Zusammenfassung Med. Mikrobiologie im Fliesstext (PDF)

ZHAW BL 22 / HS 22 -Zusammenfassung für StudentInnen ZHAW Reinhard Zbinden, Externer Dozent ZHAW, FAMH Medizinische Mikrobiologie, Prof. em. Dr. med. et lic. phil. II Medizinische Mikrobiologie Diese Zusammenfassung stellt den prüfungsrelevanten Inhalt der Vorlesungen dar. Inhaltsverzeichnis 1....

ZHAW BL 22 / HS 22 -Zusammenfassung für StudentInnen ZHAW Reinhard Zbinden, Externer Dozent ZHAW, FAMH Medizinische Mikrobiologie, Prof. em. Dr. med. et lic. phil. II Medizinische Mikrobiologie Diese Zusammenfassung stellt den prüfungsrelevanten Inhalt der Vorlesungen dar. Inhaltsverzeichnis 1. Definition von Mikrobiologie – Was gehört zum Leben – Einteilung der Mikroorganismen 2. Einteilung der Mikroorganismen mit Bedeutung in der Medizinischen Mikrobiologie 3. Diagnostischer Überblick – unterteilt einmal vor 4. und einmal nach 4. 4. Staphylococcus aureus / Staphylokokken / Streptokokken / Streptococcus pyogenes / Pneumokokken / Enterokokken 5. Enterobacteriaceae – Erklärung TSI 6. Urinbakteriologie – Diagnostik und Erreger 7. Stuhlbakteriologie – Diagnostik und Erreger 8. Nonfermeter – Erklärung TSI 9. Diagnostische Aspekte für respiratorische Infekte 10. Anaerobe Bakterien inclusive Diagnostik 11. Vier-Felder-Test, Sensitivität, Spezifität, negativer und positiver Voraussagewert 12. Anspruchsvolle Gram-negative Stäbchen 13. Neisserien und Gram-negative kokkoide Stäbchen 14. Bakerien der Urogenitaltraktes - STI 15. Gram-positive Stäbchen 16. Chlamydien und Mycoplasmen sowie Coxiella, Leptospira, Rickettsien und Bartonella 17. Bakteriensystematik 18. Systematik der Bakterien, die sich nicht nach Gram einteilen lassen 19. Borrelia burgdorferi – mikrobiologische Eigenschaften 20. Treponema pallidum – mikrobiologische Eigenschaften 21. Erste serologische Hinweise (Wh) und Serologie allgemein und Serologie anhand von Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum 22. Nocardia spp. mit mikrobiologischen Eigenschaften, halbsäure Färbung, Hinweis auf Streptomyceten 23. Mycobacterium tuberculosis – Komplex - Mikrobiologische Eigenschaften – Färbung- Diagnostik inclusive nicht-tuberkulöse Mykobakterien (NTM) 24. Mikrobiologische Aspekte von spitalhygienischen Fragen mit allgemeinen Aspekten 25. Untersuchungsmaterialien für MRSA, VRE, ESBL, Carbapenemase bei Enterobacteriaceae, MDR 26. Erreger, die unabhängig von der Resistenz wichtig sind für die Spitalhygiene (SH): Clostridioides (Clostridium) difficile, Burkholderia cepacia – insbesondere bei CF-Patienten, Mycobacterium tuberculosis Gedacht als mögliche Prüfungsvorbereitungsunterlagen in Word-Version entsprechend den jeweiligen Zusammenfassungen der Powerpointpresentationen (Tag 1-5, Tag 6-10, Tag 11-14) R. Zbinden, 24. Dez. 2022 hochgeladen 1 1. Definition von Mikrobiologie – Was gehört zum Leben – Einteilung der Mikroorganismen Mikrobiologie ist die Lehre (logos) des kleinen (mikros) Lebens (bios) Was gehört zum Leben – Resultate der des gemeinsamen Erarbeitens - DNA als genetischer Informationsträger - Möglichkeit der Entwicklung – Evolution - Möglichkeit der Fortpflanzung (Vermehrung) und / oder Wachstum - Vorhandensein einer Zelle - Eigener Stoffwechsel - Reaktion auf äussere Reize - Bewegung Für die Erfüllung müssen alle Eigenschaften vorhanden sein - «Ein Virus ist ein Virus», hat einige der obigen Eigenschaften, aber nicht alle: keine Zelle, keine Bewegung - Prione sind infektiöse Proteine, welche sich auch «vermehren» können, aber sonst Obiges nicht erfüllt Erbmaterial = Genom, bestehend aus DNA DNA Transkription  RNA  Translation  Proteine Retroviren haben eine reverse Transkriptase: RNADNA 2. Einteilung der Mikroorganismen mit Bedeutung in der Medizinischen Mikrobiologie (Bakterien, Pilze, Parasiten, Viren) Struktur und Systematik der Bakterien - Bakterien sind ca. 1/1000 mm gross (1 Mikron = 1µm = 1µ) - Bakterien haben keinen Zellkern  Prokaryonten - Bakterien haben keine Organellen - Bakterien haben eine Zellwand - Bakterien teilen sich durch Zweiteilung sehr schnell; Generationszeit 20 Min. - Bakterien sind Einzelzellen Plasmid ist ein sich selber vermehrendes DNA-Stück, oft mit Resistenzgenen Die Bakteriensystematik um- umfasst die Klassifikation, die Nomenklatur und die Identifikation - Die Klassifikation beinhaltet das Ordnen der Bakterien in taxonomische Gruppen aufgrund Bei den Aminosäuren sind die von Verwandtschaften und Ähnlichkeiten zwei letzten der Kette wichtig: in phänotypischen (messbaren) Merkmalen d-Alanin-d-Alanin, die durch die - Morphologische Merkmale: Form, Feinstrukturen, Transpeptidasen gebunden Färbeverhalten werden - Metabolische Merkmale: Stoffwechselleistungen - Chemische Merkmale: DNA, Mureingerüst, Antigenstruktur  Vermehrt Sequenzierung der DNA. - Die Basis der Klassifikation ist die Art (Species). Verwandte Arten werden in einer Gattung (Genus), verwandte Gattungen in einer Familie (Familia) zusammengefasst. - Die Nomenklatur der Bakterien richtet sich nach den in der Biologie gültigen Regeln. Eine Art wird demnach mit 2 latinisierten Namen gekennzeichnet, wobei der erste Name die Gattung, und der zweite Name die Art charakterisiert. 2  Familie (Familia) Enterobacteriaceae Gattung (Genus) Escherichia Art (Species) Escherichia coli - Hinweis zur Schreibweise: (nicht Prüfungsstoff). Das erste Mal muss man das Bakterium kursiv ausschreiben, das zweite Mal im Text ist E. coli O.K. Species (auf Lateinisch Art, Einzahl und Mehrzahl gleich geschrieben) wird als sp. abgekürzt, wenn Einzahl, aber als spp., wenn Mehrzahl. Achtung: sp. und spp. werden nicht kursiv geschrieben; z.B. Proteus sp. Subspecies wird als ssp. Abgekürzt. Grau hinterlegte Informationen sind als Hilfestellung gedacht, aber nicht prüfungsrelevant Der Begriff Stamm wird unterschiedlich gebraucht - In der naturwissenschaftlichen Mikrobiologie bezeichnet man damit häufig eine Zellpopulation, die aus einer Zelle hervorgegangen ist (= Klon) - In der diagnostischen Mikrobiologie versteht man darunter die Erstkultur einer Erreger-Art, die von einem Patienten isoliert wurde - In der Epidemiologie wird als Epidemiestamm der die Epidemie auslösender Erreger bezeichnet, auch wenn dieser von verschiedenen Patienten isoliert wurde. Dies ist insbesondere bei den nosokomialen Infektionen wichtig, wo man die Weiterverbreitung eines besonders resistenten und/oder besonders pathogenen Keimes verhindern will. Medizinische Einteilung der Pilze - Pilze sind Eukaryonten, haben kein Chlorophyll, Zellwand enthält kein Murein, aber Glucane, Mannane, Chitin (120'000 Arten), aber nur ca. 200 wichtig für Medizin. Kommen vor allem bei Immunsupprimierten vor (Opportunisten). Prinzipiell bilden die Pilze Hyphen [im Bild 1a) septiert], welche sich zum Mycel verbinden [im Bild 1b)]; davon abzugrenzen sind die Hefen mit Sprossformen verbinden [im Bild 2)] Dermatophyten (Hautpilze), sind keratophil (Hornhaut, Nägel, Haar)  Klinisches Bild – Tinea (ganz rechts) Hefen – Candida albicans als Hauptvertreter  Vielfältige Klinik, Stomatitis, Soor Vulvovaginitis Tinea - Cryptococcus neoformans  Meningitis bei Immunsuppression (unten) Liquor-Präparat Hefen mit Kapsel in Tuschepräparat sichtbar Schimmelpilze verursachen Krankheiten bei Immunsupprimierten  gefürchtet sind Aspergillus-Arten Parasiten - Protozoen (10-30 µm) – Würmer (nicht Mikroorganismen) Viele Parasiten benötigen für die Entwicklung Zwischenwirte - Malariaerreger (Plasmodien)  Anophelesmücke - Rinderbandwurm  Rind - Fuchsbandwurm  Mensch Protozoen-Beispiele - Trichomonas vaginalis  Vulvovaginitis - Entamoeba histolytica  Durchfall - Trypanosoma brucei  Schlafkrankheit - Giardia lamblia (intestinalis)  Durchfall - Plasmodium falciparum Malaria - Toxoplasma gondii  Toxoplasmose Würmer - Bandwürmer  Cestoden, - Saugwürmer  Tremadoden, Fadenwürmer  Nematoden Viren - Reifes Viruspartikel wird auch Virion genannt - Kapsid ist viruscodiertes Protein, das die Nukleinsäure umschliesst, besteht aus Kapsomeren - Nukleinsäure, entweder RNA oder DNA, einzelsträngig oder doppelsträngig, linear (ev. segmentiert) oder zirkulär - Ev. Hülle, die Kapsid umgibt  empfindlicher auf Desinfektionsmittel Schematischer Weg des Eindringens des Virus in Wirtszelle (auf Bild durch Membran der Wirtszelle) - Virus kann sich nicht ohne eukaryotische Zelle vermehren Schematischer Weg des Austretens des Virus aus Wirtszelle 3 3. Diagnostischer Überblick Mensch besteht aus 10 Billionen Körperzellen, besitzt aber 10-mal mehr Bakterien in sich und auf sich Aufgabe der Medizinischen Mikrobiologie - Die Hauptaufgabe der Medizinischen Mikrobiologie ist die Suche von Erregern aus Patientenmaterial: prokaryontische Bakterien, eukaryontische Pilze und Viren; im weiteren Sinne auch Parasiten. - Zum Teil werden auch indirekte Methoden wie der Antikörpernachweis gegen bestimmte Erreger eingesetzt. - Die Identifizierung von Bakterien gehört zur Aufgabe der Medizinischen Bakteriologie, damit der Arzt aufgrund des identifizierten Keimes und der dazu gehörenden Resistenzprüfung allenfalls therapieren kann. - In den letzten Jahren sind Fragen des Bioterrors oder neuer Grippe-Pandemien etc. zur Zusatzaufgabe geworden. Nachweis von Infektionserregern in Patientenmaterial - Bakterien  Medizinische Bakteriologie - Pilze  Medizinische Mykologie - Viren  Medizinische Virologie - Parasiten  Parasitologie - Antikörper Serologie/Immunologie Unterscheidung von Erreger und Besiedler ist zentral - Bakterien der Normalflora schützt vor Erregern - Besiedler werden durch Antibiotika auch beeinflusst Traditionelle bakteriologische Untersuchung – Arzt entnimmt Material vom Patienten  Labor - Direktnachweis - Ausstrich auf Objektträger - Hitzefixierung - Färbung - Mikroskopie - Beispiel von Gram-Präparaten - Meningokokken - Staphylokokken (Gram-negative Diplokokken) (Gram-positive Kokken in Haufen) „rötlich angefärbte Kugel“ „blau violette angefärbte Kugeln Gram-positive Zellwand Gram-negative Zellwand Untersuchungsgang für Kultur - Beimpfen auf Nährboden mit Öse - Bebrüten über Nacht 37oC - Gram-Färbung  Gram-positive Kokken - Biochemische Eigenschaften Empfindlichkeitsprüfung der Bakterien - Suspension beimpfen - Antibiotika-Blättchen auflegen - Bebrüten - Hemmzonen messen 4 4. Staphylococcus aureus / Staphylokokken / Streptokokken / Streptococcus pyogenes / Pneumokokken / Enterokokken Staphylococcus aureus – Klassisches Beispiel von Gram-positiven Bakterien - Staphylokokken bilden generell Gram-positive Kokken in Haufen - Eiter mit Staphylococcus aureus - Hier Kultur von S. aureus mit Hämolysinen, welche dann hemolytische Kolonien verursachen - Alle Staphylokokken sind Katalase positiv - 2 H2O2  2 H2O + O2 - Zusätzlich hat S. aureus Enzym, welches Plasma koaguliert-Koagulase - Dies ergibt den Begriff Koagulase-positive Staphylokokken – wichtige Abgrenzung gegenüber Koagulase-negativen Staphylokokken - Schema für Identifizierung mit Schlüsselreaktionen (Algorithmus) - Koagulase-negative Staphylo- kokken zeigen in der Regel keine Auflösung der Erythro- zyten (keine Hämolyse). - Bild Staphylococcus epidermidis Gram-positive Kokken in Ketten im Flüssigpräparat Verdacht auf Streptokokken - Katalase negativ - Verschiedenes Hämolyse-Verhalten gegenüber Schafblutplatte - Echte Auflösung der Erythrozyten =  - Hämolyse - Abbau des Hämin  Vergrünung =  - Hämolyse - Keine Veränderung der Erythrozyten =  - Hämolyse Streptokokken der Gruppe A = Streptococcus pyogenes (Lancefield-Gruppe A)  andere Streptokokken haben andere Gruppen - Zusammen bilden sie die  - hemolysierenden Streptokokken Gram-positive Kokken in Ketten im Flüssigpräparat mit Vergrünung  Vergrünende Streptokokken - Nur teilweise mit typischen Reaktionen - Streptococcus anginosus-Gruppe ist typischerweise positiv für Voges-Proskauer (VP), kann aber β - hämolytisch sein – typisch sind kleine trockene Kolonien mit grosser Hämolysezone, typisch Lancefieldgruppe F (A, C, G auch möglich) Gram-positive Kokken in kurzen Ketten  Verdacht auf Enterokokken - Enterokokken sind Pyrrolidonyl-Amidase positiv, Galle-resistent, Wachstum in 6.5% NaCl, Aesculin positiv, Lancefieldgruppe D - Enterococcus faecium zeigt  - Hämolyse - Enterococcus faecalis zeigt  - Hämolyse Pneumokokken – Streptococcus pneumoniae (Bilder) - Diplokokken, Kapsel, deshalb manchmal Pseudoketten, weil Pneumokokken wegen der Kapsel aneinanderkleben - Oft vergrünende Kolonien, schleimig, Gallenlöslich, Optochin-empfindlich, 5 3. Diagnostischer Überblick (Fortsetzung) Probenentnahme - Punktat in Anaerobiertransportmedium - Mit Spritze und aufgesetzer Nadel durch Gummikappe ins Anaerobiertransportmedium - Punktate zusätzlich nativ oder in Blutkulturen - Punktate besser als Abstriche - Abstriche nur als Notlösung (in Agarmedium) - Neue Alternative E-Swab, kein Agar - Gewebeproben / Biopsien nativ einschicken - Materialien möglichst rasch ins Labor Identifizierung von Bakterien - Versuch einer Definition des Expertensystems = Expertenmeinungen zur automatischen Anwendung in System verpacken – in letzten Jahren vermehrt Ansatz mit künstlicher Intelligenz und «machine learning» (big data) - Identifizierung der Bakterien beruht auf dem Prozess, die Eigenschaften eines isolierten Bakteriums mit den Eigenschaften bekannter „Referenzbakterien“ oder „Expertenmeinungen“ zu vergleichen Prinzipiell zwei Methoden - 1. Algorithmus mit Schlüsselreaktionen - 2. Gleichzeitiger Vergleich mehrerer Reaktionen mit Datenbasis von Experten oder Firmen Algorithmus mit Schlüsselreaktionen - Identifizierung Gram-positiver Kokken 1. Katalase positiv  Staphylokokken negativ  Streptokokken 2. Koagulase positiv  Staphylococcus aureus negativ  Koagulase-negative Staphylokokken - Vorteil: schnell - Nachteil: falsche Schlüsselreaktion führt in falsche Richtung - Es gibt auch Katalase-negative oder Koagulase-negative S. aureus Berücksichtigung mehrerer Reaktionen und Vergleich mit Datenbasis - Vergleich mehrerer Reaktionen des Bakteriums mit den Reaktionen möglichst vieler Bakterien in einem Identifikationssystem, welches viele verschiedene Bakterien enthält - In der Regel wird eine wichtige Eigenschaft vorausgesetzt, z.B. Gram-negatives Stäbchen - Vorteil: Schlüsselreaktion darf einmal falsch sein, weil alle Reaktionen berücksichtigt werden - Nachteil: Keim muss in Datenbasis enthalten sein - Die Identifizierung eines Bakteriums wird einerseits durch die Prozentidentifizierung charakterisiert, welche aussagt, wie wahrscheinlich die Identifizierung im Verhältnis zu den anderen passt und anderseits, wie gut das gefundene Profil eines Isolates zum typischen Profil des identifizierten Bakteriums passt, T-Wert (siehe Api-Beispiel). Der T-Wert von Vitek 2 – Beispiel ist ähnlich Identifizierungen mit MALDI-TOF und 16S rRNA Gen Sequenzierung beruhen auch auf Vergleich eines individuellen Resultates mit Datenbank (diese Methoden werden in separaten Kursen behandelt) 5. Enterobacteriaceae – Erklärung TSI Gram-negative Glucose – Fermenter Fakultativ anaerobe Gram-Stäbchen, welche sowohl mit Luft und ohne Luft wachsen können - Vorkommen im Darm von Tier und Mensch, > 100 Arten, ca. 25 Arten als Erreger beim Mensch - Teilweise Kapsel - Generationszeit 20 – 30 Minuten - Wachsen auf MacConkey – Agar (siehe unten) - O - Antigene, Polysaccharide, LPS - Endotoxine - H - Antigene, Geisseln aus Proteinen für Beweglichkeit - F - Antigene, Fimbrien für Anheftung an Zellen - Weitere Pathogenitätsfaktoren wie Zytotoxine, Invasine Laktose-positive Glucose - Fermenter - Paradebeispiel Escherichia coli - Gram-negatives Stäbchen, fakultativ anaerob, Darmbewohner - Laktose positiv, besitzt Beta-Galactosidase, um Laktose in die beiden Zucker Glucose und Galaktose zu spalten (rot auf MacConkey, Bild) - Fermentativ mit Gasbildung - Beweglich - Indol positiv, Nitrat positiv - Ornithin - und Lysin - Decarboxylase positiv - Beta-Glucuronidase positiv 6  Laktose-positive Glucose – Fermenter - Test mit TSI – triple sugar iron agar - TSI-Agar enthält 1% Saccharose und 1% Laktose, aber nur 0,1% Glucose und viele Peptone (Eiweisse) - Bakterien benützen zuerst Glucose - Ganzes Medium wird sauer bei der Säurebildung, deshalb gelb wegen Phenolrot - Wenn Keim Laktose und/ oder Saccharose spaltet und abbaut,  weitere Säurebildung  Stich und Schrägfläche bleiben gelb - Beispiel Laktose-positive E. coli Laktose-positive Glucose – Fermenter - MacConkey Agar – Differential-/Selektivmedium - MacConkey-Agar enthält Hemmstoff gegen Gram-positive Bakterien - Kristallviolett und wenig Gallensalze (1.5 g/L) - Laktose als C-Quelle, wenn Laktose gespalten und weiter zu Säure abgebaut wird, werden die Kolonien wegen Neutralrot bei tieferem pH rot (siehe Seite 6 Beispiel Escherichia coli) - Wenn Laktose nicht gespalten wird, dann bleiben die Kolonien bei pH 7 in der Farbe des Agars Laktose-positive Glucose - Fermenter - Klebsiella pneumoniae - Unbeweglich - Urease positiv - Sehr stark Gas aus Glucose in biochemischer Reihe - Schleimig wegen Kapsel Laktose-negative Glucose - Fermenter Paradebeispiel Salmonella enterica - Gram-negatives Stäbchen, fakultativ anaerob, Durchfallerreger - Laktosespaltung ist zentral für Einteilung der Enterobacteriaceae - Laktose-negative Fermenter sind verdächtig auf Salmonellen und Shigellen 1. Schritt der Laktosespaltung: Aufnahme der Laktose in Bakterienzelle 2. Schritt ist die eigentliche Spaltung der Laktose (Disaccharid aus Glucose und Galaktose) mit der -Galaktosidase - Es braucht Aufnahme und Spaltung - Wächst auf Hectoen-Platte (Selektiv-Differentialmedium) - Medium enthält mehr Gallensalze (9 g/L) als MacConkey-Agar - Laktose als C-Quelle  Laktose-positive Kolonien gelb - Salmonellen agarfarbige Kolonien am Rande, aber schwarz im Zentrum Im TSI hat es ebenfalls Na-thiosulfat - Salmonellen bilden daraus H2S, so dass ein schwarzes Präzipitat im TSI gebildet wird Salmonellen und andere Lactose- negative Gram-negative Glucose-Fermenter benützen zuerst Glucose - Ganzes Medium wird sauer bei der Säurebildung, deshalb zuerst gelb wegen Phenolrot - Wenn Keim Laktose nicht abgebaut wird, wird auf der Schrägfläche unter aeroben Be- dingungen Pepton (Eiweiss) abgebaut, dadurch steigt der pH durch Aminproduktion und wegen Phenolrot wird das Medium bei der Schrägfläche rötlich - Bei Salmonellen nicht gut sichtbar wegen Schwarzfärbung Nomenklatur der Spezies Salmonella enterica subsp. enterica (subsp. Abkürzung für Subspecies) - Salmonella enterica subsp. enterica umfasst alle Salmonellen, die bei Menschen vorkommen - Unterscheidung durch Serotypen Typhöse Salmonellen - Salmonella Typhi - Salmonella Paratyphi A, B, C Enteritische Salmonellen  Salmonella Enteritidis  Salmonella Typhimurium über 1000 andere Serotypen Unterscheidung der O-Antigene (LPS – ohne Hauch) und der H-Antigene (Geissel – mit Hauch) mit Antiseren gegen diese Antigene, Kaufmann-White Schema Lactose-negative Glucose - Fermenter - Shigellen und andere GNS  Shigellen sind unbeweglich, genetisch nicht unterscheidbar von E. coli  Auf MacConkey plattenfarbige Kolonien  Im TSI, gelber Stichagar wegen Glucosefermentation, aber rötliche Schräg- fläche wegen Peptonabbau, da Laktose nicht abgebaut werden kann  4 Serogruppen - Shigella dysenteriae ist Serogruppe A, - Shigella flexneri ist Serogruppe B - Shigella boydii ist Serogruppe C - Shigella sonnei ist Serogruppe D Proteus spp. auch Laktose-negativ, aber H2S und Urease positiv, was gegenüber Salmonellen abgrenzt 7 6. Urinbakteriologie – Diagnostik und Erreger Begriffe zur Urinbakteriologie  Bakteriurie  Bakterien im Urin - Signifikante Bakteriurie  > 100'000 Mikroorganismen/ml - kleinere Zahlen sind meistens Kontaminationen, aber nicht immer; oft auch kleinere Zahlen signifikant - Asymptomatische Bakteriurie - Bakteriurie ohne Symptome - Symptomatische Bakteriurie - Symptome mit Leukozyturie  Harnwegsinfekt  Reinkultur: nur eine Art von Bakterien  Mischkultur: mehrere Bakterienarten - Tendenziell Hinweis auf Kontamination - Bei Dauerkatheter Keime > 105/ml differenzieren  Bakteriämie  Urosepsis  Quantitative Untersuchung - Angabe der Bakterien pro ml Normale Bakterien stören Diagnostik  Harnröhre normalerweise besiedelt - Koryneforme Bakterien, Koagulase-negative Staphylokokken, vergrünende Streptokokken, auch wenig Enterobacteriaceae - Lactobacillen, Gardnerella vaginalis bei der Frau  Blase ist meistens keimarm - Ungestörter Harnfluss eliminiert Bakterien - Vermehrung der Bakterien bei Entleerungsstörung  Obere Harnwege sind normalerweise steril - Meistens aufsteigende Infektion, selten hämatogen - Angabe der Bakterien pro ml Eintauchnährboden – semiquantitative Keimzahlbestimmung auf CLED durch Vergleich mit Bildern Vorteile des Nativurins – allenfalls mit konservierender Borsäure  Ansatz von Nativ-Urin als Notfall möglich  Direkte Inokulation auf Agar-Platten mit 1µl Öse - Jede Kolonie x 1000  Anzahl Bakterien/ml - bessere Quantifizierung möglich - Erkennnen von Mischkultur einfacher - Erfassen schlecht kultivierbarer Keime - Aerococcus urinae, Gardnerella vaginalis Actinobaculum (neu Actinotignum) schaalii - Erfassen seltener Keime - Lactobacillen, coryneforme Bakterien - Ansatz von Spezialmedien für Mycoplasmen Uringewinnung  Mittelstrahurin ist Standard Komplizierte Uringewinnung mit Einmalkatheter  Falls Mittelstrahlurin nicht möglich Häufige Erreger  Gehören zur normalen Stuhlflora  Keime gehen von Stuhl  Vagina  Urethra  Harnblase Cystitis / einfache Pyelonephritis  Escherichia coli  Staphylococcus saprophyticus  Enterokokken, Proteus spp., Klebsiella spp. Komplizierte Infektionen  E. coli und andere Enterobacteriaceae  Pseudomonas aeruginosa, Enterokokken  Candida bei oberen Harnwegen hämatogen  Staphylococcus aureus ist meistens filtriert, deshalb Quelle suchen und Endocarditis ausschliessen Escherichia coli ist häufigster Erreger von Harnwegs-infektionen  Urosepsis  Meistens Lactose-positiv, rote Kolonien auf MacConkey, TSI Stich und Schrägfläche gelb (Seite 6/7)  Biochemische Identifizierung innerhalb von 24 Stunden nach Abnahme - Biochemische Reihe - Konventionelle Biochemieröhrchen - Spezialplatten mit integrierten biochemischen Reaktionen - Kommerziell mit Becherchen (Api) - Enthalten dehydrierte Substrate, welche mit der Bakterien- suspension inokuliert werden; nach der Inkubationszeit zeigt ein Farbumschlag enzymatische Aktivität oder Zuckerfermentation an 8 7. Stuhlbakteriologie – Diagnostik und Erreger Zusammenstellung der Erreger mit Hinweis Diagnostik Diagnostik von Salmonellen  Ansatz eines Selektiv/Differentialmedium  Salmonellen als schwarze Kolonien  Spezieller Phage lysiert spezifisch Salmonellen  TSI zeigt „ gelben“ Stich, „alkalische“ Schrägfläche, aber meistens schwarz - Ausnahme Salmonella Typhi  Bestimmung des Serovars - Agglutination mittels Antiseren (Kaufmann-White Schema) 8. Nonfermenter – Erklärung TSI TSI-Reaktionen zur Diagnostik Non-Fermenter – fermentieren Glucose nicht Pseudomonas aeruginosa ist Paradebeispiel  TSI zeigt keine Fermentation  Typischerweise ist die Oxidase positiv  Die Nonfermenter haben in der Atmungskette (Sauerstoff-Transport) ein Enzym, welches Cytochromoxidase genannt wird.  Das Vorliegen der Cytochromoxidase wird mit der Oxidase-Reaktion geprüft  Wie die Katalase für Gram-positive Bakterien (Bild rechts: 2 H2O2  2H2O + O2) wichtig ist, ist dies die Oxidase für die Gram-negativen Bakterien  Das Substrat Tetramethyl-p-Phenylenediamin Dihydrochlorid wird durch die Cytochromoxidase in Anwesenheit von Naphtol und Sauerstoff in blaues Indolphenoblau (Bild links) Typische Reaktionen von P. aeruginosa  Geruch traubenartig  Flache Kolonien mit Metallglanz  Pyocyanin, Pyoverdin  Resistent gegen viele Antibiotika  Empfindlich gegen Colistin  Wachstum bei 42oC,  Hämolyse auch bei atypischen P. aeruginosa bei Cystischer Fibrose (CF)  ungenügende Identifikation mit automatischen Systemen  Oxidase aber weiterhin positiv bei atypischen Stämmen bei CF  Colistin empfindlich Non-Fermenter – fermentieren Glucose nicht - Allgemeine Eigenschaften der Nonfermenter (es gibt sehr viele verschiedene Nonfermenter, deshalb immer wieder Ausnahmen der Reaktionen)  In der Regel auf Schafblutplatten gutes Wachstum  Auf der MacConkey-Platte Farbe der Platte (Laktose negativ) (Achtung: Glucose nicht fermentierend)  Umweltkeime – Wasserkeime  Biofilme in Wasserröhren und auf Fremdkörpern  Opportunistische Infektionen  Tendenziell viele Resistenzen  Besitzen auch LPS (Endotoxine)  Beweglich mit Geisseln, können auch Pili und Fimbrien haben, um an Zellen zu binden  Einzelne Arten sind Oxidase negativ 9  Acinetobacter baumannii  Nicht beweglich, haben keine Geisseln (a-cineto)  Gram-negative Stäbchen, die aber zum Teil sehr kokkoid sind  Normalerweise sind Gram-negative Stäbchen resistent gegenüber Vancomycin  Acinetobacter spp. (spp. ist Plural von species) zeigen Hemmhof bei Vancomycin  Vancomycin wird aber nicht zur Therapie eingesetzt.  Sehr resistent gegen Umwelteinflüsse  Können monatelange auf Oberflächen überleben  Auf der MacConkey-Platte Farbe der Platte, vielfältige Morphologie  Umweltkeime – Wasserkeime  Biofilme in IPS- Wasserröhren gefürchtet, kann zum Abbruch zwingen  Opportunistische Infektionen Stenotrophomonas maltophilia  Zeigt auf Schafblutplatte Pigment  Oxidiert Maltose, oft Oxidase negativ, Resistent gegen Colistin 9. Diagnostische Aspekte für respiratorische Infekte Qualität des Sputums ist wichtig für Kultur  Wenn im Gram-Präparat des Sputums über >25 Epithelzellen im 100er Gesichtsfeld  Probe nicht verwertbar für allgemeine Bakteriologie, aber für Suche nach Mycobacterium tuberculosis und IPS-Überwachungskulturen immer akzeptieren  Bei der Bearbeitung von Sputum müssen die pathogenen Bakterien in Relation zu der normalen Mundflora gesetzt werden. Bei viel Normalflora sind ganz wenige pathogene Bakterien nicht von Bedeutung. Leukozyten beachten  Gleiche Mikroorganismen in der 100 x 10 = 1000er Vergrösserung weisen auf Erreger hin  Bakterien vom Sputum, aber auch von Trachealsekret können nur Besiedler sein  Abgrenzung von Erregern nicht immer einfach  Während Transport können sich normale Bakterien vermehren und Infektionserreger überwuchern Sputum in 100-Vergrösserung Sputum in 1000er-Vergrösserung (10er Objektiv, Okular 10x) (100er Öl-Objektiv, Okular 10x) Zu viele Epithelzellen (Bakterienklumpen) mit normalen Mundbakterien Entsprechende Platten mit normalen Mundkeimen Schoggiplatte Schafblutplatte  Vor allem vergrünende Streptokokken auf Schoggi-Platte mit Candida albicans Haemophilus sp. Gram-Präparat von Trachealsekret mit homogenem Bild gleicher Bakterien weist auf Erreger hin Pneumokokken Haemopilus influenzae 10  Anzahl Bakterien bei einer Pneumonie bei beatmeten Patienten ist 105-6 pro ml  Quantitative bakteriologische Untersuchung (Baselski et al. Clin Microbiol Newsletter (1994) 16: 65-69)  Beim Trachealsekret werden einige ml entnommen und es gibt keine Verdünnung, so dass der Cutoff bei 106/ml liegt (siehe – falls Interesse – für BAL bei Originalfolie) Bei Trachealsekret entspricht semiquantitative Fraktionierung gut überein mit der quantitativen Fraktionierung:  Wachstum nur in der 1. Fraktion entspricht 103-4/ml;  Wachstum auch in der 2. Fraktion entspricht 104-5/ml  Wachstum auch in der 3. Fraktion entspricht 105-6/ml. Spezielle Hinweise zu Materialien  Rachenabstrich  normalerweise nur Suche nach beta-hemolysierenden Streptokokken der Gruppe A  Bei Neugeborenen Streptokokken der Gruppe B möglich  Für Mycoplasma pneumoniae und Chlamydophila pneumoniae PCR verlangen. Inzwischen Multiplex-PCR  Bei Neugeborenen auch Chlamydia trachomatis (PCR) und Ureaplasma urealyticum (Kultur) aus respiratorischen Materialien suchen  Für Legionellen Antigen-Nachweis im Urin nachweisen  Analog für Pneumokokken  Blutkulturen ebenfalls abnehmen 10. Anaerobe Bakterien inclusive Diagnostik Anaerobe Bakterien können definiert werden als Bakterien, die keinen Sauerstoff zum Leben brauchen  Diese Definition ist sehr einfach und geht nicht genauer, weil dann sofort Probleme mit der Kategorisierung auftauchen Fakultative Anaerobier 0-20% O2  Enterobacteriaceae Aerotolerante Anaerobier 0-20% O2  Actinomyces spp., welche anaerob besser wachsen Mikroaerotolerante Anaerobier 0-5% O2  Bacteroides spp., welche wenig Sauerstoff ertragen Obligate Anaerobier < 0.05% O2  Fusobacterium spp., bei denen Sauerstoff sofort toxisch ist Allgemeine Eigenschaften  Anaerobe Bakterien sind allgemein sehr empfindlich auf Sauerstoff-Radikale, können sich aber teilweise je nach Spezies dagegen schützen  Katalase (2 H2O2  2 H2O +O2) und andere (siehe Originalfolie bei Interesse)  Diese Enzyme kommen aber nur bei wenigen Anaerobiern vor  Obligate Anaerobier haben andere Anforderungen an die Entnahme und den Transport als fakultative Anaerobier  Wenn ein Labor Fusobacterium spp. isolieren kann, dann funktioniert das anaerobe System von der Entnahme bis zur Kultur  Heute im Wesentlichen E-Swab, was die Anaerobier durch verschiedene Zusätze auch während des Transports schützt Anaerobe Bebrütung  Die anaerobe Atmosphäre besteht aus 80-90% Stickstoff N2, 5-10% Wasserstoff H2, 5-10% Kohlendioxid CO2  Angesetzte Platten so schnell wie möglich in anaerobes Milieu bringen.  Erreichen der anaeroben Atmosphäre  Gasaustausch bei Anaerobierkammern  Anaerobiertopf: Mit Hilfe eines Katalysators wird der Atmosphäre Sauerstoff entzogen und es entsteht auch Wasserstoff und Sauerstoff  Wasser  zusätzlich kontrolliert ein Sauerstoffindikator die Anaerobie  Dieser Prozess läuft auch in der Anerobierkammer ab, wenn Luft beim Einschleusen der Platten in die Kammer gelangt  Das notwendige Kohlendioxid und der notwendige Wasserstoff wird durch chemische Reaktionen produziert  Bei Anreicherungsmedien muss das flüssige Medium immer vorreduziert werden, d.h. dass der Sauerstoffgehalt reduziert wird, z.B. durch Kochen; es ist darauf zu achten, dass nach der Beimpfung die Flüssigmedien die Röhrchen schnell wieder dicht verschlossen werden; Thioglycolat bietet auch bei offenem Deckel zuunterst im Röhrchen anaerobe Bedingungen Heute wird die Identifizierung mit kommerziellen Systemen (Api) oder häufiger mit MALDI-TOF durchgeführt Es gibt aber für das kleine Labor einfache Teste für eine grobe Einteilung 11  Medien für Anaerobier siehe Kasten Stufendiagnostik – Stufe 1  Anaerobe Platten werden angesetzt  Verdacht auf Anaerobier möglich  Geruch (flüchtige Fettsäuren)  Mehr Wachstum auf anaeroben Platten als auf aeroben Platten  Möglichkeit, verdächtige Kolonien aerob und anaerob zu subkultiveren  Wachstum der Subkultur auf der anaeroben Platte vorhanden, nicht aber aerob  Gram-Präparat von Kolonie (ev. auch schon Originalmaterial) erlaubt Diagnose: Fusobacterium nucleatum mit spezieller Morphologie oder Sporen bei Clostriden  Wachstum auf Selektivplatten erlaubt weitere Identifierung, z.B. Doppelzonenhämolyse Clostridium perfringens Stufendiagnostik – Stufe 2  Beimpfung einer Brucella-Platte (1. Fraktion) mit Resistenzblättchen  Kanamycin 1000 g = 1 mg; Vancomycin 5 g; Colistin 10 g  Zusätzlich Nitratblättchen für Testung der Bildung von Nitrit  Beimpfung von Lecithinaseplatte  Lecithinase und Lipase  Interpretation der Resistenzblättchen der groben Einteilung  Prinzipiell sind die Gram-positiven Bakterien, auch die aeroben, empfindlich gegenüber Vancomycin und resistent gegenüber Colistin  Viele Ausnahmen, z. B. viele Laktobazillen sind resistent gegenüber Vancomycin  Prinzipiell sind die Gram-negativen Bakterien, auch die aeroben, resistent gegenüber Vancomycin und empfindlich gegenüber Colistin  Viele Ausnahmen, z.B. Bacteroides fragilis Gruppe resistent gegenüber Colistin Stufendiagnostik – Stufe 3  Identifikationsssyteme z.B. Api 20A, RapID ANA  Bestimmung der flüchtigen und nichtflüchtigen Fettsäuren  Zelluläre Fettsäuren  Sequenzierung  MALDI-TOF ist heute weit verbreitet Einteilung der anaeroben Bakterien – Gram-negative Stäbchen  Bacteroides spp., im Wesentlichen  Bacteroides fragilis-Gruppe kommt vor allem im Darm vor  Resistent gegen Colistin, Kanamycin, Vancomycin  Besteht aus über 20 Spezies  Porphyromonas spp. und Prevotella spp.  Kommen vor allem im Mund und oberen Respirationstrakt vor, auch Darm  Früher meistens auch Bacteroides genannt  Sehr viele Pigmentbildner – Prevotella spp. dabei  Fusobacterium spp.  Fusobacterium nucleatum  Fusobacterium necrophorum und Fusobacterium mortiferum  Campylobacter gracilis – früher Bacteroides ureolyticus-Gruppe 12  Fusobacterium spp.  Strikt anaerob  Gehören zur normalen Mundflora  Bilden Buttersäure als flüchtige Fettsäuren  Anaerobierlabor hat selbst für Mikrobiologen einen strengen Geruch  Fusobacterium nucleatum zeigt feine beidseits zugespitzte Gram-negative Stäbchen (siehe Seite 12)  Fusobacterium necrophorum und Fusobacterium mortiferum zeigen polymorphe Formen im Gram-Präparat Einteilung der anaeroben Bakterien – Gram-positive Stäbchen  Clostridien - Sporenbildner  Gehören zur normalen Darmflora  Bilden verschiedenste Fettsäuren, auch teilweise Buttersäure  Clostridium botulinum, Clostridium tetani  Bilden starke Toxine, biologisch am stärksten wirksame Toxine  Clostridium perfringens  Bilden Toxine, welche die Zellmembran zerstören  Clostridioides (Clostridium) difficile  Bilden Cytotoxine – Antibiotika-induzierte Diarrhöe Weitere anaerobe Gram-positive Stäbchen – keine Sporenbildner  Sehr viele sind nicht richtige Anaerobier, wachsen anaerob besser  Einige Spezies dieser Genera können aber strikte Anaerobier sein  Propionibacterium spp. (Hautflora)  Einige werden heute Cutibacterium genannt:  Cutibacterium acnes siehe bei Tag 9 bei Fremdkörperassoziierten Infektionen  Cutibacterium avidum / granulosum  Propionibacterium spp. wichtig in der Käseindustrie, bilden Propionsäure  Lactobacillus spp. (Mund- und Darmflora; Vaginalflora)  Bilden Laktat – Milchsäure  Viele aerobe Spezies, aber wachsen teilweise nicht auf Blutplatten  Viele sind auch als Probiotika eingesetzt  Actinomyces spp. (Mund- und Darmflora)  Actinomyces israelii und Actinomyces meyeri wachsen normalerweise nur anaerob  Bifidobacterium spp. (Darm- und Vaginalflora) Einteilung der anaeroben Bakterien – Gram-positive Kokken  Früher als Peptostreptokokken bezeichnet, quasi anaerobe Streptokokken, Mundflora, aber auch Darm und Vagina  Heute sehr viele verschiedene Namen  Staphylococcus saccharolyticus – anaerober Staphylokokkus, Katalase – negativ, nach mehreren Subkulturen auch leichtes aerobes Wachstum, Metronidazol resistent, Hautkeim Einteilung der anaeroben Bakterien - Gram-negative Kokken  Früher als Veillonella spp.  Heute sehr viele verschiedene Namen  Eher selten isoliert  Kommen im Mund, weniger im Darm vor  Veillonella spp. können als frühe Kolonisatoren der Zahntasche mit anderen Bakterien zusammen zur Periodontitis führen 11. Vier-Felder-Test, Sensitivität, Spezifität, positiver und negativer Voraussagewert Berechnung der Sensitivität und Spezifität bzw. positiver und negativer Voraussagewert (Wh) (Nachtestwahrscheinlichkeiten), siehe rechts  Bei einer Prävalenz von 50% (oben) erwarten wir jedes 2. Resultat als positiv  Die Voraussagewerte sind hoch, wenn Sensitivität und Spezifität hoch  Bei einer Prävalenz von 1% (rechts unten) erwarten wir mit dem gleichen neuen Test jedes 100. Resultat als positiv  Positiver Voraussagewert ist tief, obwohl Sensitivität und Spezifität hoch 13 12. Anspruchsvolle Gram-negative Stäbchen Identifikation anspruchsvoller Gram-negativer Stäbchen  Wachstum auf Schafblutplatte nur mit Amme oder auf «Kochblut-platte»  Haemophilus influenzae / Haemophilus parainfluenzae  Haemophilus influenzae  Gram-negatives Stäbchen, oft sehr kokkoid  Katalase und Urea positiv, aber nie so schnell wie bei Brucella spp.  Wächst nicht auf Schafblutplatte, sondern auf Kochblutagar (siehe Seite 10 oben)  Mit Pfeil Haemophilus sp. glasige Kolonie; auf normaler Platte nicht sichtbar  Benötigt freies Hämin (X-Faktor) und NAD (V-Faktor, Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid)  Früher hat man Schafblut zuerst gekocht, damit die Erythrozyten platzen und X-Faktor und V-Faktor freigeben – Kochblutagar oder «Schoggiagar» genannt  Neuere Platten sind direkt mit X-Faktor und V-Faktor angereichert  Auf der Schafblutplatte kann man das Ammenphänomen zeigen, was als dia- gnostisches Kriterium gilt; Staphylococcus aureus lysiert Erythrozyten (X-Faktor) und trägt V-Faktor bei, so dass in der Nähe von S. aureus (Strich entlang) H. influenzae als Amme wächst  H. parainfluenzae benötigt V-Faktor, aber nicht X-Faktor, auch Ammenwachstum Klinische Information kann helfen  Endocarditis  HACEK-Keime  Katzenbiss (Hundebiss)  Pasteurella spp.  Hundebiss mit SIRS, Oxidase +, Katalase +  Capnocytophaga canimorsus  Neutropenie / Lymphatische Bluterkrankungen, Oxidase / Katalase negativ  orale Capnocytophaga spp.  Menschenbiss  Eikenella corrodens  Kind mit Gelenkschmerzen,  Kingella kingae Anspruchsvolle Gram-negative Stäbchen gehören oft zur Normalflora von Mund / Rachen beim Mensch, teilweise beim Tier. Deshalb oft Übertragung von Mensch / Tier auf Menschen Kein Wachstum auf MacConkey-Platte  anspruchsvolle GNS, wenn zusätzlich kein Wachstum aerob, mikroaerophile Kulturen beachten  Campylobacter fetus und Helicobacter spp. im Blut  Wenn Blutkulturen ein positives Wachstumsignal zeigen und in der Blutkultur gewundene Gram-negative Stäbchen sichtbar sind, dann muss man an Campylobacter denken. Capnocytophaga canimorsus, orale Capnocytophaga spp.  Einfache Reaktionen wie Katalase, Oxidase, Urea und TSI sind hilfreich für einen erste Idee der Identifikation auch bei HACEK  Haemophilus parainfluenzae  Aggregatibacter aphrophilus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans  Cardiobacterium hominis  Eikenella corrodens  Kingella kingae Brucella melitensis – mikrobiologische Eigenschaften  B. melitensis wächst strikt aerob, zeigt hohe Wachstumsansprüche  Hohe Resistenz in Umwelt, Kuhmist, Käse  Kokkoide Stäbchen  Haemophilus influenzae kann damit verwechselt werden, da auch kokkoide, kurze Stäbchen möglich, welche auch Urease positiv sind (aber weniger schnell)  Gefahr für Laborpersonal, deshalb ist klinische Angabe sehr wichtig  Gram-negative Stäbchen, welche auf der MacConkey-Platte nicht wachsen, sind in der Blutkultur bis zum Beweis des Gegenteils verdächtig auf Brucella  Man muss daran denken – Serologie-Suchtest möglich – Gruppe 3 Erreger Francisella tularensis  Gram-negative kokkoide Stäbchen, aerob, Katalase schwach positiv, Oxidase negativ (bei Brucella positiv)  Kultur – Labor muss informiert werden, Ansatz der Proben (Ulcusmaterial) unter Sicherheitskabine  Falls Verdacht bestätigt, weitere Bearbeitung im Sicherheitslabor Stufe 3 (Gefahr der Laborinfektion, Gruppe 3 Erreger); lange bebrüten. Francisella-Verdacht ist für Arzt und Labor meldepflichtig  PCR ist heute zuverlässiger, Serologie – Mikroagglutination und ELISA, Veterinärmedizin spezialisiert 14 13. Neisserien und Gram-negative kokkoide Stäbchen Mikrobiologische Aspekte der Neisserien allgemein  Neisserien bilden typischerweise Gram-negative Kokken, Oxidase positiv  Neisserien sind typische Schleimhautparasiten  Viele Arten gehören zur Normalflora des Rachens  Diese Arten werden apathogene Neisserien genannt  Klassische Infektionskrankheiten verursachen die Gonokokken (Tripper) (Neisseria gonorrhoeae) und die Meningokokken (Neisseria meningitidis)  Gonokokken haben Affinität zur Mukosa des Urogenitaltraktes  Meningokokken siedeln auf der Mukosa des Nasopharynx  Einige Neisserien sind aber Stäbchen, welche zu den anspruchsvollen Gram-negativen Stäbchen gezählt werden können  Stäbchenförmige Neisserien können auch zur normalen Mund-/Rachenflora gehören  In der Regel wachsen Neisserien auf der Schafblutplatte gut  Die apathogenen Neisserien sind oft gelblich. Davon abzugrenzen sind die Gram-positiven Kokken mit stark gelben Kolonien – Micrococcus luteus, auch Oxidase pos. Wichtige Unterscheidung von Kokken und Stäbchen  Oft ist Unterscheidung zwischen Gram-negativen Kokken (Neisserien) und Gram-negativen kokkoiden Stäbchen schwierig  Acinetobacter spp. (Oxidase-negative Nonfermenter) und Moraxella spp. (Oxidase-positiv) sind oft kokkoid und können nicht ohne Weiteres von Neisserien abgegrenzt werden  Moraxella catarrhalis – auf Platte gut verschiebbare Kolonien  Ein Präparat von einem Penicillin-Blättchen-Rand zeigt bei Neisserien weiterhin Kokken und bei Gram-negativen kokkoiden Stäbchen dann lange Stäbchen  Trick  Manual of Clinical Microbiology (8. – 9. Edition), ASM, Kapitel Neisserien und Moraxellen  Kokken oder Stäbchen?  Test mit Penicillinblättchen Mikrobiologische Aspekte der Meningitis, abhängig von Alter  Neugeborene bis zu einem Monat  Escherichia coli  Streptococcus agalactiae (Streptokokken der Lancefield - Gruppe B)  Routinemässige Suche bei Schwangeren in der 35./36. Schwanger- schaftswoche aus Vaginal-/Cervikalabstrich mit guter Spezifität und Sensitivität, insbesondere Anreicherungskultur.  -Hämolyse von Streptokokken der Gruppe B ist nicht stark  In der Geburtshilfe vermehrt rund um die Uhr PCR mit dem GeneXpert durchgeführt  Listeria monocytogenes  Meningitiserreger im Alter von 1 Monate bis 2 Jahre  Escherichia coli  Streptococcus agalactiae (Streptokokken der Lancefield - Gruppe B)  Haemophilus influenzae (insbesondere Serotyp B) (siehe bei Pneumonie)  Streptococcus pneumoniae  Meningitiserreger im Alter von 2 – 50 Jahre  S. pneumoniae  Neisseria meningitidis  Meningitiserreger im Alter über 50 Jahre  S. pneumoniae häufiger als Meningokokken  N. meningitidis  Listeria monocytogenes  auch Gram-negative Stäbchen  Bei Immunsuppression vielfältige Erreger; siehe bei Interesse weitere Situationen in Originalfolien 15  Neisseria meningitidis  Mikrobiologische Aspekte der Meningokokken  Gram-negative Diplokokken (Bild Liquor)  Teilweise können sie auch leicht Gram-positiv aussehen  Die Pneumokokken sind auch Diplo- kokken, welche aber auch einmal Gram-negativ aussehen können.  Der Schnelltest für den Nachweis des Pneumokokkenantigens aus dem Urin, kann auch im Liquor (Bild) eingesetzt werden, um die Unterscheidung zu machen  sehr nützlicher Hinweis  Kapsel aus Polysaccharid, mehrere Serogruppen (A, B, C, Y, W135)  Kapsel ist Pathogenitätsfaktor, schützt vor Phagozytose.  IgA-Protease, welche IgA – lokale Schleimhautantikörper – eliminiert  Lipooligosaccharid (entspricht LPS) der äusseren Membran (= Endotoxin)  Oxidase positiv, Katalase positiv, nicht so stark wie Gonokokken, wächst auf Thayer-Martin Agar  Identifikation mit ApiNH, MALDI-TOF, teilweise in Multiplex-PCR für Meningitis Neisseria gonorrhoeae  Mikrobiologische Aspekte von Neisseria gonorrhoeae  Neisseria gonorrhoeae ist das Paradebeispiel der Neisserien, aber mit vielen Eigenheiten  Fähigkeit zur Eiterbildung – Bild von Pfizerbroschüre – Gram-negative Diplokokken mit Leukozyten aus Ausfluss von Urethra  Gram aus Eiter der Urethra hat sehr hohe Spezifität  Heute kaum mehr in Praxis durchgeführt, allenfalls noch in der Dermatologiepraxis  Kultur ist schwierig, weil die Gonokokken oft während Transport absterben  Transportmedium entscheidend (E-Swab O.K.)  Früher Spezialagar (Thayer-Martin oder Schoggiagar) für direkte Inokulation des Abstrichs in der Praxis – CO2 Tablette dazu – verschlossen – schneller Transport (siehe oben rechts)  N. gonorrhoeae hat auch eine äussere Zellmembran mit LPS (Endotoxine)  N. gonorrhoeae hat eine extrem starke Katalase, d.h. wenn Koloniematerial mit Wasserstoffperoxid (H2O2) zusammengegeben wird, kommt es zu einer sehr schnellen starken Bildung von Bläschen – Superoxoltest  Prinzipiell wachsen Gonokokken auf Schafblutplatten, wenn diese mit 5-7% CO2 aerob bebrütet werden, was ja die Regel ist  Andere Bakterien können aber die Gonokokken überwuchern, so dass Kultivierung schwierig  N. gonorrhoeae wachsen auf Schoggiplatten oder noch besser auf Selektivmedien, welche Antibiotika (Vancomycin, Colistin, Antimykotika), z.B. Thayer-Martin Agar (TMA) (Bild Pixnio, Renelle Woodall, USCDCP)  Häufig kann man mit einer Durchstrich- oxidase, d.h. man geht durch die erste Fraktion ohne Einzelkolonien, kontrollieren, ob Gonokokken vorhanden (z.B. bei Rektalabstrich)  Identifizierung mit ApiNH oder MALDI-TOF möglich  Direktnachweis mit PCR heute Standard  für Resistenzprüfung Kultur 14. Bakterien des Urogenitaltraktes – STI Treponema pallidum  Mikrobiologische Aspekte von T. pallidum  Gehört zu den Spirochäten, welche in der Dunkelfeldmikroskopie direkt nachgewiesen werden können (Pfizer-Broschüre, Bild rechts)  Lange gewundene Stäbchen mit Endoflagellen  Sind nicht auf Agar kultivierbar  PCR bei Ulcus möglich statt Dunkelfeldmikroskopie Treponema pallidum subsp. endemicum  klassische Lues 16  Gardnerella vaginalis  Gardnerella vaginalis ist der Leitkeim der bakteriellen Vaginose (BV), welche im Wesentlichen ein Überwuchern der anaeroben Bakterien bedeutet  Gram-labil, aber an sich Gram-positiv, mit einer dünnen Mureinschicht  KOH-Test (10%) löst aus Gram-negativen Bakterien die DNA heraus und es kommt zu einem Fadenziehen  G. vaginalis ist auch KOH positiv, weil auch hier die DNA herausgelöst wird (Fadenziehen)  Prinzipiell auf Schafblut kultiverbar, aber auf Humanblut-Agarplatte (Gardnerella-Platte, BioMérieux) mit Zusatz von Nalidixinsäure und Colistin zur Unterdrückung weiterer Bakterien der Vaginalflora einfacher  Katalase negativ, Hippurat positiv Clue cells im Nativpräparat (Phasenkontrast) in NaCl sichtbar Epithelzellen mit Bakterien übersät, im Wesentlichen G. vaginalis bakterieller Vaginose Was ist in unseren Breitengraden die normale Vaginalflora?  Bei der geburtsfähigen Frau führt das Östrogen zu einer Verdickung des vaginalen Epithels und zur Ablagerung von Glycogen  Laktobazillen bauen das Glykogen zu Glucose ab und schlussendlich zu Laktat  Der resultierende tiefe pH hemmt die meisten Säure-empfindlichen pathogenen Spezies  Laktobazillen (Döderlein-Bakterien) bilden auch Wasserstoffperoxid, welches anaerobe Bakterien hemmt  Laktobazillen spielen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung des gesunden Milieus der Vagina  Gram-Präparat (1000er Vergrösserung) vor der Kultur (Bild rechts) (Praxis am IMM Zürich) – viele Laktobacillen, keine Kultur notwendig  Gram-Präparat von Bakterieller Vaginose (Clue cells) Nach hoher Score für BV wegen fehlenden Laktobazillen und vielen Clue cells – Epithelzellen mit G. vaginalis übersät 15. Gram-positive Stäbchen Generelle Übersicht Anaerobe Gram-positive Stäbchen  Clostridien = anaerobe Sporenbildner  Clostridien können einmal entfärbt sein, so dass sie im Gram rot, also Gram-negativ erscheinen  Andere anaerobe Gram-pos. Stäbchen ohne Sporen, z.B. Eubacterium sp.  Teilweise sind Laktobazillen und Bifidobakterien anaerob, Katalase negativ  Auch Laktobazillen können sich entfärben und Gram-negativ aussehen  Actinomyces israelii, Actinomyces meyeri, Katalase negativ  Verschiedene nicht-sporenbildende anaerobe Gram-positive Stäbchen sind in der Klinik seltener und werden nicht weiter vorgestellt wie z. B. Eggerthella lenta, vorher Eubacterium lentum Aerobe Gram-positive Stäbchen  Bazillen = aerobe Sporenbildner, Katalase pos.  Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus anthracis, sehr viele andere  Corynebacterium spp., Katalase positiv, sehr viele Arten  Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans, C. amycolatum, C. jeikeium  Coryneforme Bakterien  Actinomyces spp., fakultativ anaerob, sehr viele verschiedene, Katalase variabel  Cutibacterium (Propionibacterium) acnes, Cutibacterium avidum/granulosum  Viele weitere coryneforme Bakterien  Listerien, beim Mensch im Wesentlichen Listeria monocytogenes  Nocardia asteroides Actinomyces israelii und Actinomyces meyeri  sind anaerobe Bakterien, welche nicht einfach zu züchten sind, wachsen aber prinzipiell auf der Brucella-Agar-Platte anaerob  Katalase negativ, verzweigte Gram-positive Stäbchen  Bilden im Gewebe Drusen – histologische Diagnose (Bild)  Krankheitsbild heisst Aktinomykose, welche vor allem in der Lunge, aber auch genital – IUD- Trägerin (Spirale – intrauterin device) vorkommen 17  Bacillus spp. Gutes Beispiel für Einteilung in Risikogruppen  Gruppe 1 kein oder vernachlässigbar kleines Risiko für Erkrankung  Bacillus subtilis, Probiotika  Gruppe 2 geringes Risiko  Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli  Gruppe 3 mässiges Risiko, therapierbar  Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis  Gruppe 4 hohes Risiko, hohe Letalität  Pockenvirus, Ebolavirus  Bei Bazillen gibt es innerhalb der gleichen Gattung – GENUS – verschiedene Arten – SPECIES –, welche in drei verschiedene Risiko-Gruppen eingereiht werden Bacillus cereus (Wh)  Gruppe 2 Organismus Differentialdiagnose: Bacillus anthracis  B. cereus ist ein aerober Sporenbildner – Katalase positiv  Macht eine Hämolyse und ist Penicillin resistent  Beweglich  Kann wegen emetischem Toxin analog zu Clostridium perfringens und Staphylococcus aureus kurz nach Nahrungsaufnahme Erbrechen verursachen  Molekularbiologisch ist das Genom fast gleich wie Bacillus anthracis  Im Labor prinzipiell einfach zu unterscheiden: links B. cereus rechts B. anthracis  B. cereus ist hemolytisch, B. anthracis nicht  B. anthracis ist unbeweglich, Trübung nur entlang Stich; man kann auch im Nativ-Präparat dies mit dem Phasenkontrastmikroskop (auch im normalem Mikroskop mit ge- schlossener Blende) beurteilen  B. anthracis ist empfindlich auf Penicillin Bacillus anthracis  Gruppe 3 Organismus  B. anthracis ist auch ein aerober Sporenbildner  Gram-positive Stäbchen in «Ketten»  In der Blutkultur zum Teil Sporen sichtbar  1867 von Koch entdeckt  Kapsel  Toxinbildung  Ödemfaktor (EF)  Letalfaktor (LF) Corynebacterium spp.  Generelle Eigenschaften  Gram-positive Stäbchen  Unregelmässig geformt mit keulenartiger Struktur  Coryne heisst auf Griechisch die Keule  Viele sind fakultativ anaerob  Unbeweglich  Katalase positiv  Viele gehören zur Normalflora der Haut, der Schleimhäute  Einige sind obligat pathogen, die meisten Opportunisten  Diagnostik mit MALDI-TOF / CoryneApi / 16S rRNA Gen Seqenzierung Corynebacterium diphtheriae  Gram-positive Stäbchen, pleomorph, oft Keulenform keine Geisseln, keine Sporen  Polkörperchen aus Polyphosphat (Neisserfärbung)  Katalase positiv  Obligat pathogen – Reservoir ist nur der Mensch – Rachen / Wunde  Reduktion von Tellurit zu Tellur (Tellur kann auch im Rachen andere Bakterien hemmen)  4 Biotypen, nur mit ApiCoryne möglich, PCR nur für Toxin  gravis, oft mit Toxin  mitis  belfanti, kein Toxin  intermedius 18  Weitere Corynebacterium spp.  Corynebacterium ulcerans  Kann auch Corynebacterium diphtheriae – ähnliches Toxin produzieren  Kommt bei Katzen vor – Zoonose  Corynebacterium amycolatum  Normalerweise enthalten Corynebakterien Mycolsäuren  C. amycolatum enthält keine Mycolsäure, deshalb trockene, rauhe Kolonien  Bei Reinkultur je nach Entnahmeort relevant, Blut, Wunden  In der Routine häufigstes nicht-lipophiles isoliertes Corynebacterium  Corynebacterium jeikeium (JK)  Lipophil, d.h. macht auf Schafblutagar nur grosse Kolonien, wenn Lipid (Tween) dazu gegeben wird, sonst ganz kleine Kolonien  Hautbewohner, weil es dort genügend Lipide hat  Oft im Zusammenhang mit Katheter und Fremdkörper gefunden Cutibacterium (Propionibacterium) acnes und andere Cutibacterium spp.  Unregelmässig geformte Gram-positive Stäbchen  Beispiel links aus der Blutkultur  Wachsen anaerob besser als aerob  Katalase +  CAMP positiv (siehe bei Listerien)  Propionsäure als Hauptendprodukt der Glucosefermentation  Habitat: Menschliche Haut Listeria monocytogenes  Erklärung von CAMP- Christie-Atkins-Munch-Peterson -Test  Verstärkung der Hämolyse von Staphylococcus aureus durch CAMP-Faktor  CAMP-Test wird durchgeführt, indem ein Impfstrich von Staphylococcus aureus auf einer Schafblutplatte gezogen wird und im rechten Winkel dazu (von aussen zum Impfstrich von S. aureus hin) ein Impfstrich des Keimes, bei welchem man den Effekt einer Hämolyse-Verstärkung bei S. aureus nachweisen möchte: typischer Keim Streptococcus agalactiae  Bild von SlideServe  Viele Bakterien haben diesen CAMP-Faktor  Cutibacterium acnes  Listeria moncytogenes, aber schwach, Bild links  Diagnostisch einfacher nützlicher Test 16. Chlamydien und Mycoplasmen sowie Coxiella, Leptospira, Rickettsien und Bartonella Prinzipielle Biologie der Chlamydien  Chlamydien sind «zellwandlose, allerdings (?) wenig Murein» Bakterien», welche für die Vermehrung eine eukaryotische Zelle brauchen  Elementarkörperchen dringen in eukaryotische Zelle und entwickeln sich zu Retikulärkörperchen, aus welchen wieder Elementarkörperchen freigesetzt werden, welche wieder Zellen infizieren  Früher wurden viele Chlamydien- Krankheiten als viral vermutet (vor 60-40 Jahre entdeckt)  Früher standardmässig in Zellkultur kultiviert oder auch in Eiern gezüchtet  Drei Spezies sind wichtig  Chlamydia trachomatis  Chlamydia pneumoniae  Zeitweise auch Chlamydophila bezeichnet  Chlamydophila psittaci  Früher als Chlamydia bezeichnet  Goldstandard für den Nachweis ist die PCR, aber Serologie möglich  Serologie ist kompliziert wegen Kreuzreaktionen zwischen den Spezies Chlamydia trachomatis  Verschiedene Serotypen teilweise unterschiedlichen klinischen Bildern  Die Serotypen (B), D-K verursachen die üblichen lokalen Infektionen, auch Auge  Die Serotypen A, B, C sind als Erreger des Trachoms bekannt (Tropen)  Die Serotypen L1, L2, L3 sind vor allem bei MSM bekannt für Analinfektion  Für die PCR benötigt man Zellen, weil C. trachomatis intrazellulär ist  Heute ist PCR Standardmethode, gleichzeitig mit Gonokokken  C. trachomatis kann bei Neugeborenen eine Pneumonie verursachen; bei Geburt Mutter-Kind-Übertragung 19  Chlamydia (Chlamydophila) pneumoniae  PCR ist heute Standard – meistens in Multiplex-PCR zusammen mit Viren Chlamydia (Chlamydophila) psittaci  Identisch mit Erreger der Papageienkrankheit – Ornithose  Zoonose mit Pneumonie beim Menschen – Psittakose  PCR ist vorhanden, aber nicht unbedingt bei Multiplex-PCR Mycoplasma pneumoniae und genitale Mycoplasmen  Mycoplasmen haben keine Zellwand, können aber teilweise auf Spezialmedien gezüchtet werden, insbesondere genitale Mycoplasmen  Erkältung, die bis zur hartnäckigen Pneumonie übergehen kann  Nicht-pathogene Spezies kommen im Mund-Rachenbereich vor  Oft bei Zellkulturen als Kontaminanten bekannt  M. pneumoniae ist in der respiratorischen Multiplex-PCR enthalten  Serologie ist eine Option (EIA, früher KBR), weil Kultur nicht erfolgreich Genitale Mycoplasmen  Mycoplasma hominis  Assoziert mit BV  PID?  Häufig aus Amnionflüssigkeit isoliert  Mycoplasma genitalium  Urethritis beim Mann, PCR, da Kultur zu lange  Ureaplasma urealytium, Ureaplasma parvum  Häufig vaginal, U. parvum mit Frühgeburtlichkeit assoziiert  U. urealyticum und U. parvum  Kultur  Differenzierung der beiden mit PCR  M. hominis  Kultur  M. genitalium  PCR Coxiella burnetii - Q-Fieber  Coxiella burnetii hat eine Gram-negative Zellwand. Kokkoide Stäbchen, pleomorph  Q-Fieber  Query (Fieber-Ausbruch 1935 in Australien im Schlachthof)  Sporen-ähnliche Strukturen, resistent gegen Temperatur, Alkohol  LPS Bestandteil der Gram-negativen Zellwand  O-Antigen bei Salmonellen  Bei Fehlen des O-Antigen spricht man von Rauh-Form  PCR ist möglich, aber vor allem serologische Diagnose Leptospira  Gehört zu Familie Leptospiraceae  Spirochaeten  0.1µm x 6-20 µm  Rechtsdrehende Helix  Periplasmatische Flagellen (Endoflagellen wie Borrelien)  Aerobes Wachstum  Leptospira interrogans (sensu lato)  pathogen  Leptospira biflexa (sensu lato)  nicht pathogen für Mensch, saprophytisch Rickettsien  Rickettsien (auch Ehrlichia) haben wie Coxiella burnetii eine Gram-negative Zellwand.  Kokkoide Stäbchen, pleomorph  Fleckfiebergruppe (englisch „typhus“)  Zeckenbissfieber-Gruppe (englisch „spotted fever“) Bartonella henselae  Katzenkratzkrankheit – KKK - Cat scratch disease - CSD, BA, Endocarditis Bartonella quintana  Grabenfieber während des ersten Weltkrieges, Bazilläre Angiomotose (BA), Endocarditis  Zuerst Rickettsia quintana, dann Rochalimea quintana genannt 17. Bakteriensystematik Bakteriensystematik Gram-positive Bakterien - Aerobe (meist fakultativ anaerobe) Kokken  Katalase positiv Kokken in Haufen - Koagulase-positiv Staphylococcus aureus - Koagulase-negativ Staphylococcus epidermidis Staphylococcus lugdunensis (Clumping factor positiv) Staphylococcus saprophyticus  Katalase positiv Kokken in Haufen/Tetraden/Oxidase positiv Micrococcus luteus (aerob) 20  Bakteriensystematik Gram-positive Bakterien - Aerobe (meist fakultativ anaerobe) Kokken (Forts.)  Katalase negativ Kokken in langen Ketten beta-hemolys. Gruppe A Streptococcus pyogenes beta-hemolys. Gruppe B Streptococcus aglactiae beta-hemolys. Gruppe C/G Streptococcus dysgalactiae vergrünende Streptokokken z.B. Streptococcus oralis (teilweise hemolysierend) Streptococcus anginosus Gr. typisch Gruppe F (S. anginosus, S. intermedius, S. constellatus) -hemolys. Streptococcus bovis (gallolyticus) (Gr. D)  Katalase negativ Kokken in kurzen Ketten -hemolys. Enterococcus faecium (Gr. D) -hemolys. Enterococcus faecalis (Gr. D) (alpha--hemolys. bedeutet vergrünend; -hemolys. bedeutet keine Hämolyse  Katalase negativ Kokken in Diplo -hemolys. Streptococcus pneumoniae (Kapsel)  Katalase negativ Kokken in Tetraden -hemolys Aerococcus urinae Bakteriensystematik Gram-positive Bakterien - Aerobe (fakultativ anaerobe) Stäbchen  Katalase positiv unregelmässige Formen (keine Sporen) Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium ulcerans Corynebacterium amycolatum Corynebacterium jeikeium  Katalase positiv (coryneform) eher lange Stäbchen Turicella otitidis teilweise kokkoid, auch verzweigt Rothia dentocariosa (grosse cremige Kolonien) Brevibacterium casei (eher kokkoid) Dermabacter hominis (Vancomycin resistent; H2S im TSI) Erysipelothrix rusiopathiae  Katalase positiv, teilweise verzweigt, wachsen besser anaerob (CAMP pos.) Cutibacterium acnes Cutibacterium avidum Cutibacterium granulosum  Katalase positiv, gerade, oft entfärbt, Sporenbildner Bacillus subtilis Bacillus cereus Bacillus anthracis  Katalase variabel, teilweise verzweigt Actinomyces neuii Actinomyces spp. Bifidobacterium spp.  Katalase positiv, (teils negativ) leichte Hämolyse, CAMP positiv, kokkoid Listeria monocytogenes  Katalase negativ, oft entfärbt, schlank, teilweise auch kokkoid Lactobacillus spp. Bakteriensystematik Gram-positive Bakterien – Anaerobe Stäbchen und Kokken  Sporenbildner – Stäbchen Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostrididum spp.  Nicht sporenbildende Stäbchen Actinomyces meyeri, Actinomyces israelii  Kokken Peptostreptokokken mit den verschiedenen neuen Namen Bakteriensystematik Gram-negative Bakterien - Aerobe (fakultativ anaerobe) Stäbchen  Oxidase negativ, Glucose-Fermenter, Lactose positiv Escherichia coli – als Parade- beispiel der Enterobacteriacieae Klebsiella pneumoniae (unbeweglich) Citrobacter freundii (H2S im TSI) Enterobacter cloacae  Oxidase negativ, Glucose-Fermenter, Lactose negativ Shigella spp. Salmonella enterica (H2S im TSI) Proteus mirabilis (H2S im TSI, Urea +)  Oxidase negativ, Glucose-Nonfermenter  Lactose negativ Acinetobacter baumannii  Oxidase positiv, Glucose-Fermenter, Lactose positiv Vibrio cholerae (Vibrionaceae) Aeromonas hydrophila  Oxidase positiv, Glucose-Nonfermenter, Lactose negativ Pseudomonas aeruginosa / andere NF  Anspruchsvolle Gram-negative Stäbchen (auf MacConkey kein Wachstum) HACEK, kokkoide: Haemophilus influenzae (Amme), Brucella melitensis (kokkoid), Francisella tularensis. Normale GNS: Pasteurella multocida, Capnocytophaga canimorsus, Capnocytophaga spp., G. vaginalis  Mikroaerophile Stäbchen Campylobacter jejuni/coli, C. gracilis Helicobacter pylori Bakteriensystematik Gram-negative Bakterien - Aerobe (teils fakultativ anaerobe) Kokken  Oxidase positiv, in Diplo Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Neisseria spp.  Oxidase positiv, z. T. Stächen Neisseria elongata, Moraxella sp., Moraxella catarrhalis Bakteriensystematik Gram-negative Bakterien - Anaerobe Stäbchen und Kokken  Stäbchen Bacteroides fragilis, Bacteroides spp., Porphyromonas spp., Prevotella spp.  Extrem strikte anaerobe Stäbchen Fusobacterium nucleatum, F. mortiferum, F. necrophorum  Kokken Veilonella spp. 21 18. Systematik der Bakterien, die sich nicht nach Gram einteilen lassen Coxiella burnetii - Q-Fieber Chlamydia trachomatis – STD – Trachom – verschiedene Serotypen – häufigste STD Chlamydia / Chlamydophila pneumoniae – respiratorische Infekte Chlamydia psittaci – Pneumonie – Psittakose – Papageienkrankheit Mycoplasma hominis Mycoplasma genitalium Ureaplasma urealyticum Ureaplasma parvum Rickettsia– Fleckfieber-Gruppe-„typhus“, Zeckenbissfieber-Gruppe „spotted fever“ Anaplasma phagocytophilum – Humane granulocytäre Ehrlichiose 19. Borrelia burgdorferi – mikrobiologische Eigenschaften negative Zellwand, nicht richtig im Gram anfärbbar 0.2 dick x 5-20 lang, mit Flagellen innerhalb der äusseren Zellmembran – Endoflagellen (siehe Pfeile) Verschiedene Oberflächenproteine - Outer surface proteins; Flagellin 41kD - Fusionsprotein VlsE Kultur ist in komplizierten Flüssigmedien möglich, aber sehr schwierig - Nachweis aus Zecken erstmals 1981 gelungen: Burgdorfer - Kultur auf Agar nicht möglich Direktnachweis mittels PCR in speziellen Situationen möglich Die Serologie ist zentral für die Diagnostik - Sehr sensitive Suchteste mit einer erniedrigten Spezifität (Falsch positive Resultate sind akzeptiert) - Spezifische Bestätigungsteste für die positiven Suchteste, ob wirklich positiv Wie viele anderen Borrelien Übertragung durch Zecken Beim ZNS-Befall wird nur teilweise die PCR durchgeführt; zentral ist der Nachweis von B. burgdorferi - spezifischen Antikörper im Liquor - Die Antikörper im Blut können durch die sogenannte Blut-Hirn-Schranke in die Hirnflüssigkeit diffundieren, so dass diese auch im Liquor nachgewiesen werden können - Entscheidend sind die sogenannten intrathekal gebildeten Antikörper, d.h. solche, welche im Hirn produziert werden  komplizierte Berechnungen 20. Treponema pallidum – mikrobiologische Eigenschaften Gehört zu den Spirochäten, in der Dunkelfeldmikroskopie direkt sichtbar - Lange gewundene Stäbchen mit Endoflagellen, analog zu Borrelien Sind nicht auf Agar kultivierbar, teilweise im Tier PCR bei Ulcus möglich statt Dunkelfeldmikroskopie oder durch die direkte Immunfluoreszenz (IF) Diagnostik vor allem serologisch Suchteste und Bestätigungsteste Treponema pallidum subsp. pallidum  klassische Syphilis (Lues) 21. Erste serologische Hinweise (Wh) und Serologie allgemein Wieso bindet ein Antikörper ein Antigen? Proteine haben untereinander eine Interaktion, welche bei engem Kontakt bei passender Form – wie Schlüssel zu Schlüsselloch – sich anziehen: schwache Kräfte im Gegensatz zur kovalenten Bindung Wenn der Antikörper gut zum Antigen passt, kommt es zur Bindung (Bild links), wenn nicht passt, keine Bindung (rechts) Indirekte Immunfluoreszenz für Antikörpernachweis - Wenn auf dem Objektträger mit dem Antigen in Zellen (z.B. B. henselae) die Patientenantikörper binden, dann werden diese nach einem Waschgang durch die FITC- markierten Antikörper gebunden - Detektions-Antikörper, welche humane Antikörper binden, werden mit einem Fluoreszenzfarbstoff (FITC) markiert - Dadurch wird der primäre Antigen-Antikörper-Komplex im Immunfluoreszenzmikroskop durch Leuchten unter UV-Licht sichtbar - Den FITC-markierten Antikörper nennt man auch Konjugat 22  Der Antigen-Antikörperkomplex muss irgendwie nachgewiesen werden, sehr viele verschiedene Spielarten Prinzipiell kein Unterschied, ob Antigen oder Antikörper nachgewiesen werden soll - Für Antigennachweis, z.B. von Antigenen auf Salmonellen ist die einfachste Methode der Agglutina- tionstest mit spezifischen Antiseren gegen O- und H- Antigene: siehe Kaufmann-White Schema - Die Salmonellen werden durch die Antikörper gebunden und sie agglutinieren - Schnellteste für Streptokokken der Gruppe A – Latexagglutination - Schnellteste für Pneumokokken-Antigen im Urin – Immunchromatographie) ELISA = Enzyme linked immuno sorbent assay - Ein Antigen wird an Polystyrol gebunden - Das ungebundene Antigen wird weggewaschen - Das Patientenserum wird in einer Verdünnung dazu gegeben; wenn spezifische Antikörper gegen das Antigen vorhanden sind, binden sich diese daran - Das restliche Serum mit unspezifischen Antikörpern wird weggewaschen und ein zweiter, mit einem Enzym E markierten Antikörper (Konjugat), der gegen humane IgG oder IgM oder beide gerichtet ist, wird dazugegeben - Dadurch wird der Antigen-Antikörper-Komplex (2. Bild) gebunden (3. Bild) - Das ungebundene Konjugat wird gründlich weggewaschen - Anschliessend wird das Substrat dazu gegeben, welches durch das Enzym E in farbiges Produkt umgesetzt wird - Oft ist das veränderte Substrat gelb oder blau; die Farbe kann man quantitativ messen 21.(Fortsetzung) Serologie anhand Borrelia burgdorferi Mit dem Suchtest ELISA (wie oben) werden Antikörper gegen B. burgdorferi gesucht, aber dieser Test hat viele falsch positive Resultate - Die Sensitivität ist sehr hoch, aber die Spezifität eingeschränkt Indirekter Nachweis der Antikörper gegen Borrelien-Antigene - Die Suchteste enthalten meistens auch das Flagellin, was bei vielen Bakterien auch vorkommt  Kreuzreaktionen Für die Bestätigung wird oft ein Immunoblot eingesetzt 21. (Fortsetzung) Serologie anhand Treponema pallidum Mit dem Suchtest werden Antikörper gegen T. pallidum gesucht, aber dieser Test hat viele falsch positive Resultate - Die Sensitivität ist sehr hoch, aber die Spezifität eingeschränkt Die erste serologische Diagnostik überhaupt wurde anhand der Lues durchgeführt Nicht - Treponema – Antikörper (meistens als Aktivitätsparameter) – RPR – Rapid Plasma Reagin Anti - Treponema – Antikörper (Immunoglobuline ist ein Überbegriff, abgekürzt Ig) - TPHA (T. pallidum Hämagglutinations-Assay) (Suchtest), weist alle Antikörperklassen (Ig) nach - ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) (Suchtest), teilweise als Kompetionstest (alle Ig) - FTA-ABS-Test (Fluoreszenz Treponema Antibody) (Suchtest, teils Bestätigungstest) - Western blot oder Immunoblot (Bestätigungstest) - ELISA in der Regel empfindlicher (sensitiver) als TPHA Eine positive Lues-Serologie kann auch eine positive Borrelien-Serologie verursachen, deshalb bei positiver Borrelien-Serologie auch Lues-Serologie erwägen Bilder zur Illustration – nicht Treponema-Antikörper TPHA ELISA - RPR (Rapid Plasma Reagin) als Aktivitätsparatmeter (Suchtest) (sehr empfindlicher Suchtest) 23 22. Nocardia spp. mit mikrobiologischen Eigenschaften, halbsäure Färbung, Hinweis auf Streptomyceten Nocardia asteroides und andere Spezies - Mikrobiologie – Haupteigenschaft – halbsäurefest Nocardien sind verzweigte Gram-positive Stäbchen (ähnlich zu Hyphen) - Ähnlich zu anaeroben Actinomyces spp. - In der Gram-Färbung links aber nicht homogen angefärbt, blau-violett, teilweise granuliert - Halbsäurefest (siehe bei Mykobakterien) - Obligat aerob - Kommen in der Umwelt vor - Erde, organisches Material, Kompost Nocarida asteroides – Komplex - Wichtigste Vertreter - Kultur benötigt in der Regel mehr als 2 Tage, eher 5 - 7 Tage - Trockene Kolonien, riechen nach Waldboden, teils Lufthyphen - Oft Pigmente gelb, orange Nocardien werden oft im Tuberkulose-Labor isoliert - Längere Bebrütungsdauer - Verschiedene spezielle Arten mit unterschiedlicher Resistenz Streptomyces – Arten sehen ähnlich aus, nicht halbsäurefest, Lufthyphen - Antibiotikaproduzenten, z. B. Streptomycin, erstes effektives Tuberkulostatikum 23. Mycobacterium tuberculosis – Komplex – Mikrobiologische Eigenschaften – Färbung – Diagnostik – NTM Mykobakterien - tuberkulöse und nicht-tuberkulöse Arten Gattung Mycobacterium gehört zur Familie Mycobacteriaceae - Lipidreiche Zellwand (Mykolsäuren) verhindert richtige Gram-Färbung - Spezialfärbung – säurefeste Färbung - Ziehl-Neelsen-Färbung Mycobacterium tuberculosis – Erreger der Tuberkulose Mycobacterium leprae – Erreger der Lepra Viele nicht-tuberkulöse Mykobakterien (teilweise schnelles Wachstum) Aerobe Bakterien mit einer Generationszeit von 12-18 Stunden - Für die Kultur Spezialmedien mit hohem Lipidgehalt - Eiernährböden – Löwenstein-Jensen – mehrere Wochen bebrüten Diagnostik (siehe unten) - Direktmikroskopie – teilweise mit Fluoreszenzfarbstoff - Kultur – Festmedien und Anreicherungsmedien - PCR - Resistenzprüfung Mycobacterium tuberculosis – Komplex Mycobacterium tuberculosis (TB) Mycobacterium bovis Davon abgeleitet Mycobacterium bovis BCG – Impfstamm - Sind zusammen mit Mycobacterium leprae obligat pathogen Gruppe 3 Erreger, deshalb Biosafety level 3 Labor  BL-3 Labor - Primäre Kulturen dürfen in normalem Labor – BL-2 erfolgen - Sobald Kultur positiv – säurefeste Stäbchen nachweisbar- weitere Verarbeitung in BL-3 Nationales Zentrum für Mykobakterien NZM, Institut für Medizinische Mikrobiologie in Zürich - Meldepflichtig von Arzt und Labor Diagnostik muss auch als Notfalldiagnostik ablaufen können - Heute meistens PCR statt ZN - (Ziehl-Neelsen) – Färbung Nicht – tuberkulöse Mykobakterien (NTM) Schnellwachsende NTM können auf den normalen Schafblutplatten innert 5-7 Tagen wachsen - z.B. Mycobacterium fortuitum Langsamwachsende NTM - z.B. Mycobacterium kansasii Teilweise langsam wachsende Mykobakterien (NTM) auch eingeteilt nach Bildung eines Pigments ohne Licht (skotochromogen) und mit Lichteinfluss (photochromogen) Bild von Mycobacterium kansasii mit Licht gelb; rechts M. tuberculosis (Atlas G.L. Mandell) 24  NTM sind fakultativ pathogen Zellwand analog zu M. tuberculosis Diagnostik M. tuberculosis Mikroskopie - Screening mit Auramin-Fluoreszenz-Färbung - Leuchtende Stäbchen können schnell entdeckt werden - Bestätigung mit Ziehl-Neelsen-Färbung Vorteil: schnell ohne Dekontamination (innerhalb einer Stunde) Nachteil: Mangelnde Sensitivität, keine Speziesdiagnose Prinzip der Ziehl-Neelsen-Färbung Wie bei Gram-Färbung auch eine Gegenfärbung nach Entfärbung mit Alkohol, aber saurer Alkohol Kultur auf Festmedien - Kultur auf Festmedien: Bevor Kultur angesetzt wird, müssen die normalen Bakterien des Materials (meistens Materialien aus dem Respirationstrakt) abgetötet werden mit NaOH, damit diese die langsam wachsenden Mykobakterien nicht überwuchern - Löwenstein-Jensen (Röhrchen) oder H-7 Agar - Trockene Kolonien wachsen nach Tagen bis Wochen; Bilder M. tuberculosis  Röhrchen rechts ohne Beimpfung Röhrchen links, beimpft mit M. tuberculosis Vorteil: sensitiv, meistens notwendig für Resistenztestung Nachteil: ca. 3 - 8 Wochen Kultur – Anreicherungsmedien – MGIT - Material muss dekontaminiert werden - In der Regel schneller positiv als Festmedien, Kontaminationsgefahr - Sobald Wachstum, dann ZN aus Anreicherungsmedium - M. tuberculosis bildet im Flüssigmedium cords (Bild) PCR für Direktnachweis und auch für Identifizierung der Spezies aus der Kultur – teilweise auch direkte Resistenztestung - Mit PCR teilweise gleichzeitiger Nachweis von M. tuberculosis und NTM Resistenztestung für M. tuberculosis auch PCR möglich, sonst mit MGIT Resistenztestung für NTM mit MGIT oder Mikrodilution GeneXpert - Weit verbreitet ist Direktnachweis mit dem GeneXpert – 7/24 (Notfall) - Kassette für M. tuberculosis Komplex - Gleichzeitig auch Nachweis der Rifampicin-Resistenz - Eine einzige Mutation im Gen für die DNA-abhängige RNA-Polymerase führt zur Resistenz Vorteil: sehr sensitiv Nachteil: nicht überall verfügbar, aber meistens wegen Covid in allen Laboratorien vorhanden 25  Indirekte Diagnostik eines Kontakts mit M. tuberculosis – Zeitlicher Zusammenhang nicht relevant - IGRA – Interferon  related assays sind in vitro Tests analog zu Tuberkulintest - Der Tuberkulintest ist eigentlich eine allergische Reaktion (Typ 4) auf ein M. tuberculosis-Extrakt, wenn Kontakt mit M. tuberculosis - Komplex irgend einmal stattgefunden hat (auch nach BCG-Impfung); bei IGRA keine Reaktion nach BCG- Impfung; dies ist ein entscheidender Vorteil der IGRAs gegenüber Tuberkulintest; zusätzlich neg. und pos. Testkontrolle 24. Mikrobiolog. Aspekte von spitalhygienischen Fragen mit allgemeinen Aspekten Das mikrobiologische Labor ist wichtig für den Nachweis von Erregern, welche spezielle spitalhygienische Massnahmen einleiten Einige Erreger müssen rund um die Uhr nachgewiesen werden Man unterscheidet «zwei» Arten von Untersuchungen - Gezielte Untersuchungen, um bei Patienten im Spital Bakterien nachzuweisen, welche wegen Risikofaktoren (Reisetätigkeit, Spitalaufenthalt im Ausland, Risiko-kantonen, ev. sogar Pflegeheim) häufiger spitalhygienisch relevante Keime tragen - Zufälliger Nachweis von spitalhygienisch relevanten Keimen im Rahmen der normalen mikrobiologischen Untersuchungen - Es gibt viele Untersuchungen, welche dazwischen liegen - Einige Untersuchungen sind auch für die allgemeine Bevölkerung – näheres Umfeld – relevant, teilweise sogar für die Laborsicherheit 25. Untersuchungsmaterialien für MRSA, VRE, ESBL, Carbapenemase bei Enterobacteriaceae, MDR Die Untersuchungsmaterialen werden so gewählt, dass die wichtigen spitalhygienisch relevanten – Besiedler bzw. Erreger isoliert werden MRSA - Nasenabstriche, allenfalls kombiniert mit Rachenabstrich - Axilla-Abstrich, ev. Inguinal-Abstrich VRE - Perianalabstrich - Inguinalabstrich - Stuhlprobe (insbesondere bei Patienten mit Darmdekontamination) ESBL, Carbapenemase, multiresistente Gram-negative Stäbchen (MDR = multi-resistent rods) - Inguinalabstrich - Perianalabstrich - Axillärabstrich, ev. auch Rachenabstrich Clostridioides difficile - Stuhlprobe, Rektalabstrich Mycobacterium tuberculosis - Sputum - andere respiratorische Materialien MRSA (Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus) - Allgemeine Punkte - In den letzten Jahren sind die MRSA in der Schweiz etwas zurück gegangen, aber immer noch relevant, insgesamt immer noch ca. 5% - Nachweis mit der Kultur - Kultur auf der Schafblutplatte kann innerhalb von 18 – 24 Stunden bereits die S. aureus sichtbar machen - Der Einsatz von selektiven chromogenen Platten verschnellern den Nachweis, in dem einerseits – wegen Antibiotika, in der Regel Cefoxitin in der Platte – das Wachstum von Methicillin-resistenten Staphylokokken erlaubt und die MRSA mit einer Enzymreaktion noch von den Koagulase-negativen Staphylokokken differenziert werden VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken) - Kultur auf der Schafblutplatte kann innerhalb von 18 – 24 Stunden bereits die Enterokokken sichtbar machen, aber gleiches Problem wie bei S. aureus, nämlich VRE nicht von VSE (Vancomycin- empfindliche Enterokokken) unterscheidbar, deshalb auch Selektivplatten - Bei Repatriierten wird VRE immer parallel zu MRSA und multiresistenten GNS gesucht, wobei in Spezialfällen auch die PCR mit dem GeneXpert (vanA/vanB) aus Rektalabstrich möglich ist - Wichtiger ist die korrekte Ablesung der routinemässige Resistenzprüfung, wobei die Hemmhöfe gegen Vancomycin scharf sein müssen, ansonsten müssen weitere Abklärungen folgen (PCR für vanA/vanB / Screeningplatten), weil meistens VRE-Ausbrüche im Spital unerwartet sind 26  ESBL (Extended Spektrum Beta-Laktamase) - Die Schweizerische Gesellschaft für Infektiologie hat von der Schweizerischen Gesellschaft für Mikrobiologie immer verlangt, dass die diagnostischen Laboratorien nicht nur korrekt die Resistenz- prüfung durchführen, sondern auch