Histología Unidad I-2-57 PDF

¿Por qué Histología? La histología es la ciencia que se encarga del estudio morfológico y funcional de la célula y su agrupación en tejidos y órganos. Su estudio se ubica en el primer año de la carrera ya que los conocimientos aquí adquiridos son importantes para la comprensión de la bioquímica y la...

¿Por qué Histología? La histología es la ciencia que se encarga del estudio morfológico y funcional de la célula y su agrupación en tejidos y órganos. Su estudio se ubica en el primer año de la carrera ya que los conocimientos aquí adquiridos son importantes para la comprensión de la bioquímica y la fisiología, bases fundamentales de la fisiopatología. Además es necesario aprender “lo normal” para poder comprender los cambios en el estado patológico. Fíjate durante este primer año nos vamos a enfocar en el aprendizaje de lo “normal”… Anatomía macro y microscópica: en la primera con la ayuda de la pinza, tijera y bisturí descubrirás el maravilloso mundo macroscópico de nuestro cuerpo y en la segunda, HisTOloGía, aprenderemos el no menos fascinante mundo microscópico. Para poder alcanzar nuestra meta, debemos primero conocer los instrumentos necesarios para la observación: el microscopio y en segundo lugar aprender la metodología empleada para poder procesar los tejidos de manera que puedan ser estudiados con el microscopio, la Técnica Histológica. Nuestra primera clase estará dedicada a conocer los principios de la Microscopía y la Técnica Histológica. Nota: Es importante que para tu clase práctica adquieras un lápiz bicolor, o un color rosado y uno morado, así podrás realizar tus actividades adecuadamente. APRENDIENDO A USAR EL MICROSCOPIO. Aun cuando sabemos que no es tu primer contacto con un microscopio, ya que durante tus estudios o quizás en alguna navidad te regalaron un pequeño microscopio que anunciaba tu inquietud por la medicina, es importante, que en este momento, aprendas los principios básicos de su funcionamiento y adquieras destrezas en su manejo, debido a que es fundamental en el aprendizaje de la histología y lo volverás a utilizar durante tu carrera en otras asignaturas, tales como: microbiología, parasitología, medicina tropical, anatomía patológica. En el ejercicio de la medicina es un instrumento de apoyo fundamental para el especialista en anatomía patológica, el ginecólogo, el hematólogo permitiendo un diagnóstico preciso de trastornos infecciosos, neoplásicos, degenerativos, etc. El objetivo principal de esta primera clase es conocer las características generales, usos y cuidados del microscopio de manera de lograr adquirir las destrezas necesarias para su buen uso. La cátedra de Histología en su búsqueda de la excelencia cuenta, para el uso de los estudiantes, con microscopios binoculares, de reciente adquisición. Es importante que comprendan que del cuidado y buen manejo que cada uno de nosotros haga con los microscopios, dependerá que muchas generaciones puedan gozar de este privilegio. LA CÁTEDRA CUENTA CON USTEDES PARA EL CUIDADO DE NUESTRA UNIVERSIDAD… LA CASA QUE VENCE LAS SOMBRAS. BIENVENIDOS. “Pensar y obrar, obrar y pensar es la suma de toda sabiduría.” -J. W. Goethe 2 EL MICROSCOPIO. “En su afán de llegar siempre más lejos en la investigación de la naturaleza de lo que los límites de los órganos sensoriales le imponen, el hombre ha construido múltiples instrumentos que le han permitido acceder allí donde los sentidos no podían penetrar. Así como el telescopio abrió a la humanidad las puertas de lo infinitamente grande, el microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones ínfimas, entre ellos la célula, base de la vida.” (Enciclopedia Hispánica) “Los microscopios son aparatos, que en virtud de las leyes de formación de imágenes ópticas, aumentadas a través de lentes convergentes, permiten la observación de pequeños detalles de una muestra dada que a simple vista no se percibiría”. (Enciclopedia Hispánica. Tomo 10 pág. 127-128) El término microscopio deriva etimológicamente del griego mikrós (pequeño) y skoopéo (observar). En la actualidad existen diferentes tipos de microscopios, herramientas de trabajo no sólo en el campo del médico y el biólogo, sino de numerosas áreas como la del criminalista, geólogo, en la metalurgia entre otros. El microscopio es un instrumento que proporciona imágenes amplificadas y detalladas de estructuras que no pueden ser observadas a simple vista. Los microscopios se clasifican de acuerdo a la fuente de luz en 1. Microscopio óptico o de luz. 2. Microscopio electrónico. 3. Microscopio de Efecto Túnel. 4. Microscopio de Fuerza Atómica. El MICROSCOPIO ÓPTICO (fotónico o de luz) se clasifica según el número de lentes que posea en:  SIMPLES: constituidos por una sola lente.  COMPUESTOS: constituidos por dos o más lentes. El microscopio óptico compuesto se clasifica en: a. Campo claro. b. Campo oscuro. c. Contraste de fases. d. Fluorescencia. e. Luz polarizada. f. Confocal de barrido a) MICROSCOPIO COMPUESTO DE LUZ (CAMPO CLARO). Es el instrumento que utilizaremos a lo largo de este curso de histología por lo que debemos conocer en detalle sus partes y el funcionamiento de cada una de ellas. Se le denomina de campo claro porque la luz que debe llegar hasta los oculares debe ser totalmente neutra por lo que el campo debe ser blanco. Hace su aparición a principios del siglo XVII en Europa, aunque con exactitud no se sabe quién fue su inventor. Consta de una serie de lentes ordenadas para lograr el máximo aumento al tiempo que se mantiene el poder de resolución. Consta de una PARTE MECÁNICA que brinda un soporte adecuado a los diferentes elementos ópticos y a la preparación que se examina, y una PARTE ÓPTICA encargada de la iluminación y el aumento 3 PARTE MECÁNICA:  PIE: constituye el soporte del instrumento, debe ser sólido y pesado para asegurar su estabilidad.  LA COLUMNA: consiste en un vástago vertical que parte del pie. Sus funciones son relacionarse con el tubo, la platina y portar los mecanismos para el enfoque (Tornillo macrométrico y micrométrico).  TUBO: es un cilindro metálico, que se ubica en el extremo superior de la columna, cuyo interior se encuentra pintado de negro para evitar la reflexión de la luz. Su función es servir de sustentación al ocular y a los objetivos del microscopio, en sus extremos superior e inferior respectivamente. En su parte inferior existe una pieza llamada revolver en la cual se enroscan los diferentes objetivos.  REVOLVER: consiste en una pieza circular, que se encuentra en el extremo inferior del tubo, la cual posee por una de sus caras 3 a 4 orificios donde se enroscan los diferentes objetivos. Está dotado de un sistema que le permite girar sobre su propio eje y así poder seleccionar el objetivo con el cual queremos observar.  MECANISMOS PARA EL ENFOQUE: son tornillos que permiten el desplazamiento con precisión de la muestra o del tubo, para lograr el enfoque correcto de la preparación. “Manejan el enfoque bien sea por el movimiento vertical de la platina o del tubo, según el tipo de microscopio.” Se encuentran ubicados en las caras laterales de la columna. Existen dos tipos de tornillos:  Macrométrico: destinado a realizar movimientos rápidos, para buscar un punto aproximado al enfoque.  Micrométrico: realiza movimientos lentos, para obtener un enfoque exacto. Cuando se utilizan objetivos de pequeño aumento es posible enfocar bien una preparación utilizando sólo el tornillo macrométrico; pero cuando se emplean objetivos de gran aumento (40X, 100X), el uso del tornillo micrométrico es indispensable.  PLATINA: es una pieza plana, generalmente cuadrada, con un orificio central que permite el paso de la luz. Por uno de sus bordes está conectada con la columna; sobre ella descansa la preparación a examinar. Está provisto de dos tornillos que permiten movimientos laterales y verticales de la preparación.  FIG. N° 1. MICROSCOPIO COMPUESTO DE LUZ: SE SEÑALAN LOS ELEMENTOS QUE CONSTITUYEN SU PARTE MECÁNICA. PARTE ÓPTICA. Consta de una parte óptica de observación: ocular y objetivos y una óptica de iluminación: condensador y la fuente de luz SISTEMA ÓPTICO DE OBSERVACIÓN: 1. OCULAR: Es un cilindro hueco metálico corto, que se encuentra enroscado en el extremo superior del tubo del microscopio. Presenta en cada extremo un lente convergente, y entre ambos existe un diafragma. La lente superior se denomina lente ocular y la inferior lente colectora. Su función es aumentar la imagen real e invertida dada por el objetivo, sin agregar resolución a la imagen. La imagen formada es virtual, derecha y aumentada. 4 Generalmente la imagen formada esta aumentada 10 veces, ya que la mayoría de los oculares tienen un aumento de 10X. En el ocular se puede observar la siguiente información: aumento expresado por un número seguido de la letra “X”. Por lo general es 10X. A continuación hay una diagonal seguida de un número. En el caso del ejemplo es 18. 10X/18 Con estos datos más el aumento del objetivo podemos calcular el campo visual: dividimos el valor colocado después de la diagonal en el ocular entre la amplificación del objetivo. Si el objetivo es de 100X, en nuestro ejemplo seria 18/100= 0.18 mm. 2. OBJETIVOS: es la parte esencial del microscopio. Consta de varias lentes, montadas en un tubo metálico. La primera de estas lentes se le denomina: Lente Frontal. La función de los objetivos es formar la primera imagen amplificada del objeto de observación y de ellos depende la resolución. Los objetivos poseen varios datos de gran utilidad en su parte externa:  Numero de aumento: nos indica la amplificación que tiene la imagen formada por el objetivo. Generalmente son de 4X, 10x, 40X y 100X.  Abertura numérica: es una cifra que alude a la capacidad de la lente frontal del objetivo (primera lente) para captar una determinada cantidad de rayos luminosos. De ella depende la resolución de la imagen. A mayor cantidad de rayos difractados y captados por el objetivo, mayor será la cantidad de rayos que contribuyen a formar una imagen precisa. “Para formar la imagen es indispensable la captación de rayos difractados por la lente frontal del objetivo”. Se encuentra grabada en la manga del lente, siendo de 0,30 para el objetivo de 10X, de 0,65 para el de 40X y de 1,30 para el de 100X.  Poder de resolución: es la capacidad del ojo o de un sistema óptico para diferenciar o individualizar dos puntos o estructuras que se encuentran muy cercanas entre sí. Esta capacidad tiene un límite de resolución, que se define como la distancia mínima de separación que puede existir entre dos puntos o estructuras para que el sistema óptico los aprecie como entidades diferenciadas. El límite de resolución del ojo es de aproximadamente 0,08 mm por lo cual puede identificar estructuras no menores de 100 m de diámetro. A mayor resolución mejor definición de la imagen, mayor número de detalles, y por tanto, mejor calidad. Una forma sencilla de calcular el límite de resolución del objetivo empleado es: LR= k x lambda/AN. donde K es una constante cuyo valor es 0,61; lambda es la longitud de onda de la luz empleada (para el caso de la luz blanca es de 500nm (0,55) que representa un promedio 5 de todas las longitudes de onda que integran la luz blanca) y AN es la abertura numérica del objetivo empleado. Un sistema tiene un mayor poder de resolución cuanto menor sea la cifra del límite de resolución. Esto guarda una relación inversa con la abertura numérica: a mayor abertura numérica mejor será la resolución. Por otra parte la resolución depende de varios factores, entre ellos, longitud de onda de la luz, espesor de la muestra, calidad de la fijación e intensidad de la coloración. El límite de resolución de los mejores microscopios de luz es de 0,25 m.  Distancia mecánica: es una cifra expresada en milímetros que señala la longitud máxima que puede tener el tubo del microscopio en el que se utiliza el objetivo.  Espesor del cubreobjetos: indica en milímetros el espesor máximo del cubreobjetos que debe usarse en la preparación.  Medio de inmersión: Es la sustancia que debe usarse al emplear el objetivo y que se coloca entre éste y la muestra. El medio de inmersión mejora la captación de los rayos luminosos por la lente frontal del objetivo y por lo tanto la resolución de la imagen. Tenemos objetivos secos, que son aquellos que no ameritan de medio de inmersión. Objetivos húmedos, aquellos que necesitan de un medio de inmersión para lograr el enfoque OBJETIVO SECO AUMENTO 40X. O, 65 APERTURA NUMÉRICA. 160: DISTANCIA DE TRABAJO DEL OBJETIVO (LONGITUD DEL TUBO) 0.17 ESPESOR DEL CUBREOBJETO SABIAS QUE… Las lentes de los microscopios están dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Los M/O actuales tiene un poder de resolución de 0,2 µm, unas mil veces la del ojo humano. Recuerdas ¿Cuál es el límite de resolución del ojo humano? SISTEMA ÓPTICO DE ILUMINACIÓN: a. CONDENSADOR: se encuentra intercalado entre la luz y la platina. Es un tubo metálico corto, que posee un sistema de lentes convergentes que al ser atravesados por los rayos de luz, concentran y proyectan un amplio cono de luz sobre la muestra. Esto permite que incidan en el preparado una mayor cantidad de rayos luminosos y que se genere una adecuada iluminación sobre la misma. Generalmente está provisto de un diafragma el cual regula la intensidad de la iluminación que recibe el preparado. 6 b. FUENTE DE LUZ (FOCO): esta puede ser natural proyectada a través de un espejo. En el microscopio que utilizaremos la luz está incorporada en el pie del microscopio y está constituida por una bombilla de halógeno de 6 volt. y 20 watt. El sistema de encendido se encuentra a la derecha del microscopio en la columna y está provisto, en el lado izquierdo de la base, de una rosca que permite regular la cantidad de luz. FIG. N° 2. MICROSCOPIO COMPUESTO DE LUZ: SISTEMA ÓPTICO DE OBSERVACIÓN Y DE ILUMINACIÓN En el mecanismo del microscopio compuesto, la luz emitida por la fuente es enfocada desde abajo hacia la muestra a través del condensador. La luz que atraviesa la muestra es recogida por una de las lentes objetivo que se encuentran enroscadas en el revólver, donde es posible elegir el aumento con el cual queremos observar nuestro preparado (lupa, 10X, 40X o 100X). La luz recogida por el objetivo es proyectada en el ocular, el cual amplifica la imagen generalmente 10 veces (suele ser el aumento de la mayoría de los oculares) para obtener un aumento final de 40, 100, 400 o 1000 de la imagen que podrá ver la retina. SABÍAS QUE…Lo que determina la riqueza del detalle de la imagen provista por un sistema óptico es su límite de resolución y no su poder de aumentar el tamaño de los objetos. El límite de resolución depende de la abertura numérica (AN) del objetivo y de la longitud de onda de la luz utilizada. El aumento total del microscopio es igual al producto del aumento dado por el ocular y el objetivo que se estén usando. Del objetivo depende la resolución y el ocular aumenta la imagen dada por el objetivo. Algunas recomendaciones  Gradúe la altura de su asiento de tal manera que pueda sentarse cómodamente frente al microscopio.  Al inicio de la observación comience siempre por el objetivo de menor aumento.  El condensador debe estar alto y el diafragma abierto.  Coloque el preparado sobre la platina con el cubre objetos hacia arriba.  Enfoque con el macrométrico. Si es necesario utilice luego el micrométrico.  Acostúmbrese a observar con los dos ojos. 7  Si desea observar una porción en particular del preparado con mayor aumento, coloque en el centro del campo microscópico lo que se desea observar a mayor aumento. Luego proceda a cambiar el objetivo y enfocar. b) MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO. El microscopio de campo oscuro es una modificación al sistema de campo claro, que consiste en bloquear los rayos centrales que alcanzan al condensador, por medio de un disco o algún otro tipo de dispositivo, de manera tal que el cono iluminador es un “cono hueco de luz”, con mayor abertura numérica que la del objetivo. Esta forma de iluminación permite que sólo aquellos rayos que han sido desviados por la muestra observada, sean captados por el objetivo. Es decir la imagen microscópica está formada en este caso sólo por rayos difractados. “El efecto es similar al que producen las partículas de polvo en el haz luminoso de un proyector de diapositivas cuando la habitación está oscura. La luz reflejada por las partículas de polvo alcanzan la retina del ojo y eso permite verlas como puntos brillantes.” Este tipo de microscopio utiliza luz con la misma longitud de onda que el de campo claro por lo que tienen la misma resolución pero debido al mayor contraste que se obtiene en el campo oscuro, en éste pueden detectarse partículas más pequeñas. Es como si en una habitación oscura entra un pequeño haz de luz por la rendija de una ventana y, en el fondo oscuro de la habitación, se iluminan las partículas de polvo que flotan en el aire. Lo que en un principio era invisible se vuelve visible. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin procesarla. También es utilizado en la evaluación de muestras metalográficas para la observación de detalles en superficies con alta reflectancia. En la práctica clínica es útil para la detección de cristales en la orina (oxalato o ácido úrico) y para la identificación de espiroquetas, en particular Treponema pallidum (agente causal de la sífilis). c) MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES. Para poder observar una célula o tejido al microscopio de campo claro convencional hay que fijarla y hacerle una tinción, lo que implica, la muerte de la célula en cuestión. Esto siempre ha sido una preocupación para los expertos en el campo del estudio celular, debido que al pasar por todos estos procesos, algunas estructuras pueden dañarse o cambiar su forma. Para esto se utiliza el microscopio de contraste de fase (entre otros métodos más modernos), que permiten realizar exámenes inmediatos y observar células vivas. Su inventor fue el físico neerlandés Frits Zernike que junto al método de contraste de fases le valió para ganar el Premio Nobel de Física en 1953. Se basa fundamentalmente en el retraso que se produce en las ondas de luz al atravesar objetos de distintos índices de refracción, aprovechando y amplificando dichos retrasos. Fundamentalmente el microscopio de contraste de fase es un microscopio óptico de campo claro al que se le incorporan un par de anillos de fase que trabajan de manera complementaria. La manera de funcionar es la siguiente: Por medio del condensador, se logran separar los rayos luminosos que no son difractados por el objeto de los que no lo hacen. Al pasar por la muestra, los rayos que atraviesan objetos más densos, experimentan un retraso de un cuarto de lambda, y al pasar por el anillo de fase estos rayos, debido a la forma del anillo de fase, estas ondas se retrasan un cuarto de lambda más, en cambio, las que no se han retrasado, pasan por una parte más delgada del anillo de fase y no se siguen retrasando. Entonces estos desfases de las ondas luminosas se perciben como diferencias 8 en el contraste, en distintos tonos de gris. Además el anillo de fase disminuye la intensidad de la luz. La eficiencia de este sistema óptico se alcanza con luz verde cromática Aplicaciones. El microscopio de contraste de fase, debido a sus propiedades, se utiliza para exámenes inmediatos (o in vivo), permite el examen de células y tejidos no teñidos, cultivos celulares. Cabe destacar como desventaja, el que los objetos se vean delimitados por un halo o aura brillante alrededor en el caso del contraste de fase positivo, o por una sombra en el caso del contraste negativo, defecto producido por la manera como se producen las imágenes. Dos modificaciones del microscopio de contraste de fase son el microscopio de interferencia, que permite cuantificar masa hística y el microscopio de interferencia diferencial de especial utilidad para evaluar las propiedades de la superficie de las células. d) MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA. La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia que fue observado inicialmente por Sir George Stokes en el año 1852, para luego ser explicada físicamente en el año 1935 por Alexander Jablonski. Es la propiedad que tienen ciertos elementos químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiación intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada (por ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática azul) y luego emiten otra luz de longitud de onda mayor (de un determinado color, verde, rojo, amarillo). Este microscopio hace uso de la fluorescencia y se convierte en una herramienta de inestimable valor para la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa desapercibida. Existen moléculas con fluorescencia natural como la vitamina A y algunos neurotransmisores. En general para el estudio con este método la muestra se tiñe con una sustancia fluorescente que absorbe la energía de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas más largas (verde). El marcaje selectivo de moléculas y otros compuestos celulares se realiza mediante la técnica de inmunofluorescencia, en la cual una sustancia fluorescente se une a un anticuerpo específico de la muestra que queremos estudiar. Si el anticuerpo se une al microorganismo, este microorganismo emite fluorescencia y se puede identificar. La microscopía de fluorescencia es muy útil porque la molécula fluorescente, aun cuando sea muy pequeña, puede ser observada debido a la luz que emite. Aplicaciones del microscopio de fluorescencia Son numerosas las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia, notablemente en biología y medicina Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación. Estudio de células normales y patológicas. Estudios inmunológicos. Mineralogía. e) MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA Es un microscopio de campo claro al cual se le adicionan filtros que modifican la luz. También se denomina microscopio petrográfico o metalúrgico por su uso inicial en el estudio de minerales, sin embargo su aplicación se ha extendido al campo de la biología, medicina, química y muchas otras disciplinas. Esta técnica microscópica puede emplear tanto la luz transmitida como la luz incidente (trans-iluminación y epi-iluminación respectivamente). 9 Fundamentalmente es un microscopio de campo claro al cual se le añaden dos filtros:  Polarizador: se coloca entre la fuente luminosa y la muestra  Analizador : entre el lente objetivo y el observador Se fundamenta en el hecho de que las moléculas o los conjuntos de moléculas muy bien ordenadas pueden rotar el ángulo del plano en el que vibra la luz polarizada Comparada con las otras técnicas de incremento de contraste, el uso de la luz polarizada es la más efectiva en el estudio de muestras ricas en materiales birrefringentes, puesto que mejora de manera incomparable la calidad de la imagen. La luz proveniente de una fuente estándar de iluminación vibra y se propaga en todas las direcciones, pero al pasar por un filtro polarizador las ondas y su campo eléctrico oscilan todos en un mismo plano. El polarizador es un dispositivo que solo deja pasar la luz que vibra en un plano determinado denominado eje de polarización. Muchos materiales tienen sus átomos uniformemente distribuidos en las tres direcciones principales del espacio y presentan una máxima simetría (cúbica o regular) o por el contrario, en algunos materiales sus átomos carecen de organización. Los primeros tienen las mismas propiedades ópticas, independientemente de la dirección en que se midan. Cuando la luz atraviesa sustancias con estas características, la velocidad es la misma en todas las direcciones y gracias a ello se denominan isótropos. Por el contrario, los materiales cuya organización cristalina es diferente (hexagonal, trigonal, tetragonal, rómbico, entre otras) poseen sus constituyentes dispuestos de manera asimétrica y varían según la dirección; en consecuencia el comportamiento de las ondas luminosas también es diferente, denominándose anisótropos. La estructura interna del espécimen determina su comportamiento isótropo o anisótropo. Cuando se estudia el comportamiento de la luz al atravesar un espécimen, los materiales anisótropos presentan distintos índices de refracción en relación a la dirección del haz de luz; por el contrario, los materiales isótropos presentan un índice de refracción constante. Cuando un rayo de luz incide sobre la superficie de un material anisótropo transparente se presenta el fenómeno de la doble refracción o birrefringencia; esto quiere decir que se producen dos rayos refractados distintos que vibran en planos diferentes que se propagan con diferentes velocidades en el interior del material. Este microscopio facilita la investigación de las propiedades ópticas de los especímenes y es ideal para observar y fotografiar aquellos elementos que son visibles gracias a la anisotropía, de allí su uso en cristalografía; sin embargo, también se emplea para estudiar el carácter birrefringente de muchas estructuras celulares anisótropas. En biología su principal utilidad consiste en distinguir las sustancias isotrópicas de las anisotrópicas, revelando información detallada sobre la estructura y composición de los materiales con la finalidad de caracterizarlos para fines diagnósticos. El músculo estriado y los cristaloides en las células intersticiales de Leydig del testículo, exhiben birrefringencia. Aplicaciones del microscopio de luz polarizada Identificar sustancias cristalinas o fibrosas intracelulares (como el citoesqueleto) y extracelulares (sustancia amiloide, asbesto, colágeno, cristales de uratos y otras de origen exógeno). Identificar y estimar cuantitativamente los componentes minerales. Sabías que: con el uso de lentes de sol polarizados se logra reducir el resplandor de la luz ambiental. 10 f) MICROSCOPIO CONFOCAL La microscopía confocal es una técnica relativamente nueva que está logrando excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biología, materiales, geología, etc.). Este sistema óptico combina componentes de un microscopio óptico de campo claro con un sistema de barrido para disecar ópticamente una muestra. Permite la visualización de una muestra biológica en tres dimensiones. Aunque el principio de la microscopía confocal fue dado a conocer por Minsk en 1957 y los primeros microscopios basados en esta técnica demostraron su validez en 1968, gracias a los trabajos de Petran y colaboradores; su gran aceptación tuvo lugar hasta hace unos pocos años con el desarrollo de los láseres y equipos de cómputo. Su éxito se debe a las ventajas que ofrece frente a la microscopía óptica convencional (imágenes de mayor nitidez y contraste, mayor resolución vertical y horizontal, etc.) y sobre todo, a la posibilidad de obtener imágenes que permiten su estudio tridimensional. El principio de la microscopía confocal se basa en eliminar la luz reflejada o fluorescente procedente de los planos fuera de foco. “La diferencia principal entre un microscopio convencional y uno confocal es la adición de una apertura de detector (orificio puntiforme) que está en conjunción con el punto focal de la lente: por lo tanto es confocal” (Ross 5a edición). La microscopía confocal permite estudiar muestras que por su grosor o por sus características, no son transparentes. Con ello se han logrado desarrollar nuevas técnicas de preparación de muestras, sin implicar el corte en rebanadas delgadas como se hacía anteriormente, logrando incrementar las posibilidades de estudiar las relaciones estructura- función, ya sea a nivel uni o multicelular. Con este sistema se exploran muchos puntos individuales en el mismo plano focal y un programa informático reconstruye la imagen a partir de los datos registrados durante la exploración. En este aspecto se parece a la tomografía computarizada. La resolución de este sistema es de 0.2 a 0.5 m MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS: La fuente es un haz de electrones y puede ser a. Transmisión b. Barrido Debido a que la longitud de onda de un haz de electrones es 2000 veces menor que la de un haz de luz, la resolución aumenta por un factor de 103. El límite de resolución que pudiese alcanzar es de 0.005nm pero en la práctica es de 0.2 nm, 1.000 veces mayor que la resolución del microscopio óptico de campo claro. El principio del microscopio es el siguiente:  La fuente de luz es un filamento de Tungsteno calentado que emite electrones (cátodo).  Los electrones son atraídos hacia el ánodo.  Una diferencia eléctrica entre el cátodo y el ánodo imparte un voltaje de aceleración de entre 20.000 y 200.000 voltios a los electrones con lo que se genera un haz.  Este haz de electrones atraviesa luego una serie de lentes electromagnéticas que cumplen la misma función que las lentes de cristal del microscopio óptico.  Lente condensadora: forma el haz de electrones que incide sobre la muestra.  Luego una vez que atraviesa la muestra el haz de electrones es enfocado y aumentado por el lente objetivo.  Finalmente es nuevamente aumentado por la lente proyectora.  La imagen se observa en una pantalla. El material para ME es procesado con las mismas etapas de la técnica histológica para la microscopía de luz, pero debido al mayor poder de resolución del ME es necesario utilizar fijadores que preserven bien los enlaces de proteínas. Como ejemplos de fijadores para la 11 ME están el Glutaraldehido, paraformaldehido, tetroxido de osmio y permanganato de potasio. Estos fijadores además actúan como colorantes electrondenso. El Microscopio Electrónico de Barrido proporciona una imagen tridimensional del espécimen debido a que el haz de electrones no atraviesa la muestra sino que explora su superficie. El material se fija, se deshidrata por desecación de punto crítico, se cubre con una película de oro-carbono evaporado, se monta en un soporte de aluminio y se coloca en la cámara para muestras de MEB. El haz de electrones explora la superficie y los electrones reflejados de la superficie (electrones retrodispersados) y los electrones que son expulsados desde la superficie (electrones secundarios) son recogidos por un detector y son reprocesados para formar una imagen tridimensional en un Tubo de Rayos Catódicos (TRC). PRINCIPALES MEDIDAS USADAS EN HISTOLOGÍA. UNIDAD VALOR Milímetro (mm) 1 mm= 1000 mm Micrómetro (mm) 1 mm= 0,001 mm Nanómetro (nm) 1 nm= 0,001 mm 12 TÉCNICA HISTOLÓGICA. Durante la parte práctica de las clases de histología, el alumno deberá realizar el estudio microscópico de PREPARACIONES HISTOLÓGICAS que se obtienen mediante la aplicación de la técnica de “inclusión en parafina y coloración con Hematoxilina y Eosina”. Una preparación histológica no es más que una rebanada muy delgada (corte histológico) de una pequeña parte de tejido corporal, colocada sobre una lámina porta- objeto, coloreada y cubierta por una lámina cubre-objeto. TODOS LOS PROCEDIMIENTOS DESTINADOS A OBTENER PREPARACIONES HISTOLÓGICAS CONSTITUYEN LA LLAMADA TÉCNICA HISTOLÓGICA. Basándonos en nuestra experiencia docente, nosotros consideramos de mucha utilidad que el alumno tenga una idea general de los procedimientos más comunes que se emplean en dicha técnica, para que lo ayuden a la interpretación de sus observaciones microscópicas. ETAPAS PARA OBTENER UN PREPARADO HISTOLÓGICO. 1. Obtención del material 2. Fijación 3. Elaboración del bloque de parafina (inclusión en parafina). a. Deshidratación b. Aclaramiento c. Impregnación en parafina d. Inclusión en el bloque de parafina 4. Corte y montaje en la lámina porta objeto 5. Coloración 6. Colocación del medio de montaje y de la lámina cubre-objeto 1. OBTENCIÓN DEL MATERIAL: Como en Histología se estudia la morfología de los tejidos normales, la fuente de los mismos puede ser material procedente de animales o de humanos obtenido por biopsia o autopsia. La palabra biopsia es compuesta y procede del griego bio, vida, y opsia, ver. Una biopsia es un procedimiento diagnóstico que consiste en la extracción de una muestra de tejido en un organismo vivo para, posterior a la técnica histológica, examinarla al microscopio. En general dependiendo si se extirpa la totalidad del órgano o lesión o no se dice que la biopsia es: Excisional: cuando se extirpa el órgano o la lesión en su totalidad. Por ejemplo, la extirpación de la glándula mamaria o un nódulo en la piel. Incisional, cuando obtenemos parte de un órgano o de una lesión. 2. FIJACIÓN: “La fijación nos permite conservar el tejido y su tratamiento ulterior” (Ross 2007) El objeto de la fijación es interrumpir el desarrollo de los procesos orgánicos, fijando y conservando de la forma más fidedigna posible el estado y la situación en que se encontraban los tejidos. Los fijadores actúan coagulando las sales proteicas de las células, endureciendo los geles e inactivando las enzimas. Además, la mayor parte de los fijadores son buenos antisépticos, por ello, matan a los agentes patógenos que puedan estar infectando el tejido. La fijación se utiliza para: 1. Abolir el metabolismo celular 13  2. Impedir la degradación enzimática de las células y los tejidos por autolisis. 3. Destruir los microorganismos patógenos (bacterias, hongos y virus) 4. Endurecer el tejido (esto es consecuencia de la formación de enlaces cruzados o la desnaturalización de las moléculas proteicas).(Ross 2007) Condiciones que debe cumplir un fijador: a) Preservar el tejido. b) No producir artificios. c) No dificultar el tratamiento ulterior. d) Poder y velocidad de penetración. Propiedades de los fijadores:  Preservan la morfología celular y tisular.  Preservan la composición química.  Penetran a los tejidos con relativa rapidez.  Facilitan la coloración posterior.  Inhiben el crecimiento microbiano y por lo tanto la putrefacción.  Aumentan la consistencia de los tejidos. Efectos indeseables de algunos fijadores:  Retraen los tejidos.  Precipitan en forma de cristales.  Endurecen demasiado las muestras.  Poseen olor desagradable e irritan la piel y las mucosas.  Producen alteraciones importantes a nivel molecular.  Producen alteraciones importantes a nivel ultraestructural. TÉCNICA DE FIJACIÓN. Una vez que se ha obtenido la muestra para su estudio, debe procederse a su fijación inmediata. Podemos proceder de dos maneras, cuando utilizamos fijadores en estado líquido:  Fijar por inmersión que consiste en colocar el tejido dentro de un recipiente que contiene el fijador.  Fijar por perfusión: introducir por vía sanguínea el fijador. RECUERDA: FIJACIÓN POR INMERSIÓN. Consiste en sumergir un pequeño trozo de tejido en el fijador inmediatamente después de haber sido extraído. Los fijadores se pueden clasificar en:  Físicos  Químicos. FIJADORES FÍSICOS: 1. Desecación. 2. Calor seco. 3. Calor húmedo. 4. Frío. 5. Congelación y desecación. 14 FIJADORES QUÍMICOS Son los más utilizados. Estos pueden ser a su vez simples, constituidos por una sola sustancia química, y compuestos o mezclas fijadoras, cuando varias sustancias intervienen en su constitución. FIJADORES SIMPLES: Formol: es el más usado, debido a su bajo precio y fácil uso y buena preservación de los tejidos. Es un líquido incoloro que emite vapores irritantes. Comercialmente se encuentra en una solución al 40%, por lo que para su uso debe prepararse en concentraciones que oscilan entre 4 y 10%. Actúa mediante la formación de puentes entre las moléculas tisulares. Normalmente se usa en solución tamponada e isotónica. Es el fijador de elección con mayor frecuencia debido a:  Permite buena preservación del tejido.  Actúa como conservante.  Produce poca retracción tisular.  Es un buen fijador para lípidos.  Es compatible con la mayoría de las tinciones histológicas, incluidas las de inmunocitoquímica e hibridación de ácidos ribonucleicos. Alcohol etílico: Fija por deshidratación y se usa entre el 70 y 90 %. Es un buen elemento para preservar moléculas, como ciertas enzimas, glucógeno, pigmentos y para las extensiones citológicas. Debido a que deshidrata, a la vez que fija, se puede usar también como un conservante de las muestras. Alcohol metílico: se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.). Ácido ósmico: al 1 ó 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien estructuras celulares. Glutaraldehído: Forma puentes entre las moléculas de los tejidos. Se usa a una proporción entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidad para preservar la estructura celular, por lo que es el fijador de referencia para observación de ultraestructura celular con el microscopio electrónico de transmisión. Es habitual que los tejidos destinados a microscopía electrónica sean inicialmente fijados en glutaraldehído (1 al 3 %) y paraformaldehído (2 al 4 %), para posteriormente ser postfijados en tetróxido de osmio al 1 % en solución tamponada. Este último es un buen preservador de la ultraestructura celular, sobre todo membranas, en cooperación con los aldehídos. Hay que tener cuidado con su baja penetración tisular y puede producir retracciones. Tetróxido de osmio. Forma puentes entre moléculas. Se emplea al 1 % en soluciones tamponadas. Es buen fijador de la ultraestructura de la célula por lo que se emplea habitualmente para las observaciones con el microscopio electrónico. Es un buen fijador para grasas y membranas celulares. Por su fuerte carácter oxidante no se usa para tinciones convencionales, excepto para las impregnaciones argénticas como el método de Golgi. FIJADORES COMPUESTOS: En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de complementar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética. b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética. c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética. e) Líquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico. 15 Líquido de BOUIN: Está formado por ácido pícrico, formaldehido y ácido acético glacial. Es muy útil para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el núcleo y el glucógeno. Hay que tener cuidado con el tiempo de fijación, que no debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones por inmersión. Antes de la inclusión en parafina es conveniente eliminar el ácido pícrico mediante lavados en alcohol de 70° porque puede hacer que no se produzca una buena inclusión o que las tinciones no sean adecuadas. Para poder obtener una rebanada delgada de tejido es necesario endurecerlo, para ello una vez realizada la fijación se procede a impregnarlo e incluirlo en un bloque de parafina, con el cual podremos realizar cortes delgados. 3. ELABORACIÓN DEL BLOQUE DE PARAFINA Este paso consiste en impregnar los tejidos con una sustancia líquida que luego pasa a una fase consistente homogénea, necesaria para obtener cortes histológicos delgados y uniformes. El medio, de inclusión más utilizado es la PARAFINA Comprenda lo siguiente: “Las células y los tejidos por ellas conformados son ricos en agua y la parafina no es soluble en el agua”.  ¿Cómo logro impregnar los tejidos con parafina, siendo éstos ricos en agua, la cual no es solvente de la parafina? Para lograrlo debo extraer el agua y sustituirla por una sustancia solvente de la parafina. El solvente de la parafina que se usa en la técnica histológica de rutina es el xilol. El xilol no es soluble en el agua.  ¿Qué debo hacer para sustituir el agua por xilol? Para ello extraigo el agua con una sustancia que sea solvente del agua y del xilol, esta sustancia es el alcohol, por lo tanto el esquema es:  Tejidos ricos en agua, se les extrae el agua sustituyéndolas por alcohol. Este procedimiento se denomina: DESHIDRATACIÓN.  Tejidos ricos en alcohol, se les extrae el alcohol sustituyéndolo por xilol. Este procedimiento se denomina: ACLARAMIENTO.  Tejidos ricos en xilol: el tejido se encuentra ahora en condiciones para ser impregnados con parafina. EN CONCLUSIÓN: Como la parafina es insoluble en agua, es necesario primero extraer el agua tisular (DESHIDRATACIÓN) por medio de una sustancia que sea soluble en agua y en xilol y luego sustituirla por el XILOL que es el solvente de la parafina (ACLARAMIENTO). 3.1 DESHIDRATACIÓN: Para obtener la deshidratación el tejido debe sumergirse en alcoholes de concentración creciente, hasta que el agua de la célula sea reemplazada por el alcohol. 3.2 ACLARAMIENTO: Se utiliza el xilol por ser soluble tanto en alcohol como en parafina. El tejido, después que sale del alcohol se sumerge en xilol hasta que el alcohol sea sustituido por éste. 3.3 IMPREGNACIÓN EN PARAFINA: al salir del xilol el tejido se coloca en parafina fundida (caliente se encuentra en estado líquido) hasta que el xilol sea sustituido por ella. 3.4 INCLUSIÓN EN BLOQUE DE PARAFINA: una vez que el tejido está impregnado en la parafina se procede a realizar el bloque de parafina con el tejido en su centro, con la finalidad de:  Conservar la pieza por tiempo prolongado  Facilitar los cortes con el micrótomo Para ello el técnico coloca el tejido ya impregnado en el fondo de una caja, ya sea de metal o de papel elaborada por él, y a continuación coloca parafina liquida. Una vez lleno 16  el envase con el tejido en el fondo, se procede a colocar sobre una plancha fría o simplemente se deja a temperatura ambiente, consiguiendo así que la parafina pase a su estado sólido obteniéndose de esta manera el bloque de parafina. Note que lo deshidratación y el aclaramiento constituyen pasos previos para la inclusión propiamente dicha. 4. CORTE: Como resultado de todos los procedimientos anteriores, se obtiene una muestra del tejido en un bloque parafina, el cual se monta en el microtomo y se corta en delgadas rebanadas (corte histológico) de 4 a 8 micras. El Microtomo es un instrumento destinado realizar cortes histológicos lo suficientemente delgados, que permitan la penetración de los reactivos utilizados para colorearlos y dejen pasar la luz para poder ser observados al Microscopio. Paro lo obtención de cortes con Microtomo se requiere, más que instrucciones destreza manual. Aquí se coloca el bloque de parafina para su corte Microtomo de Rotación Una vez realizado el corte este se coloca en un baño de maría de manera de poder extenderlos bien y a continuación se procede a colocarlos sobre una lámina porta objeto. Para ello la rebanada obtenida del microtomo se coloca sobre el agua del baño de María de manera que ésta flote y posteriormente montar el tejido sobre la lámina portaobjeto. En esta imagen podemos observar como el técnico está colocando sobre la lámina porta objeto el fragmento de tejido 17 CORTE POR CONGELACIÓN. Este método consiste en obtener rebanadas de un tejido el cual no ha pasado por ninguno de los pasos anteriores de la técnica histológica. Una vez obtenida la muestra, para obtener el bloque, se pone en una rejilla con un gel especial (medio para montaje de congelación rápida), a continuación se coloca en un micrótomo el cual se encuentra en el interior de una cámara de congelación (temperatura -20°) (criostato). Tiene la ventaja de permitir hacer el estudio del tejido de forma casi inmediata al momento en que se obtuvo la muestra (el tejido no es procesado por el método de rutina el cual tiene una duración promedio de 12 horas) y poder realizar cortes más delgados que con el microtomo convencional, 4m y en manos experimentadas hasta 2m. Investiga el uso y valor en medicina del corte por congelación. CRIOSTATO La tinción tiene como objeto aumentar el contraste de las estructuras biológicas, e identificar componentes mediante su afinidad tintorial. Cuando se trata de cortes obtenidos por la técnica de la parafina, es necesario como primer paso eliminar la parafina antes de colorear, ya que los colorantes son de base acuosa. Esto se logra colocando la lámina en la estufa de manera que la parafina se ponga en estado líquido y luego en xilol para extraerla y sustituir la parafina por xilol. Una vez que hemos retirado la parafina, el corte de tejido es rico en xilol y podemos proceder a realizar la coloración elegida.  Si los cortes van a teñirse con un colorante en solución acuosa, el tejido debe ser rehidratado, colocándolo en una batería de alcoholes de concentraciones decreciente, sustituyendo así el xilol por alcohol, el cual es soluble en agua.  La coloración que el alumno observará con mayor frecuencia en lo práctica es HEMATOXILINA / EOSINA, por este motivo la explicaremos un poco. 5. PROCEDIMIENTO DE COLORACIÓN. La coloración tiene como objeto aumentar el contraste de las estructuras biológicas, e identificar componentes mediante su afinidad tintorial. Cuando se trata de cortes obtenidos por la técnica de la parafina, es necesario como primer paso eliminarla antes de colorear. Esto se logra colocando la lámina en la estufa de manera de que la parafina se ponga en estado líquido y luego en xilol para extraerla y cambiar la parafina por xilol. Una vez que hemos retirado la parafina podemos proceder a la coloración elegida. 18   Además si los cortes van a teñirse con un colorante en solución acuosa, el tejido debe ser rehidratado, colocándolo en una batería de alcoholes de concentraciones decreciente.  La coloración que el alumno observará con mayor frecuencia en lo práctica es HEMATOXILINA / EOSINA, por este motivos la explicaremos un poco. COLORACIÓN CON HEMATOXILINA Y EOSINA (H/E) En esta coloración se utilizan dos colorantes uno BÁSICO y otro ÁCIDO. El colorante básico es la HEMATOXILINA y el ácido es la EOSINA. Es conveniente aclarar que un colorante se denomina ÁCIDO o BÁSICO, dependiendo de si el componente que proporciona color está en el anión o en el catión. Si está en el anión el colorante se denomina ÁCIDO; si está asociado al catión, se denomina BÁSICO Colorantes ácidos: como por ejemplo la eosina, colorante cargado en forma negativa, se une a componentes celulares cargados positivamente. Estos componentes cargados positivamente se denominan acidófilos, porque tienen afinidad por los colorantes ácidos. Por ejemplo, estos colorantes se unen a grupos aminos de las proteínas. Estas proteínas pueden pertenecer al citoesqueleto de la célula o hallarse en la matriz extracelular. Debido al elevado contenido de proteínas del citoplasma la eosina es un excelente colorante citoplasmático. La eosina se une también a las membranas plasmáticas, sin embargo, se desconoce la naturaleza química de esta unión. Las células que presentan un gran desarrollo de membranas (muchas mitocondrias, mucho retículo endoplasmático liso, etc.) son sumamente acidófilas, o sea, se tiñen intensamente con la eosina. Colorantes básicos: como por ejemplo el azul de metileno, colorante cargado positivamente, se une a componentes celulares cargados negativamente. Estos componentes cargados negativamente se denominan basófilos, porque tienen afinidad por los colorantes básicos. Por ejemplo, estos colorantes se unen al núcleo y ciertas regiones del citoplasma. Como caso particular, la hematoxilina no tiene carga, para teñir un tejido se la une a un mordiente que junto a la hematoxilina forman una laca. La laca es básica y por lo tanto se une a cargas negativas de la célula o matriz extracelular. RECUERDE ESTO  La HEMATOXILINA tiñe de color azul o púrpura  La EOSINA tiñe de color rosado o rojo  Cualquier sustancia observada en un corte histológico coloreado con H/E, se denomina BASÓFILA si tiene afinidad por la hematoxilina (colorante básico) lo mismo una sustancia es ACIDÓFILA si tiene afinidad por la EOSINA (colorante ácido).  El NUCLEO de las células contienen ácidos nucleicos (ADN Y ARN) por lo tanto es BASÓFILO. Capta la hematoxilina y se colorea azul o púrpura.  El CITOPLASMA contiene proteínas, éstas al pH al que se realiza la coloración, tienen grupos básicos en sus cadenas laterales, por lo que captan la EOSINA y se colorean de rosado y se dice que es ACIDOFILO.  La GRASA en las células se disuelve y desaparece por acción del xilol utilizado en la técnica de inclusión en parafina. Esto explica que aparezcan espacios vacíos, redondeados y de bordes netos, en aquellos sitios del citoplasma donde existía grasa.  El GLUCÓGENO requiere de una coloración especial (PAS). 6) MONTAJE nos propusimos al comienzo a OBTENER un preparado definitivo en condiciones de ser observado al microscopio y protegido del ambiente para evitar su 19 hidratación y deterioro. Esta protección se obtiene cubriendo el preparado con una laminilla o cubreobjetos que se mantiene adherida al portaobjeto por medio de sustancias o medios conservadores tales como Bálsamo de Canadá o Mountec. Para ello debemos proceder a colocar unas gotas del medio de montaje sobre el corte ya coloreado y luego cubrir con la laminilla cubreobjetos. Existen otras coloraciones que se emplean en histología convencional que nos permiten obtener información con relación a la naturaleza química de los componentes de las células y los tejidos que ellas constituyen. REACCIÓN PAS, (ácido peryódico de Schiff) Esta es una coloración que permite identificar la presencia de carbohidratos y de moléculas ricas en carbohidratos. El fundamento de la coloración consiste en: 1.- El ácido peryódico rompe las uniones de los carbonos adyacentes de las moléculas de hexosas que poseen los carbohidratos dando lugar a la formación de grupos aldehídos. 2.- Estos grupos aldehídos reaccionan con el reactivo de Schiff (fucsina básica) para dar un color purpura intenso característico. Una técnica con frecuencia utilizada es el PAS con y sin digestión enzimática la cual permite identificar la presencia de glucógeno. REACCIÓN DE FEULGEN. Tiene el mismo fundamento que el PAS y, utiliza el reactivo de Schiff. Esta reacción permite identificar la presencia de ADN ya que se basa en la ruptura de los enlaces de las purinas con el azúcar de cinco carbono (Desoxirribosa) por medio de una hidrólisis ácida débil dando lugar a la formación de grupos aldehídos los cuales reaccionan con el reactivo de Schiff tomando así la coloración característica purpura intenso. (El ARN no da positiva la reacción de Feulgen ya que su azúcar no es desoxirribosa). TÉCNICA TRICRÓMICA DE MALLORY. Es una coloración que utiliza tres colorantes ácidos: azul de anilina, fucsina ácida y naranja G que tiñen con selectividad el colágeno, el citoplasma en general y los eritrocitos respectivamente. Esta técnica es utilizada para identificar el colágeno el cual se tiñe de azul. El tricrómico de Masson tiñe las fibras colágenas de verde. DETERMINACIÓN HISTOQUÍMICA DE LÍPIDOS. Para poder observar lípidos luego de fijar el tejido este es procesado por el método de corte por congelación. Una vez obtenido el corte, se utiliza un colorante casi insolubles en agua, como el sudan III (rojo) que nos permite identificar la presencia de triglicéridos en los adipocitos y sudan IV (negro) que se utiliza para identificar las vainas de mielinas de los nervios, las cuales están constituidas por lipoproteínas. METACROMASIA. Propiedad que poseen ciertos elementos histológicos de adquirir una coloración diferente a la del colorante empleado. La Metacromasia se debe a que en tejidos con altas concentraciones de POLIANIONES, la molécula del colorante se polimeriza entre si y sus propiedades de absorción son diferentes 20 de las propiedades de las moléculas individuales. Se interpreta que la Metacromasia refleja gran cantidad de cargas aniónicas muy cercanas unas a otras en el tejido. Como ejemplo tenemos el azul de toluidina, el cual es un colorante básico que al reaccionar con los componentes hísticos, forman aglomeraciones diméricas y poliméricas que modifican la absorbancia por lo que las zonas teñidas en lugar de verse del color del colorante (azul) se ven púrpura o rojo. Es posible observar en la sustancia fundamental del cartílago y en los gránulos de los mastocitos, como el Azul de Toluidina tiñe a estos de color púrpura. INMUNOHISTOQUÍMICA. Se fundamenta en la especificidad de la reacción entre un antígeno y un anticuerpo. La Inmunohistoquímica es una técnica que se basa en la detección de antígenos celulares a través de anticuerpos. Este antígeno es una molécula que muchas veces puede ser específica para cierta célula. Por ejemplo, el antígeno de PSA (prostatic specific antigen o antígeno prostático específico) es expresado en las celulas prostáticas. Entonces, para detectar el PSA se crea un anticuerpo anti-PSA. Los anticuerpos son glicoproteínas producidas por células del sistema inmunitario (linfocitos B, plasmocitos) en respuesta a un antígeno. En esta técnica se utilizan dos tipos de anticuerpos, policlonales y monoclonales. Los anticuerpos policlonales son mezclas de anticuerpos producidos por varios clones de linfocitos B en las que cada clon reconoce una región diferente del antígeno. ¿Cómo se obtienen anticuerpos policlonales? El antígeno en cuestión es aislado de una especie (rata) e introducido en la circulación de una especie diferente (conejo). En éste el sistema inmunitario reconocerá como extraño el antígeno introducido por lo que generará una respuesta inmunológica, que dará a lugar a la formación de varios grupos de linfocitos B (clones de linfocitos) y estos a anticuerpos policlonales. Los anticuerpos monoclonales son los elaborados por un solo grupo de linfocitos B idénticos. Estos linfocitos B se obtienen de líneas celulares. ¿Cómo se obtienen? El antígeno en cuestión se introduce en un animal, rata, conejo. Luego se aíslan, en el sistema inmunológico (bazo, ganglios linfáticos) animal, los linfocitos B activados. Estos linfocitos B se fusionan con líneas celulares de plasmocitos provenientes de un mieloma múltiple, constituyéndose un HIBRIDOMA, una línea celular capaz de secretar un anticuerpo individual inmortalizado. En este método de inmunohistoquímica se mezcla la técnica de antígeno anticuerpo con la propiedad que tienen algunos cuerpos de absorber longitudes de onda (ej. luz ultravioleta) y luego emitir luz de una longitud de onda específica (por ej. verde, amarilla). Una vez obtenido el anticuerpo específico de lo que queremos identificar se procede a localizarlo por dos métodos:  Inmunofluorescencia Directa: Consiste en marcar el anticuerpo (monoclonal o policlonal) con fluorocromo y ponerlo en contacto con la muestra en estudio. Tiene la desventaja de que la intensidad de la señal que emite es muy baja.  Inmunofluorescencia Indirecta: tiene mayor sensibilidad que los métodos directos. En este método se genera un anticuerpo (anticuerpo secundario) contra el anticuerpo (monoclonal o policlonal) (anticuerpo primario) de lo que queremos identificar. El anticuerpo secundario se conjuga con el fluorocromo. 21 LA CÉLULA. INTRODUCCIÓN. Célula del latín “Cellulae” (habitaciones pequeñas) es la unidad mínima de un organismo capaz de actuar de manera autónoma. Es la unidad anatómica, fisiológica y de origen de los seres vivos. Todos los organismos vivos están formados por células, y en general se acepta que ningún organismo es un ser vivo si no consta al menos de una célula. Aunque el ser humano está formado por más de 200 tipos diferentes de células, cada una con una función diferente, todas las células poseen ciertas características en común y por tanto pueden describirse en términos generales. Las similitudes fundamentales entre los diferentes tipos de células proporcionan un marco común para la biología celular, permitiendo que los principios básicos aprendidos a partir de un solo tipo de célula puedan ser extrapolados y generalizados a otros tipos de células. Como unidades básicas, las células similares entre sí, se agrupan para formar tejidos. Los cuatro tejidos fundamentales (tejido epitelial, tejidos conectivos, múscular y nervioso) que constituyen el organismo se unen para formar órganos, que a su vez se integran en aparatos y sistemas. Para poder comprender cómo funciona el cuerpo humano sano, cómo se desarrolla y envejece y qué falla en caso de enfermedad, es imprescindible conocer las células que lo constituyen. POSTULADOS DE LA TEORÍA CELULAR a) Todos los seres vivos están conformados por una o más células. b) Las células son la unidad estructural de los seres vivos. c) Las células se originan por la división de una célula preexistente. PRIMERA APROXIMACIÓN A LAS CÉLULAS. Cuando observamos con el microscopio de luz preparados histológicos teñidos con hematoxilina eosina, en ellos podemos comprobar que un tejido está constituido por la reunión de células con características similares y en un mismo plano de observación podemos ver diferentes tejidos, como parte de un órgano, y por ende diferentes células. Al realizar estas observaciones podremos evidenciar que: 1) Las células en preparados de rutina y observadas con el microscopio de luz están constituidas por dos elementos claramente evidenciables: a. Núcleo b. Citoplasma 22 2) El núcleo generalmente se tiñe con el colorante básico (hematoxilina) y lo podemos observar de una coloración azul-morada. 3) El citoplasma rodeando al núcleo y delimitando la forma y el tamaño celular, generalmente se tiñe con el colorante ácido (eosina) de rosado. 4) Si agudizamos nuestra observación podremos constatar que existen diferentes formas celulares, las cuales generalmente varían en razón de su función. a. Células nerviosas con formas estrelladas y múltiples prolongaciones. b. Células musculares estriadas que son alargadas. c. Las células musculares lisa con forma de huso. d. Las células epiteliales con formas geométricas: cúbicas, cilíndricas, planas, poliédricas. Sepa desde ya que la forma de las células está determinada por tres factores:  El estado físico químico del protoplasma.  La influencia mecánica ejercida por los elementos vecinos.  La función que la célula realiza. La célula libre en un medio líquido tiende adoptar una forma esférica según las leyes de la tensión superficial, pero al ponerse en contacto mutuo para formar tejidos, por la influencia mecánica de los elementos vecinos, toma formas geométricas. (Planas, cúbicas, cilíndricas, poliédricas). 5) El núcleo puede variar en número, forma, calidad de su tinción y ubicación en el citoplasma. 6) El citoplasma también puede presentar diferencias en relación a la tinción, aspecto, cantidad, límites. 7) Es importante también analizar la disposición en conjunto de las células, por ejemplo muy cercas unas de otras, o separadas por abundante sustancia intercelular, en grupos, constituyendo hileras, láminas etc. 8) El tamaño de la célula es muy variable. Células grandes como las neuronas, o una célula muscular estriada del miembro inferior; a células tan pequeñas como los granos del cerebelo. 23 FUNCIONES GENERALES DE LAS CELULAS:  Absorción: capacidad de tomar sustancias del medio que las rodea.  Excreción: capacidad de eliminar productos de desechos, producidos por su metabolismo, al exterior.  Respiración: absorber oxígeno para la oxidación de sustancias nutritivas y así producir energía.  Reproducción: capacidad de renovarse.  Irritabilidad: capacidad de reaccionar ante un estímulo, ya sea químico, físico o eléctrico.  Conductividad: capacidad de transmitir un impulso u onda excitatoria producido por un estímulo irritante, que se extiende por toda la superficie, desde el lugar de excitación. Ej.: célula nerviosa.  Contractilidad: capacidad de acortarse en una dirección determinada, en respuesta a un estímulo. Ej.: célula muscular.  Secreción: facultad de sintetizar a partir de pequeñas moléculas absorbidas, nuevos productos útiles utilizando energía, que luego son expulsados al medio extracelular. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS CÉLULAS. Una célula eucariota, como las que constituyen nuestro organismo, puede considerarse constituida por dos componentes, morfológica y funcionalmente diferentes: a) El CITOPLASMA, delimitado por la membrana plasmática, a través de la cual se realizan los intercambios de las células con el medio ambiente. b) El NÚCLEO, delimitado por la membrana nuclear, a través de la cual se realizan los intercambios núcleo-citoplasmáticos. El citoplasma y el núcleo tienen funciones distintas pero actúan en conjunto para mantener la viabilidad celular. CITOPLASMA. El citoplasma se extiende desde la membrana plasmática hasta la envoltura nuclear; tiene encomendada dos funciones fundamentales: 1. En él tienen lugar las reacciones enzimáticamente catalizadas que constituyen la fase anabólica y catabólica del metabolismo. 2. A su nivel se realizan las funciones especiales encomendadas a los diferentes grupos celulares dentro del todo orgánico: la secreción de las células glandulares, la contracción en las musculares, la excitabilidad y conductibilidad en las células nerviosas, el almacenamiento de sustancias de reserva en los adipocitos, etc. Para que esta doble actividad funcional citoplasmática sea posible, es indispensable que se mantenga un intercambio de sustancias:  con el ambiente a través de la membrana plasmática  con el núcleo a través de la membrana nuclear. Componentes del citoplasma. El agua representa el mayor volumen del citoplasma y en ella se disuelven o suspenden diversas sustancias inorgánicas y orgánicas. Esta suspensión líquida se denomina CITOSOL. El citosol parece contener escasa estructuras, pero se ha evidenciado en él un entretejido reticulado formado por finos filamentos que actúa como un esqueleto celular y forman el denominado CITOESQUELETO. El citoplasma además de su porción amorfa o citosol contiene en su interior diferentes elementos a saber:  ORGANELAS: son diferentes estructuras que se encuentran incluidas en el interior del citosol, existen de modo constante en casi todas las células y realizan funciones 24  definidas, ya dentro del marco metabólico, como de las funciones especiales asignadas a los diferentes grupos celulares. Las organelas se pueden clasificar tomando como criterio la presencia o no de membrana en su constitución. Asi tenemos: ORGANELAS MEMBRANOSAS: con membrana plasmática que separan su medio interno del citoplasma circundante. 1. La membrana plasmática 2. El retículo endoplásmico rugoso, liso y sarcoplásmico. 3. El aparato de Golgi 4. Mitocondrias 5. Endosomas 6. Lisosomas 7. Peroxisomas ORGANELAS NO MEMBRANOSAS: carecen de membrana plasmática. 1. Centriolos 2. Ribosomas 3. Citoesqueleto 4. Proteosomas  INCLUSIONES: son componentes no vivos de la célula que carecen de actividad metabólica y no están limitados por membranas. NÚCLEO. Es la estructura característica de las células eucariotas. En él se encuentra el material genético de la célula (DNA) que codifica la información que condiciona la estructura y la función de la célula y, en consecuencia, de todo el organismo. RECUERDA: La actividad o función especializada de una célula no es sólo el reflejo de la presencia de una cantidad mayor del componente estructural específico que efectúa la actividad sino también de la forma de la célula, su organización con respecto a otras células similares y sus productos. (Ross 5° edición). EL CITOSOL. El citosol (matriz citoplasmática) es la parte amorfa al microscopio de luz del citoplasma celular. Está compuesto de agua, iones inorgánicos y moléculas que contienen carbono (orgánicas) y una rica red de proteínas filamentosas, el citoesqueleto, que confiere a la célula estabilidad estructural y contribuye con su movilidad. Al citosol se le describen tres zonas según su característica de gel o sol: a) Centrosoma: rodea al núcleo, tiene característica de gel, es decir consistencia gelatinosa rígida y contiene a los centriolos. b) Endoplasma: rodea al centrosoma, tiene característica de sol, es decir tiene consistencia más fluida, y en él se encuentra la mayor parte de las organelas e inclusiones. c) Ectoplasma: se localiza inmediatamente por debajo de la membrana plasmática, tiene consistencia de gel y en él se encuentra el córtex celular. En el citosol el agua representa el 70% o más de la masa celular total. En consecuencia, las interacciones entre el agua y el resto de los componentes celulares tienen una importancia central en la química biológica. La propiedad crítica del agua es que es una molécula polar, donde los átomos de hidrógeno poseen una carga ligeramente positiva y el oxigeno posee 25 una carga ligeramente negativa. Debido a su naturaleza polar, las moléculas de agua pueden formar enlaces o puentes de hidrógeno entre sí o con otras moléculas polares así como interaccionar con iones cargados positiva y negativamente. Como resultado de estas interacciones, los iones y las moléculas polares son fácilmente solubles en el agua (hidrófilas). Por el contrario las moléculas no polares, que no pueden interaccionar con el agua, son escasamente solubles en un medio acuoso (hidrófobas). En consecuencia las moléculas no polares tienden a minimizar su contacto con el agua relacionándose estrechamente entre sí. Estas interacciones desempeñan un papel fundamental en la formación de estructuras biológicas como las membranas celulares. El 1% o menos de la masa celular total está constituida por iones inorgánicos: sodio, potasio, magnesio, calcio, fosfato, cloro y bicarbonato, los cuales están implicados en numerosos aspectos del metabolismo celular, y de este modo, desempeñan importantes papeles en la función celular. La mayoría de los componentes orgánicos pertenecen a una de cuatro clases de moléculas: proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos. Las proteínas representan el elemento más abundante y las podemos encontrar constituyendo el citoesqueleto o difusamente constituyendo enzimas. Las estimaciones acerca de la concentración de proteínas en el citosol van desde los 200 a 400 mg/ml. Muchos procesos que tienen que ver con la producción y el almacenamiento de la energía metabólica se realizan merced a la intervención de las enzimas presentes en el citosol. Por ejemplo: la glucólisis, la vía de la pentosafosfato y la gluconeogénesis, la biosíntesis de los ácidos grasos, el metabolismo del glucógeno y de los disacáridos. EL CITOESQUELETO. De modo similar a las varillas de acero que sostiene la estructura de un edificio, el citoesqueleto desempeña un papel estructural importante, al sostener la membrana plasmática y formar carriles a lo largo de los cuales se pueden desplazar las organelas y otros elementos del citosol. Sin embargo a diferencia del pasivo marco de un edificio, el citoesqueleto es sometido a reordenamientos constantes, capaces de producir movimientos. (Lodish. Biología Celular y molecular 4° edición). La capacidad de las células eucariotas de adoptar una diversidad de formas, organizar la mayoría de sus componentes internos, interactuar mecánicamente con el medio ambiente y llevar a cabo movimientos coordinados depende del citoesqueleto. El citoesqueleto es una red de filamentos de proteínas que se extiende por todo el citoplasma de las células eucariota, el cual proporciona a) Un armazón estructural para la célula, actuando como un andamio que determina la forma y la organización general del citoplasma. b) Es el responsable de los movimientos celulares, de la célula como un todo y del transporte interno de los organelos y otras estructuras (cromosomas) a través del citoplasma. c) Es una estructura dinámica que se reorganiza continuamente y está constituido por: Filamentos de Actina (microfilamentos). Filamentos intermedios. Microtúbulos, los cuales se mantienen juntos y unidos a los organelos intracelulares y a la membrana plasmática mediante proteínas accesorias. El citoesqueleto no sólo representa “los huesos” de una célula, sino también sus “músculos” y es el responsable directo de diversos movimientos en gran escala, como el deslizamiento sobre una superficie, la contracción de las células musculares y los cambios de la forma celular que se producen durante el desarrollo embrionario. En ausencia de citoesqueleto, las heridas no curarían, los músculos serían inútiles y los espermatozoides jamás alcanzarían al óvulo. (Bruce Alberts. Introducción a la Biología celular. 2a edición). 26 FUNCIONES DEL CITOESQUELETO:  Actuar como un andamio sosteniendo a la membrana plasmática y dándole forma a la célula.  Mantener la distribución espacial característica en el interior de la célula.  Motilidad celular.  Transporte interno, organelas, cromosomas, vesículas de transporte.  Forma parte fundamental de los medios de unión, favoreciendo su estabilidad. FILAMENTOS DE ACTINA. (Microfilamentos). La Actina es una proteína que se aisló por primera en 1942, en células musculares, en donde constituye aproximadamente el 20% de la proteína total de estas células. Se encuentra en casi todas las células eucariotas en donde representan aproximadamente un 5 a 10% de la proteína total. ¿Que son los filamentos de Actina? Son filamentos de la proteína Actina que miden 6 a 9 nm de diámetro. ¿Cómo se constituye un filamento de Actina? La Actina se encuentra en dos formas: 1. Monómero de proteína globular denominada Actina G. 2. Polímero filamentoso denominado Actina F, y que no es más que una cadena lineal de subunidades de Actina G. Cuando los investigadores evaluaron sus observaciones en el M/E de preparados teñidos con acetato de uracilo, encontraron que los filamentos de Actina aparecían como collares de perlas arrolladas con un diámetro que varía entre 6 y 9 nm. Los filamentos de Actina presentan polaridad con un extremo positivo “mas” por el cual a través de una proteína de ensamblaje, la PROFILINA, se añaden monómeros de Actina y por consiguiente aumenta en longitud el filamento y un extremo negativo “menos” por donde a través de otra proteína de desensamblaje, la COFILINA, se despolimeriza o disocian subunidades o monómeros de Actina. Existe además una proteína ARP 2/3 la cual actúa como sitio de nucleación para iniciar el ensamblaje de nuevos filamentos de Actina. ¿Cómo se disponen los filamentos de Actina en la célula? Se organizan asociados a proteínas (proteínas fijadoras de Actina ABP) en dos tipos de estructuras: I. HACES DE ACTINA II. REDES DE ACTINA. HACES DE ACTINA. Para constituir haces los filamentos de Actina se disponen paralelos, unidos por puentes cruzados de proteínas asociadas. Dependiendo del tipo de proteína asociada se constituyen dos tipos de haces de Actina.  HACES PARALELOS: es este caso las proteínas asociadas son la Fimbrina y la fascina, las cuales hacen que los filamentos estén estrechamente agrupados. Este tipo de haces los encontramos constituyendo el eje de modificaciones apicales de la membrana plasmáticas tales como: microvellosidades y Estereocilios. 27  HACES CONTRÁCTILES. En los haces contráctiles la proteína asociada es laactinina, la cual permite una mayor separación entre los filamentos de Actina logrando así que la miosina pueda interrelacionarse con los filamentos de Actina durante la contracción muscular. Estos haces contráctiles los podemos encontrar en el anillo contráctil que divide a las células en dos tras la mitosis y formando parte de los miofilamentos finos de las células musculares. REDES DE ACTINA. Los filamentos de Actina se mantienen unidos mediante la proteína de unión FILAMINA. La filamina es un dímero en forma de V con los dominios de unión a la Actina en los extremos de cada brazo de manera, que cada brazo, se une a un filamento de Actina ortogonal creando así una malla tridimensional holgada. Estas mallas se encuentran subyacentes a la membrana plasmática como un soporte estructural de la superficie de la célula que se denomina córtex celular. Esta asociación de la Actina con la membrana plasmática es fundamental para la estructura y la función celular. En la mayoría de las células se observa que este córtex celular se une a través de ciertas proteínas a proteínas integrales de membrana y a través de éstas últimas a la matriz extracelular, ayudando de esta manera a la integridad celular. Investigue: ¿Qué es la distrofina? Se asocia a algún trastorno su ausencia ó síntesis anómala. Los filamentos de Actina también son importantes en el movimiento celular. Ayudan a deformar la membrana para formar pseudópodos que en células fagocitarias, como los macrófagos, permiten envolver el material a fagocitar. Intervienen en la formación de lamelipodios y filipodios. RECUERDA: La Actina la podemos encontrar en la célula:  En las microvellosidades y Estereocilios.  Constituyendo los miofilamentos finos de las células musculares.  En el córtex celular.  Asociadas al movimiento celular: emisión de pseudópodos  Relacionadas con las uniones celulares. FILAMENTOS INTERMEDIOS. Los filamentos intermedios tienen un diámetro de 10 nm y su papel fundamental es estructural, proporcionando resistencia mecánica a las células y los tejidos. Se les denomina intermedios porque su diámetro se encuentra entre el de los filamentos delgados de Actina y los microtúbulos. Son los más resistentes y estables de los tres tipos de filamentos del citoesqueleto. Se disponen formando una red alrededor del núcleo que se extiende hacia la periferia para abarcar la totalidad del citoplasma. También se localizan dentro del núcleo donde constituyen una red de filamentos intermedios denominados lámina nuclear, que sustenta y refuerza la envoltura nuclear en todas las células eucariotas. Se asocian a la membrana plasmática y a los otros elementos del citoesqueleto, filamentos de Actina y Microtúbulos, logrando así proporcionar un andamiaje que integra a los componentes del citoesqueleto y organiza la estructura interna de la célula. Están constituidos por diversas proteínas que se expresan en diferentes tipos de células. Se han identificado más de 50 tipos de proteínas diferentes de filamentos intermedios las cuales han sido clasificadas en seis grupos en función de la similitud entre sus secuencias de aminoácidos. 28 Todos los filamentos intermedios tienen en común no sólo su diámetro sino su organización estructural. Ellos son comparables en su estructura a una cuerda constituida por hebras finas que se entrelazan. Cada hebra o protofilamento (tetrámero) se constituye por la unión de dímeros y los dímeros a partir de monómeros. Los monómeros, se caracterizan por presentar una región central de secuencia aminoácida variable con cada tipo de filamento intermedio y una región globular constante la cual es importante para el auto ensamblaje. Un par de monómero se enrosca para formar dímeros. Dos dímeros se enroscan entre sí para producir un tetrámero. Cada tetrámero (protofilamento) como unidad individual se alinean a lo largo del eje del filamento y ocho tetrámeros se entrelazan, como las hebras de una cuerda, para constituir un filamento intermedio. Los filamentos intermedios predominan sobre todo en el citoplasma de células sujetas a fuerzas mecánicas. Por ejemplo,  son muy abundantes en los axones de las neuronas proporcionándoles un refuerzo interno fundamental a estas prolongaciones celulares extremadamente finas y largas.  En las células musculares y epiteliales cutáneas también son abundantes en donde estiran y distribuyen más uniformemente el efecto de las fuerzas locales, lo cual evita la ruptura de las células y de sus membranas como consecuencia de la tensión. Pueden clasificarse en cuatro categorías: En el citoplasma: 1. Filamentos de queratina: en las células epiteliales. 2. Filamentos de vimentina y filamentos relacionados a ella (desmina, proteína ácido glio fibrilar, periferina) 3. Neurofilamentos en las células nerviosas En el núcleo: 4. Láminas nucleares en relación con la cara interna de la membrana nuclear. En la práctica médica la puesta en evidencia de los filamentos intermedios a través de inmunohistoquímica, permite al patólogo identificar el tipo de célula (epitelial, muscular, fibroblasto, etc.) de el tejido en estudio. TIPO PROTEINA LOCALIZACIÓN I QUERATINA CELULAS ACIDA EPITELIALES QUERATINA CELULAS NEUTRA EPITELIALES II VIMENTINA FIBROBLASTOS MÚSCULO LISO GLÓBULOS BLANCOS DESMINA CELULAS MUSCULARES PROTEINA CELULAS ACIDO GLIO GLIALES FIBRILAR PERIFERINA NEURONAS PERIFERICAS III NEUROFILAME NEURONAS NTOS IV LAMINAS MEMBRANA NUCLEARES NUCLEAR 29 Investigue Qué es la Epidermólisis bullosa simple y la esclerosis lateral amiotrófica y su relación con los filamentos intermedios. MICROTÚBULOS. Es el tercer componente del citoesqueleto. Son varillas rígidas y huecas de aproximadamente 25 nm de diámetro, constituidos pro la proteína globular TUBULINA. La Tubulina es un monómero que puede ser: Los microtúbulos se originan en el tubulina. Cada anillo es el punto de partida o sitio de nucleación del crecimiento del microtúbulo. Los monómeros de tubulina forman heterodímeros los cuales se polimerizan para forman protofilamentos. Finalmente se reúnen trece protofilamentos para constituir un Microtúbulo. Al igual que los filamentos de Actina los Microtúbulos tienen un extremo positivo y otro negativo, constituyendo así estructuras dinámicas que están continuamente ensamblándose y desensamblándose en la célula. ¿Cómo se disponen los Microtúbulos en las células? Los podemos encontrar en:  Distribuidos en toda la célula  Constituyendo el huso mitótico  Como eje de cilios y flagelos ¿Qué función cumple en la célula? Como ya mencionamos forman parte del citoesqueleto para dar un andamiaje estructural pero al igual que los filamentos de Actina también juegan un papel en el movimiento celular:  De la célula como un todo como es el caso del flagelo del espermatozoide.  Intervienen en el transporte intracelular. Para lograrlo se asocian a otras proteínas relacionadas con el microtúbulo (MAP). Las dos proteínas motoras del Microtúbulo son: Dineina: la cual transporta del extremo positivo al negativo y la Cinesina transporta del extremo negativo al positivo. 30 RECUERDA: El citoesqueleto permite a la célula el mantenimiento de su forma, la capacidad para cambiarla y desplazarse, así como para mantener la ubicación de los organelos celulares o facilitar el desplazamiento de éstos y de otros componentes o sustancias. ORGANELAS CITOPLASMÁTICAS. Son estructuras celulares metabólicamente activas que realizan funciones específicas. En general las organelas se clasifican de acuerdo a si presentan en su constitución membrana plasmática o no. Pero también podemos clasificarlas de acuerdo a la función que ellas realizan: Organelas relacionadas con la función de síntesis: 1. RER 2. REL 3. Aparato De Golgi 4. Ribosomas Organelas relacionadas con la producción de energía 1. Mitocondria Organelas relacionadas con la digestión 1. Lisosomas 2. Peroxisomas 3. Proteosomas Organelas relacionadas con la división celular 1. Centriolos 2. Microtúbulos Organelas relacionadas con la estructura y movimiento celular 1. Microtúbulos 2. Microfilamentos 3. Filamentos intermedios. 1. LA MEMBRANA PLASMÁTICA. Toda célula está constantemente rodeada por una membrana que recibe el nombre de membrana celular, membrana plasmática o plasmalema. Las membranas no solo separan el interior celular de su entorno sino que definen los compartimientos internos de las células eucariotas. Fíjese en lo siguiente: a) Además del plasmalema, la célula posee otros sistemas de membrana que incluyen: la membrana nuclear y la membrana que reviste a los organelos (RER, REL, mitocondrias, Golgi, lisosomas, peroxisomas, proteosomas). b) Mientras el plasmalema delimita la célula como un todo, los restantes sistemas membranosos delimitan dentro de las células diferentes compartimientos, permitiendo así una separación de funciones. Vale decir en cada compartimiento intracelular, delimitado por membranas, se realiza con máxima eficacia determinado número y tipo de funciones. 31 c) Las membranas biológicas no son funcionalmente inertes, intervienen activamente en los procesos bioquímicos que se realizan en el compartimiento celular por ella delimitado. d) De modo permanente se realiza un intercambio de membrana entre el plasmalema y los restantes sistema de membranas intracelulares. e) De su integridad depende de forma crucial la estructura y función celular. Desde el punto de vista morfológico, cuando se examinan preparados histológicos teñidos con H/E, en el microscopio de luz, las membranas plasmáticas no son visibles. Cuando el tejido es tratado y fijado con osmio y luego observado con el microscopio electrónico todas las membranas biológicas se observan con una estructura trilaminar definida como: Dos líneas densas, de alta densidad electrónica, de 2,5 a 3 nm de espesor, separadas por Una línea lúcida, de baja densidad electrónica, de 3,5 a 4 nm de espesor. Esta estructura trilaminar, también se le observa a los organelos membranosos de allí que se denomine UNIDAD DE MEMBRANA. Estas características ultraestructurales son la expresión, como veremos más adelante, de su composición molecular. COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA MEMBRANA. Desde el punto de vista de su composición química la membrana plasmática está constituida por lípidos, proteínas y carbohidratos. La disposición de sus elementos constituyentes se basa en las propiedades de los lípidos, de allí que todas las membranas celulares compartan una misma organización estructural: “BICAPA DE FOSFOLÍPIDOS CON PROTEINAS ASOCIADAS”. LÍPIDOS. La mayoría de los lípidos presentes en las membranas son fosfolípidos, glucolípidos y colesterol. Todos tienen carácter anfipático. Es decir, parte de la molécula es hidrófoba y parte de la molécula es hidrófila Los fosfolípidos, los lípidos más abundantes, son los bloques de construcción fundamental de todas las membranas celulares. Ellos consisten en dos cadenas de ácidos grasos ligados a un grupo de cabeza hidrófilo compuesto por glicerol unido a fosfato. Debido a que sus colas son escasamente solubles en agua, los fosfolípidos forman bicapas espontáneamente en soluciones acuosas, con las colas hidrófobas enterradas en el interior de la membrana y los grupos polares de cabeza expuestos en ambos lados en contacto con el agua. Dichas bicapas lipídicas forman una barrera estable entre dos compartimientos acuosos y representan la estructura básica de todas las membranas biológicas. Las moléculas de ácidos grasos de los fosfolípidos forman uniones covalentes con la molécula de glicerol y uniones no covalentes débiles con los ácidos grasos de la otra bicapa, manteniendo así unidas las bicapas. Las otras moléculas anfipáticas que se encuentran en la membrana son glucolípidos y el colesterol y representan el 40% de los lípidos totales. Una propiedad importante de las bicapas lipídicas es que se comportan como fluidos bidimensionales en los que las moléculas individuales son libres para rotar y moverse en direcciones laterales. Esta fluidez es una propiedad crucial de las membranas y depende tanto de la temperatura como de su composición lipídica. En líneas generales los lípidos con 32 ácidos grasos de cadenas cortas o insaturados le confieren mayor fluidez a la membrana. El colesterol, se inserta en la bicapa lipídica con su extremo hidrófilo hacia la cabeza de los fosfolípidos y sus anillos hidrocarbonados rígidos interactúan con las cadenas de ácidos grasos adyacentes a las cabezas del fosfolípido; esta interacción disminuye la movilidad de las porciones externas de las cadenas de ácidos grasos, haciendo que esta parte de la membrana sea más rígida. El colesterol disminuye la fluidez de las membranas. PROTEÍNAS. Representan el componente fundamental de casi todas las membranas biológicas. Estas moléculas son anfipáticas como los fosfolípidos, con un extremo polar y otro no polar. En la región polar se encuentran residuos de aminoácidos hidrofílicos y residuos de azúcares los cuales están en contacto con el agua. La región no polar contiene residuos no polares y está embebida en la región hidrofóbica de la membrana. Las proteínas de la membrana plasmática mejor estudiadas son las del eritrocito. Se dividen en dos grupos generales de proteínas de acuerdo a su asociación con la membrana:  Las proteínas integrales de membrana: embebidas directamente dentro de la bicapa lipídica. Están unidas a los lípidos por interacciones hidrofóbicas y enlaces covalentes.  Las proteínas periféricas de membrana: se localizan a un lado u otro de la bicapa lipídica y están unidas débilmente a las cabezas polares de los lípidos de membrana u otras proteínas integrales por enlaces de hidrógenos. Son más abundantes en la cara citoplasmática y corresponden en su mayoría a enzimas. Las proteínas de membrana desempeñan las funciones específicas de las diferentes membranas de la célula.  Interviene en el transporte a través de la membrana.  Actúan como receptores.  Proteínas de enlace (CAMs)  Enzimas. CARBOHIDRATOS. Los carbohidratos se sitúan en la superficie externa de las células eucariotas por lo que contribuyen a la asimetría de la membrana. Estos glúcidos son oligosacáridos unidos a lípidos (glucolípidos) o a las proteínas (glicoproteínas). Esta cubierta de glúcidos representa el carnet de identidad de las células, constituyen la cubierta celular o glucocáliz, a la que se atribuyen funciones fundamentales: 1) Protege la superficie de las células de posibles lesiones. 2) Confiere viscosidad a las superficies celulares, permitiendo el deslizamiento de células en movimiento como, por ejemplo, las células sanguíneas. 3) Presentan propiedades inmunitarias, por ejemplo los glúcidos del glucocáliz de los glóbulos rojos representan antígenos propios de los grupos sanguíneos del sistema sanguíneo ABO. 4) Intervienen en los fenómenos de reconocimiento celular, particularmente importantes durante el desarrollo embrionario. 33 5) Intervienen en los procesos de adhesión entre óvulo y espermatozoide. En la actualidad el modelo más aceptado que explica la conformación de la membrana plasmática es el propuesto por Singer y Nicholson (1972) denominado modelo del mosaico fluido, el cual presenta las siguientes características: a) Considera que la membrana es como un mosaico fluido en el que la bicapa lipídica es la red cementante y las proteínas embebidas en ella, interacciona unas con otras y con los lípidos. Tanto las proteínas como los lípidos pueden desplazarse lateralmente. b) Los lípidos y las proteínas integrales se hallan dispuestos en mosaico. c) Las membranas son estructuras asimétricas en cuanto a la distribución fundamentalmente de los glúcidos, que solo se encuentran en la cara externa. Por el medio de Criofractura, las membranas se dividen en su parte media y pueden analizarse las dos mitades:  Cara P: es la cara interna de la membrana, que mira hacia el exterior donde se observan numerosas partículas de 6 a 9 nm, que representan las proteínas integrales de membrana.  Cara E: es la cara de la mitad externa de la membrana que mira hacia adentro y es relativamente lisa. CONVIENE COMPRENDER Y RECORDAR:  Desde el punto de vista morfológico, cuando se examinan en microfotografías electrónicas, todas las membranas biológicas se componen de 3 láminas: dos externas muy densas y otra central más clara.  Esta estructura trilaminar se ha designado, en consecuencia, con el nombre de UNIDAD DE MEMBRANA.  Desde el punto de vista químico todas las membranas biológicas son complejos lipoproteicos con una disposición similar de sus lípidos y proteínas.  Sin embargo la composición química difiere de un sistema de membrana a otro y aún, de un sitio a otro dentro de la misma membrana Este modelo de organización de las membranas biológicas admite dos características de extraordinaria importancia funcional. La primera de ellas sostiene que las membranas biológicas son estructural y funcionalmente asimétricas. Esto quiere decir, que las superficies EXTERIOR e INTERIOR de la membrana poseen diferente composición química y, por ende, diferentes funciones. De hecho: Las proteínas receptoras se ubican en la superficie exterior y suelen ser diferentes los tipos de enzimas que se hallan en una u otra superficie. Sin embargo; La máxima asimetría se obtiene a consecuencia de que los grupos carbohidratos que forman parte de las glicoproteínas y de los glucolípidos de la membrana se disponen en su totalidad hacia la superficie EXTERIOR de la célula. De esta manera puede aceptarse que: Las células están exteriormente tapizadas por una capa de carbohidratos, más o menos desarrollada, que constituye lo que se denomina cubierta celular o GLUCOCALIX. 34 La segunda característica atribuida a las membranas es su fluidez, la cual es tanto mayor cuanto mayor sea la proporción de ácidos grasos no saturados y de cadena corta que contengan. El contenido en colesterol disminuye la fluidez. El hecho de que las membranas no sean estructuras rígidas sino fluidas permite que, tanto las moléculas de proteínas como los lípidos, puedan desplazarse en el interior de las mismas. La membrana plasmática mantiene la relación entre la célula y el exterior. TRANSPORTE A TRAVÉS DE LA MEMBRANA. Transportes de Moléculas de Baja Masa Molecular. 1. EL TRANSPORTE PASIVO. Es un proceso de difusión de sustancias a través de la membrana. Se produce siempre a favor del gradiente, es decir, de donde hay más hacia el medio donde hay menos. Este transporte puede darse por: o DIFUSIÓN SIMPLE. Es el paso de pequeñas moléculas a favor del gradiente; puede realizarse a través de la bicapa lipídica o a través de canales proteicos. o Difusión simple a través de la bicapa. Así entran moléculas lipídicas como las hormonas esteroideas, anestésicos como el éter y fármacos liposolubles. Y sustancias apolares como el oxígeno y el nitrógeno atmosférico. Algunas moléculas polares de muy pequeño tamaño, como el agua, el CO2, el etanol y la glicerina, también atraviesan la membrana por difusión simple. La difusión del agua recibe el nombre de ósmosis o Difusión simple a través de canales. Se realiza mediante las denominadas proteínas de canal. Así entran iones como el Na+, K+, Ca2+, Cl-. Las proteínas de canal son proteínas con un orificio o canal interno, cuya apertura está regulada, por ejemplo por ligando, como ocurre con neurotransmisores u hormonas, que se unen a una determinada región y el receptor de la proteína de canal, sufre una transformación estructural que induce la apertura del canal. o DIFUSIÓN FACILITADA. Permite el transporte de pequeñas moléculas polares, como los aminoácidos, monosacáridos, etc., que al no poder atravesar la bicapa lipídica, requieren que proteínas trasmembranosas faciliten su paso. Estas proteínas reciben el nombre de proteínas transportadoras o permeasas que, al unirse a la molécula a transportar sufren un cambio en su estructura que arrastra a dicha molécula hacia el interior de la célula. 2. EL TRANSPORTE ACTIVO. En este proceso también actúan proteínas de membrana, pero éstas requieren energía, en forma de ATP, para transportar las moléculas al otro lado de la membrana. Se produce cuando el transporte se realiza en contra del gradiente electroquímico. Son ejemplos de transporte activo la bomba de Na/K, y la bomba de Ca. o La bomba de Na+/K+ Requiere una proteína transmembranosa que b