제제설계학 요약본 1-9조 PDF

Understanding molecular mechanisms of biologics drug delivery and stability from NMR spectroscopy 1. Introduction 1. 바이오로직스의 한계점 1) 물리적 특성의 한계 - 분자량 크고 친수성 높음=> 세포막의 소수성 코어 통과하기 어려움 2) 구조적, 안정성 한계 - 유연한 구조와 동적 특성 가...

Understanding molecular mechanisms of biologics drug delivery and stability from NMR spectroscopy 1. Introduction 1. 바이오로직스의 한계점 1) 물리적 특성의 한계 - 분자량 크고 친수성 높음=> 세포막의 소수성 코어 통과하기 어려움 2) 구조적, 안정성 한계 - 유연한 구조와 동적 특성 가짐=>단백질 응집 경향 증가 - 약물과 부형제 간의 상호작용 => 안정성 문제 - 방부제=> 생화학적 불안정성과 단백질 응집 유발 ∴ 안정적 부형제 선택과 메커니즘 필요 2. 바이오로직스의 해결 방안 => 바이오로직스 수송체: CPP(Cell-Penetrating Peptides) - 세포 침투 펩타이드: 세포막을 파괴하지 않고 세포로 들어가 물질 전달 가능 - 자신보다 60배 큰 물질 운반 가능 - 단점: 표적 특이성 낮음, 효소 분해에 취약 - 예시: LNP(Lipid-Based Nanoparticles) but, 국소적인 전달만 가능하다는 한계점 2. NMR 연구의 필요성 - 약물 전달과 단백질 약물 안정성 담당하기 위해 구조적 속성 파악 필요 => NMR은 단백질 구조를 옹스트롬 수준에서 결정할 수 있는 주요 기술 - 목표는 NMR 기반의 분석을 통해 세포막과 약물 또는 약물 수송체 분자가 상호작용하는 메 커니즘을 이해하고, 이를 최적화해 바이오로직스 약물 전달 시스템을 개발 2. Structural Investigation of Drug Delivery 2.1 Cellular membrane as the permeation barrier [생체 이용률의 중요성] - 생체 이용률: 약물이 변형되지 않은 상태로 전신 순환계에 도달하는 비율 - 세포막과 같은 생물학적 장벽을 효과적으로 투과하는 것 => 약물의 흡수, 분포, 생체 이용률에 중요 - 대부분의 약물: 세포 내부에 치료 표적 있음/수용성/분자량 큼 => 소수성 세포막 통과 어렵 [세포막의 역할] - 외부 물질로부터 세포 보호 - 선택적으로 특정 화학 물질과 지용성 분자 투과 허용 - 막투과: 수동 확산이나 수송체에 의해 발생=> 분자의 크기와 극성이 중요한 영향 미침 - 통과 가능: 비극성 기체, 작은 분자(물, 에탄올) - 통과 불가: 큰 분자, 수용성, 전하 띤 분자 [CPP의 막 삽입 메커니즘] CPP(세포 침투 펩타이드): 약 40개 미만의 아미노산 잔기로 이루어짐 양전하를 가진 아르기닌(Arg)과 라이신(Lys) 잔기 포함 => ① CPP의 양전하 잔기+인지질의 음전하 그룹 간 이온 결합/수소 결합 ② CPP와 물 분자 간 상호작용 ③ 이동성↑ 막 투과 효율 ↑ [지질막과 막 단백질의 상호작용] - 지질막: 수용성 분자, 단백질 수동 확산 차단 but 특정 전하 띤 분자나 펩타이드는 선택적으로 투과시킴=> 이 관계를 이해하는 것이 약물 전달 시스템 설계에 중요하다~ - 세포막의 구성 요소: 다양한 지질(구성은 세포마다 다름) + 다양한 막 단백질 - 막 지질: ① 인지질 ② 당지질 ③스테롤 - 인지질: 이중층 형성, 외부는 친수성 머리/ 내부는 소수성 꼬리 - 막 지질 구성은 세포 기능, 조직에 따라 다름: -포유류는 외부엔 PC/내부엔 PE&PS 많음(비대칭적) 예시 1) 암세포: 포스파티딜세린(PS)이 세포 외부 많음 => 면역 시스템이 암세포를 인식하지 못하게 함 예시 2) 콜레스테롤: 모든 동물 세포막의 주요 성분 세포막의 밀도를 높이고 유동성을 줄임 항암제 내성 암세포: 콜레스테롤 조절로 막의 유연성 조절해 암세포 잘 전이되게 함 세포막에는 콜레스테롤X-> 표적 약물 전달 시스템 개발에 유용 [CPP와 NMR 분석] NMR 분광법: CPP와 같은 물질이 세포막에 삽입될 때의 구조와 동역학을 분석할 수 있음 별로 안 중요해 보임.. 1) HIV-1 외피 당단백질 등 막 결합 펩타이드 분석해 막 결합 구조, 펩타이드-지질 상호작용 분석 2) 인플루엔자 M2 단백질의 콜레스테롤 결합 부위 분석 -> 아만타딘(인플루엔자 치료제)이 M2 채널에 결합하여 바이러스 탈외피를 방해하는 메커 니즘 확인 3) 31P NMR 분광법으로 막의 구조 분석 -막의 곡률: 세포막이 특정 생물학적 과정에서 가지는 곡률인데 약물 확산 및 투과에 영향 줌 ex) 특정 곡률의 막은 약물 더 잘 통과하거나 어떤 위치에 도달하기 쉽게 함 - 라멜라와 Hexagonal phases: - 라멜라: 막이 층층이 배열된 구조(첫 번째 그림&그래프) - 헥사고날 상: 기둥형 구조, 특정 조건에서만 형성(세 번째 그림&그래프) => 이 두 가지 구조는 31P NMR에서 고유의 비등방성 패턴(anisotropic) 나타남 - 작은 소포와 미셸은 반대로 등방성 패턴 나타남(두 번째 보라색 그래프) 4) 멜리틴: 양이온성 용혈 펩타이드 -static 31P NMR을 통해 멜리틴이 지질 이중층 구조를 변화시키고 분해하는 것 알아냄 => NMR 기술은 약물 전달 시스템의 최적화를 위해 구조를 분석하는 데에 활용될 수 있고 차 세대 약물 전달 시스템 개발에도 기여할 수 있다! (NMR 기술의 유용성을 말하고 싶은 거임) 2.2 Membrane interaction of cell-penetrating peptides 이 챕터에서는 CPP의 특징을 알아내기 위한 실험이 주구장창 나옴 [CPP(Cell-Penetrating Peptide)의 특징과 역할] 1. CPP란? - CPP: 세포막을 통과하여 약물을 세포 내부로 전달하는 펩타이드 - 필요성: 대부분의 약물은 크기가 너무 크거나 친수성 때문에 세포막 투과 효율이 낮음. 이 를 극복하기 위해 CPP와 같은 운반체 시스템이 필요 - 구조적 특징: CPP는 약 40개 미만의 아미노산 잔기로 구성되며, 주로 양전하를 띤 아미노 산인 아르기닌(Arg)과 라이신(Lys)을 포함 2. CPP가 세포막을 투과할 수 있는 이유 1) 양이온 전기적 상호작용: - CPP의 양이온 아미노산(아르기닌, 라이신)이 세포막 인지질의 음전하를 띤 머리 부분 (PO₄⁻)과 강력한 이온 결합 및 수소 결합을 형성 2) 수소 결합 가능성: - 양전하 아미노산 잔기와 물 분자 사이의 수소 결합이 CPP의 투과성을 높임 3) 높은 이동성: - CPP는 유연한 구조와 높은 이동성을 가지고 있어 막을 빠르게 통과할 수 있음 3. CPP의 세부 특성 및 실험 결과 (여기 나오는 실험들은 다 위에 CPP가 막을 통과할 수 있는 이유를 증명하려고 하는 거임) [실험 1] 아르기닌과 인지질의 상호작용 B. 아르기닌-인산염 핵 간 거리 C. 라이신-인산염 핵 간 거리 - 아르기닌-인산염 간의 평균 거리: 4.2Å - 라이신-인산염 간의 평균 거리: 4.0Å → 이 두 잔기는 짧은 거리를 유지하며 강력한 이온 결합 및 수소 결합을 형성 - 대조군(중성 아미노산인 이소류신과 인산염의 핵간 거리): 6.9Å(길다)→ 상호작용이 약함 아르기닌&라이신은 인지질의 인산염과 강력한 상호작용함 [실험 2] 구아니디늄과 다이메틸 구아니디늄 치환 실험 - 구아니디늄 그룹(Guanidinium): 아르기닌의 작용 그룹 인산염과의 수소 결합에서 중요한 역할(→이번 실험으로 보여주마.) 왼쪽은 구아니디늄 그룹(수소결합 O) 오른쪽은 다이메틸 구아니디늄 그룹(수소 결합X) - 구아니디늄 그룹을 다이메틸 구아니디늄으로 치환 시 인산염과의 결합 효율 약 95% 감소 → 수소 결합 기회가 감소했기 때문 - 아르기닌을 라이신으로 치환한 경우에도 결합 효율 감소 → 아르기닌의 구아니디늄 그룹이 더 많은 수소 결합을 형성할 가능성을 제공하기 때문 아르기닌의 구아니디늄 그룹+인지질의 결합 => CPP의 막 투과성과 안정성에 중요 [실험 3] 아르기닌의 동적 특성과 안정성 - S-값(질서 매개 변수): CPP와 막 간의 상호작용 강도를 나타냄 =>S값 높을수록 막과 상호작용 강함(안정성이 높은 거임) - 구아니디늄 그룹 S-값(빨간 동그라미): 0.3 (가장 높음)→ 막과 상호작 용 강함 - 나머지 잔기는 S-값 낮음=> 더 유연하고 자유도 높음 - 아르기닌의 구아니디늄 그룹이 막 투과 과정에서 중요한 안정성을 제 공  아르기닌의 구아니디늄 그룹 덕분에 CPP가 막에 안정적으로 결합하고 막 투과성도 높 아짐 [실험 4] TAT 펩타이드 (TAT 펩타이드가 세포막에 어떻게 위치하고 있는지 알아내고자 함) TAT 펩타이드란? - TAT는 대표적인 CPP, 세포막을 투과하며 아르기닌과 라이신 잔기를 포함 - Cα, Cβ, Cγ, Cδ 관찰 (Cα, Cβ, Cγ, Cδ는 탄소 원자 위치 나타낸 거) - X축은 탄소 원자의 화학적 이동값 Y축은 해당 탄소에 연결된 수소 원자 신호 - 빨간 선(H2O): 물 분자와 상호작용하는 부분 파란선 (Lipid CH₂): 세포막 내부 지질층과 상호작 용하는 부분 - 그래프에서 빨간 선과 파란 선 부분에서 모두 피크가 관찰됨 => 물과 지질층 모두와 상호작용함 TAT 펩타이드는 세포막 외부(물)과 내부(지질층) 모두와 상호작용하며 세포막의 경계 부분에서 안정적으로 존재한다.(+그래서 세포막 내외부 모두 투과 가능) [실험 5] 망가니즈 이온 실험 (Paramagnetic Relaxation Enhancement, PRE) (CPP가 세포막 내부/외부 양쪽에 위치할 수 있음을 확인하고자 함) - 망가니즈 이온(Mn²⁺): 상자성 이온, 근처 원자핵의 NMR 신 호 억제 - 빨간 선: 망가니즈 이온이 외부에 있을 때 까만 선: 망가니즈 이온이 외부/내부에 있을 때 1. 망가니즈 이온을 세포막 외부에만 배치: - 세포막 외부의 펩타이드 신호가 억제됨. 2. 망가니즈 이온을 세포막 내부와 외부 모두에 배치: - 세포막 내부와 외부의 신호가 모두 억제됨 →CPP가 세포막 전체에 침투했다! CPP 펩타이드는 세포막의 인지질 양쪽(내부와 외부) 모두에 침투 가능 =>CPP는 약물 전달 과정에서 세포 내외로 물질 운반 가능하다 4. CPP의 응용 가능성 1) 혈액-뇌 장벽(BBB): CPP는 BBB를 통과할 수 있어 중추 신경계 표적 약물 전달에 적합 2) 경피 약물 전달: CPP는 각질층을 효율적으로 침투하여 경피 약물 전달 시스템에서도 활용 가능 2.2에서 하고 싶은 말 - CPP는 세포막을 안정적으로 투과할 수 있는 효율적인 약물 전달 매개체로, 다양한 생물학 적 환경에서 약물 전달 효율을 극대화할 가능성이 있음 - 특히, BBB와 각질층을 포함한 난투과성 장벽을 극복하는 데 유용하며, 신약 개발 및 나노 약물 전달 시스템에서 중요한 역할을 할 수 있음 2.3 Structural Basis of Cellular Uptake as revealed by comparing membrane-active molecules (이 챕터에서는 CPP와 유사한 AMP에 대해 알아보고 그 예시인 PG-1에 대한 내용) 1. AMPs(Antimicrobial Peptides)란? - 항균 펩타이드 - 세균 세포를 선택적으로 공격 - CPP와 유사하게 세포막에 삽입될 수 있음 [CPP vs AMP] CPP AMP Ÿ 1차 서열이 유사함 Ÿ 아미노산이 40개 미만인 아르기닌 풍부한 펩타이드 공통점 Ÿ 아르기닌-인산염 / 라이신-인산염 상호작용 함 Ÿ 세포막에서 생물학적, 치료적 활동 수행 주요 기능 세포 내로 물질 운반 병원체 공격, 파괴 일시적 침투 세포막과 상호작용 비가역적으로 세포막 파괴 세포막 파괴X 차이점 무질서하거나 코일 β-헤어핀 같은 정형화 된 구조 형태(유연함) 2차 구조 분자 유동성 상대적으로 높음 상대적으로 낮음 2. AMPs의 예시 1) PG-1이란? - PG-1(Protegrin-1): 세포막을 관통해 막에 구멍을 형성하는 AMPs의 한 종류 - 막의 수직 방향으로 관통하면서 막에 구멍 냄 => 그 구멍이 트로이드형 포어 (toroidal pore) - 트로이드형 포어: PG-1에 의해 세포 막의 인지질 이중층이 일그러지며 형성 - PG-1 머리는 양전하 아미노산 풍부 인지질 머리: 음전하 => 전기적 상호작용 하며 세포막으로 진입 2) PG-1의 특성을 파악하기 위한 실험=>전부 막 파괴하는 것 확인하는 거임 [실험 1] 망가니즈 PRE NMR 실험 (PG1이 세포막에서 어떻게 위치하고 작용하는지 확인하기 위함) - PG1의 양쪽 끝은 세포막의 양쪽 표면에 위치 => PG1은 막의 양쪽 면에 걸쳐 작용 - PG1의 중간 베타 헤어핀 구조가 세포막 깊숙이 삽입 =>PG1이 막을 관통하고 막의 구조를 교란하는 데 핵심적 13 [실험 2] C-31P REDOR NMR 실험 (PG1의 특정 아미노산 잔기가 세포막의 인산기(PO₄⁻)와 상호작용하는 정도를 확인) - PG1은 세포막 중심까지 관통하며 transmembrane(막의 수직 방향) 구조 형성 =>PG1이 세포막을 완전히 뚫고 지나가며 막을 파괴할 수 있음 확인 [실험 3] 31P NMR 실험 (인지질 이중층이 파괴될 때 발생하는 신호 변화를 관찰) 1. 정상적인 인지질 이중층: - NMR 신호에서 넓게 퍼진 이방성(anisotropic) 신호 2. 인지질 이중층 파괴: - PG1에 의해 세포막이 파괴되면, 뾰족한 신호(isotropic peak)가 관찰됨 => 세포막이 분리되고 붕괴되는 과정을 나타냄 NMR 신호를 통해 PG-1이 세포막 파괴한다는 사실 확인 3) AMPs와 유사한 다른 약물 예시 ① PMX30016 - PMX30016: 소분자 항균 아크릴아마이드 약물 - AMP처럼 세포막 파괴를 통해 병원체 공격 - 독특한 막 파괴 메커니즘 가짐 19 [실험 1] F NMR 실험 (PMX30016의 구조와 세포막 삽입 메커니즘 분석) 1. 분자 축의 방향성: - 긴 분자 축: 세포막 평면과 평행하게 놓임 - 짧은 분자 축: 세포막에 약 20도 기울어져 삽입 2. 분자 칼날 효과: - PMX30016은 세포막에 삽입되면서 칼날처럼 회전하 여 막을 파괴 => 세포막의 안정성을 붕괴시키고 구조를 교란 PMX30016은 분자 칼날 효과에 의해 세포막 파괴함 2.4 Nanoparticle Vehicles that enable and enhance drug delivery (약물 전달체로서 나노입자가 좋다고 제안하는 내용) 1. 나노 입자 기반 약물 전달 시스템 1) 나노입자의 필요성 - 기존 생체 치료제: 세포에 도달하기 전에 분해될 가능성이 높음 => 나노입자를 약물 전달체로 사용 2) 나노입자의 장점 - 부피 대비 표면적이 큼 - 생체 적합성, 안정성 우수 - 생체 이용률과 표적 특이성 높음 - 혈중 순환 시간이 길어 약물 전달 효율 증가 2. 나노입자 설계 시 중요 요소 - 조성, 모양, 크기, 표면 특성, 표면 전하 등이 조절 가능해야 함 - 약물이나 표적에 따라 구성 요소를 최적화하여 약물 전달 효과를 극대화 3. Nanoparticle surface modifier(표면 수정) - 나노입자를 최적화 시키기 위한 방법으로 나노 입자 표면을 수정할 수 있음 1) Hydrophilic steric-stabilizing lipid - 나노입자 표면에 친수성 머리를 가진 지질을 코팅 - 면역계의 인식을 줄이고 안정성 높임 - 친수성이어서 생체 내에서 잘 분산되고 입자 간 응집을 방지 - 약물이 접근하기 어려운 표적의 접근성 높임 2) 포도당 - BBB 극복하기 위한 방법 - 뇌 모세혈관 내피세포에 포도당 수용체(GLUT-1)가 풍부하게 발현됨(에너지 공급 받아야 돼 서) - 나노입자 표면에 포도당을 부착하면 GLUT-1이 이를 인식해 BBB를 통과시킴 3) PEG - 가장 일반적인 surface modifier - 입자 간 응집을 줄이고 약물 전달체의 안정성 높임 2.4.1. Lipid-based nanoparticles (이제부턴 나노입자 중에서 지질 기반 나노입자를 주구장창 소개할 거임) 2.4.1.1. Liposome 1. 리포좀(Liposome) - 나노 크기의 구형 소포 - 하나 또는 여러 개의 인지질 이중층으로 구성 - 내부에는 친수성 핵을 가짐 => 소수성 약물은 지질층에, 친수성 약물은 내부 공간이나 이온성 머 리 부분에 캡슐화됨 - 구성 성분: - 인지질: 약물 보호 - 콜레스테롤: 약물 누출 감소 - PEG-lipid: 안정성 및 혈중 순환 시간 증가 - 문제점: - PEG-lipid가 특정 농도 이상일 경우 미셸을 형성하여 리포좀을 용해시킴 => 최적화가 필요하며, 이를 연구하기 위해 NMR 기술 활용됨 2. 리포좀 최적화 연구(NMR 이용) 1) PEG-lipid 최적 농도 확인 - PGSE NMR과 static 31P NMR을 이용해 연구 - PEG와 리포좀 핵의 인지질이 유사한 길이를 가지는 경우, PEG-lipid가 8%일 때 가장 효 율적인 약물 전달 가능 2) 약물 전달 및 캡슐화 효율 분석: - NOESY 및 PRE NMR을 통한 연구 - 친수성 분자가 인지질 머리 부분에 존재한다는 사실 밝혀냄 - Ex. Resveratrol(친수성 약물)이 인지질 머리 부분에 위치함을 확인 3) 캡슐화 효율 평가: - 약물이 나노입자 전달체에 얼마나 봉입 됐는지 확인하고자 함 but, 기존 방법(크로마토그래피, 원심분리, 투석)으로는 약물이 들어간 전달체 부서질 가능 성↑ - NMR을 이용하여 캡슐화 효율을 정확히 계산: [방법 1] 수소 신호 변화 측정 - 리포좀 내부 약물은 pH 변화에 둔감, 외부 약물은 민감 - pH 민감 분자인 호모카르노신의 NMR 신호 변화를 통해 리포좀 내부 약물 양을 확인 - Ext. 부분이 리포좀 외부에 있는 약물의 피크 Int. 부분이 리포좀 내부에 있는 약물의 피크 - pH가 변화함에 따라 Ext의 피크 위치는 계속 바뀜 but, Int의 피크 위치는 거의 그대로 => 이를 이용해 캡슐화된 약물의 비율 계산 가능 [방법 2] 표준 물질(Pyridine)과 신호 비교 - 약물의 신호를 정량화하여 정확한 캡슐화 효율 계산 - 외부 환경의 영향을 받지 않는 피리딘을 내부 표준 물질로 사용 - MTX(Methotrexate): 약물 이름 - 아래 그래프에서 1,2,3(피리딘 고리의 수소들) 피크가  8.5~6.5ppm에서 관찰됨 - 아래 초록색 숫자: 각 그래프의 적분 값 - 피리딘 분자 10개 당 하나의 약물 분자 있음 피리딘 신호와 약물 신호의 적분 면적을 비교해 약물의 양 정량화 가능 3. 리포좀의 단점 해결(->리포실로 변형) 1) 리포좀의 한계: - 위장관 통과 시 약물이 분해되거나 리포좀이 약해짐 2) 해결 방안: Liposil로 만들기 - Liposil: 리포좀을 실리카로 코팅한 것 - 리포좀 강도 증가 및 pH로 인한 약물 분해 방지 - 경구 투여에 적합 4. 실리카와 리포좀의 상호작용 분석 31 1) P ssNMR을 이용해 liposil 구조와 계면 분석 - 물과 결합한 DPPC가 실리카에 의해 고정됨 DPPC는 지질 이름 - 온도 변화 실험: (결론) 저온에서 실리카와 리포좀의 결합력이 더 강함 2) 추가 실험들 결론만 - 리포좀과 실리카 껍질은 물리적으로 가까이서 상호작용함 - 실리카와 리포좀은 물분자를 통해 연결됨, 실험적/이론적으로 모두 검증함 - 나노입자는 약물 전달체로서 다양한 가능성을 가지고 있음 - 특히, 리포좀과 같은 지질 기반 전달체는 생체 적합성과 안정성이 우수하며, 경구 투여와 같은 새로운 방식으로 활용 가능 - 실리카 코팅과 NMR 연구를 통해 리포좀의 약물 전달 효율을 최적화하고 새로운 응용 가능 성을 열 수 있음 2.4.1.2 Lipid nanoparticles(LNP) 1. siRNA와 LNP의 필요성 - small interfering RNA(siRNA): - 유전자 발현 억제 및 mRNA 분해를 통해 질병 치료에 사용 - 높은 선택성을 가지고 모든 유전자를 표적으로 삼을 수 있는 잠재력을 지님 - 문제점: - 크기가 크고 음전하로 인해 세포막을 통과하여 세포 내 작용 부위로 도달하기 어려움 - 구조적 안정성이 낮아 체내 환경에서 분해 가능성 높음 ∴ siRNA같은 핵산 치료제를 전달하기 위한 수단이 필요함=>그거슨 지질 나노입자! 2. LNP(Lipid Nanoparticle) - 구성 ① 이온화 가능한 양이온성 지질: 형질 내 이동 효율을 향상시키며 면역원성과 독성을 낮춤 ② 인지질: 구조적 안정성↑ ③ 콜레스테롤: 입자의 안정성을 높이고 약물 누출 감소 3. LNP의 구조 및 안정성 분석 1) DNP(동적 핵분극, Dynamic Nuclear Polarization)-enhanced NMR - LNP에 약물(siRNA/mRNA)이 들어있는지에 관계없이 LNP의 구조 분석 - 극성을 전달하여 LNP의 표면 및 내부의 구조적 변화를 분석 - 결과: - siRNA가 포함되지 않은 LNP, 50% 설포네이트된 LNP, 100% 설포네이트된 LNP를 비교 - siRNA가 완전히 포함되었을 경우 내부에 위치 - 부분적으로 설포네이트된 경우 siRNA는 표면과 내부 모두에 존재 2) cryo-TEM & SAXS - 특징: - 크라이오 트랜스미션 전자현미경(Cryo-TEM)과 소각산란 X선(SAXS) 분석을 통해 LNP 구조의 계층 모델 제안 - 결과: - LNP의 외부는 PEG와 인지질(DSPC)로 구성 - 내부는 서브코어와 코어 레이어로 나뉨: - 서브코어: 양이온성 지질과 siRNA가 결합 - 중심부: 콜레스테롤과 혼합된 중성 지질로 이루어짐 3) PEG 방출 동력학 분석 (PGSE NMR) - PEG 탈락의 중요성: - PEG가 지질막에서 떨어져 나가야 세포막과 상호작용 가능(PEG-shedding) - 짧은 PEG 꼬리를 가진 LNP는 빠르게 방출되며, 긴 꼬리를 가진 LNP는 더 오래 안정성 을 유지 - 결과: - PEG의 길이에 따라 LNP의 방출 효율과 안정성을 조정 가능 4. LNP의 연구 의의 - siRNA 전달 효율 개선: - NMR과 구조 분석 기법을 통해 LNP의 구조와 안정성을 최적화 - 다양한 조건에서 siRNA 전달을 제어하고, 특정 장기나 세포로의 분포를 유도 - 다른 장기 표적화: - 기존 간 표적 전달 한계를 극복하기 위한 연구가 진행 중 - 구조적 설계와 PEG 방출 조절로 조직 특이적 전달 효율 증가 가능 - LNP는 siRNA 치료제를 체내에서 안정적으로 전달하는 핵심 기술 - 다양한 분석 기법(DNP NMR, Cryo-TEM, SAXS 등)을 통해 구조와 기능을 세밀히 조정하 고, siRNA의 효과적인 전달과 조직 특이적 분포를 가능하게 함 2.4.1.3 Solid Lipid Nanoparticles 1. Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) - SLN: 실온에서 고체 상태의 결정 구조를 유지하는 고융점 지질 - 주요 성분 ① 지방산 ② 스테로이드 ③ mono-/di-/tri-글리세라이드 ④ 왁스 등 장점 단점 Ÿ 약물을 싣는 데에 제한 있음 Ÿ 높은 약물 안정성 Ÿ 약물 방출에 제약 있음(고제 지질의 다형 Ÿ 약물 방출 오랫동안 지속됨 성 전이로 인해) - 개선 방법 1) NLC (Nanostructured Lipid Carriers): 액체 지질을 포함해 SLN의 단점을 보완 2) Calixarene-Based SLNs: 특수 화합물을 이용해 SLN의 성능 개선 2. Nanostructured Lipid Carriers (NLCs) - 고체 지질 껍질 내부에 중쇄 중성 지방 등 하나 이상의 액체 지질 포함된 구조 - 장점: - SLN보다 약물 로딩이 더 용이 - 약물 방출 속도를 조절 가능 3. SLN과 NLC의 구조적 특징 분석 방법 1) NMR Relaxation Measurements =>약물의 균일성 측정 - 균질 혼합물: 동일한 스핀 격자 이완 시간 (Spin-Lattice Relaxation Time, T1q) - 상 분리 상태: 이완 시간 서로 다름 2) 1H NMR으로 각 구성 성분의 이동성 확인 -Tripalmitin(고체 지질 코어): 1H NMR에서 신호 없음 → 코어의 고정화 상태 확인 - PEG 사슬: 좁은 1H 선폭과 긴 이완 시간(T1, T2) → PEG 사슬의 높은 유동성 확인 => 나노입자의 표면은 역동적이고 코어는 고체(고정됨) 3) Diffusion-Oriented Spectroscopy (DOSY) - PEG chain이 SLN의 외부 수성 상과 혼합되지 않고 표면에 부착되어 있음을 확인 4) Chemical Shift 측정 - 1H 선폭 변화 측정 - NLC 내 액체 지질의 유동성 및 물리적 상태를 평가 온도가 높아지면 유동성이 증가 => 낮은 온도일 때는 고체 지질과 상호작용해서 고정되고, 높은 온도일 때는 유동성 높아짐 + 액체 지질(oil) 함량이 증가하면 유동성 증가 5) Continuous Flow Hyperpolarized 129Xe NMR - Calixarene 기반 SLN: - Xenon 가스를 이용해 빈 공간(host cavity) 탐색 - 염화메틸렌 가스와의 경쟁 흡착 → 구조적 변화 확인 - Xenon 신호가 증가하면 SLN 내부와 표면에서 구조 안정성을 확인 2.4.2. Biodegradable polymeric nanoparticles 1. 천연 및 합성 폴리머 기반 나노입자 1) 천연 폴리머 - 구성: 단백질 기반(알부민, 콜라겐) 및 다당류(키토산, 덱스트란, 알지네이트 등) 장점 단점 Ÿ 자연에 풍부 Ÿ 분자량 변화 크고 변동성 높음 Ÿ 생분해성, 생체 적합성↑ → 조직 축적 위험↑, 약물 방출에 영향 Ÿ 독성 낮음 2) 합성 생분해성 및 생체 흡수성 폴리머 - 예시: PLA, PGA, PCL, PLGA 등 - 특징: - 생분해성 및 생체 흡수성 - 분자량이 클수록 축적 가능성이 높지만, PEG를 결합해 안정성 증가 가능 - NMR 활용 - PEG-PLA 및 PEG-PLGA의 구조적 특성 확인 - 수성 환경에서 소수성 코어 형성 여부 평가 2. Core-Corona 구조 - 내부 코어: 소수성 폴리에스터가 약물을 안전하게 캡슐화 외부 코로나: 친수성 PEG 사슬이 혈액 순환 시간을 연장 - 장점: - 약물의 혈중 안정성 증가 - PLGA-PEG의 PEGylation으로 혈장 단백질과의 상호작용 최소화 3. 나노입자의 크기와 표면 - 다양한 표적, 질병 등에 대한 전달체 개발에 중요 - 직경 200nm 이상은 비장에서 걸러질 수도 - 유동성↑: 분해 속도, 크기, 모양 조절 - 3중 구조 3. PEI (Polyethyleneimine)의 특성과 활용 - 분해되지 않는 합성 고분자, DNA와 결합해 유전자 전달에 기여 - 과량의 PEI는 세포 독성을 유발(분해되지 않기 때문에 과하게 생성될 수도)→ 정량화 필수 - NMR 활용: - 내부 표준 물질과 비교해 free polymer와 polyplex 농도 정량화 가능  Understanding molecular mechanisms of biologis drug delivery and stability from NMR spectroscopy 3. Moleculer mechanism of biophysical and biochemical stability ~ 22 김주원 단백질 간 상호작용으로 높은 특이성, 저분자 약물과 항체 사이 간극 감소. 바이오 의약품 개발의 목표: 약물을 안정적이고 효과적인 제형으로 변환하여 환자에게 전달하는 것. 보통 단백질 및 펩타이드 약물로 구성되며, 작은 분자 약물과는 달리 구조적 유연성이 높아 불안정성이 크다는 특징. → 단백질 약물의 안정성은 환경적 스트레스(예: 빛, 열, 물리적 충격)와 상호작용에 따라 변할 수 있으며, 특히 응집 (aggregation) 문제가 있음. 단백질 응집은 고차 구조(high-order structure) 형성과 비정질 응집체(amorphous aggregates), 그리고 섬유구조(fibrils)로 이어지게 된다. 화학적 상호작용으로 인해 열역학적으로 다차 구조가 더 안정하다. => 자연스럽게 응집하려고 하는 상태가 된다는 문제점. 이러한 응집 현상은 알츠하이머 병, 파킨슨 병에서도 나타난다. 이를 줄이고자 개발된 기법 magic angle θ = 54.75˚에서 sample 회전해 측정. 응집체 구조 분석. (magic angle 내용은 뒤에 다시 한 번 더 나옴) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence NMR. 서로 다른 핵의 상호작용을 탐지하는 피크를 측정한다. 여기서는  H와  N의 상호작용을 탐지하여 피크를 관측. 해당 피크를 2차원에 표현하여, 3차 구조, 복합체를 분석하고 동적 변화를 감지. 특히 부형제 첨가에 따른 단백질의 미 세 구조 변화를 탐지하거나, 단백질의 deamidation이나 oxidation 같은 분해를 감지할 수 있다. (한 축은 H ppm, 다른 축은 N ppm으로 비교) - 2 - 섬유 형성 과정(Fibril Formation) 단백질 응집체는 주로 β-병풍(β-sheet) 구조를 형성하며, 이는 비정질 응집체(amorphous aggregates)나 섬유 (amyloid fibrils)로 발전할 수 있다. ex) 글루카곤(Glucagon): 글루카곤의 섬유화 과정은 α-나선 구조에서 시작되어 β-병풍 구조로 변환되지 않고 진행. 섬유화 핵심 영역은 N-말단에서 관찰되었으며, 이는 상호 분자 β-병풍 구조의 중심(core)을 형성 ex) Interferon α-2a aggregation: 인터페론 제형에 사용되는 보존제인 BA(Benzyl Alcohol)은 단백질의 일부 구조 를 풀어 (partial unfolding) 응집을 유도. (BA가 단백질의 소수성 영역을 더 노출시키는 원리!) ** 타 연구 인용: ANS 부분이 단백질 소수성 영역 결합하며 형광 방출이 증가하기에, BA가 나타내는 변화 관찰 => BA 농도가 증가함에 따라 형광 세기가 강해졌기에, 해당 현상을 증명하는 실험 결과이다. ppt추가) interferon α-2a chemical degradation (화학적 분해) 앞서 언급한 oxidation, deamidation에 따른 변형 시 2차 구조에는 나타나지 않던 변화가 3차 구조에서 나타남! (deamidation에 의해 구조 내에서 상호 작용이 달라지기 때문) 이는 곧 IFN의 항바이러스, 항증식, 면역 조절 약효를 감소하게 된다. => NMR로 평가 (국소 구조 변화, 잔기 변화) 탈아미드화 전에는 Asn93이 인접한 Tyr157, Arg241과 상호작용하나, 탈아미드화 후에는 Asn156이 Leu153, Ser152, His76과 상호작용하여 미세한 구조적 변화를 나타낸다. ex) B2 macroglobluin 분자 내 상호작용 + 분자 간 상호작용간 경쟁으로 응집 형성 조절 (intra- vs. inter) * cis-to-trans isomerization: Pro32 잔기가 isomerization 되며 섬유 응집의 trigger 역할을 한다. + 60~70번대 영역의 아미노산 서열의 aromatic R기에 따라 응집을 유발할 가능성 => 이후 protofilament로 구성되고, π-stacking과 disulfide bond로 안정화. - 3 - 즉 단백질 자체가 아닌, 아미노산 서열에 따라 amyloid 형성 가능성을 시사한다. 단백질의 안정성 증가시키는 전략 Glucagon Fibril 형성과 안정성에 중요한 Phe36, Tyr10, Val23, Met27. 이를 Alanine으로 치환시키는 경우, fibrillation 경향성이 감소하게 된다. ** 이때 β-sheet를 구성하는 interaction이 사라지더라도 fibrillation 경향성에는 크게 영향을 미치지 않는다. 항체의 고차 구조(HOS, Higher Order, Structure) 단백질의 고차 구조와 유사. (경쇄와 중쇄에서). 항체가 기능을 발휘하기 위해 올바른 고차 구조를 가져야 한다. (이황화 결합(disulfide bonds) 및 소수성 상호작용(hydrophobic interactions)에 의해 안정화) 1) 아미노산의 변형 → 3차원 구조 영향 2) 주사기, 공기-액체 경계면, 기기의 표면 → 항체 분해 가능성 증가 3) 항체의 환경 변화 → 약물 분해 속도 증가 * arginine glutamate과 같은 첨가제는 고농도 제형에서 자가응집(self-association)이나 구조적 변화를 완화 항체의 안정성 유지, HOS 데이터 확보를 위해 NMR 활용:  H NMR과 2차원 NMR 소개. (과거의 방법은 해상도가 낮았음. (FT-IR, DSC, CD 등). => 고해상도 분석법) - 4 -  H NMR의 경우 수소의 핵 전자 spin 이용하여 측정. 외부자기장에 따라, 핵 spin이 정렬되면서 자기장과 같은 α spin과 다른 β spin으로 형성 => NMR spectrum은 α spin 상태와 β spin 상태 사이의 에너지 간극에 따른 radio-wave 흡수를 측정한다. 이때 분자 내의 양성자 주위에 존재하는 전자의 환경에 따라 'shielding effect'가 발생하며, 변화가 발생한다. (양성자는 전자 구름에 둘러싸이나, 자기장 내에 전자도 운동하기에 자기장을 가리우는 효과를 일으킨다. 이는 원래 가해준 자기장보다 약한 자기장을 느끼게 하기에, 해당 변화한 효과를 측정한다.) 기준점을 TMS (trimethylsilane)으로 잡고, 해당 peak에서 얼마나 감소했는지를 ppm 단위로 나타낸다. PGSTE (Pulsed-Field Gradient Stimulated Echo): 항체의 확산 계수를 측정, 약물의 구조적 유체역학적 특성 규명. PCA (Principal Component Analysis): 항체 간 유사성과 차이를 통계적으로 분석, 구조적 변이 감지. ex) 인플릭시맙(Infliximab)과 리툭시맙(Rituximab) (다양한 제조 환경에 따른 변이를 1D NMR과 PCA를 통해 분석 하였으며, 이로부터 분자 지문(molecular fingerprint)을 도출.) infliximab이 빨간색, rituximab이 파란색 두 항체 크기 차이를 보여주는게 elution profile (우상단) -> elution volume이 다르다= 크기가 다르다 두 항체의 분자 크기, 구조적 차이에서 발생 하단의  H NMR 결과: NMR 신호가 유사하지만 일부 차이 => 고차 구조의 차이가 반영된 모습 ≫  H NMR은 용액 내 항체 구조 변화, 첨가제의 상호작용 탐지에 매우 유용함을 밝힘 제형 선별 및 평가를 위한 방법으로 사용될 수 있음. (ex: NMR + 다변량 분석 = 분해된 항체의 4차 구조 연구) ** 폴리소르베이트(Polysorbate)와 항체 구조 간 상호작용을 2D 메틸 NMR로 분석하여 Fab 영역이 Fc 영역보다 더 민감하게 반응함을 확인. 2D NMR (2차원 NMR) 원자 수준 ~ 약물 3차, 4차 구조까지 넓은 범위의 탐지가 가능. => 약물 내의 당화(glycosylation), 서열 변이, 안정성 변화 (PTMs 등), 응집 등 특징을 식별하는 데에 이용 즉 약물 개발 및 품질 관리에 활용될 수 있으며, 단백질과 첨가제 간 상호작용도 분석이 가능함. - 5 - COSY (Correlation Spectroscopy) '수소 원자' 간의 상관 관계 (화학적 이동이 유사) => 특정 수소 원자가 연결된 다른 수소와의 관계 파악 ex) 우측 타 논문 그림에서는 D O 내의 sucrose가 500 MHz 스펙트럼을 나타낸다. 붉은색과 초록색은 서로 다른 양성자 간의 교차를 나타냄. 두 개의 서로 다른 주파수 측 사용 => 2차원 (일반적으로  H-  H coupling 이용) 화학적 이동이나 다른 핵의 상호작용으로 축 설정해 수소 원자 간의 spin-spin 결합과 같은 여러 상호작용을 나타낸다. => 분자의 구조적 변화, 동적 변화 확인 [주의] COSY는 핵 사이의 직접적인 spin-spin coupling을 측정하는 방식이며, 앞서 나온 HCQR에서의 이(異)핵 간 상호작용을 측정하는 것과는 대비된다. 이 경우 특히 멀리 떨어진  N이나  C 를 이용하는 경우가 많기에, COSY와 HCQR을 혼동하지 않도록 하자. mAB SSS (single-clone antibody) 예시,  H와  C 간 gHSQC spectrum 지문을 나타낸 결과. 각 500, 900 MHz. => 왼쪽 오른쪽 그래프는 두 항체가 다른 조건에서 유사한 패턴을 보임을 나타내며, 각각의 아미노산 잔기가 항체 내에서 어떻게 위치하며, 서로 다른 스펙트럼 간 차이를 분석 백신: 감염병 예방을 위해 병원체의 표면 단백질, 독소, 비활성화된 병원체 등을 포함하며, 구조적 안정성과 효능을 유지하기 위해 NMR 활용 다당류-단백질 접합 백신 (Polysaccharide-Protein Conjugate Vaccines) 다당류 항원의 구조적 정체성(identity) 및 안정성을 NMR로 분석. NMR은 다량의 첨가제가 포함된 복합 백신에서도 고도의 구조적 명확성을 제공함 => 품질 평가에 활용 - 다당류는 독립적으로 T-cell dependent 면역 반응을 일으키지 못하지만, 다당류를 단백질에 공유결합시키는 경우 면역 반응을 일으킬 수 있다. 따라서 해당 공유결합된 상태를 NMR로 측정할 수 있다. - O-acetylation 함량을 NMR로 측정해 활용한다. O-acetylation은 다당류의 특정 부분에 -COCH  아세틸기가 결합한 것. 이는 면역계의 반응 방식을 조절하기에, O-acetylation의 정량 분석을 통해 다당류 항원의 일관성을 보장하고 면역원성을 최적화할 수 있다. - 6 - 알루미늄 기반 보조제 (Aluminum-Based Adjuvants) (용액 NMR) Aluminium 염은 가장 흔히 사용되는 보조제로, 면역을 강화시킨다. 이를 위해 중성 pH에서 자유 인산염 농도를 측정한 후, 산성 pH에서 인산염 + 알루미늄 농도 측정. * 중성 pH에서는 인산염 이온이 주로 free state로 존재해, 보조제와 결합하지 않는 상태로 존재한다. 이러한 자유 인산염은 결합 인산염에 비해 chemical shift가 명확해, 쉽게 측정할 수 있다. * but 산성 pH에서는 강산성으로 인해 Al-PO4 결합이 끊어지며 결합된 인산염이 자유형으로 해리된다. 이를 통해 용액 내 모든 인산염이 자유 상태로 변환되어, 이를 통해 총 인산염을 측정할 수 있다. => 총 인산염 양과 총 알루미늄 양을 측정할 수 있다. 27Al MAS NMR: 알루미늄 Hydroxyphosphate(adjuvant)의 소량 tetrahedral, 주로 octahedral 알루미늄 구조를 분석. 팔면체의 경우 variscite (-9 ppm)과 hydroxide (+9 ppm) 사이에서 관찰. (기준) 이때 인산염의 함량에 따라 알루미늄 구조에 영향을 미쳐, 화학적 이동 변화를 유 발하게 된다. 인산염이 많아질수록 octahedral 구조의 비율이 증가해, 안정성이 높 아지는 효과. =>  Al MAS NMR을 통해 보조제 내의 알루미늄과 인산염 간 상호작용, 구조적 변화를 관찰. < 동위원소로 표지된 Alum 보조제를 사용해 단백질과 Alum의 결합 부위, 접힘, 구조적 안정성을 추적 > 파란색: AlumOH가 단백질이 흡착된 상태에서의 chemical shift 빨간색: 동결건조되 단백질이 re-hydration된 상태의 chemical shift 자주색: 단백질이 AlumOH와 상호작용해 구조적 변화가 일어난 부위. AlumOH와 단백질 간 상호작용에 따라 백신 안정성 평가, 보조제 설계 최적화가 가능. 동결 건조에 따라 단백질이 어떻게 변화했는지, epitope이 변화하지 않았는지 확인. Subviral Particles(SVP) 바이러스에서 일부 구조 (캡시드, 외피 등), 복제 능력은 없으나 표면 항원을 유지해 면역 반응 유도 가능. => 백신 플랫폼으로 널리 사용되며 안정성과 경제성에서 장점 보유 110kHz MAS NMR에서 self-assembly 과정과 구조적 안정성 분석. 단백질 함량이 0.5mg 미만일 때도 NMR 신호 감지가 가능하다는 특징. - 7 -  이때 2D  H-  N ssNMR 분석을 통해 SVP 조립 과정에서 발생하는 구조적 변화 관찰 => 백신 보조제와 결합된 상태에서 SVP가 유지되는 안정성을 평가함. 바이러스 유사 입자(VLPs, Virus-Like Particles) VLPs는 유전체만 없는 바이러스 구조, 안정적인 백신 플랫폼으로 활용  F NMR: VLP의 해체 상태와 같은 구조적 변화와 세포 내부에서의 행동을 추적하여 설계 최적화에 기여.  F를 포함하는 비정상적 아미노산은 라벨링해, 구조적 혹은 상호작용의 변화를 추적. (질의응답 cf: F는 마치 자석처럼 작용) 침전 문제 (Sedimentation) 백신 제조 과정 중 부유 입자가 침전되는 경우, 균일하게 채워지지 않아 용량 오류 발생. 운송 및 저장 중에서도 발생이 가능하기에, 재현탁(resuspension)이 불가능한 경우 제품 회수가 불가결 * Benchtop NMR 소형 NMR 장비, 비침습적으로 샘플 분석. 휴대성이 높고 빠른 품질 관리가 가능 * 물(水) NMR 물 분자 내 양성자와 이완율( R  ) 측정을 통해 용액의 무리적 상태 평가. 침전된 입자와 물 사이 상호작용을 통해, 침전 상태를 비침습적으로 측정 침전 속도와 균질성을 wNMR(물 NMR)로 측정하여 유통 과정에서 발생할 수 있는 문제를 해결. 고체 제형의 안정성과 특성 고체 단백질 제형은 기존의 액체 제형을 대체할 수 있는 형태로, 단백질 안정성을 높이고 운송 및 유통상의 장점을 제 공. 1) vial-lyophilization (동결 건조): 가장 널리 사용되는 방식으로, vial에 충전 후 동결, 진공 건조 후 봉인. 2) spray-drying (분무 건조): 액체 원료를 분무한 후 건조하여 입자를 형성. 3) crystallization (결정화): 포화 용액의 냉각이나 증발을 이용해 응결핵을 형성, 성장시킨 후 분리해 세척 후 건조. - 8 - 하지만 건조 과정에서의 스트레스 존재한다는 문제점: 열, 탈수, 기계적 스트레스는 단백질의 안정성을 저하시키고 응집(aggregation)이나 비활성화를 유발 가령 동결 건조 과정에서 pH 변화는 단백질의 응집을 증가시키거나 수소 결합이 깨지면서 구조가 불안정해질 가능성 => 건조 과정 및 첨가제 선택의 최적화가 필수. ** ppt 자료의 타 논문 소개 1) Mensick et al. (2016): 단백질-당류 동결 건조 혼합물의 혼화성(miscibility)과 안정성 단백질과 당류 간 혼화성이 높을수록 장기적인 안정성이 높아짐. ssNMR을 통해 미세 환경 및 상호작용을 평가. 2) Li et al. (2020): 동결 건조 단백질과 백신 제형의 미세 환경의 산성도 산성도 변화는 단백질 안정성을 크게 저하시키기에, Histidine chemical shift를 통해 정량적 평가. ssNMR은 산성도 변화에 따른 단백질 손상을 추적할 수 있는 효과적 도구. 3) Reichert et al. (2019): 미세 중력을 이용한 단백질 결정화 실험 ISS에서 caffeine을 이용해 제조된 Pembrolizumab 미세 결정은 지상에서 제조된 것보다 높은 품질과 안정성을 가 짐. (  C CP MAS spectrum 분석) 미세 중력 환경이 단백질 기반 치료제의 결정화에 영향을 미친다는 것을 발견. ∴ 고체 제형은 단백질 약물의 장기 안정성을 보장하며, 스프레이 건조나 결정화와 같은 공정은 피하 주사와 같은 적 합한 제형 개발에 유용 solution NMR: 잘 용해된 분자에서 ns 단위 빠른 등방성 운동을 이 용해, 고해상도 구조 분석. 단백질 접힘, 항체의 구조 변화 등 확인.  H,  C,  N 이용 but 분자량이 큰 복합체 (> 100 kDa)의 경우 신호가 복잡해짐. solid-state NMR: 분자량이 크고 잘 용해되지 않는 복합체 분석. 쌍극자 상호작용 및 화학적 이방성을 분석해, 샘플의 거리와 각도를 정량화. 고체 상태 단백질, 응집체, 분자 복합체 구조를 해석함. 단백질 응집 메커니즘을 분석해, 고체 제형의 안정성 평가 가능. 이때 MAS(magic-angle spinning)은 고체 NMR에서 신호 해석을 용이하기 위해 사용되는 핵심 기술 쌍극자 상호작용, 화학적 가리움의 식에는 cos   항을 포함하게 된다. solution NMR에는 빠른 등방성 운동으로 평균 값이 0이 되나, 고체 시료에서는 해당 항이 0이 되도록 θ 값을 54.74˚ = magic-angle로 맞추어 회전축 설정. In-cell NMR: 생체 내 단백질의 구조 및 동적 상호작용을 연구. 세포 내 단백질의 입체 구조 및 복합체 형성을 원자 수준에서 분석하고, 단백질의 상호작용과 안정성 실시간 연구. 생체 내 대사 및 단백질 변형 (post-translational modification) 연구에 활용 가능성. - 9 - 1) Introduction - 수용성 코어가 있는 submicron 캡슐 (ex. Liposome) - 지질층으로 둘러싸여 안정화된 고체 또는 비정질 (amorphous) 코어 (ex) doxil: 항암 치료 림포좀 / Onpattro: siRNA 전달 -> FDA 승인 인지질의 머리 성분: PA, PG, PE, PC 등으로 나뉨 - 체내 pH: PA, PS, PG 음성 / PC, PE 중성 인지질 꼬리 성분: alkene이 존재하면 고체에서 액체로의 전이 온도 낮아져 불포화지질이 리포솜 형성 촉진 음전하 띠는 RNA, DNA: 인산염 그룹이 없는 합성 양이온성 지질과 복합화 (ex) DMG-PEG / Dlin-MC3-DMA 3. 크기와 구조 SUV (small unilamellar vesicles): 20-50nm / 체내 특정 조직에 쉽 게 흡수되며 짧은 시간 동안 약물 전달 유리 LUV (Large unilamellar vesicle): 100nm 이상, 리포솜 제형 MLV (Multilamellar vesicle): 캡슐화 내용물을 외부 환경 보호 MV (multivesicular vesicle) 마이크론 크기. 국소 진통용 마취제 등 전달 GUV (giant unilamellar vesicle): 세포 모방 모델 시스템으로 사용 4. 해결해야 할 과제 장점: 안정성과 효율적인 약물 전달 단점: 복잡한 물리화학적 특징과 제조 과정 FDA에 400개 리포솜 의약물 분석 - 품질 문제 중 47% 리포솜 특정된 것 - 41% 제품 사양 / 27% 지질 구성체와 의약품 품질 문제 2018년 FDA에서 산업 지침 발행 및 CQA (critical quality attributes) - 지질 종의 식별 및 정량화 - API: 총 API의 정량화 - 나노 입자: 형태, 구조, 입자 크기 분포 등으로 특성화 - 안정성: 물리적, 화학적 안정성 - 약물 방출: 시험관 내 동력학 2) Identification and quantification of lipid species: NMR, MS, Raman, TLC 등 2.1. Identification of lipid molecules - - - Mass spectrometry - - - Raman spectrometry - - - - 2.2. Lipid quantification by chromatography approaches 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC) 얇은막 크로마토그래피 (TLC) - - 기체 크로마토그래피 (GC) - - 2.3. Lipid quantification by colorimetric and fluorometric assays Colorimetric 방법 - Fluorometric 방법 - - 3) Quantification of drug encapsulation: RP-HPLC, CE, FFF (AF4) 방법 1. REV (Reverse-Phase Evaporation, 역상 증발) 2. Remote Loading Method (원격 로딩 방법) 3. 캡슐화되지 않은 약물 정량 - 펌프로 압력을 줘서 이동상 움직이게 함 Liquid sample을 지나게 하고 detecting 진행 고체상 추출 (SPE, Solid phase extraction) 사용 목적: SPE: RAM column 사용 (methylcellulose가 고정된 octadecylsilylated silica) -> 저분자 잡아두지만 고분자나 리포솜 제외 Doxil: 리포좀 약물 / DOX: 독소루비신 / I=Injection, P=pump, D=detector, V=Valve (아래 그림에서) 3.2. Capillary electrophoresis (CE, 모세관 전기영동) 3.3. Field-flow fractionation (FFF) FFF: FFF의 구조 - 적절한 membrane 소재와 MWCO (molecular weight cutoff) MWCO: 최적화 과정 (알고리즘) 다른 기술과의 사용 Semi-preparative AF4 + HPLC-UV-CAD → AF4+LC-MS → AF4+MALS, DLS 𝑅𝑔 𝑅ℎ 𝑅𝑔 /𝑅ℎ 4.1. Nanoparticle morphology identified by microscope techniques: TEM, SEM, AFM TEM (투과 전자 현미경, transmission electron microscopy) SEM (주사 전자 현미경, Scanning electron microscopy) ESEM (환경 SEM) AFM (Atomic force microscopy) -> 옆의 사진 4.2. Nanoparticle lamellarity: NMR, SAXS&SANS, 현미경 31P-NMR 4.3. Nanoparticle size determined by light scattering techniques: DLS, NTA, TRPS 등 1. DLS (동적 광산란, Dynamic Light Scattering) - - - ⚫ ⚫ ⚫ - - - - - - - -  - 4.4. Nanoparticle size measured by size exclusion chromatography (SEC) 소재 - - - - - - - - - - 4.5. Nanoparticle surface charge (zeta potential) = PALS Nanoparticle surface charge - - - PALS (Phase analysis light scattering) - -  제타 포텐셜과 리포좀 - - - - 4장 요약: Lipid nanoparticle (LNP) 특징을 아는 것이 약물 전달 시스템에 필수적임 5) Stability: Lipid nanoparticle formulation 안정성 측면 5.1. Physical stability: DSC, 현미경 등 3. 현미경 기법으로 시각화: cryo-TEM 4. DLS나 UV-vis spectroscopy - 5.2. Chemical stability: RP-HPLC, TLC 등 :    산화:   분석 기법 RP-HPLC (역상 HPLC) + ELSD (Evaporative light scattering detection)    TLC    LC-MS (liquid chromatography-Mass spectrometry) 7) Summary = 앞에 언급했던 기술들 장단점 정리된 표 / 논문에 표 있는데 일단 발표에 언급된 내용만 정리 Analytical Mechanism Advantages Challenges techniques 31-P NMR 인지질 낮은 민감도 구분 가능 비싼 기기 제한된 on-line 1H-, 13C-, detection and 31P-NMR 두 가지 NMR 기법을 2차원적 분석 – mixture 구성 : 원하는 인지질의 구성, 조성을 알 수 있음 높은 민감도 시료 내 불순물 및 지질 구조의 보존 배경 성분 간섭 가능 크로마토그래피와 결 사용 가능 용매 범위 합 가능 제한 ESI-MS ESI-MS (좌), MALDI-TOF (우) ESI: MS 분석을 하기 전 전하를 걸어주는 방법. 모세관에서 고전압 을 걸어주면 용매가 에어로졸로 방출 -> 용매가 방울 형태로 나오며 전하가 부여 -> 용매가 증발되며 남은 입자에 전하 밀도 증가 MALDI-TOF: 레이저를 통해 이온화를 시켜서 MS에 넣음 -> MALDI-TOF: 큰 질량의 분석에 한계가 있음 -> ESI-MS: 다중 이온 만들 수 있어 큰 전하, 질량 가능 에너지 조사했을 때, 조사된 빛보다 라벨이 필요 없음 순수한 지질 성분 스 작거나 더 큰 에너지의 빛이 방출 단일 입자 분석 가능 펙트럼 미리 알고 있 -> 분자 간의 결합 에너지의 진동 샘플의 상태 (고체 어야 가능 Raman 에너지에 따라 에너지가 방출됨 등) 상관 없이 분석 지질 아닌 성분 간섭 Spectrometry -> 구조 분석 가능 가능 가능 분자의 병진, 회전에 의한 스펙트럼 얻기 어려움  리포좀 내 DNA가 들어 있는 경우 : DNA와 DORMA lipid 분석해서 리포좀의 크기와 DNA 확인 가능 다양한 컬럼을 사용 높은 압력 하에서 입 해 고해상도로 물질 자 파괴될 수 있음 분리 및 정량화 고가의 장비 필요 미봉입 약물, 봉입 약 RP-HPLC 물 동시에 분리 및 정량화 높은 효율성 좌: 리포좀 내 각 성분 검출 우: 봉입된 약물의 정량화 높은 민감도 각 지질 성분에 대해 HTS 가능 비특이적 높은 정량화 정확도 별도의 기질 및 시약 요구 Colorimetric, fluorometric 좌: 인산의 양에 따른 발광 밀도 (인산+실험 물질 -> 파란색) 우: 지질의 종류 및 농도에 따른 DPH 형광 자유 약물의 분리 및 캡슐화 효율성 정량화 (3.) 나노 입자를 온전히 중성 입자 분석의 어 보존 가능 려움 입자 크기와 전하를 재현성을 확보하기 CE 동시에 측정 가능 위한 실험 조건 최적 화의 어려움 전하를 띤 나노 입자와 유리된 약물이 크기와 전하에 따라 분리 나노 입자를 온전히 시간이 오래 걸림 보존 가능 실험에 관여하는 전통적 크로마토그래피 별도의 컬럼 사용 X parameter 많아 방 한계점 극복 DLS 등 Mw와 크기 법론 개발이 복잡 AF4 1. 높은 전단력으로 인 분석 가능 한 손상 -> 확산 2. 고정상에 시료 흡착 -> 고정상 없음 해상도가 매우 높음 Direct visualization 시료 준비 복잡성 A: 원시 이미지 신호 크기 분포 분석 B: 필터 적용: FFT (Fast Fourier 고해상도의 입자 구 Transform) 및 여러 필터를 통한 노이즈 조 분석 가능 Microscopy 최소화 및 신호 증폭 technique C: 세분화: MATLAB 이용한 나노 입자 식별 D: 입자 경계 검토 E: 세분화 마스크 생성: 최종 경계 결정 F: 입자 식별 및 데이터 출력: 형태, 크기  paramagnetic 높은 민감도 특수 probe 필요 이온과 결합 시 정량적 분석 (다층) 용매와 probe 농도 외부 인지질에서 영향 정량화 낮음 31P-NMR 나오는 신호 확인 빠른 Complexation 지질 층 사이에서 아 및 형광 quenching 미노 지질 또는 형광 1. TNBS: 외부/전체 아미노 지질과 결합할 때 흡광도 증가 반응 표지 지질의 균일한 분광 방법 2. 막 비투과성 Sodium Dithionite: 외부/전체 NBD 표지 지질의 형 간편한 정량화, 동역 분포 필요 광 감소 학 분석 탁도 및 빛 산란에 적은 양의 표지 지질 의한 간섭 방지 로 강력한 정량화 빠르고 간단한 측정 입자가 구형임을 가 자동화 및 HTS 가능 정 큰 입자나 응집체에 용매 특성이나 온도 도 예민하므로 물리 영향 DLS 적 안정성 확인 가능 Heterogenous particle 경우 정량화 분석 한계 DLS보다 높은 해상 보정을 위해 입자 기 도 준 필요 개수 기반 크기 분포 입자 농도, 이미지 배 및 입자 농도의 동시 경 (NTA), 막의 기공 NTA/TRPS 측정 크기 (TRPS) 등 최 TRPS에 의해 제타 적화 방법 복잡 포텐셜 동시 측정 낮은 처리량 NTA: 단일 입자의 이동 경로 추적해 입자 크기 측정 TRPS: 얇은 막의 작은 기공을 통과하는 입자의 이온 전하 측정 나노입자의 분석적 고정상 (SEC), 막 정량화 및 예비 분획 (AF4)과 입자의 상호 (fractionation) 작용 SEC/AF4 입자 크기에 따라 분리 MALS/DLS detection 없다면 외 부 기준 필요 간단한 준비와 빠른 Ph, 온도, 이온 강도 PALS 전기적 이동하는 나노 입자의 제타 전위 측정 분석 등 용액 조건 영향 다른 지질을 혼 라벨링, 외부 물질 추 민감도가 낮음 합하여 새로운 가 필요 없이 비파괴 복잡한 샘플 준비 상전이 상태 확 적 관찰 가능 DSC 인 실시간 관찰 가능 탐침 융합할 지질막 매우 적은 Probe로 내에 균일 분포 Fluorophore Quenching, dequenching, FRET 확인 높은 민감성 labeling 정량화  간단한 물리적 측정 반정량적 방법으로 다른 입자 정량화 어려움 입자 물질의 흡광 Turbidity 방해 assay 400-600nm 파장에서 흡광도 증가 이 외에도 위에서 언급된 SS, DM, CF 등 다양한 방법 논문 표에 정리되어 있음 ! 8) Conclusions and future perspectives 지질 나노 입자의 약물 전달 강점 - CQAs (주요 품질 특성) 분석의 중요성 - - 산업적 관점에서의 필요성 - - 개선 방향 - - 제제설계학 5 조 Ⅱ. 나노캐리어 논문제목: Fundamentals of a targeted drug delivery 1. Liposomes system(TDDS) Ⅰ. Introduction 1. DDS(drug delivery system) 5 세대 - 1 세대 : 생물학적 막을 통한 약물 흡수에 의존하는 약물 (아스피린 경구제, 페니실린 주사제) - 2 세대 : 서방형제제나 장용정과 같이 약물의 방출 속도나 지속 시간을 조절하는 약물 - 3 세대 - 인지질 이중층 단일막 or 다중막으로 이루어진 : 삼투압 펌프 혹은 농도차에 의한 확산을 소포 이용한 니코틴 패치 등 약물이 체내에서 - 일반적으로 내부에 수성 중심을 가짐 원하는 속도와 농도로 방출되는 약물 - 소분자 약물, 단백질, 핵산 등의 운반체로 사용 - 4 세대: TDDS - retain, release, target, evade 만족 - 5 세대: 나노 로봇, gene therapy - 단점: 불안정하여 특수한 저장조건 요함 2. TDDS 란? ⚫ Riposome 의 종류 (크기와 생산 구조에 따라 나뉨) : 파울 에를리히의 ‘magic bullet’ (숙주 유기체의 스트레스를 최소화하고, 병원균에 선택적인 치명적 작용을 가한다는 타겟팅 개념)에서 출발 ⚫ TDDS 의 이점 1) 약물 성분을 specific 한 신체 부위에 전달 2) 비특이적인 독성↓, 다중부위 상호작용↓ 3) 치료 효능에 필요한 약물 양↓ 1) SUVs: 가장 작은 단일막 + 대사 지연, 체내 안정성↑, 용해도↑ 가능 2) MVLs: 큰 막 안에 작은 소포 여러 개 -> 3 조에서 발표한 내용이라 그냥 넘어감 ⚫ TDDS 의 4 가지 핵심 요구사항 1) 내용물을 목적지 전까지 안정하게 retain 할 것 ⚫ 현재 미국, 유럽에서 시판 중인 liposomal 제품은 14 개 2) 신체의 방어 evade 할 것 - Doxil: FDA 최초 승인 리포좀 제형, 난소암, 3) Target 에 물질을 선택적으로 축적할 것 카포시 육종, 흑색 종을 적응증으로 가짐 4) 원하는 작용 부위에서 약물을 release 할 것 - AmBisome: 전신진균 감염에 사용 추가적으로 생화학적으로 불활성, 생체 적합성, - 대부분의 리포좀 제형의 구조는 SUVs 비면역원성, 생체 내 분해특성 그리고 비교적 효율적인 : 200nm 이하의 크기로 체내 순환 시간이 제조 공정을 지니며 약물 방출의 예측 가능한 방출 길어 투여 간격이 늘어남. 질병 부위 패턴을 지녀야 이상적인 TDDS 수동적 타겟팅 가능. ⚫ TDDS 의 3 가지 구성요소 1) Coordinated drug behavior. 2) Target 부위 3) Pharmaceutical carrier ⚫ Lipsome 제법 - 비이온성 계면활성제는 산화 및 가수분해되기 1) Film-Hydration Method 필름 수확법 쉬운 인지질(중성 or 음전하)과 달리 안정하고 독성이 적음. 리포좀보다 더 넓은 범위의 온도(25- 37°C)에서 안정 - 제작 용이, 저렴한 비용, 저장 간편 ⚫ Niosome 제법 1) Sonication - 전통적 제법으로 주로 소수성 약물 적재 - AmBisome 이 이 제법으로 만들어짐 ① 유기용매에 지질 녹이고 회전 증발시킴 ② 플라스틱 벽면에 얇은 필름이 생김 - 간단하며 소포 크기를 조절할 수 있고, 유기 ③ 수용성 용액을 넣어주면 이 필름이 뭉치면서 용매를 사용하지 않아 친환경 적이라는 장점 다중층 소포(MLVs)가 생김 - 에너지 소비가 크다는 단점 ④ Size reduction 기술을 통해, MLVs 를 SUVs 로 ① 계면활성제와 콜레스테롤 혼합물에 약물을 만들 수 있음 포함한 수용성의 완충용액 부음 2) Size-Reduction 기술: Extrusion (압출법) ② Probe Sonicator 로 60°C 3 분간 초음파 3. Transferosomes - polycarbonate 막을 통과시키면 파열 후 재배열 과정을 거쳐 크기가 줄어듦. - 반복 수행 시 크기 점진적 감소 2. Niosomes - 유연하고 변형 가능(deformable)한 천연 인지질 막 소포 - 막의 10~25%를 구성하는 edge activator 가 인지질 이중층을 유연하게 만들어 줌. (edge activator 는 Sodium cholates, Tweens and Spans 등의 계면활성제임) ⚫ 리포좀과의 유사점 - 리포좀과 네오좀과 달리 각질층 통과 능력이 - 양친매성 분자 단일막 or 이중층 소포 뛰어남. → 스스로 납작해져서 봉입 약물의 손실 없이 피부 - 크기 10~1000nm 장벽 통과 - 생체 적합 및 DDS 사용 가능 → 수분이 있는 쪽을 향해 이동하는 특성인 주수성 ⚫ 리포좀과의 차이점 (Hydrotaxis)을 추진력으로, 건조된 각질층에서 - 리포좀의 Double chain 인지질과 달리 Single 촉촉한 피부 안쪽으로 이동함. chain 의 비이온성 계면활성제로 구성 → 비폐색적 조건에서 더 효율적으로 통과함. (꼬리가 2 개가 아니라 1 개) (붕대로 감으면 각질층이 불어서) ⚫ Transferosome 제법 ① Polymer+ drug 와 surfactant+물, 두 개의 1) Rotary Evaporation-Sonication Method 상을 이용한 Emulsion 을 만듦 ② Sonification 을 통해 계면활성제 막을 구성 ③ 용매를 증발시켜 폴리머 분자 사이의 유기용매가 증발하며 폴리머가 응축 - sonication+필름 수확법 ① 인지질과 edge activator 를 녹인 유기용매를 회전 증발기를 이용해 증발시킴 ② 벽면에 남은 필름에 수용액을 넣어 소포 ⚫ Polymeric NP 의 특성 형성 - Size: DLS ③ sonication 또는 압출법을 이용해 크기 조절 - Zeta potential: 응집과 관련 4. Polymeric Nanoparticles (NP) - Molar mass distribution 에 따른 안정성 변화 - Drug Association: 나노입자 내에 약물의 양 - 고분자(예: PLA, PLG, PLGA 등)를 이용한 NP ① Ultracentrifugation & Ultrafiltration-centrifugation 방법 : 초원심분리기를 통해 자유 약물과 나노입자 내 약물을 분리하고 자유 약물의 농도를 구해서 전체에서 빼는 방법. - Lyophilization (동결건조), spray drying (분무건조) 등이 주로 사용되어 안정성 높임 ⚫ Polymeric NP 의 장점 - PLGA 고분자는 FDA 승인을 받았음 - 생체 적합, 낮은 독성, 생분해성 - 치료 예시: BBB 통과 가능 PLGA +Rapamycin: anti-glioma activity (Nanosphere) - Nanocapsule 과 Nanosphere 로 나뉨 PLGA +Fenofibrate: diabetic retinopathy (Nanosphere) ① Nanocpasule→ Reservoir system PLGA-PEG + Paclitaxel: breast/brain cancers (Nanocapsules) : 약물이 외피 특성을 지닌 고분자 막 내에 5. Solid lipid Nanoparticles (SLNs) 존재하여 외피의 두께와 방출 특성에 따라 속도가 조절됨. ② Nanosphere→ Matrix system : 고분자 matrix 사이에 약물이 균일하게 분산된 형태로, 약물의 확산 속도나 Matrix 의 특성에 따라 속도가 조절됨. ⚫ Polymeric NP 제법 1) Solvent Evaporation 용매 증발법 - 지질 단층막이 solid lipid core 를 둘러싼 구조 - Solid lipid: wax. triglyceride 등의 천연 지질 ⚫ SLNs 제법 ⚫ Albumin NP 의 장점 1) High Pressure Homogenization - gp60, SPRAC, Transferrin, TRAIL 리간드 (고압 균질화 방식) 결합을 통해 종양 특이적 타겟팅 가능 - 양물 방출 조절 가능 - 약물 내성 우회 기전 - 안정성(ex: siRNA 약물 전달) - 치료 예시: Abraxane®(nab-paclitaxel)- breast, lung, pancreatic cancer →FDA 승인을 받아 상용화 됨! Doxorubicin binding Nanoparticles- breast cancer Noscarpine binding Nanoparticles- breast cancer - 유기용매를 사용하지 않고 만들어 친환경적 ① 약물을 지질에 녹여 emulsion 을 만듦 ② 고압 가하여 분쇄 ⚫ SLNs 장점 - 생체 적합, 생분해성, 낮은 독성 - 치료 예시: BBB 통과 가능 7. Nanocrystal Breast cancer: Paclitaxel-loaded SLNs Lung cancer: Naringenin-loaded SLNs Brain cancer: Doxorubicin, Etoposide 6. Albumin Nanoparticles ⚫ Albumin NP 제법 1) 탈용매 기술 - 나노크기로 결정구조를 유지하는 입자 - 강자성체만이 아닌 상자성체로도 구성 가능 ① 강자성체: 외부 자기장 없어도 자화되는 물질 ② 반강자성체: 외부 자기장이 있을 때 자화되지만, 그 자화가 자기장 방향과 반대 방향으로 번갈아 배열됨 ③ 상자성체: 외부 자기장이 있을 때만 자화 ① 수층에 약물을 녹이고 유기용매를 조금씩 (반강자성체, 상자성체는 입자 크기와 무관하게 그냥 떨어뜨림 물질 자체의 특성으로 생각하면 되고, 아래의 내용은 ② 유기용매가 알부민 근처에 있는 물 분자를 강자성체의 보자성에 대한 내용임) 탈수시킴 ③ 알부민 사이의 소수성 상호작용이 증가하여 서로 응축됨 ④ Glutaraldehyde 와 같은 교차 결합제를 넣어 안정화해주면 입자가 형성됨  ⚫ Nanoemulsion 의 장점 - 표면적이 커서 표면 활성과 자유에너지 높음 → 세포막과의 융합이 더 잘 됨 - 열역학적 불안정성에 따른 약물 방출 촉진 - Emulsifier(계면활성제)를 사용해 독성이 낮음 - 층 분리(크리밍), 응집 발생 적어 안정성 높음 ⚫ Nanoemulsion 의 활용 1) Antigen presenting ① Repetitive antigen display ⚫ 보자성 (Hc, coerctivity 항자기성) : 외부 자기장으로 자화시킨 후, 외부 자기장을 제거해도 자성체에 남아있게 되는 강자상체의 자화 유지 능력 - 나노입자 표면에 antigen 을 많이 합성한 후, - Ds(임계지름) 기점으로 작을 경우 단일 세포 내부로 들어가 신호 체계를 활성화 도메인(S-D), 클 경우 다중 도메인(M-D)을 ② Cross-presentation 이룸 - Dp(초상자성 임계지름)보다 큰 입자에서 보자성이 증가하다가 Ds 기점으로 감소 - Dp 보다 작은 직경은 보자성이 0 으로 초상자성 물질의 거동과 유사함 ➔ Hyperthermia 고열 치료에 응용 : 자기장유도가열기술 ① 임계지름보다 크게 만들어 자화 유지 능력을 갖고 암을 타겟팅 - 나노입자 표면의 antigen 이 분해되어 ② 고주파 교류 자기장을 가해 전류가 발생 antigen 만 세포 내부로 들어가 신호 전달 ③ 열을 이용해 타겟을 태움 2) Vaccine - 표면에 단백질을 결합헤 면역반응 유도 8. Nanoemulsion - 독감, HIV, HBV 백신이 임상 시험 중 - 입자평균지름 50~1000nm (대부분 100~500nm) - 방출속도 조절해 투여 횟수 감소 - 수중유(w/o) 또는 유중수(o/w) - 고온에 장기적으로 안정하여 냉장체인이 필수적이지 않아 개발도상국에서 사용 가능 9. Dendrimer - 말단의 amino group 이 음전하의 세포막과 정전기적 상호작용을 하여 타겟팅에 도움을 줌 - 세대가 증가할수록 독성이 증가함 - 나무를 뜻하는 그리스어“Dendron” 유래 - 세대(G1, G2…)를 거듭할수록 고분자 형태가 커지고 말단(S)에 많은 functional group 존재 - functional group 이 거대분자적 특성을 결정 - 약물 캐리어로서 기능 ⚫ 단분산성(Monodispersity) - DNA 를 겉에 붙여서 세포 내부로 gene transfection 할 수도 있음 ⚫ Dendrimer 의 intracellular delivery - 일반적인 고분자 NP 는 Molar mass distribution 이 다분산성이지만, Dendrimer 는 단분산성임. - 나뭇가지 붙어가며 계층적으로 규칙성 있게 성장하고 여러 차례의 정제 과정을 거치기 때문 → 균일한 구조가 유지되므로 재현성을 제공함 ⚫ Dendrimer 활용 1) PAMAM - 말단 부분의 기능기에 약물, ligand, 항체, gene 등을 부착하여 세포 내부로 ethylenediamine endocytosis 후 약물 작용 가능 - ethylenediamine 핵 사용하여 고분자화 Ⅲ. 표적 메커니즘 2) RES (세망 내피계) 회피 1. Passive targeting : 신체의 자연스러운 반응으로 인한 약물 표적 40kDa 를 넘는 적절한 분자량을 가져야 하며, RES 를 회피해야 하고, EPR 효과를 증가할 수 있는 환경적 여건이 갖춰질 때 효과적인 Passive targeting 이 가능함 - RES: 림프절, 지라, 골수 등의 세망 세포나 간, 부신 등 특별한 기관 내부의 혈관 ⚫ 메커니즘 내피세포 등을 말함. - 약물이 loading 된 나노입자가 RES 회피 및 (예: 간의 쿠퍼 세포, 뇌의 미세아교세포, 폐포 EPR 효과에 의해 종양과 같은 병리학적 대식세포… 간단하게 외부 물질을 제거하는 단핵구 및 부위에 축적됨 대식세포라고 생각하기) - 나노입자가 정맥 투여되면 이물질로 1) EPR 효과(Enhanced permeability and retention) 인식되어 옵소닌화되고 RES 에 의해 빠르게 제거됨 ➔ 나노입자가 EPR 효과에 의해 축적되기 위해서는 순환계에 6 시간 이상 머물러야 하는데, 이 시간 동안 RES 를 회피해야 함 ⚫ Passive targeting 조건: 크기 40kDa 이상 40-50 kDa 이하의 분자는 신장에서 빠르게 걸러짐 - 1986 년 Maeda 의 연구 혈장 알부민에 결합하는 Evans blue 염료, 트랜스페린(90kDa) 및 IgG(160kDa)과 같은 혈장 단백질 등이 종양 조직에 축적됨. 그러나 - 암세포와 주변 혈관에서 나타나는 효과로 네오카르지노스타틴(12kDa) 및 오보뮤코이드(29kDa)와 혈관 투과성이 증가하고 림프의 배출이 감소 같이 작은 단백질은 종양 내에 축적되지 않았음 ① 정상적인 혈관은 크기가 2~4nm 이상인 ➔ 분자량이 신장 역치(40kDa)를 넘는 거대 분자가 분자를 통과시키지 않는 tight junction 을 정맥 주사되면 종양 조직에 우선적으로 축적되는 갖추고 있어 나노입자가 순환계 내에 유지됨 경향이 있음 ② 악성 종양이 만들어 낸 새로운 혈관은 무질서하고 림프계가 잘 발달되어 있지 않음. - Dreher 등의 연구 덱스트란 분자량이 증가하면 혈관 투과성이 크게 ③ 새로운 혈관의 넓은 틈새로 나노캐리어가 감소하지만, 혈장 반감기가 증가하며 덱스트란이 들어옴. 40~70kDa 일 때 가장 높은 종양 축적이 나타났음 ④ 림프계로 배출되지 않아 정체됨. ➔ 혈관 투과와 혈장 반감기 사이의 균형이 필요함 - EPR 효과에 미치는 요인: PGs, VEGF, Peroxynitrite, MMPs, NO, Bradykinin, 혈압 ⚫ Passive targeting 의 한계 - 종양 사이질에서 나노 입자의 효율적인 국소화를 촉진하지만 암세포에 의한 나노 입자의 흡수를 촉진할 수는 없음 - 세포로의 직접적인 흡수를 촉진하기 위해서는 능동적 표적화가 필요함  2. Active targeting, 스마트 약물 전달 ① 개념 - 리간드와 수용체의 친화성을 이용해 약물이 - 압타머(aptamer): 안정된 삼차구조를 특정 질환 부위에만 선택적으로 도달 유지하면서 특정 분자에 특이적으로 강하게 - 특수한 구조적 설계를 통해 타겟팅 결합할 수 있는 핵산 - 온도나 pH 에 반응하는 물리적 타겟팅 - SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 기술을 이용하여 (리간드-수용체만 중점적으로 다룸) 발굴, 선별됨 ⚫ 대표적인 리간드-수용체 사례 - 항체의 대체 기술로 주목 1) Antibody-targeted nanocarriers ② 항체 VS 압타머 - 항체(~150kDa)에 비해 분자량(~20kDa)이 ① 개념 작아 생산하기 쉬움 - 항체나 항체조각이 종양 항원에 특이적으로 - 동물세포를 이용하여 생산하는 항체에 비해 결합하여 종양 부위에 직접 약물을 전달함 화학적 공법으로 합성하여 생산성과 품질 - 설계 요소 재현성이 높음 : 항체의 구성, 출처, 나노입자에 결합되는 - 열과 화학물질에 더 안정적이어서 생산, 이용 방식(직접 or PEG 같은 연결분자에 의해) 편리하고 응용 가능 - 암세포의 표피 성장 인자 수용체(EGFR)와 - 항체를 개발하기 힘든 물질들(ex. 종양의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 등이 당단백질)에도 특이적으로 결합하는 주된 타겟임 aptamers 개발 가능 - 다양한 항체나 항체 조각과 결합된 약물로는 - 화학적 잔기 치환이나 기능성 고분자를 gemtuzumab(젬투주맙), 붙이는 등의 여러 가지 변형이 항체보다 trastuzumab(트라스투주맙), 쉬워서 기능성과 응용 방법 개선 가능함 tositumomab(토시투모맙) 등이 있음 - 생체 내에서 면역반응을 거의 일으키지 않음 ② 활용 사례 - 트라스투주맙(유방암 치료제) ③ 활용 사례 : 항-HER2 단일클론 항체인 트라스투주맙을 - 스트립 바이오센서(ANSB) 시스템 결합한 자성 나노복합체(TMCN)가 MCF-7 유방암 세포에서 HER2 를 선택적으로 인식 - HER2 는 세포 성장, 접착, 이동 및 분화를 조절하는 막 티로신 키네이스 수용체로, 인체 유방암의 25-40%에서 과발현 - 대표적인 제품: 허셉틴 ✓ 순환 암세포(백혈병, 림프종, 골수종…)를 민감하고 빠르게 비침습적 검출 2) Aptamers-targeted nanocarrier ✓ 두 종류의 특수 압타머 이용 - thiol-TD05: 황 원자 포함된 티올 그룹을 통해 금 나노입자(Au-NPs)에 결합. (금 나노입자의 독특한 광학적 특성 → 바이오센서에서 높은 민감도로 목표 물질 검출) - biotin-TE02: 테스트 영역에 고정  ✓ 측면 흐름 장치(lateral flow device)로 - 악성 세포의 성장과 분열에는 많은 양의 샘플의 흐름에 따라 검출 진행됨 철이 필요하여, 종양 세포에서는 트랜스페린 →검체가 ASNB 에 도입 수용체(TfR)가 과발현 →암세포가 금 나노입자와 결합한 thiol- - 트랜스페린을 리간드로 사용하여 종양 TD05 와 상호작용 세포로 약물을 전달하는 표적화 전달 →세포가 결합된 금 나노입자는 시스템이 개발 계속해서 biotin-TE02 가 고정된 테스트 영역으로 이동 →바이오틴-스트렙타비딘 결합을 통해 세포가 테스트 영역에 고정되어 적절한 신호를 생성 →적색 밴드 생성 or 정량적 측정 - 다중벽 탄소나노튜브(MWCNT) 기반 나노 초음파 대조제 - 트랜스페린을 결합한 나노입자는 수용체 매개 세포 내 흡수 경로를 통해 암 세포 내로 진입을 촉진 ② 활용 사례 ✓ 전립선암 조기 진단 바이오마커인 ✓ 뇌혈관 장벽(BBB)을 통과하고 GLUT-1 전립선 특이 막 항원(PSMA)에 특이적 (혈뇌장벽의 포도당 수송체)와 결합하여 결합 교모세포종(glioblastoma multiforme, ✓ 다중벽 탄소나노튜브(MWCNT)에 GBM) 등 중추신경계(CNS) 질환을 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 결합한 표적화 형태인 MWCNT-PEG 에 PSMA 압타머를 부착 (PEG: 생체 적합성 높이고 체내 4. Inverse targeting 순환시간 연장하는 역할) - RES 를 회피하기 위해 다당류 또는 lipid ✓ 초음파 영상에서 암세포 위치 표시 micromolecule 을 나노입자 표면에 접목하는 →비침습적 진단 기술로서 활용 것 3. Transferrin-targeted nanocarriers ⚫ 활용 사례 - lipid microemulsion (LM) emulsified with poloxamer 338 : 간과 비장과 같은 RES 가 풍부한 장기에 흡수되는 문제를 피하고자, 기존 LM 의