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Questions and Answers
¿Qué efecto tienen los fijadores sobre los microorganismos patógenos presentes en los tejidos?
¿Cuál es el principal objetivo de la fijación en los tejidos?
¿Cuál de las siguientes propiedades no es deseada en un fijador?
La fijación por inmersión se refiere a:
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¿Qué característica es esencial para que un fijador sea efectivo?
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¿Cuál de los siguientes efectos indeseables puede provocar un fijador?
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La fijación por perfusión implica:
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Entre las condiciones que debe cumplir un fijador, ¿cuál es incorrecta?
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¿Cuál es la función principal de los objetivos en un microscopio?
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¿Qué indica el número de aumento en un objetivo?
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¿Cómo se relaciona la abertura numérica con la resolución de la imagen?
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¿Qué representa el límite de resolución en un microscopio?
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¿Cuál es la longitud de onda promedio de la luz blanca utilizada en el cálculo del límite de resolución?
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¿Qué factor NO influye en la resolución de un microscopio?
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Qué determina el poder de resolución de un sistema óptico?
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¿Cuál es el límite de resolución típico de los mejores microscopios de luz?
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¿Cuál es la principal característica de los materiales isótropos?
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¿Qué fenómeno se observa en materiales anisótropos al incidir un rayo de luz?
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¿Cómo se distribuyen los átomos en los materiales anisótropos?
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¿Qué estructuras celulares exhiben birrefringencia?
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¿Cuál es la principal utilidad del microscopio de luz polarizada en biología?
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¿Qué tipo de organización cristalina presentan los materiales anisótropos?
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¿Cuál es una propiedad de los materiales isótropos en relación con el índice de refracción?
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¿Qué aplicaciones tiene el microscopio que observa la anisotropía?
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¿Cuál es una característica del tetróxido de osmio en la fijación de tejidos?
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¿Qué líquido de fijación incluye una mezcla de cromo, osmio y ácido acético?
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¿Cuál es el propósito de eliminar el ácido pícrico después de la fijación con el líquido de BOUIN?
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¿Cuál es la función del xilol en la técnica histológica de rutina?
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Antes de incluir tejido en parafina después de una fijación con líquido de BOUIN, ¿qué se debe hacer?
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¿Cuál de los siguientes fijadores está diseñado específicamente para tejidos blandos y embriones?
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¿Qué sucede si se excede el tiempo de fijación con líquido de BOUIN más de 48 horas?
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¿Qué proceso se realiza después de la fijación para obtener cortes delgados de tejido?
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¿Qué es un hibridoma en el contexto del sistema inmunológico?
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¿Cuál es la principal desventaja de la inmunofluorescencia directa?
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¿Qué tipo de célula es considerada la unidad mínima de un organismo?
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¿Cuál de los siguientes tipos de tejidos NO es uno de los cuatro tejidos fundamentales?
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¿Qué describe mejor la función de los linfocitos B activados en el sistema inmunológico?
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¿Cómo se clasifica la inmunofluorescencia indirecta en comparación con la inmunofluorescencia directa?
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¿Cuál es una característica común de todas las células?
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¿Qué componente se utiliza para marcar específicamente los anticuerpos en la inmunofluorescencia?
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Study Notes
Los objetivos del microscopio
- La función de los objetivos es generar la primera imagen ampliada del objeto de observación. La resolución del microscopio depende de los objetivos.
- Los objetivos tienen datos importantes que se pueden identificar a simple vista:
- Número de aumento: indica la amplificación de la imagen que genera el objetivo. Los objetivos de uso común son 4X, 10x , 40X y 100X.
- Abertura numérica: determina la capacidad de la lente frontal del objetivo (la primera lente) de captar rayos luminosos. La resolución de la imagen depende de la abertura numérica. A mayor cantidad de rayos difractados que captura el objetivo, mejor será la imagen. Para formar la imagen, es imprescindible que la lente frontal del objetivo capte rayos difractados.
- La abertura numérica se encuentra grabada en el objetivo y suele ser: 0,30 para el objetivo de 10X, 0,65 para el de 40X y 1,30 para el de 100X.
- Poder de resolución: es la capacidad del ojo o un sistema óptico para diferenciar dos puntos cercanos. Esta capacidad tiene un límite de resolución, la distancia mínima entre dos puntos necesaria para que el sistema óptico los identifique como entidades distintas.
- El ojo humano tiene un límite de resolución de aproximadamente 0,08 mm, por lo que puede identificar estructuras no menores a 100 m de diámetro.
- A mayor resolución, mejor definición de la imagen, más detalles y mejor calidad de imagen.
- El límite de resolución del objetivo se calcula con la siguiente fórmula:
LR= k x lambda/AN.
Donde:
- k es una constante cuyo valor es 0,61.
- lambda es la longitud de onda de la luz empleada. Para luz blanca, lambda es 500nm (0,55).
- AN es la abertura numérica del objetivo empleado.
- Un sistema óptico tiene mayor poder de resolución cuanto menor sea el límite de resolución. La abertura numérica y el límite de resolución tienen una relación inversa: a mayor abertura numérica, mejor resolución.
- La resolución también depende de: longitud de onda de la luz, espesor de la muestra, calidad de la fijación e intensidad de la coloración.
- El límite de resolución de los mejores microscopios de luz es de 0,25 m.
Materiales isótropos y anisótropos
- Algunos materiales tienen sus átomos uniformemente distribuidos en las tres direcciones principales del espacio, presentando máxima simetría (cúbica o regular).
- Otros materiales, en cambio, carecen de organización atómica, presentando una distribución azarosa.
- Los materiales con distribución atómica regular tienen las mismas propiedades ópticas, independientemente de la dirección en que se midan. Se les denomina isótropos.
- Cuando la luz atraviesa sustancias isótropas, su velocidad es la misma en todas las direcciones.
- Los materiales con organización cristalina diferente (hexagonal, trigonal, tetragonal, rómbico, entre otras) tienen sus átomos dispuestos de forma asimétrica, variando según la dirección. Su comportamiento con la luz también es diferente, denominándose anisótropos.
- La estructura interna del espécimen determina su comportamiento isótropo o anisótropo.
- Los materiales anisótropos presentan índices de refracción distintos en relación a la dirección del haz de luz.
- Los materiales isótropos tienen un índice de refracción constante.
Microscopio de luz polarizada.
- Cuando un rayo de luz incide sobre la superficie de un material anisótropo transparente, se produce el fenómeno de doble refracción o birrefringencia.
- La birrefringencia ocurre cuando se generan dos rayos refractados distintos, que vibran en planos diferentes y se propagan a diferentes velocidades dentro del material.
- El microscopio de luz polarizada permite estudiar las propiedades ópticas de los especímenes.
- Es útil para observar y fotografiar elementos visibles gracias a la anisotropía, por lo que se utiliza en cristalografía.
- También se emplea para estudiar el carácter birrefringente de estructuras celulares anisótropas.
- En biología, es útil para distinguir sustancias isotrópicas de las anisótropas, revelando información detallada sobre la estructura y composición de los materiales.
- Se utiliza para caracterizar materiales con fines diagnósticos.
- Ejemplos de estructuras que presentan birrefringencia: músculo estriado y los cristaloides en las células intersticiales de Leydig del testículo.
Aplicaciones del microscopio de luz polarizada.
- Identificar sustancias cristalinas o fibrosas:
- Intracelulares (como el citoesqueleto).
- Extracelulares (sustancia amiloide, asbesto, colágeno, cristales de uratos y otras de origen exógeno).
Fijación de tejidos
- La fijación es un proceso para detener el desarrollo de procesos orgánicos en los tejidos y conservarlos lo más fielmente posible al estado original.
- Los fijadores actúan coagulando las sales proteicas de las células, endureciendo los geles e inactivando las enzimas.
- La mayoría de los fijadores son antisépticos, matando agentes patógenos que podrían infectar el tejido.
Objetivos de la fijación:
- Abolir el metabolismo celular.
- Impedir la degradación enzimática de las células y tejidos por autolisis.
- Destruir microorganismos patógenos (bacterias, hongos y virus).
- Endurecer el tejido, debido a la formación de enlaces cruzados o desnaturalización de las moléculas proteicas.
Condiciones que debe cumplir un fijador:
- Preservar el tejido.
- No producir artificios.
- No dificultar el tratamiento ulterior.
- Poder y velocidad de penetración.
Propiedades de los fijadores:
- Preservan la morfología celular y tisular.
- Preservan la composición química.
- Penetran a los tejidos con relativa rapidez.
- Facilitan la coloración posterior.
- Inhiben el crecimiento microbiano y la putrefacción.
- Aumentan la consistencia de los tejidos.
Efectos indeseables de algunos fijadores:
- Retraen los tejidos.
- Precipitan en forma de cristales.
- Endurecen demasiado las muestras.
- Poseen olor desagradable e irritan la piel y las mucosas.
- Producen alteraciones importantes a nivel molecular.
- Producen alteraciones importantes a nivel ultraestructural.
Técnicas de fijación.
- Se realiza inmediatamente después de obtener la muestra.
- La fijación se puede realizar por dos métodos:
- Fijación por inmersión: colocar el tejido en un recipiente con el fijador.
- Fijación por perfusión: introducir el fijador por vía sanguínea.
Fijación por inmersión.
- Sumergir un pequeño trozo de tejido en el fijador inmediatamente después de la extracción.
- Es importante cuidar la baja penetración tisular de este método, ya que puede producir retracciones.
-
Tetróxido de osmio:
- Forma puentes entre moléculas.
- Se emplea al 1 % en soluciones tamponadas.
- Es un buen fijador de la ultraestructura de la célula, por lo que se utiliza para observaciones con el microscopio electrónico.
- Es un buen fijador para grasas y membranas celulares.
- Debido a su fuerte carácter oxidante, no se utiliza para las tinciones convencionales, excepto para impregnaciones argénticas, como el método de Golgi.
Fijadores compuestos
- Son mezclas de varios fijadores simples, elegidos para complementar la acción o atenuar los defectos de cada uno.
- Algunos fijadores compuestos:
- Líquido de Fleming: mezcla cromo-osmio-acética.
- Líquido de Zenker: mezcla bicromato-sublimado-acética.
- Líquido de Helly: mezcla Zenker-formol.
- Líquido de Bouin: mezcla picro-formos-acética.
- Líquido de Duboscq-Brasil o Bouin alcohólico.
Líquido de Bouin.
- Está formado por ácido pícrico, formaldehido y ácido acético glacial.
- Es muy útil para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el núcleo y el glucógeno.
- El tiempo de fijación no debe exceder las 48 horas en el caso de fijaciones por inmersión.
- Antes de la inclusión en parafina, es conveniente eliminar el ácido pícrico mediante lavados con alcohol de 70°, ya que puede dificultar la inclusión y la tinción.
Inclusión en parafina.
- Para obtener rebanadas delgadas de tejido, es necesario endurecerlo.
- Después de la fijación, se impregna el tejido e incluye en un bloque de parafina.
- La parafina permite realizar cortes delgados y uniformes.
¿Cómo se impregna el tejido con parafina?
- Las células y los tejidos son ricos en agua, y la parafina no es soluble en agua.
- Para lograr la impregnación, se extrae el agua y se sustituye por una sustancia soluble en parafina.
- El solvente de la parafina que se usa en la técnica histológica de rutina es el xilol.
- El xilol no es soluble en agua.
Hibridomas.
- Los linfocitos B activados se aíslan en el sistema inmunológico (bazo, ganglios linfáticos).
- Estos linfocitos B se fusionan con líneas celulares de plasmocitos de un mieloma múltiple.
- El resultado es un hibridoma, una línea celular capaz de secretar un anticuerpo individual inmortalizado.
Inmunofluorescencia.
- Combina la técnica de antígeno-anticuerpo con la capacidad de ciertos cuerpos de absorber longitudes de onda específicas, emitiendo luego luz de una longitud de onda específica.
- Se utiliza para identificar y localizar moléculas específicas en tejidos y células.
- Se utiliza un anticuerpo que se une específicamente al antígeno que se busca.
- El anticuerpo se marca con una sustancia que puede absorber la luz y luego emitirla con una longitud de onda diferente, creando fluorescencia.
- Existen dos métodos principales:
- Inmunofluorescencia directa: el anticuerpo se marca con fluorocromo y se pone en contacto con la muestra. Es menos sensible que la inmunofluorescencia indirecta.
- Inmunofluorescencia indirecta: se genera un anticuerpo secundario contra el anticuerpo (anticuerpo primario) que buscamos. El anticuerpo secundario se conjuga con el fluorocromo. Este método es más sensible que el método directo.
La célula.
- La célula es la unidad mínima de un organismo capaz de actuar de manera autónoma.
- Es la unidad anatómica, fisiológica y de origen de los seres vivos.
- Todos los organismos vivos están formados por células. No hay seres vivos si no hay al menos una célula.
- El ser humano está formado por más de 200 tipos diferentes de células, cada una con función específica.
- Todas las células comparten características comunes.
- Las similitudes entre los diferentes tipos de células proporcionan un marco común para la biología celular.
- Las células similares se agrupan para formar tejidos.
- Los cuatro tejidos fundamentales (epitelial, conectivo, muscular y nervioso) se unen para formar órganos.
- Los órganos forman aparatos y sistemas.
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