Gentechnik - VO4 - PDF

**GENTECHNIK** **[Definition:]** - Anwendung moderner molekularbiologischer Methoden zur Änderung der genetischen Eigenschaft von Organismen - \"rekominante DNA-Technologie\": weil damit Erbinformation gezielt mutiert,rekombiniert oder neukombiniert werden kann **[Bereiche der Gentec...

**GENTECHNIK** **[Definition:]** - Anwendung moderner molekularbiologischer Methoden zur Änderung der genetischen Eigenschaft von Organismen - \"rekominante DNA-Technologie\": weil damit Erbinformation gezielt mutiert,rekombiniert oder neukombiniert werden kann **[Bereiche der Gentechnik:]** - Herstellung von Proteinen für medizinische und technische Anwendungen (Antikörper!) - Herstellung von transgenen Pflanzen und Tieren (Sojaprodukte im Supermarkt) - Gendiagnostik - somatische Gentherapie - CRISPR/Cas9?, seit 2018 (Veränderung des Genoms in Tier & Mensch, gezielte Mutation) keine Gentechnik ist: - klassische Züchtungsverfahren - extrakorporale Befruchtung - Embryoteilung/Embryotransfer bei Nutztieren - Herstellung von tierischen oder pflanzlichen Hybriden (Schiege, Tomatoffel) **[CRISPR/Cas:]** 1. Wenn ein Virus seine DNA in die Zelle hineingibt, können Bakterien diese fremd DNA in Stücke zerschneiden und in einen speziellen Locus im Genom inserieren 2. Bei erneutem eindringen des Virus können Bakterien den Virus erkennen und über die Transkription eine pre-c-RNA anfertigen welche zwischen den Wiederholungssequenzen (Haarnadelstruktur) eingebaut wird 3. Bakterien können dann die pre-c-RNA zurechtschneiden, sodass Stücke aus cRNA, spezifischer viralen DNA und Wiederholungsfrequenzen entstehen 4. Findet die virale DNA wider ein Stücken komplementärer DNA von dem gleichen Virus, dann wird sie über die komplemetären Sequenzen erkannt und wird von einem Enzym, dass von den Wiederholungssequenzen rekrutiert wird, zerschnitten - bei Bakterien: erworbene Immunität gegen Viren - bei Mensch und Tier/Eukaryoten: gezieltes Genom editing Genome Editing: - unterliegt seit 2018 dem Gentechnikgesetz - Eingriffe in die Keimbahn nicht erlaubt - Einsatzbereich: Behandlung von Krankheiten die auf somatische Zellen beschränkt sind - Synthese einer Guide DNA -\> Guide RNA findet Ziel DNA -\> Cas9 Proteine schneiden DNA - Ergebnis: Reperatursystem der Eukaryoten nicht gut genug zum flicken, Leseraster wird verschoben, Translation stoppt -\> Bsp.: Expression von einem Protein unterdrücken **[Mikroorganismen:]** - Ideale Vorraussetzungen für die Erforschung ws. Fragen in der Molekularbiolgie: - -\> sehr klein, vermehren sich schnell, Genom lässt sich manipulieren, leicht zu kultivieren **[Klonieren:]** **Klon:** genetisch identische Tochterzelle 1. **Ligation:** DNA Fragment (aus Genom des Menschen z.B.) wird in ein Plasmid eingefügt wodurch viele kleine DNA Ringe entstehen, welche notwendig sind, da lineare DNA von Bakterien sehr schnell abgebaut wird 2. **Einschleusen in die Wirtszelle:** das rekombinierte Plasmid (Name nach Zusammenfügung) wird anschließend in die Wirtszelle eingeschleust 3. **Selektion** (Bsp): Bakterienzellen haben nun ihr eigenes Genom + einzelne haben den Plasmidring aufgenommen. Durch Selektionieren wird sichergestellt, dass nichtveränderte Zellen sich nicht weiter vermehren. Klonungswirte: Escherichia Coli (Prokaryot) -\> gram-negativ - Vorteile: gut entwickelte Genetik, viele Stämme, am besten untersuchte Prokaryot - Nachteile: potenziell pathogen, Periplasma hält Proteine zurück Bacillus subtilis (Prokaryot) -\> gram-positiv - Vorteile: leicht transformierbar, nicht pathogen, schneidet natürlicherweise Proteine aus, Endosporenbildung erleichtert die Kultivierung - Nachteile: genetisch nicht stabil, Genetik weniger entwickelt als bei E. Coli Saccharomyces cerevisiae (Eukaryot: Hefe) - Vorteile: gut entwickelte Genetik, nicht pathogen, kann mRNA und Proteine prozessieren, leicht zu züchten - Nachteile: Plasmide nicht stabil, kann die meisten prokaryotischen Plasmide nicht replizieren **[Werkzeuge der Gentechnologie:]** - Spender DNA (ganzes Gen oder bestimmte Nukleotidsequenzen) - Vektor- oder Plasmid-DNA: fungieren als Genfähren für klonierte DNA - Restriktionsenzyme: Proteine die DNA schneiden können - Ligasen: Enzyme die als genetischer Kleber fungieren - DNA-Transfermethoden: Beförderung der hergestellten DNA in Organismen - Wirtsorgansimen: Bakterien/eukaryotische Zellen (Hefe) oder auch tierische Zellen Spender DNA 1: - **Restriktionsenzyme**: schneiden DNA in Stückchen -\> notwendig zum klonieren - Erkennungsfrequenz: spezifische Basenabfolge auf der DNA die von dem Restriktionsenzym erkannt wird und dann dort in der Nähe geschnitten wird - **Typ I**: schneidet die DNA an einer zufälligen Stelle weit von der Erkennungsfrequenz entfert, benötigt ATP - **Typ II:** schneidet die DNA innerhalb oder in unmittelbarer Nähe der Erkenennungsfrequenz, benötigt kein ATP - **Typ III:** schneidet die DNA etwa 20 bi 25 Basenpaare von der Erkennungsfrequenz entfernt, benötigt ATP **[Restriktionsenzyme: ]** - Restriktionsenzyme erkennen eine bestimmte Frequenz auf einem DNA-Strang, den sie genau dort durchtrennen -\> \"Genscheren\" - es gibt viele Restriktionsenzyme, von denen jedes seine spezifische Erkennungsstelle auf der DNA hat - Erkennungssequenzen der **Restriktionsdonukleasen** vom Typ II bestehen meist aus palindromischen Sequenzen vor vier, sechs oder acht Basenpaaren - **palindromische Sequenzen**: obere Strang ließt sich gleich wie der untere nur in umgekehrter Reihenfolge -\> Bsp.: 5\'-GAATTC-3\' und 3\'-CTTAAG-5\' -\> häufig bei Typ II Nomenklatur der Restriktionsenzyme: - Enzyme häufig in Bakterien identifiziert -\> daher Namensgebung - Name: Gattungsname, Artname, Stamm/Serotyo, Reihenfolge der Entdeckung - Bsp.: Escherichia Coli -\> EcoRI -\> Escherichia - coli - Stamm R - 1.Enzym - große Anzahl an Restriktionsenzymen -\> Eco RI, Bam HI, Hind III Restriktionsenzyme bei Bakterien: - bei Bakterien: Schutz vor/gegen Bakteriophagen - **Bakteriophagen:** Viren die Bakterien infizieren, indem sie ihr eigenes Erbgut in Form von DNA/RNA in die Zelle injizieren - Restriktionsenzyme=Schutzmechanismus wobei es zur spezifischen Spaltung der viralen DNA mit Restriktionsnukleoasen kommt - Bakterien schützen die eigene DNA durch Methylierung - DNA des Wirtes ist genau an den Stellen, die die Enzyme spalten, mit eine Methylgruppe (-CH3) versehen und so geschützt - **DNA-Methyltransferasen** haben das gleiche Erkennungsmerkmal wie Restrikitionsenzyme (RE), nur dass sie nicht schneiden, sondern eine Methylgruppe den Erkennungssequenzen (ES) anfügen -\> ES kann nicht mehr von RE erkannt/geschnitten werden - Konsequenz: eigene DNA ist durch das Methylierungsmuster (MM) vor dem Verdau durch eigene RE geschützt, fremde DNA ohne dieses MM kann weiterhin geschnitten werden Struktur: - Dimere -\> Zusammenlagerung zweier Enzyme - DNA befindet sich quasi in einer Rinne zwischen den Enzymen - Restriktionsenzym kann an der DNA entlang fahren bis es auf die Erkennungssequenz stößt und diese herausschneidt - Geschnitten wird nach der ersten Base der Sequenz -\> überhängende/klebrige Enden - klebrige, überhängende, sticky Enden: bei ungleichmäßigen palindormischen Sequenzen - glatte/bland Enden: bei gleichmäßig palindormischen Sequenzen  Isoschizomere: - unterschiedliche Restriktionsendonukleasen mit identischen Erkennungssequenzen - Bsp.: HindIII & HsuI -\> 5\'-A/AGCTT - Enzyme die die identische Sequenz erkennen, aber nicht an derselben Stelle schneiden und keine kompatiblen Enden haben -\> keine Ioschizomere Abschluss Klonieren: -\> linearisiert DNA Sequenz kann in Bakterien nicht vermehrt werden! -\> Restriktionsprodukt und Vektor müssen **kompatible Enden** haben! **[PCR:]** - **PCR=** Polymerase Kettenreaktion - in vitro Methode zur Vervielfältigung spezifischer DNA Sequenzen - durch PCR kann man einen definierten Bereich aus dem Chromosom unabhängig von möglichen Restriktionsschnittstellen erhalten - Ziel: Erstellung von Ziel DNA mit definierten Enden - notwendige Komponenten: DNA Template (=Spender-DNA), 3\' & 5\' Primer, DNA Polymerase, Desoxynukleotide (dNTPs), Pufferlösung, H20 **Primer:** - Oligonukleide die als Startpunkt der DNA-Polymerase dienen - 5\' Primer definiert den zu vervielfältigen Bereich am 5\' Ende - 3\' Primer definiert den zu vervielfältigen Bereich am 3\' Ende -\> DNA Sequenzen der Primer komplementär zueinander - Kriterien für die Primer Wahl: 18-30 Nukleotide lang, gleichmäßige Verteilung der Nukleotide, Base G/C am 3\' Ende, keine Hairpin-loops (komplementäre Rückfaltung), ausgeschlossene Primer-Dimer Bildung, Schmelztemperatur zwischen 65°-70° - Schmelztemperatur bei G & C Nukleotiden stärker als bei A & T da 3 HBBs stabilisiert DNA Polymerase: - muss hohe Temperatur tolerieren - ursprünglich aus Bakterien isoliert die in heißen Quellen identifiziert wurden Schritte der PCR: 1. Denaturierung (95°): Trennung der DNA Doppelhelix in 2 Einzelstränge 2. Hybridisierung (54-63°): Primer binden an Einzelstränge wo komplementär 3. Polymerisierung (72°): DNA Polymerase bindet dNTP an das 3\' Ende der DNA **PCR-Zyklus 1:** 1. Denaturierung der DNA: Doppelhelix wird getrennt 2. \"Annealing\"/Hybridisierung der Primer: Primer binden an komplementäre Sequenzen 3. Elongierung: DNA Polymerase binet an das 3\'-OH Ende die Nukleotide die komplementär zu den Einzelsträngen sind -\> Endprodukt noch nicht erreicht, da anstatt eines kompakten doppelsträngigen Fragments 2 lange doppelsträngige Produkte entstanden sind die zudem auch einzelsträngige Teile haben **PCR-Zyklus 2:** 1. Ergebnis der Elongierung aus dem 1 Zyklus wird erneut denaturiert indem die Doppelstränge wieder aufgeschmolzen werden 2. Primer können bei Annealing Temperatur wieder anlagern 3. in der Verlängerungsphase kann die DNA Polymerase in 5\'-3\' Richtung wieder Nukleotide anfügen, sodass die DNA Stränge zu einer Doppelstrang DNA aufgefüllt werden -\> Produkte nach dem 2.Zyklus immer noch nicht die Zielprodukte **PCR-Zyklus 3:** 2 Fragmente die begehrte Zielstruktur **PCR-Zyklus 4:** 8 Fragmente die begehrte Zielstruktur **PCR-Zyklus 5:** 22 Fragmente die begehrte Zielstruktur -\> Amplification Graph zeigt Wachstum: nach 3 Zyklus linear und ident Nachweis & Effizienz: - Gelelektrophorese: Bestimmung der Größe der PCR Fragmente - Hilfsmittel: DNA Gel (poröse Substanz) aus Aquarose, Marker, elektrisches Feld - In porösem Gel trennen sich DNA Fragmente der Größe nach auf -\> große Fragmente bewegen sich langsamer, kleine schneller - PCR Fragmente haben eine kalkulierbare Größe aufgrund DNA Sequenz und Primer - Puffer leitet den Strom durch das Feld Ablauf: Im Gel sind kleine Taschen ausgespart wo man die DNA Proben aufträgt. Dann schließt man einen Strom an und da DNA negativ geladen ist (aufgrund der Phosphatreste), wird sich die DNA in einem elektrischen Feld in Richtung positiver Elektrode bewegen. Je nach Größe wird die DNA an einer bestimmten Stelle dann aufgetrennt. Nach dem Gellauf wird das Gel mit speziellen Komponenten (wie z.B.: Titium bromit) behandelt, die in die DNA interkalieren und fluoreszieren können. Nach dem Baden in der Komponente kommt das Gel auf einen UV Tisch wodurch die Fluoreszenz angeregt wird und die DNA Fragmente sichtbar werden. Anhand des Markers kann man die Größe abschätzen. Klonieren mit PCR: - Regel des Klonierens: kompatible Enden! - Über die PCR Reaktion kann man Restriktionsschnittstellen einfügen, die dann erlauben, dass man das man das PCR Fragment einfügen kann 1. Beim Einfügen von zusätzlichen Restriktionsschnittstellen wird der DNA Doppelstrang aufgeschmolzen 2. An das 5\' Ende wird die Nukleotidsequenz der zusätzlichen Schnittstelle angesetzt. 3. Anschließend wird die PCR Reaktion durchgeführt, wobei die Primer Sequenz schön an die komplementäre Sequenz in dem Einzelstrang bindet. Die zusätzliche Schnittstelle liegt dabei noch frei und ungepaart in der Lösung vor. 4. Ab dem 3 Zyklus gibt es dann zum ersten mal das PCR Amplikat mit der Schnittstelle 5. Das Ergebnis wird über die PCR Reaktion vermehrt und anschließend in den Vektor hineinkloniert Klonieren eines Gens: - Wenn man über PCR keine zusätzliche Schnittstelle für Restriktionsenzyme einfügen möchte, kann man eine \"TA\"- Zwischenklonierung einführen - PCR Fragment wird über PCR erzeugt und die Taq Polymerase fügt ein A an das 3\' Ende -\> man erhält einen käuflich erwerblichen Vektor der ein überhängendes t hat und damit kompatible Enden - Fragment kann wieder herausgeschnitten und in eigentlichen Zielvektor eingesetzt wereden - mithilfe der **Ligase** wird die Lücke des DNA Strangs geschlossen **[Plasmide:]** - sehr kleine ringförmige DNA-Moleküle die in Bakterienzellen vorkommen können - Plasmide replizieren sich unabhängig von der Haupt-DNA durch eine bestimmte Nukleotidsequenz - In der Gentechnologie tragen die Plasmide häufig Resistenzgene - geeignetes Tool für die Gentechnologie Plasmidarten: - Resistenz (R) Plasmid: enthalten Resistenzgene gegen Antibiotika/Gifte - Fruchtbarkeits (F) Plasmid: enthalten nur transfer (tra) Gene -\> Aufgabe: Einleitung der Konjugation - Klonierungsplasmid: dienen zur Ligation von neuen Sequenzen und deren Vermehrung - Expressionsplasmid: sind für die Expression der neuen Sequenz optimiert **Klonierungsplasmid:** - ORI (Origin of replication)= Replikationsursprung: markiert den Ort für den Start der Replikation -\> spezifische Sequenz von Nukleotiden - Selektionsmarker: ermöglicht die Selektion von Zellen, in der die rekombinierte DNA vorkommt -\> Transformanten - MCS (=Multiple Cloning Site)/ Polylinker: Stelle die viele Restriktionsenzym-Erkennungsfrequenzen enthält **[Bildung eines rekombinierten Vektors:]** (Bsp. anhand EcoRI) 1. Die entstehende DNA hat klebrige Enden/typischen Überhänge für EcoRI 2. DNA wird durch EcoRI an den Pfeilen aufgeschnitten 3. Das Gen wird in das Plasmid integriert und durch die Ligase verbunden 4. Ergebnis ist ein neuer rekombinierter Strang um ein DNA Plasmid **[Genetischer Austausch bei Prokaryoten:]** 1. Transformation: Aufnahme freier DNA 2. Transduktion: Übertragung von Genen durch einen Virus (z.B.: Bakteriophagen) von einer Zelle zu einer anderen 3. Konjugation: Genübertragung von einer Bakterienzelle zu einer anderen durch einen Mechanismus, an dem Zellkontakte und Plasmide mitwirken 1\. Transformation: - DNA liegt als ein großes Einzelstück vor - wenn Zelle lysiert wird, läuft die DNA aus und kann dabei brechen - DNA kann leicht von anderen, kompetenten Bakterien aufgenommen werden -\> kompetent: Zelle die DNA aufnehmen kann (chemisch kompetent machen geht auch) **Griffiths Experiment** mit Pneumococcus (Erreger einer tödlichen Lungenentzündung) -\> lebende Zelle notwendig für Infektion! - **Lebende glatte S-Zellen** umgeben von Schleimkapsel: töten Mäuse, weil Immunzellen Bakterien mit Kapseln nicht erkennen können - **Durch Hitze abgetötete S-Zellen**: töten nicht - **Lebende raue R- Zellen** ohne Kapseln & nicht pathogen: töten nicht - **Kombination aus lebenden R-Zellen und toten S-Zellen** tötet Mäuse: lebenden S-Typ-Zellen können aus den Tieren isoliert werden. Aus den S-Zellen wird die DNA, die die Kapselbindung kodiert freigesetzt und von den R-Zellen aufgenommen, wodurch sie zu S-Typzellen transformiert werden **Transformation** chemisch kompetenter Bakterien: 1. Kompetente E. coli auf Eis auftauen 2. Zugabe der DNA 3. Inkubation auf Eis für 30 min 4. Hitzeschock für ca. 60 sec bei 37°-42° 5. Zugabe von Medium 6. Kultivierung für 30 min bei 37° 7. Ausplattierung auf Selektionsplatten -\> nur Bakterien die das Plasmid mit der Antibiotikaresistenz gegen Ampicillin aufgenommen haben, können wachsen - Vorraussetzung um genetischen Austausch nachzuweisen: Merkmalunterschieden (Bsp.: Ampicillin Resistenz) - Nachweis, dass das Plasmid auch wirklich das Insert trägt: Blau-Weiß-Klonierung -\> wenn nicht aufgenommen: Farbumschlag durch Enzym LacZ nach blau -\> wenn aufgenommen: hohe Anzahl an Kolonien ohne Farbumschlag nach blau Blau-Weiß Selektion: Das Operon Modell: - Funktionseinheit auf der DNA von Prokaryoten - Modell zur Regulation der Genexpression - Kodiert für Proteine, die den Abbau von Laktose gebraucht werden (sofern Laktose vorhanden ist) Das Lac-Operon: - Bestandteile: Promotor, Operator, 3 Strukturgene (lacZ/lacY/lacA), Terminator - Promotor: wenn aktiv kann er eine polycistronische RNA produzieren, die die Strukturproteine ablesen kann - lacZ codiert für eine β-Galactosidase: Enzym wichtig für Spaltung von Lactose - lacY codiert für eine Permease die für die Aufnahme von Lactose in die Bakterienzelle verantwortlich ist - lacA codier für eine β-Galactosid-Transacetylase - vor dem Lac-Operon: Repressor der von lacI exprimiert wird - wenn keine Laktose vorhanden ist, wird der Repressor von seinem eigenen Promotor expremiert, bindet an den Operator von von dem Lac-Operon und damit kann die Polymerase vom Promotor an nicht mehr das Lac-Operon ablesen -\> Genexpression unterbrochen - wenn Lactose von Allolactose (Isomer von Lactose) aufgenommen (im Labor durch IPTG=Induktor) -\> Bindung an Repressor möglich -\> Repressor ändert Konformation und fällt von Operator ab -\> Genexpression kann fortgeführt werden -\> lacZ Expression - Nachweis durch Blau-Weiß Selektion: wenn X-Gal in Medium eingearbeitet kann unter Sauerstoff Zufuhr das LacZ X-Gal spalten -\> Bildung eines blauen Farbstoffs - Wenn nur MCS -\> blaue Kolonien - Wenn Insert in MCS hineinklodiert: LacZ unterbunden -\> farblose Kolonien 2\. Transduktion: - Übertragung von Bakterien-DNA durch einen virulenten Bakteriophagen - Bei der Phagenvermehrung in der Bakterienzelle kann es zufällig passieren, dass in einen Phagen ein Stück der Bakterien-DNA eingebaut wird - Infektion entweder frei im Cytoplasma der Zelle oder im Genom - **lysogener Zyklus:** Weiterverbung des infiszierten Genoms (Bakteriophag in Genom eingebaut) an die Tochterzellen - **lytischer Zyklus:** infiszierte Zelle vermehrt sich, DNA+Genmaterial fragmentiert, Bakteriophagen können weiter Zellen infiszieren +Genmaterial - **Induktion:** Prophag wird aktiviert und aus dem Genom herausgeschnitten -\> fragmentierte Bakterien-DNA-\> Freisetzung der Bakteriophagen -\> Infektion anderer Zellen 3\. Konjugation: - Ausbildung von Plasmabrücken zwischen 2 Zellen und die darauffolgende Übertragung von DNA als Träger von Erbinformation - Über Fertilitäts (F) Pili/Sexpili verbinden sich zwei Bakterienzellen und können so DNA-Stränge von der Spenderzelle zur Empfängerzelle übertragen -\> Übertragung des F-Faktors/Fertilitätsplasmids (wenn enthalten=F+männlich, wenn nciht dann F-weiblich) **Varianten:** - Transfer erfolgt gerichtet vom fertilen Bakterium zum nichtfertilen -\> entscheidend ist der Fertilitäsfaktor - Fertile Bakterien haben entweder ein Fertilitätsplasmid (F+), besitzen ein Fertilitätsplasmid mit zusätzlichen Genen (F\') oder haben den Fertilitätsfaktor (Hfr-Stamm) in ihrem Genom integriert Aufbau F-Plasmid: