Gentechnik und CRISPR/Cas9 Methoden

Gentechnik

• Anwendung moderner molekularbiologischer Methoden zur Änderung genetischer Eigenschaften von Organismen.
• "Rekombinante DNA-Technologie" ermöglicht gezielte Änderung, Rekombination oder Neukombination von Erbinformation.

Bereiche der Gentechnik

• Herstellung von Proteinen (z.B. Antikörper) für medizinische und technische Anwendungen.
• Herstellung von transgenen Pflanzen und Tieren (z.B. veränderte Sojaprodukte).
• Gendiagnostik.
• Somatische Gentherapie.
• CRISPR/Cas9 (seit 2018): gezielte Veränderung des Genoms in Tier und Mensch.

CRISPR/Cas

• Virus-DNA wird in Bakterienzellen zerschnitten und in spezielle Bereiche des Bakteriengenoms integriert.
• Bei erneuter Infektion erkennen Bakterien das Virus und produzieren pre-cRNA.
• pre-cRNA wird zu kurzen RNA-Stücken zerschnitten, welche Informationen zu viraler DNA und Wiederholungssequenzen enthalten.
• Wenn virale DNA erneut in die Zelle eindringt, wird sie durch das komplementäre Stück der cRNA erkannt und zerschnitten.
• Bakterien verwenden diesen Mechanismus für erworbene Immunität, und Menschen nutzen ihn für gezieltes Genom-Editing.

Genome Editing

• Eingriffe in die Keimbahn sind seit 2018 verboten.
• Einsatzbereich: Behandlung von Krankheiten, die sich auf somatische Zellen beschränken.
• Synthese einer Guide-RNA, die das Ziel-Genom findet und CRISPR/Cas9 zum Schneiden der DNA an der Zielstelle verwendet.

Mikroorganismen

• Ideale Modelle zur Forschung in der Molekularbiologie: klein, schnelle Vermehrung, leicht manipulierbares Genom, leicht kultivierbar.

Klonieren

• Klon: genetisch identische Kopie einer Zelle oder eines Organismus.
• Ligation: Einfügen von DNA-Fragmenten in ein Plasmid.
• Einschleusen in die Wirtszelle: Einführen des modifizierten Plasmids in eine Wirtszelle.
• Selektion: Isolierung der Zellen, die das Plasmid aufgenommen haben.

Klonungswirte

• Escherichia coli (Prokaryot), gram-negativ: gut untersuchte Genetik, viele Stämme. Nachteile: potentiell pathogen, Periplasma.
• Bacillus subtilis (Prokaryot), gram-positiv: leicht transformierbar, nicht pathogen, erleichterte Kultivierung, Nachteile: genetisch weniger stabil.
• Saccharomyces cerevisiae (Hefe, Eukaryot): gut entwickelte Genetik, nicht pathogen, leicht zu kultivieren. Nachteile: Plasmide weniger stabil.

Werkzeuge der Gentechnologie

• Spender-DNA: DNA-Sequenz, die kloniert werden soll
• Vektor-/Plasmid-DNA: Transportmittel für DNA-Fragmente
• Restriktionsenzyme: schneiden DNA an bestimmten Stellen
• DNA-Ligasen: verbinden DNA-Fragmente
• DNA-Transfermethoden: Einführen der DNA in Wirtszellen

Restriktionsenzyme

• Erkennen spezifische DNA-Sequenzen (Erkennungsfrequenz).
• Schneiden DNA an diesen Stellen.
• Typ I, II und III: unterscheiden sich in der Position zum Erkennungsort, Notwendigkeit von ATP bei den Typen I und III.
• Palindromische Sequenzen: Sequenzen, die identisch in beide Richtungen gelesen werden.

PCR (Polymerase-Kettenreaktion)

• Verfahren zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen "in vitro".
• Benötigte Bestandteile: DNA-Template, Primer, DNA-Polymerase, Desoxynukleotide (dNTPs), Pufferlösung.
• Schritte: Denaturierung, Hybridisierung, Polymerisierung.
• Nachweis und Effizienz: Gelelektrophorese zur Bestimmung der Größe der PCR-Produkte.

PCR-Fragmente

• Nach drei PCR-Zyklen linearer und identischer Amplifikation.
• Gelelektrophorese erlaubt Bestimmung der Größe und Effizienz der PCR Produkt-Amplifikation.
• PCR-Fragmente müssen passende Enden für den Einbau in einen Vektor/Plasmid haben.

Plasmide

• Kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die in Bakterien vorkommen.
• Können unabhängig von der Haupt-DNA replizieren.
• Häufig enthalten Resistenzgene.
• Können in der Gentechnik als Vektoren verwendet werden.
• Können für die Herstellung eines rekombinierten Vektors verwendet werden.
• Aufbau eines typischen F-Plasmids, mit zentralen Tra Region, OriT sowie Gene der Replikation.

Klonierungsplasmide

• Enthalten eine Origin of Replication (Ort der Replikation des Plasmids).
• Selektionsmarker (z.B. Antibiotikaresistenz) erleichtern die Auswahl der transformierten Zellen.
• Multiple Cloning Site (MCS): enthält viele Restriktionsschnittstellen.

Genetischer Austausch in Prokaryoten

• Transformation: Aufnahme von freier DNA durch die Bakterienzelle.
• Transduktion: Übertragung von DNA durch Viren (Bakteriophagen).
• Konjugation: Übertragung von DNA zwischen zwei Bakterienzellen über Plasmabrücken; wichtig bei der Übertragung von Fertilitätsfaktoren.

Transformation

• Einbringen von fremder DNA in eine kompetente Zelle.
• Chemische oder physikalische Methoden (z.B. Elektroporation) können Zellen kompetent machen.
• Kompetenz: Fähigkeit einer Zelle, fremde DNA aufzunehmen.
• Griffiths-Experiment: Demonstration der Transformation mit Pneumokokken.

Weitere Methoden

• PCR
• Plasmidtypen
• Aufbau eines F-Plasmids
• Genetischer Austausch in der Zusammenfassung