires : apoprotéine + groupe prosthétique (l’hème) → fixation réversible de l’oxygène (stockage et distribution). Myoglobine : - Présente dans les muscles (8% des protéines musculaires des animaux plongeurs) → rôle de stockage de l’oxygène dans les muscles (pour tenir apnée) - Une seule chaine protéique : 153 résidus d’AA, 8 hélices α (A-H), 1 hème - Fixation réversible de l’O2 sur l’hème (Fe au centre) - 1 monomère, pas de structure quaternaire - Couleur viande = reflet de la quantité de myoglobine présente dans les muscles de l’animal - Stockage oxygène : courbe d’oxygénation des tissus → elle capte et se sature en O quand il n’arrive plus par le sang (le relibère quand faible concentration) Hémoglobine : - Présente dans les GR (3108molécules/érythrocytes) - Rôle : transport oxygène des poumons vers organes (capte la ou il y en a et transport la ou besoin) - Tétramère composé de 2 types de chaines de globine (2α et 2β) - Globine : α = 141 aa, β = 146aa, 1hème/globine → 4hème/hémoglobine → capable de capter 4O, structure secondaire et tertiaire similaire à myoglobine - Fixation réversible de l’O2 sur l’hème (4hèmes → 4 O2 fixés) - Transport de l’oxygène : courbe de saturation → mécanisme de coopération : il faut qu’il y ait 1 O2 sur les 2 monomères α pour que les monomères β puissent en fixer, permettant transport de l’O2 o Au départ, les 2 monomères β incapable de fixer l’O o Quand un peu d’O dans milieu → fixation 1O sur 1 α (puis 1 autre O sur l’autre α) o Quand les 2 α ont O, modification de la conformation 3D du monomère β pour accueillir O - Affinité de l’hémoglobine pour le CO2 200x + grande que pour O2 → intoxication au CO2 - Rôle de Mb et Hb dans l’organisme découle directement de leur affinité pour l’oxygène aux faibles pressions d’oxygène → quand pression en O faible, faible saturation en O d’hémoglobine → hémoglobine ne fixe pas O mais le libère (inverse au niveau des poumons, grande qtt d’O dans environnement = grande saturation hémoglobine = capte bcp d’O) TECHNIQUES D’ANALYSES DES AA ET DES PROTEINES On prend un échantillon de départ avec un mix de molécules, mais on en veut qu’une : - Séparer/purifier les différentes molécules - Identifier chacune d’elles - Quantifier une ou plusieurs d’entre-elles (en quelle qtt sont elles la) - Analyser la structure d’une protéine : séquencer, identifier sites spécifiques, étude de structure 3D - Propriétés physico-chimiques de la molécule SEPARATION DES AA ET DES PROTEINES TECHNIQUES BASEES SUR LA SOLUBILITE DES PROTEINES Séparation des protéines en fonction de leur solubilité (grâce au pH ou à la concentration en sel) → Beaucoup de chaines latérales sont ionisables → + il y a de charge, + la protéine est soluble en milieu aqueux Influence du pH : - On place un mélange de protéine dans un milieu où l’on fait varier le pH - A pHi (charge globale neutre) : solubilité de la protéine minimale → précipitation isoélectrique : la molécule est – soluble dans l’eau (séparation molécule et eau) Force ionique du milieu influencée par la nature et la qtt de sels dissous : On prend un mélange de protéine, on le place dans un milieu dans lequel on fait varier la concentration en sel. - Force ionique = concentration en sels dissous dans une solution - Double effet sur la solubilité des protéines - A faible force ionique, la solubilité augmente avec la concentration en sel : o Salting in : les ions interagissent avec chaine R et forment écran empêchant les interactions directes entre les protéines → alors elles interagissent avec le milieu = soluble dans ce milieu - A force ioinique élevée → la solubition diminue avec la concentration en sel : o Salting out : les ions monopolisent le solvant/milieu qui devient indisponible pour la protéine dissoute → déshydratation du milieu, protéines interagissent entre elles et précipitent (=insoluble dans le milieu, permet de les faire ressortir) PAR ELECTROPHORESE On place une molécule dans un milieu dans lequel on fait passer un courant électrique → déplacement +- vers une borne selon la charge de la molécule (vitesse de migration fonction de la charge) - Séparation des espèces chargées d’après leur vitesse de migration (fonction de la charge) dans un champ électrique - Migration vers la borne de signe opposé - Pas de migration pour les molécules neutres → forme zwittéronique - Dosage (qtt AA présent) Electrophorèse sur papier : - Uniquement pour les AA (petits peptides) - Echantillons connus de différents AA traités dans les mêmes conditions comme « marqueurs », afin d’établir leur localisation - Migration dépend de la forme sous laquelle se trouve l’AA à ce pH là - AA incolore de base → mise en évidence de la présence par coloration de certains spots - Selon intensité de couleur → dosage quantité d’AA Electrophorèse en gel polyacrylamide PAGE : - Concerne les protéines (ne passe pas maillage papier buvard) → utilisation d’un gel - Séparation des protéines en fonction de la taille et de la charge - Composition du gel : polymérisation de monomères d’acrylamide et de bisacrylamide (agent pontant) → leur proportion influence le maillage et donc le passage +- facile - La composition dépend de la taille de la protéine à séparer (maillage +- serré) - Séparation des protéines en fonction de la taille et de la charge - Vitesse de migration f(taille des molécules + charge) : + rapide si + petite et/ou si très chargé Electrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) : - Séparation des protéines uniquement en fonction de la taille - SDS = Sodium Dodécyl Sulfate = détergent, agent dénaturant (modification structure 3D) - Rôle du SDS : masquer les charges, les protéines deviennent négative → migrent toute vers la cathode + , et rend la protéine linéaire - Rôle de tamis du PAGE f(taille) → vitesse de migration ne dépend plus que de la taille - Problème : 2 protéines au même endroit → SDS-PAGE + autre chose Electrophorèse bidimensionnelle (2D) : 1. Electrofocalisation : séparation des protéines en fonction du pHi, sur gel à gradient de pH o La molécule se dirige en fonction de la charge qu’elle porte et va vers la borne qui l’attire, en se déplaçant, il y a un changement de pH → arrêt de migration au niveau pHi protéine o pH > pHi → anion, migre vers borne positive o pH < pHi → cation, migre vers borne négative 2. SDS-PAGE : séparation des protéines en fonction de la taille Révélation des gels d’électrophorèse : - Révélation au Bleu de Coomassie - Révélation au nitrate d’argent PAR CHROMATOGRAPHIE Chromatographie = technique séparative analytique et/ou préparative qui consiste à faire migrer les constituants à séparer sur une phase stationnaire immobile, à l’aide d’une phase mobile (liquide ou gazeuse) de nature différente. - Support fixe = phase stationnaire - Solvant = phase mobile - Vitesse de migration est fonction des propriétés - Propriétés : taille, polarité, charge, affinité pour un substrat - (En couche mince CCM, sur colonne, …) PAR FINGER PRINT Finger Print = combinaison de 2 techniques de séparation : - Electrophorèse = séparation selon la charge - Chromatographie (CCM) = séparation selon la polarité (sépare une 2e fois) - Dosage par coloration et colorimétrie (selon intensité de couleur) IDENTIFICATION DES AA ET DES PROTEINES - Comparaison avec des étalons : on fait subir même traitement entre 1 inconnu et 1 étalon et compare. - Recueil d’informations selon la technique utilisée (ex : évaluation poids molécules de protéine inconnues par SDS-PAGE) - Comparaison avec base de données centrale DOSAGE DES AA ET PROTEINES TITRAGE DES ACIDES AMINES ACIDES ET BASIQUES Objectif : déterminer la concentration d’1 solution d’acide (ou base) en mesurant le volume exact d’1 solution de base (ou acide) de concentration connue qui réagira avec un volume exact de solution. Courbe de titrage : o > pK COOH → anion o pHi → zwittérion o < pK NH3+ → cation METHODE SPECTROPHOTOMETRIQUE : Principe de fonctionnement : passage d’une source de lumière dans un prisme, sélection longueur d’onde passant à travers échantillon → détecteur pour intensité (influence sur rayonnement) - Molécule traversée absorbe une partie du rayonnement → différence de rayonnement = absorbance (niveau de modification du rayon) - Méthode de dosage : choix de longueur d’onde du rayon incident = longueur d’onde max de la molécule donnée → à celle-ci absorbance proportionnelle à la concentration, puis dosage quantitatif selon relation Beer-Lambert Méthode spectrophotométrie directe : - AA incolores → pas d’absorption dans le domaine UV-visible SAUF o AA aromatiques absorbent dans l’UV pr o Tryptophane fluorescent (émission) Méthode spectrophotométrie indirecte : - Plupart AA incolore → pas d’absorption dans domaine UV-visible → technique de coloration : + il y a d’AA, + la couleur est fixée, puis dosage par colorimétrie ou spectro - Méthode de colorimétrie à la Ninhydrine (temps de révélation) → dosage par mesure colorimétrique (spectrophotométrie d’absorption molécule de longueur d’onde max = 570 nm) - Méthode à l’isothiocyanate de phényl (PITC) : formation complexe PITC-AA → dosage par spectrophotométrie d’absorption molécule de longueur d’onde max = 254nm - Méthode au Biuret : dosage colorimétrique des protéines totales ou molécule avec plusieurs groupements amides + ions cuivriques + milieu alcalin → complexe bleu (longueur d’onde max = 540nm) SEQUENCAGE D’UN PEPTIDE COMPOSITION EN AA 1. La protéine est traitée par urée 8M (agent dénaturant) → séparation des chaines polypeptidiques en monomère (=casser structure quaternaire) 2. Destruction structure tertiaire et secondaire : destruction pont disulfure et linéarisation chaine 3. Protéine traitée par HCl 6M (110°C pdt 16 à 72h) → hydrolyse totale = destruction structure primaire, séparation de tout les AA o ATTENTION hydrolyse peut transformer AA : Asn → Asp, Gln → Glu et Trp détruit 4. Séparation (électrophorèse, chromatographie) et dosage (ninhydrine, PITC) Détermination du résidu C-terminal par Méthode d’Akatori (hydrazine) Détermination du résidu N-terminal par la méthode de Sanger Fragmentation de la chaine polypeptidique (méthode enzymatique) : utilisation de plusieurs agents de clivage pour fragmenter la chaine pour obtenir différentes portions Puis recombinaison des fragments avec les données recueillies. Dégradation d’Edman : - Uniquement pour petits peptides (max 4 ou 5 AA) car dégradation des chaines + grandes - Fixation du PITC sur N-terminal (hydrolyse juste après) - Peptide traité à l’acide dilué à froid (hydrolyse incomplète) - Séparation et identification de l’AA