NMR Spectroscopy for Drug Delivery & Stability - 2조 PDF

Understanding molecular mechanisms of biologis drug delivery and stability from NMR spectroscopy 3. Moleculer mechanism of biophysical and biochemical stability ~ 22 김주...

Understanding molecular mechanisms of biologis drug delivery and stability from NMR spectroscopy 3. Moleculer mechanism of biophysical and biochemical stability ~ 22 김주원 단백질 간 상호작용으로 높은 특이성, 저분자 약물과 항체 사이 간극 감소. 바이오 의약품 개발의 목표: 약물을 안정적이고 효과적인 제형으로 변환하여 환자에게 전달하는 것. 보통 단백질 및 펩타이드 약물로 구성되며, 작은 분자 약물과는 달리 구조적 유연성이 높아 불안정성이 크다는 특징. → 단백질 약물의 안정성은 환경적 스트레스(예: 빛, 열, 물리적 충격)와 상호작용에 따라 변할 수 있으며, 특히 응집 (aggregation) 문제가 있음. 단백질 응집은 고차 구조(high-order structure) 형성과 비정질 응집체(amorphous aggregates), 그리고 섬유구조(fibrils)로 이어지게 된다. 화학적 상호작용으로 인해 열역학적으로 다차 구조가 더 안정하다. => 자연스럽게 응집하려고 하는 상태가 된다는 문제점. 이러한 응집 현상은 알츠하이머 병, 파킨슨 병에서도 나타난다. 이를 줄이고자 개발된 기법 magic angle θ = 54.75˚에서 sample 회전해 측정. 응집체 구조 분석. (magic angle 내용은 뒤에 다시 한 번 더 나옴) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence NMR. 서로 다른 핵의 상호작용을 탐지하는 피크를 측정한다. 여기서는  H와  N의 상호작용을 탐지하여 피크를 관측. 해당 피크를 2차원에 표현하여, 3차 구조, 복합체를 분석하고 동적 변화를 감지. 특히 부형제 첨가에 따른 단백질의 미 세 구조 변화를 탐지하거나, 단백질의 deamidation이나 oxidation 같은 분해를 감지할 수 있다. (한 축은 H ppm, 다른 축은 N ppm으로 비교) - 2 - 섬유 형성 과정(Fibril Formation) 단백질 응집체는 주로 β-병풍(β-sheet) 구조를 형성하며, 이는 비정질 응집체(amorphous aggregates)나 섬유 (amyloid fibrils)로 발전할 수 있다. ex) 글루카곤(Glucagon): 글루카곤의 섬유화 과정은 α-나선 구조에서 시작되어 β-병풍 구조로 변환되지 않고 진행. 섬유화 핵심 영역은 N-말단에서 관찰되었으며, 이는 상호 분자 β-병풍 구조의 중심(core)을 형성 ex) Interferon α-2a aggregation: 인터페론 제형에 사용되는 보존제인 BA(Benzyl Alcohol)은 단백질의 일부 구조 를 풀어 (partial unfolding) 응집을 유도. (BA가 단백질의 소수성 영역을 더 노출시키는 원리!) ** 타 연구 인용: ANS 부분이 단백질 소수성 영역 결합하며 형광 방출이 증가하기에, BA가 나타내는 변화 관찰 => BA 농도가 증가함에 따라 형광 세기가 강해졌기에, 해당 현상을 증명하는 실험 결과이다. ppt추가) interferon α-2a chemical degradation (화학적 분해) 앞서 언급한 oxidation, deamidation에 따른 변형 시 2차 구조에는 나타나지 않던 변화가 3차 구조에서 나타남! (deamidation에 의해 구조 내에서 상호 작용이 달라지기 때문) 이는 곧 IFN의 항바이러스, 항증식, 면역 조절 약효를 감소하게 된다. => NMR로 평가 (국소 구조 변화, 잔기 변화) 탈아미드화 전에는 Asn93이 인접한 Tyr157, Arg241과 상호작용하나, 탈아미드화 후에는 Asn156이 Leu153, Ser152, His76과 상호작용하여 미세한 구조적 변화를 나타낸다. ex) B2 macroglobluin 분자 내 상호작용 + 분자 간 상호작용간 경쟁으로 응집 형성 조절 (intra- vs. inter) * cis-to-trans isomerization: Pro32 잔기가 isomerization 되며 섬유 응집의 trigger 역할을 한다. + 60~70번대 영역의 아미노산 서열의 aromatic R기에 따라 응집을 유발할 가능성 => 이후 protofilament로 구성되고, π-stacking과 disulfide bond로 안정화. - 3 - 즉 단백질 자체가 아닌, 아미노산 서열에 따라 amyloid 형성 가능성을 시사한다. 단백질의 안정성 증가시키는 전략 Glucagon Fibril 형성과 안정성에 중요한 Phe36, Tyr10, Val23, Met27. 이를 Alanine으로 치환시키는 경우, fibrillation 경향성이 감소하게 된다. ** 이때 β-sheet를 구성하는 interaction이 사라지더라도 fibrillation 경향성에는 크게 영향을 미치지 않는다. 항체의 고차 구조(HOS, Higher Order, Structure) 단백질의 고차 구조와 유사. (경쇄와 중쇄에서). 항체가 기능을 발휘하기 위해 올바른 고차 구조를 가져야 한다. (이황화 결합(disulfide bonds) 및 소수성 상호작용(hydrophobic interactions)에 의해 안정화) 1) 아미노산의 변형 → 3차원 구조 영향 2) 주사기, 공기-액체 경계면, 기기의 표면 → 항체 분해 가능성 증가 3) 항체의 환경 변화 → 약물 분해 속도 증가 * arginine glutamate과 같은 첨가제는 고농도 제형에서 자가응집(self-association)이나 구조적 변화를 완화 항체의 안정성 유지, HOS 데이터 확보를 위해 NMR 활용:  H NMR과 2차원 NMR 소개. (과거의 방법은 해상도가 낮았음. (FT-IR, DSC, CD 등). => 고해상도 분석법) - 4 -  H NMR의 경우 수소의 핵 전자 spin 이용하여 측정. 외부자기장에 따라, 핵 spin이 정렬되면서 자기장과 같은 α spin과 다른 β spin으로 형성 => NMR spectrum은 α spin 상태와 β spin 상태 사이의 에너지 간극에 따른 radio-wave 흡수를 측정한다. 이때 분자 내의 양성자 주위에 존재하는 전자의 환경에 따라 'shielding effect'가 발생하며, 변화가 발생한다. (양성자는 전자 구름에 둘러싸이나, 자기장 내에 전자도 운동하기에 자기장을 가리우는 효과를 일으킨다. 이는 원래 가해준 자기장보다 약한 자기장을 느끼게 하기에, 해당 변화한 효과를 측정한다.) 기준점을 TMS (trimethylsilane)으로 잡고, 해당 peak에서 얼마나 감소했는지를 ppm 단위로 나타낸다. PGSTE (Pulsed-Field Gradient Stimulated Echo): 항체의 확산 계수를 측정, 약물의 구조적 유체역학적 특성 규명. PCA (Principal Component Analysis): 항체 간 유사성과 차이를 통계적으로 분석, 구조적 변이 감지. ex) 인플릭시맙(Infliximab)과 리툭시맙(Rituximab) (다양한 제조 환경에 따른 변이를 1D NMR과 PCA를 통해 분석 하였으며, 이로부터 분자 지문(molecular fingerprint)을 도출.) infliximab이 빨간색, rituximab이 파란색 두 항체 크기 차이를 보여주는게 elution profile (우상단) -> elution volume이 다르다= 크기가 다르다 두 항체의 분자 크기, 구조적 차이에서 발생 하단의  H NMR 결과: NMR 신호가 유사하지만 일부 차이 => 고차 구조의 차이가 반영된 모습 ≫  H NMR은 용액 내 항체 구조 변화, 첨가제의 상호작용 탐지에 매우 유용함을 밝힘 제형 선별 및 평가를 위한 방법으로 사용될 수 있음. (ex: NMR + 다변량 분석 = 분해된 항체의 4차 구조 연구) ** 폴리소르베이트(Polysorbate)와 항체 구조 간 상호작용을 2D 메틸 NMR로 분석하여 Fab 영역이 Fc 영역보다 더 민감하게 반응함을 확인. 2D NMR (2차원 NMR) 원자 수준 ~ 약물 3차, 4차 구조까지 넓은 범위의 탐지가 가능. => 약물 내의 당화(glycosylation), 서열 변이, 안정성 변화 (PTMs 등), 응집 등 특징을 식별하는 데에 이용 즉 약물 개발 및 품질 관리에 활용될 수 있으며, 단백질과 첨가제 간 상호작용도 분석이 가능함. - 5 - COSY (Correlation Spectroscopy) '수소 원자' 간의 상관 관계 (화학적 이동이 유사) => 특정 수소 원자가 연결된 다른 수소와의 관계 파악 ex) 우측 타 논문 그림에서는 D O 내의 sucrose가 500 MHz 스펙트럼을 나타낸다. 붉은색과 초록색은 서로 다른 양성자 간의 교차를 나타냄. 두 개의 서로 다른 주파수 측 사용 => 2차원 (일반적으로  H-  H coupling 이용) 화학적 이동이나 다른 핵의 상호작용으로 축 설정해 수소 원자 간의 spin-spin 결합과 같은 여러 상호작용을 나타낸다. => 분자의 구조적 변화, 동적 변화 확인 [주의] COSY는 핵 사이의 직접적인 spin-spin coupling을 측정하는 방식이며,   앞서 나온 HCQR에서의 이(異)핵 간 상호작용을 측정하는 것과는 대비된다. 이 경우 특히 멀리 떨어진 N이나 C 를 이용하는 경우가 많기에, COSY와 HCQR을 혼동하지 않도록 하자. mAB SSS (single-clone antibody) 예시,  H와  C 간 gHSQC spectrum 지문을 나타낸 결과. 각 500, 900 MHz. => 왼쪽 오른쪽 그래프는 두 항체가 다른 조건에서 유사한 패턴을 보임을 나타내며, 각각의 아미노산 잔기가 항체 내에서 어떻게 위치하며, 서로 다른 스펙트럼 간 차이를 분석 백신: 감염병 예방을 위해 병원체의 표면 단백질, 독소, 비활성화된 병원체 등을 포함하며, 구조적 안정성과 효능을 유지하기 위해 NMR 활용 다당류-단백질 접합 백신 (Polysaccharide-Protein Conjugate Vaccines) 다당류 항원의 구조적 정체성(identity) 및 안정성을 NMR로 분석. NMR은 다량의 첨가제가 포함된 복합 백신에서도 고도의 구조적 명확성을 제공함 => 품질 평가에 활용 - 다당류는 독립적으로 T-cell dependent 면역 반응을 일으키지 못하지만, 다당류를 단백질에 공유결합시키는 경우 면역 반응을 일으킬 수 있다. 따라서 해당 공유결합된 상태를 NMR로 측정할 수 있다. - O-acetylation 함량을 NMR로 측정해 활용한다. O-acetylation은 다당류의 특정 부분에 -COCH  아세틸기가 결합한 것. 이는 면역계의 반응 방식을 조절하기에, O-acetylation의 정량 분석을 통해 다당류 항원의 일관성을 보장하고 면역원성을 최적화할 수 있다. - 6 - 알루미늄 기반 보조제 (Aluminum-Based Adjuvants) (용액 NMR) Aluminium 염은 가장 흔히 사용되는 보조제로, 면역을 강화시킨다. 이를 위해 중성 pH에서 자유 인산염 농도를 측정한 후, 산성 pH에서 인산염 + 알루미늄 농도 측정. * 중성 pH에서는 인산염 이온이 주로 free state로 존재해, 보조제와 결합하지 않는 상태로 존재한다. 이러한 자유 인산염은 결합 인산염에 비해 chemical shift가 명확해, 쉽게 측정할 수 있다. * but 산성 pH에서는 강산성으로 인해 Al-PO4 결합이 끊어지며 결합된 인산염이 자유형으로 해리된다. 이를 통해 용액 내 모든 인산염이 자유 상태로 변환되어, 이를 통해 총 인산염을 측정할 수 있다. => 총 인산염 양과 총 알루미늄 양을 측정할 수 있다. 27Al MAS NMR: 알루미늄 Hydroxyphosphate(adjuvant)의 소량 tetrahedral, 주로 octahedral 알루미늄 구조를 분석. 팔면체의 경우 variscite (-9 ppm)과 hydroxide (+9 ppm) 사이에서 관찰. (기준) 이때 인산염의 함량에 따라 알루미늄 구조에 영향을 미쳐, 화학적 이동 변화를 유 발하게 된다. 인산염이 많아질수록 octahedral 구조의 비율이 증가해, 안정성이 높 아지는 효과. =>  Al MAS NMR을 통해 보조제 내의 알루미늄과 인산염 간 상호작용, 구조적 변화를 관찰. < 동위원소로 표지된 Alum 보조제를 사용해 단백질과 Alum의 결합 부위, 접힘, 구조적 안정성을 추적 > 파란색: AlumOH가 단백질이 흡착된 상태에서의 chemical shift 빨간색: 동결건조되 단백질이 re-hydration된 상태의 chemical shift 자주색: 단백질이 AlumOH와 상호작용해 구조적 변화가 일어난 부위. AlumOH와 단백질 간 상호작용에 따라 백신 안정성 평가, 보조제 설계 최적화가 가능. 동결 건조에 따라 단백질이 어떻게 변화했는지, epitope이 변화하지 않았는지 확인. Subviral Particles(SVP) 바이러스에서 일부 구조 (캡시드, 외피 등), 복제 능력은 없으나 표면 항원을 유지해 면역 반응 유도 가능. => 백신 플랫폼으로 널리 사용되며 안정성과 경제성에서 장점 보유 110kHz MAS NMR에서 self-assembly 과정과 구조적 안정성 분석. 단백질 함량이 0.5mg 미만일 때도 NMR 신호 감지가 가능하다는 특징. - 7 -  이때 2D  H-  N ssNMR 분석을 통해 SVP 조립 과정에서 발생하는 구조적 변화 관찰 => 백신 보조제와 결합된 상태에서 SVP가 유지되는 안정성을 평가함. 바이러스 유사 입자(VLPs, Virus-Like Particles) VLPs는 유전체만 없는 바이러스 구조, 안정적인 백신 플랫폼으로 활용  F NMR: VLP의 해체 상태와 같은 구조적 변화와 세포 내부에서의 행동을 추적하여 설계 최적화에 기여.  F를 포함하는 비정상적 아미노산은 라벨링해, 구조적 혹은 상호작용의 변화를 추적. (질의응답 cf: F는 마치 자석처럼 작용) 침전 문제 (Sedimentation) 백신 제조 과정 중 부유 입자가 침전되는 경우, 균일하게 채워지지 않아 용량 오류 발생. 운송 및 저장 중에서도 발생이 가능하기에, 재현탁(resuspension)이 불가능한 경우 제품 회수가 불가결 * Benchtop NMR 소형 NMR 장비, 비침습적으로 샘플 분석. 휴대성이 높고 빠른 품질 관리가 가능 * 물(水) NMR 물 분자 내 양성자와 이완율( R  ) 측정을 통해 용액의 무리적 상태 평가. 침전된 입자와 물 사이 상호작용을 통해, 침전 상태를 비침습적으로 측정 침전 속도와 균질성을 wNMR(물 NMR)로 측정하여 유통 과정에서 발생할 수 있는 문제를 해결. 고체 제형의 안정성과 특성 고체 단백질 제형은 기존의 액체 제형을 대체할 수 있는 형태로, 단백질 안정성을 높이고 운송 및 유통상의 장점을 제 공. 1) vial-lyophilization (동결 건조): 가장 널리 사용되는 방식으로, vial에 충전 후 동결, 진공 건조 후 봉인. 2) spray-drying (분무 건조): 액체 원료를 분무한 후 건조하여 입자를 형성. 3) crystallization (결정화): 포화 용액의 냉각이나 증발을 이용해 응결핵을 형성, 성장시킨 후 분리해 세척 후 건조. - 8 - 하지만 건조 과정에서의 스트레스 존재한다는 문제점: 열, 탈수, 기계적 스트레스는 단백질의 안정성을 저하시키고 응집(aggregation)이나 비활성화를 유발 가령 동결 건조 과정에서 pH 변화는 단백질의 응집을 증가시키거나 수소 결합이 깨지면서 구조가 불안정해질 가능성 => 건조 과정 및 첨가제 선택의 최적화가 필수. ** ppt 자료의 타 논문 소개 1) Mensick et al. (2016): 단백질-당류 동결 건조 혼합물의 혼화성(miscibility)과 안정성 단백질과 당류 간 혼화성이 높을수록 장기적인 안정성이 높아짐. ssNMR을 통해 미세 환경 및 상호작용을 평가. 2) Li et al. (2020): 동결 건조 단백질과 백신 제형의 미세 환경의 산성도 산성도 변화는 단백질 안정성을 크게 저하시키기에, Histidine chemical shift를 통해 정량적 평가. ssNMR은 산성도 변화에 따른 단백질 손상을 추적할 수 있는 효과적 도구. 3) Reichert et al. (2019): 미세 중력을 이용한 단백질 결정화 실험 ISS에서 caffeine을 이용해 제조된 Pembrolizumab 미세 결정은 지상에서 제조된 것보다 높은 품질과 안정성을 가 짐. (  C CP MAS spectrum 분석) 미세 중력 환경이 단백질 기반 치료제의 결정화에 영향을 미친다는 것을 발견. ∴ 고체 제형은 단백질 약물의 장기 안정성을 보장하며, 스프레이 건조나 결정화와 같은 공정은 피하 주사와 같은 적 합한 제형 개발에 유용 solution NMR: 잘 용해된 분자에서 ns 단위 빠른 등방성 운동을 이 용해, 고해상도 구조 분석. 단백질 접힘, 항체의 구조 변화 등 확인.  H,  C,  N 이용 but 분자량이 큰 복합체 (> 100 kDa)의 경우 신호가 복잡해짐. solid-state NMR: 분자량이 크고 잘 용해되지 않는 복합체 분석. 쌍극자 상호작용 및 화학적 이방성을 분석해, 샘플의 거리와 각도를 정량화. 고체 상태 단백질, 응집체, 분자 복합체 구조를 해석함. 단백질 응집 메커니즘을 분석해, 고체 제형의 안정성 평가 가능. 이때 MAS(magic-angle spinning)은 고체 NMR에서 신호 해석을 용이하기 위해 사용되는 핵심 기술 쌍극자 상호작용, 화학적 가리움의 식에는 cos   항을 포함하게 된다. solution NMR에는 빠른 등방성 운동으로 평균 값이 0이 되나, 고체 시료에서는 해당 항이 0이 되도록 θ 값을 54.74˚ = magic-angle로 맞추어 회전축 설정. In-cell NMR: 생체 내 단백질의 구조 및 동적 상호작용을 연구. 세포 내 단백질의 입체 구조 및 복합체 형성을 원자 수준에서 분석하고, 단백질의 상호작용과 안정성 실시간 연구. 생체 내 대사 및 단백질 변형 (post-translational modification) 연구에 활용 가능성. - 9 -