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CONCEPTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA En un sentido amplio, se puede definir la biología molecular como la parte de la biología que estudia la composición, estructura y función de las moléculas biológicamente importantes, así como de los procesos en los que están implicadas. Esta definición...

CONCEPTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA En un sentido amplio, se puede definir la biología molecular como la parte de la biología que estudia la composición, estructura y función de las moléculas biológicamente importantes, así como de los procesos en los que están implicadas. Esta definición englobaría principalmente el estudio de ácidos nucleicos y proteínas. Sin embargo, el vertiginoso desarrollo de nuevas técnicas y metodologías para el estudio de ambas macromoléculas ha provocado la especialización de los laboratorios y la separación conceptual de ambos tipos de estudios: La denominación “biología molecular”, se reserva para el estudio de los ácidos nucleicos. El estudio de proteínas se realiza en laboratorios de proteómica. Con esta nueva concepción, la biología molecular se ha convertido en la herramienta más potente de la genética. Por otro lado, la citogenética, se ha considerado, clásicamente, como la parte de la genética que estudia la estructura, función y comportamiento de los cromosomas en metafase. En la actualidad, está tomando auge la citogenética molecular, basada en el uso de técnicas características de la biología molecular. En consecuencia, tanto el laboratorio de biología molecular como el de citogenética se podrán considerar laboratorios de genética. 2. EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR La legislación actual no contempla ninguno de estos laboratorios como unidades independientes. El Real Decreto 1277/2003, de 10 de octubre, por el que se establecen las bases generales sobre autorización de centros, servicios y establecimientos sanitarios, en su anexo II, dedicado a las definiciones de centros, unidades asistenciales y establecimientos sanitarios, define la Unidad de Genética, como la unidad asistencial que, bajo la responsabilidad de un facultativo con formación adecuada, está dedicada a la realización de pruebas genéticas y la emisión de los dictámenes correspondientes con fines diagnósticos. Según esta definición, ambos laboratorios quedarían encuadrados dentro de la Unidad de Genética. La técnica básica que se lleva a cabo en el laboratorio de biología molecular es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Permite amplificar de forma exponencial pequeñas cantidades de ADN (A partir de una cantidad mínima de ADN, obtener millones de copias iguales a esta). Al ser considerada la herramienta molecular por excelencia, la estructuración del laboratorio, los flujos y las formas de trabajo se van a organizar alrededor de esta técnica. EL EQUIPAMIENTO Se puede hablar de dos tipos de equipamiento: equipamiento específico y equipamiento genérico EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO El equipamiento específico del laboratorio de biología molecular es el que permite realizar las técnicas exclusivas de este tipo de laboratorio TERMOCICLADOR Es el aparato en el que se lleva a cabo la PCR. Es un aparato básico en cualquier laboratorio de biología molecular. Permite realizar secuencialmente un número elevado de ciclos repetitivos programables con temperaturas diferentes y distintos tiempos de incubación, controlados por un microprocesador. Las partes más destacables del termociclador son: bloque incubador y tapa termostatizada. ▪ Bloque incubador: es la parte más importante. Se trata de un soporte metálico, con múltiples pocillos para colocar los tubos de reacción de PCR. Es capaz de mantener de manera homogénea, en todo su volumen, durante los tiempos que se requiera, las distintas temperaturas que se programan para cada fase y en cada uno de los ciclos de PCR. El rango de temperaturas que pueden alcanzar estos bloques normalmente va de 4ºC a 96ºC. Los distintos modelos de termocicladores que existen se diferencian principalmente en la tecnología que utilizan para calentar y enfriar este bloque: Sistemas de aire caliente y aire frio o resistencias eléctricas (es el sistema más utilizado en los aparatos más antiguos) Materiales semiconductores en conjunción con el efecto Peltier (termocicladores más actuales) ▪ Tapa del bloque incubador: es una tapa termostatizada a 102-105ºC que, una vez cerrada, entra en contacto directo con la tapa de los tubos de reacción. Esto evita que el agua de la mezcla de  reacción PCR se evapore por efecto de las temperaturas alcanzadas en el bloque incubador y se condense en la tapa, más fría, con la consiguiente concentración de los reactivos en la mezcla que alteraría el desarrollo de la reacción. EFECTO PELTIER, es un efecto termoeléctrico que produce una transferencia de calor entre dos metales o semiconductores diferentes unidos por dos soldaduras cuando son atravesados por corriente eléctrica continua. El resultado final es que uno de los semiconductores se caliente y otro se enfría. Se utiliza en los termocicladores actuales para aumentar o bajar rápidamente la temperatura del bloque de incubación. Un tipo especial de termociclador es el termociclador a tiempo real. Este modelo, además de los componentes descritos por el termociclador convencional, incorpora un sistema de láser y detección de fluorescencia capaz de excitar y medir la fluorescencia emitida por cada tubo de reacción individualmente. Esta tecnología permite detectar la síntesis de productos de amplificación en tiempo real. EQUIPO DE ELECTROFORESIS Básicamente este proceso sirve para separar moléculas de ácidos nucleicos de distintos tamaños, y permite por ejemplo analizar los productos amplificados de una PCR o purificar y obtener fragmentos de tamaños concretos de ADN. La electroforesis consiste en la migración de moléculas cargadas através de un medio, por la acción de un campo eléctrico. Las técnicas electroforéticas se utilizan, portanto, para separar compuestos como aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos y ácidosnucleicos. El comportamiento de una molécula en un campo eléctrico viene determinado por la movilidad electroforética, que depende directamente de la carga, de la forma y del tamaño de las moléculas. Para llevar acabo una electroforesis se necesitan los siguientes elementos: FUENTE DETENSIÓN O ALIMENTACIÓN: proporciona el campo eléctrico mediante dos electrodos, el positivo(ánodo) y el negativo (cátodo), y entre ambos se establece una diferencia de potencial. Las moléculas con carga negativa migran hacia el ánodo y las que tienen carga positiva hacia el cátodo. CUBETA: recipiente en cuyos extremos se sitúan los electrodos y donde se vierte el tampón de electroforesis. SOPORTE ELECTROFORÉTICO: puede ser papel,membrana o gel. Se lleva a cabo aplicando un campo eléctrico en una disolución tampón (Ph 7,5 – 7,8) en la que se sumerge una matriz que contiene las muestras de ácidos nucleicos. Estos migran con mayor o menor velocidad a través de la matriz en función de la carga que poseen, su tamaño y su conformación tridimensional. La matriz que se utiliza es un gel de agarosa o bien de poliacrilamida. El uso de uno u otro y la concentración de los componentes dependerá del tamaño de las moléculas que queremos separar y de la resolución que queramos obtener. El equipo que permite efectuar la electroforesis consta de: Soporte plástico o “cama” donde solidificar el gel Cubeta de electroforesis. Se compone de: ▪ Un soporte central para la “cama” con el gel. ▪ Dos zonas de depósito de tampón de electroforesis (BUFFER) en cada uno de los extremos ▪ Electrodos positivo y negativo en cada extremo. Fuente de iluminación que suministre corriente eléctrica continua a la cubeta de electroforesis. Debe permitir seleccionar voltaje o amperaje y graduar su intensidad. DOCUMENTADOR DE GELES Después de terminar la electroforesis se podrá visualizar los resultados mediante la utilización del documentador de geles. El documentador de geles es un equipo que permite visualizar las bandas de ácidos nucleicos en el gel después de la electroforesis y obtener una fotografía de él. El equipo consta básicamente de: Un transiluminador: consiste en una fuente de luz ultravioleta situada por debajo de una superficie transparente al UV donde se coloca el gel. Cuando la luz ultravioleta ilumina el gel, el agente intercalante emite fluorescencia, visualizándose las moléculas de ácidos nucleicos. Una cámara fotográfica o sistema de captación de imágenes. La visualización del gel se realiza con una cámara fotográfica, adecuada para trabajar con luz UV y controlada por un software específico. Con esta cámara es posible visualizar el gel en la pantalla de un monitor, mejorar las condiciones de la imagen, obtener fotografías y realizar mediciones. EQUIPAMIENTO GENÉRICO El equipamiento genérico es común con otro tipo de laboratorios, aunque algunos aparatos puedan tener características o adaptaciones especiales para aplicaciones concretas de biología molecular. CABINA DE BIOSEGURIDAD Las cabinas de seguridad biológica son equipos que proporcionan una barrera de contención para trabajar de forma segura con agentes infecciosos. Se les conoce igualmente bajo otras denominaciones tales como cabinas de bioseguridad, campanas microbiológicas o campanas de flujo laminar. Dependiendo de su diseño y clasificación, las cabinas de seguridad biológica son adecuadas para proteger al: Trabajador Medio ambiente Producto En los laboratorios de biología molecular se deben utilizar cabinas de flujo laminar vertical de clase II, que protegen de contaminación a la muestra, a la persona manipuladora y al medio ambiente. Existen diferentes tipos de cabinas de flujo laminar que tienen como fines generales: Proteger al operario: de agentes patógenos o contaminantes desarrollados en el interior de la cabina. Proteger el cultivo: de patógenos o contaminantes externos o internos de la cabina. Proteger al medio ambiente de patógenos o contaminantes desarrollados en el interior de la cabina. CABINAS DE BIOSEGURIDAD CLASE I Protegen al operario y al medio ambiente. Son adecuadas para la manipulación de agentes de bajo riesgo. Se denominan normalmente de gases. CLASE II Protegen al operario, al cultivo y al medio ambiente. En general, las cabinas de clase II cuentan con un equipo de protección con un panel frontal de acceso. Mantienen un flujo laminar estable en el interior, con una filtración HEPA para el aire recircularizado en cada ciclo y una filtración HEPA del aire exhausto (de salida al medio). CLASE III Es una cabina de seguridad estanca para el trabajo con agentes biológicos de alto riesgo. Existen unas recomendaciones para el uso de las cabinas de seguridad biológica (CSB): Introducir solo el material necesario para trabajar. Trabajar con mecheros bunsen, si es necesario, siempre en los lugares dentro de la cabina donde no se modifique el flujo laminar y se puedan producir turbulencias. Usar tubos con tapón de rosca y no con tapones de algodón porque pueden desprender fibras. Realizar movimientos lentos en el interior de la cabina para no producir turbulencias. Trabajar entre 5 y 10 cm de la superficie de trabajo porque es la zona mejor descontaminada. Es necesario seguir un protocolo de trabajo que consiste en: Poner en funcionamiento la cabina entre 15 y 30 minutos antes del trabajo y conectar la luz UV. Desinfectar con alcohol isopropílico al 70% la superficie de trabajo. Cargar la cabina con el material necesario para trabajar previamente descontaminando con alcohol al 70% y esperar de 2 a 3 minutos antes de empezar a trabajar para descontaminar el material. Empezar a trabajar en la cabina. Al terminar el trabajo en la cabina, desinfectar con alcohol al 70% y dejar 15 minutos la cabina en funcionamiento antes de apagarla o volver a usarla y conectar la luz UV. SISTEMA DE PURIFICACIÓN DE AGUA  En el mercado hay muchos equipos de purificación de agua basados en distintas tecnologías, como electrodesionización, resinas de intercambio iónico, ósmosis inversa, filtración… CLASIFICACION DE LOS TIPOS DE AGUA SEGÚN ASTM 1193: 2001 CLASE I (ULTRA PURA) Usada para procedimiento que requieren de máxima exactitud y precisión; tales como espectrometría atómica, fotometría de llama, enzimología, gas en la sangre, soluciones buffer de referencia y reconstitución de materiales liofilizados usados como estándares. CLASE II ( PURIFICADA) Recomendada para la mayoría de las pruebas analíticas y generales de laboratorio, tales como los análisis hematológicos, serológicos y microbiológicos; así como para métodos químicos en los que específicamente no se indique o se haya comprobado que requieren agua de calidad Tipo I. La ASTM especifica que el agua Tipo II sea preparada por destilación y como factor importante recomienda que esté siempre libre de impurezas orgánicas. CLASE III Satisfactoria para algunas pruebas generales de laboratorio; para la mayoría de los análisis cualitativos, tales como uroanálisis, procedimientos histológicos y parasitológicos; para el enjuague de muestras analíticas; preparación de soluciones de referencia; y para el lavado o enjuague de cristalería (el enjuague final de la cristalería debe hacerse con el tipo de agua especificado para el procedimiento realizado). CLASE IV Sirve para la preparación de soluciones y para el lavado o enjuague de cristalería. El laboratorio de biología molecular requiere un suministro estable de agua purificada tipo II y agua ultrapura tipo I. La elección de uno u otro dependerá del consumo diario de ambos tipos de agua. Cuando el consumo de ambos tipos de agua es muy bajo, se pueden adquirir como si se trataran de un reactivo más. ESPECTROFOTÓMETRO La medida de la concentración de ácido nucleico de una muestra y su pureza requiere lecturas de absorbancia en un rango de longitudes de onda comprendidas entre 230 y 320 nm, por lo que se requiere un espectrofotómetro que cubra ese rango. Dado que en ocasiones la cantidad de muestra es muy pequeña, se han diseñado espectrofotómetros específicos para cuantificar ácidos nucleicos que utilizan cantidades mínimas de muestra (1 ul) basados en cubetas capilares. MICROSCOPIO DE LUZ TRANSMITIDA Y FLUORESCENCIA En biología molecular, un microscopio de fluorescencia es imprescindible para interpretar las técnicas de hibridación in situ fluorescente. Debe de estar dotado con los filtros de fluorescencia adecuados para los fluorocromos utilizables y es aconsejable que tenga un sistema de captación de imágenes. AUTOCLAVE Es imprescindible si se trabaja con microorganismos y aconsejable en cualquier caso. Aunque casi la totalidad del material fungible que se utiliza en el laboratorio se puede adquirir estéril, la utilización del autoclave puede disminuir en gran medida los costes de las tareas de laboratorio. INCUBADOR O ESTUFA Las características de los incubadores que se usan en el laboratorio de biología molecular dependen de las muestras que se estudien y de las técnicas que se apliquen. Si se trabajan con bacterias se necesitarán estufas de cultivo de microbiología. Si se trabaja con cultivos celulares se requerirán incubadores con CO2 y humedad controlada. BAÑO TERMOSTATIZADO, TERMOBLOQUE Y PLACA CALEFACTORA Esta clase de equipamiento con temperatura regulable es básico para realizar todo tipo de incubaciones, digestiones y tratamientos enzimáticos. La placa calefactora, en concreto, es importante que pueda alcanzar de manera homogénea y estable temperaturas de 95-100º C para desnaturalizar el ADN de células y tejidos. CENTRÍFUGA Y MICROCENTRÍFUGA Las centrífugas y microcentrífugas tienen que tener rotores que permiten centrifugar desde tubos de 50 ml a Eppendorf de 0,2 ml. NEVERAS Y CONGELADORES DE -20ºc Y -80ºC Una infraestructura de frío con neveras y congeladores es fundamental para conservar los reactivos y las muestras: La mayor parte de los reactivos (sobre todo las enzimas) se conserva a -20ºC La conservación de todas las muestras de ARN y el almacenamiento a largo plazo de muestras de ADN debe realizarse a -80ºC OTROS EQUIPAMIENTOS En este apartado se puede incluir el equipamiento básico de cualquier laboratorio: Balanzas para pesar reactivos Agitadores magnéticos para preparación de reactivos Vórtex para homogeneizar muestras y reactivos Phmetro… LA ESTRUCTURA DEL LABORATORIO La estructura del laboratorio de biología molecular está condicionada por la técnica principal que se realiza. La realización de una PCR implica: Preparación de reactivos Extracción y purificación de ADN de una muestra biológica Reacción de amplificación propiamente dicha Análisis de los productos de la reacción mediante electroforesis Cada una de estas actividades debe realizarse en un área de trabajo independiente, físicamente separadas en salas distintas y, cada una, con su propio equipamiento y material de trabajo, de manera que estos no puedan ser intercambiables entre ellas. En consecuencia, un laboratorio de biología molecular debe constar de cuatro salas independientes: SALA DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS: se considera que esta es el área “limpia” de laboratorio (sin ADN). En ella se preparan todos los reactivos que se van a utilizar en el laboratorio, incluyendo la mezcla de reacción de PCR. Es fundamental, que los reactivos no se contaminen con ADN, para ello esta sala debería tener una ligera presión positiva, para evitarla entrada de cualquier fuente de contaminación y es imprescindible que disponga de una cabina de bioseguridad. SALA DE PREPARACIÓN DE MUESTRAS Y EXTRACCIÓN DE ADN: Esta es una sala “sucia” (con ADN), por lo que sería conveniente que tuviera una ligera presión negativa, para evitar que pueda escaparse material contaminante. Debe contar con una cabina de bioseguridad y un espectofotómetro. SALA DE PCR: Dispone de los termocicladores necesarios para llevar a cabo la PCR y un espacio de trabajo para añadir las muestras de ADN a la mezcla de reacción. SALA DE POST-PCR: Dispone de los equipos de electroforesis y de documentación de geles. Esta también es una sala “sucia”, fuente importante de contaminación por productos amplificados, por lo que también debería tener una ligera presión negativa. En situaciones ideales la documentación de geles puede situarse en una sala oscura junto con el microscopio de fluorescencia. Por supuesto, esta estructura mínima se puede complicar dependiendo de las tecnologías que usen en el laboratorio. Así, por ejemplo, puede requerirse una “sala limpia” adicional para cultivos celulares y salas “sucias” para los secuenciadores, técnicas de hibridación… 2.3. EL FLUJO DE TRABAJO La estructura parcelada del laboratorio de biología molecular en salas, no es condición suficiente para garantizar el objetivo de que los resultados de la PCR sean fiables. Es necesario que el personal técnico sea consciente de la extremada facilidad con la que se puede producir la contaminación de las muestras problema y por ello hay que tener muy presente el flujo de trabajo. El flujo de trabajo marca el sentido único de los procesos en el circuito de trabajo. En el laboratorio de biología molecular, el flujo de trabajo y de las muestras debe ser siempre unidireccional, desde las áreas limpias a las áreas sucias, en el sentido único hacia delante: PRE-PCR > PCR > POST-P Este flujo implica y pone de manifiesto la necesidad de que cada área de trabajo sea autónoma en el sentido de que debe disponer de su propia infraestructura básica (cabinas, centrifugas, baños, neveras, etc.) y del material de trabajo, pues no es posible el intercambio entre las distintas salas. El material de trabajo son las micropipetas automáticas, los equipos de protección individual (guantes, batas desechables, gafas de protección, etc.) o el material fungible (tubos, Eppendorf, gradillas, pipetas desechables, puntas de pipeta, rotuladores, etc.) y, por supuesto, se debe evitar el retorno de cualquiera de ellos de las áreas «sucias» a las áreas «limpias». 2.4. LAS CONDICIONES DE TRABAJO Es evidente que en el laboratorio de biología molecular se aplican las normas y restricciones de buenas prácticas genéricas que imperan en cualquier laboratorio, como la prohibición de comer, beber, fumar, maquillarse, etc. Pero también hay que establecer unas condiciones de trabajo especificas, que se establecen con miras a impedir, o cuando menos minimizar, la contaminación de las muestras y que consisten en unas normas para la manipulación de materiales y reactivos en condiciones de esterilidad, como la técnica aséptica. LA CONTAMINACIÓN DE LAS MUESTRAS En este contexto, el término contaminación hay que entenderlo en su significado más amplio, como la introducción accidental en la muestra de material exógeno que altera su pureza. Esta contaminación causa resultados erróneos o no interpretables. En este sentido, los dos tipos de contaminantes más peligrosos son: Los ácidos nucleicos extraños a la muestra. Las enzimas no deseadas que degradan ácidos nucleicos (nucleasas). Las fuentes de contaminación pueden ser muy variadas: Contaminación cruzada por: ▪ Material no amplificado del medio ambiente o microorganismos ambientales. Es el caso de los aerosoles generados durante la manipulación de las muestras, como pipeteos, apertura de tubos Eppendorf, centrifugación… ▪ Contaminantes procedentes del propio personal técnico de laboratorio. Como pueden ser células de descamación de la piel, pelo, guantes contaminados, etc. ▪ Contaminantes de las superficies de trabajo. Son los que se acumulan sobre las superficies de trabajo. Contaminación por productos amplificados generados mediante PCR en el propio laboratorio (carryover en la terminología inglesa). Contaminación de los reactivos comerciales y del material fungible: Esto es debido a que la mayoría de los fabricantes garantizan la esterilidad de sus productos, pero esto no es sinónimo de ausencia de ADN o nucleasas. El término estéril significa ausencia de microorga-nismos viables, pero algunos métodos de esterilización no garantizan la eliminación del ADN de los microorganismos ni la inactivación de las enzimas. NORMAS PARA LA MANIPULACIÓN DE MATERIALES Y REACTIVOS Una vez identificadas las fuentes de contaminación, hay que intentar anularlas o prevenirlas. Algunas de las medidas más importantes, como la separación física de las áreas de trabajo y el flujo unidireccional entre ellas. La contaminación de reactivos y material fungible por nucleasas se puede evitar utilizando solo aquellos que estén certificados como libres de nucleasas. La posible contaminación por ADN no se puede controlar, por lo que es importante llevar un control exhaustivo de los reactivos (lotes, fechas de apertura, fechas de caducidad) y realizar controles negativos en todas las técnicas. Pero una de las condiciones de trabajo más importantes para prevenir la contaminación consiste en el uso de buenos hábitos de trabajo en condiciones de esterilidad basados en la técnica aséptica. TECNICA ASEPTICA En los laboratorios de biología molecular el concepto de técnica aséptica se entiende como el conjunto de actividades encaminadas a prevenir la contaminación por microorganismos, ácidos nucleicos y nucleasas. De igual forma, hay que adaptar ese conjunto de actividades al entorno de trabajo de este tipo de laboratorios. Al respecto, en el esquema a pie de página se reseñan las más importantes, teniendo en cuenta que muchas de ellas cumplen un doble objetivo: prevenir la contaminación de la muestra y evitar la contaminación del trabajador por productos biológicos y químicos peligrosos. Lavado de manos. El lavado frecuente de manos es la norma de higiene básica cuando se manipulan muestras biológicas y reactivos químicos, independientemente de que se usen guantes. Uso de equipos de protección individual (EPI). Los principales equipos de protección individual son guantes sin talco y batas. El uso de guantes debe compaginarse con prácticas de trabajo que impidan su  contaminación con las muestras manipuladas. Así, por ejemplo, los tubos Eppendorf con muestras y reactivos deben centrifugarse brevemente antes de ser abiertos. En caso contrario, no solo se pueden producir aerosoles, sino también microsalpicaduras de pequeñas cantidades del contenido retenidas en la cara interna de la tapa, contaminando guantes y superficies. Descontaminación de superficies. La limpieza y descontaminación de las superficies de trabajo se pueden realizar por métodos físicos, como la irradiación con luz UV o por métodos químicos, como el lavado con soluciones de hipoclorito sódico al 10% o descontaminantes comerciales (DNA Zap, DNA Remover, DNA Away …) Prevención de contaminación ambiental. Para prevenir la contaminación cruzada ambiental es imprescindible el uso de: ▪ Cabinas de bioseguridad de clase II. ▪ Puntas de micropipeta especiales. Evitan la contaminación de las pipetas automáticas por aerosoles producidos al aspirar los fluidos. Estas puntas de pipeta pueden ser de dos tipos: De desplazamiento positivo: tienen en su interior un embolo o pistón que las convierte en autenticas microjeringas. Las pipetas que las utilizan tienen un vástago que encaja en el embolo, el cual sube y baja en el interior de la punta succionando y expulsando el fluido, sin que este toque en ningún momento el cuerpo de la pipeta ni se produzcan aerosoles. Puntas con filtro: son las más utilizadas. Tienen un filtro en su interior que impide que los posibles aerosoles alcancen el cuerpo de la pipeta. Prevención de carryover. La contaminación por productos amplificados es un serio problema en laboratorios de diagnostico que amplifican continuamente las mismas secuencias diana en un número muy elevado de muestras, puesto que la contaminación con cantidades muy pequeñas de estos productos es suficiente para producir falsos positivos. La norma principal para evitar el carryover es no revertir nunca el flujo de trabajo transportando muestras amplificadas desde las áreas de PCR o pos-PCR a las zonas de preparación de muestras y purificación de ácidos nucleicos (pre-PCR) 2.5. EL USO EFICIENTE DE LOS RECURSOS El de biología molecular es un laboratorio muy especializado con unos elevados costes, tanto en equipamiento e infraestructuras, como en reactivos. Por ello, para una eficiente gestión de los recursos es imprescindible implantar estándares de calidad adecuados y desarrollar indicadores de calidad que permitan comprobar que funcionan correctamente. Lo ideal es que el laboratorio este certificado por una empresa acreditadora para el cumplimiento de la norma de calidad ISO vigente en cada momento. En cualquier caso, el uso eficiente de los recursos debería contemplar los siguientes puntos mínimos: Equipamiento e infraestructuras. Se debe contar con un plan de mantenimiento (diario, semanal, mensual, etc.) y de revisiones técnicas periódicas. El mantenimiento debe incluir las calibraciones, si se requieren y la limpieza de los equipos. Reactivos. Hay que asegurar la trazabilidad de los reactivos, desde su recepción hasta su consumo o eliminación por caducidad. Esto implica registros de entrada, control de lotes y caducidades y almacenamiento correcto. Recursos humanos. Todo el personal de nueva incorporación debe recibir el adiestramiento adecuado a las funciones que vaya a desempeñar, así como en materia de seguridad y gestión de residuos. Se debe diseñar también un plan de formación continuada para adecuar los conocimientos del personal de laboratorio a la rápida evolución que están experimentando las tecnologías y procedimientos utilizados en biología molecular. Técnicas. Todos los procedimientos técnicos deben estandarizarse mediante procedimientos normalizados de trabajo que incluyan todos los aspectos de la técnica, desde la recepción de muestras hasta la emisión de informes, si precede, con especificación de los controles necesarios. En los laboratorios de diagnostico, además, es imprescindible una buena comunicación con los clínicos solicitantes de las pruebas, para evitar repeticiones y solicitudes inadecuadas. Gestión medioambiental. El laboratorio debería contar con un código de buenas prácticas medioambientales para: ▪ Intentar reducir, en la medida de lo posible, los consumos de agua, electricidad y papel. ▪ Garantizar el correcto reciclado de los residuos de tipo urbano.  ▪ La infraestructura básica del laboratorio deberá también estar acorde con este principio (grifos de bajo caudal, iluminación de bajo consumo, aislamiento… 3. EL LABORATORIO DE CITOGENÉTICA Y CULTIVOS CELULARES Para clarificar los conceptos a que nos referiremos, tenemos que establecer, desde el principio, la diferenciación entre dos tipos de laboratorios: El laboratorio de cultivos celulares tiene como objetivo la propagación o crecimiento de células eucarióticas de organismos pluricelulares en medios de cultivo artificiales en condiciones controladas. El laboratorio de citogenética tiene como objetivo el estudio de los cromosomas de especies eucarióticas. Centrándonos en el campo de la medicina, el laboratorio de citogenética humana se dedica al estudio de los cromosomas humanos, tanto desde una perspectiva morfológica (cariotipo), como molecular (citogenética molecular). Aunque, en virtud de sus respectivos objetivos, se puede suponer que ambos tipos de laboratorios son muy diferentes, la realidad es que tienen muchos puntos en común, tanto en estructura, como en equipamiento y condiciones de trabajo. Ambos tipos de laboratorio comparten también su principal problema: la contaminación de los cultivos por microorganismos (bacterias, hongos, micoplasmas, virus). Estos microorganismos tienen una velocidad de crecimiento en cultivo muy superior a la de las células eucarióticas, por lo que provocan la muerte del cultivo en poco tiempo. Por supuesto, en ambos tipos de laboratorios se debe implantar una política de calidad para el uso eficiente de los recursos similar a la descrita para los laboratorios de biología molecular. Dado que el laboratorio de citogenética engloba más tecnologías y presenta mayor complejidad que el de cultivos celulares, vamos a referirnos a él principalmente para describir el equipamiento, la estructura y el flujo y las condiciones de trabajo. 3.1. EL EQUIPAMIENTO El laboratorio de citogenética requiere, por un lado, equipamiento específico para realizar cultivos celulares, por otro lado, equipamiento especifico para técnicas de citogenética y, finalmente, equipamiento común a otros laboratorios. 3.1.1. EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO PARA CULTIVOS CELULARES El equipo específico para cultivos celulares consta de una cabina de flujo laminar, un incubador de CO2, un microscopio invertido y un equipo de criogenia. CABINA DE FLUJO LAMINAR La cabina de flujo laminar es la infraestructura en el interior de la cual se realizan todos los procesos y manipulaciones de cultivos celulares: preparación de medios, siembra de los cultivos, cambios de medio… INCUBADOR DE CO2 El incubador de CO2 es el aparato que proporciona las condiciones ambientales óptimas para el crecimiento de las células en el medio de cultivo. Consta de los siguientes dispositivos: Control de la temperatura, responsable de fijar y mantener estable la temperatura óptima para cada tipo de cultivo. Recircularizacion del aire interior, para homogeneizar la temperatura. Control de CO2. El C02 puro se suministra comprimido en botellas presurizadas y este dispositivo lo mezcla con aire en la proporción adecuada (4-7%) y lo inyecta en el interior del incubador. Control de humedad. En el interior del incubador se requiere una humedad ambiente elevada para evitar la evaporación del medio de cultivo. Los incubadores más sencillos lo consiguen, simplemente, colocando una bandeja con agua en el suelo del incubador. Sin embargo, esta solución no es la ideal por la facilidad con la que se contamina esa agua. Por ello, los incubadores actuales incorporan un dispositivo de control de humedad que inyecta agua estéril. MICROSCOPIO INVERTIDO El control del crecimiento de un cultivo se realiza por observación microscópica directa. Ahora bien, el tamaño de los frascos de cultivo impide la utilización de un microscopio óptico convencional y por ello se recurre a un microscopio invertido. El microscopio invertido se caracteriza por tener invertidas la posición de la fuente de luz (por encima de la platina) y el revólver de objetivos (por debajo de la platina) respecto de un microscopio convencional.  Lo ideal, además, es que el microscopio esté equipado con un sistema de contraste de fases para facilitar la visualización de las células en crecimiento, ya que se trata de estructuras vivas, transparentes y sin coloración. EQUIPO DE CRIOGENIA El equipo de criogenia permite conservar a largo plazo y en forma viable muestras de células. El equipo de criogenia mínimo está constituido por un tanque o depósito de nitrógeno líquido. Es un equipamiento imprescindible en los laboratorios de cultivos celulares, optativos en los de citogenética. EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO PARA CITOGENÉTICA En el equipo específico para citogenética son fundamentales EQUIPO DE ANÁLISIS DE IMAGEN: Es básico para documentar y analizar metafases, con el fin de obtener un cariotipo. Consta de los siguientes elementos: Microscopio óptico convencional de luz transmitida Cámara digital, para obtener imágenes para su posterior análisis. Software especifico para análisis de metafases. Existen varios programas informáticos comerciales que analizan las metafases, cromosoma a cromosoma, permitiendo su reconocimiento con base en el patrón de bandas y su emparejamiento para obtener el cariotipo. UN MICROSCOPIO ÓPTICO CONVENCIONAL Y DE FLUORESCENCIA: Debería ser un microscopio distinto al del análisis de imagen. Se utiliza para recuentos de células, estudios de viabilidad y morfología celular, visualización de preparaciones de hibridación in situ fluorescente… 3.1.3. EQUIPAMIENTO COMÚN Entre el equipamiento común de los laboratorios de citogenética y cultivo celular es habitual encontrar: EQUIPO DE ESTERILIZACIÓN: La esterilidad de todo el material y de los reactivos que estén en contacto con los cultivos es imprescindible. Por esta razón, estos laboratorios deberían contar con un equipo de esterilización compuesto por: ▪ Un autoclave para esterilizar todo tipo de material. ▪ Un sistema de filtración con filtros de 0,22 μm para esterilizar soluciones SISTEMA DE PURIFICACIÓN DE AGUA: El agua utilizada para preparar reactivos y medios de cultivo tiene que ser ultrapura, estéril y libre de apirógenos. NEVERAS Y CONGELADORES DE -20ºC Y -80ºC Un sistema de frio es necesario para conservar a las temperaturas adecuadas los distintos reactivos empleados en el laboratorio. OTROS EQUIPAMIENTOS También pueden resultar necesarios otros equipamientos comunes como centrífugas con rotores apropiados para los tubos con los que se trabaje, placas calefactoras, pHmetro, balanza, agitador magnético, pipeteadores automáticos… LA ESTRUCTURA DEL LABORATORIO Al igual que el laboratorio de biología molecular, la prevención de la contaminación condiciona la estructura de los laboratorios de citogenética. Por eso, en estos laboratorios también se aplica el criterio de la separación física de áreas “limpias” y “sucias”. Así, un laboratorio de citogenética completo debe estructurarse como mínimo en tres salas: Sala de cultivos. Es la sala «limpia» del laboratorio, en la que se van a realizar todos los procedimientos directamente relacionados con el cultivo celular. Debe estar situada en una zona tranquila, alejada de vías de paso habituales para evitar turbulencias. Lo ideal es que esté dotada de un sistema que le suministre aire filtrado y una ligera presión positiva, para que el aire ambiente este, en lo posible, libre de microorganismos. En esta sala se situarán las cabinas de flujo laminar, los incubadores y el microscopio invertido. Sala de laboratorio convencional. Es la sala «sucia», con el resto del equipamiento, excepto el equipo de criogenia. En esta sala se van a realizar todos los procedimientos que no están directamente  relacionados con el cultivo celular, como la preparación de extensiones, tinciones, cariotipos… Esta área puede tener una zona oscura para el microscopio de fluorescencia. Sala de frio, con los congeladores y el equipo de criogenia. Esta sala debe estar separada de la sala de cultivos, porque los congeladores generan bastantes turbulencias. Lo ideal es que esta sala sea una cámara frigorífica, para minimizar el consumo de nitrógeno liquido y alargar la vida de los congeladores. 3.3. LAS CONDICIONES DE TRABAJO: TÉCNICA ASÉPTICA Los hábitos de trabajo en los laboratorios de citogenética y cultivos celulares están totalmente condicionados por la prevención de la contaminación. En este sentido, las condiciones de trabajo en la sala de cultivos se ajustan a una estricta técnica aséptica que impida la contaminación de los cultivos por microorganismos; por eso, todas las manipulaciones se realizan dentro de la cabina de flujo laminar. Entre las normas más importantes, que afectan también al protocolo de trabajo en la cabina de flujo laminar, se pueden citar las siguientes: Lavado frecuente de manos. Uso de guantes y batas desechables estériles. La puerta de la sala siempre debe estar cerrada Uso exclusivo de material y reactivos estériles. El material desechable estéril no es intercambiable con el de otras salas. No introducir mecheros bunsen en las cabinas porque generan turbulencias que alteran el flujo laminar. Colocar en el interior de la cabina exclusivamente el material que se vaya a utilizar en la sesión de trabajo. No sacar el material estéril de su embalaje hasta el momento de uso, evitando tocar con el cualquier superficie. El material usado reutilizable de vidrio se puede colocar en un recipiente con hipoclorito al 10% hasta finalizar la sesión de trabajo. Después se lleva al laboratorio general para su limpieza y esterilización. El material fungible utilizado en la cabina se deposita en contenedores adecuados para material contaminado, que se retiran al finalizar la sesión de trabajo. Restringir el acceso a la sala de cultivos exclusivamente al personal que esté realizando algún procedimiento. No se deben recibir visitas en esta sala. Limpieza de las cabinas de flujo laminar con etanol al 70% o desinfectante comercial apropiado para cabinas al finalizar cada sesión de trabajo. En las cabinas dotadas de lámpara germicida UV, esta se puede conectar después de la limpieza un máximo de 30 minutos. Realizar un mantenimiento programado de las cabinas (mínimo anual) que incluya comprobación del filtro HEPA. Limpieza y desinfección de superficies con etanol al 70% o desinfectantes apropiados. Por supuesto, son también de aplicación todas las normas básicas de trabajo aplicables a cualquier laboratorio. 4. LA SEGURIDAD E HIGIENE EN EL LABORATORIO La seguridad en el trabajo recoge los procedimientos y técnicas destinadas a eliminar o disminuir el riesgo de que un trabajador sufra un accidente o una enfermedad laboral. Los accidentes y las enfermedades laborales producen en el trabajador lesiones de distinta importancia, desde leves patologías que curan rápidamente hasta la muerte del trabajador, pasando por distintos grados de incapacidad. El trabajo en un laboratorio clínico presenta una serie de riesgos que están relacionados principalmente con los productos químicos y/o biológicos utilizados, así como con el material y aparataje propios del tipo de laboratorio. Por ello, la prevención de riesgos en un laboratorio y el conocimiento de las normas mínimas de seguridad e higiene son imprescindibles para minimizar la producción de accidentes que pueden tener consecuencias muy graves e incluso fatales para el trabajador. Existen unas precauciones generales mínimas sobre la prevención de riesgos en un laboratorio a tener en cuenta:  Tener información sobre la peligrosidad de sustancias químicas y especímenes biológicos que se manipulen en el laboratorio. Adquirir buenas prácticas y hábitos de trabajo por parte del personal de laboratorio. Tener por parte del personal la cualificación laboral adecuada para el puesto de trabajo a desempeñar. Disponer del material de protección adecuado para las funciones que se van a desarrollar. Mantener los equipos de trabajo en un buen estado de funcionamiento con sus revisiones periódicas realizadas. Utilización por parte de los trabajadores de los medios de protección disponibles (¿Cómo se maneja un extintor?). Los daños que pueden producirse al trabajador en un laboratorio se clasifican en: Daños inmediatos o directos: las lesiones se manifiestan en el momento del accidente. Daños indirectos: no se manifiestan en el momento del accidente, requiriendo un período de incubación o una exposición prolongada. NORMATIVA LEGAL Las normas de seguridad e higiene en el laboratorio están recogidas en la Ley de Prevención de Riesgos Laborales de 31/1995, con sus posteriores modificaciones, como RD 374/2001 sobre la protección de la salud y seguridad de los trabajadores. En España, el Instituto de Seguridad e Higiene en el Trabajo (INSHT) tiene recogida en su página web toda la normativa, publicaciones y documentación actualizada al respecto. Notas técnicas de Prevención (NTP): Son documentos elaborados por los organismos oficiales competentes, con la finalidad de informar, actualizar, promocionar y difundir los temas relacionados con la seguridad y salud en el trabajo. Cada laboratorio debe de recoger las normas de seguridad propias de su actividad en un MANUAL DE SEGURIDAD que estará a disposición de los trabajadores y que es de obligado cumplimiento. Debe contener la siguiente información: Evaluación de los riesgos inherentes a cada puesto de trabajo en el laboratorio. Descripción y normas de utilización del equipamiento de seguridad del laboratorio (cabinas de bioseguridad, cabinas de aspiración de gases, EPIs…) Hábitos de trabajo apropiados para minimizar los riesgos de exposición. Normas de almacenamiento de productos químicos Normas para la eliminación de desechos y gestión de residuos, incluyendo los derrames Normas de actuación en casos de emergencias, accidentes biológicos y accidentes químicos. 4.2. PRODUCTOS DE RIESGO EN EL LABORATORIO Casi todos los productos que se manejan en un laboratorio presentan algún tipo de riesgo, independientemente del tipo de laboratorio donde se desarrolle la actividad laboral. Hay algunos productos que presentan riesgos especialmente peligrosos y que debemos conocer para evitar accidentes y lesiones que pueden afectar al trabajador. Como ejemplos de sustancias peligrosas habituales en los laboratorios de biología molecular y citogenética se pueden mencionar los siguientes: Inflamables: alcoholes Tóxicos y muy tóxicos: acrilamida, bromuro de etidio, formamida Carcinógenos: acrilamida, formaldehido Mutágenos: acrilamida, bromuro de etidio Teratógenos y/o perjudiciales para la fertilidad: acrilamida, formamida, tetrametil urea La identificación de los productos químicos peligrosos se realiza con dos documentos: ETIQUETAS DE SEGURIDAD: Es la primera información que recibe el trabajador del laboratorio y la cual permite identificar el producto en el momento de su uso. La etiqueta debe aparecer obligatoriamente en los envases de todos los productos químicos de riesgo y está regulada en la Ley de Prevención de Riesgos Laborales. Toda etiqueta debe contener la siguiente información: Nombre del producto químico. Nombre, dirección y teléfono del fabricante o distribuidor. Pictogramas según el tipo de sustancia peligrosa que contenga el envase. Frases H: indican los riesgos específicos de las sustancias peligrosas. Frases P: indican los consejos de seguridad y prudencia relativos al uso de sustancias peligrosas. FICHA DE SEGURIDAD: Contiene información detallada acerca de los riesgos que tiene ese producto en concreto. Recoge hasta 16 epígrafes de datos, entre los que se encuentran: Identificación del producto. Peligros que puede ocasionar su manipulación. Consejos sobre su manipulación y almacenamiento. Medidas de protección necesarias para su manipulación. Primeros auxilios que se deben prestar en caso de accidente. Informes de toxicología. Propiedades físico-químicas del producto. 4.3. NORMAS GENERALES DE HIGIENE EN EL LABORATORIO Las pautas higiénicas básicas de comportamiento para cualquier laboratorio son: Deben lavarse las manos al entrar y salir del laboratorio y siempre que se produzca algún contacto con productos químicos o biológicos. Deben utilizarse jabón y toallas de un solo uso para el lavado de manos. No es recomendable usar pastilla de jabón, sino jabón con dispensador. Debe emplearse ropa y calzados adecuados. La bata siempre se tiene que llevar abrochada y se debe renovar y limpiar de forma regular y siempre que sea necesario. Deben usarse gafas de seguridad y guantes si la peligrosidad de los productos a manejar lo requiere. El cabello debe llevarse siempre bien recogido. Está totalmente prohibido ingerir alimentos o bebidas en el laboratorio, así como fumar o masticar chicle, salvo en las zonas destinadas a ello. No se debe pipetear con la boca, sino usar los aspiradores o peras de seguridad. No se tienen que tocar con la mano ni oler los productos químicos utilizados. Se deben retirar de la mesa los objetos personales. No se deben guardar alimentos o bebidas en los refrigeradores destinados a productos químicos o reactivos. 4.4. EQUIPOS DE PROTECCIÓN INDIVIDUAL Y COLECTIVA Los equipos de protección individual (EPI) son los accesorios que el trabajador debe llevar para su protección frente a los riesgos de su puesto de trabajo. El uso de estos equipos está regulado por el RD 733/95. La bata: Es un elemento de protección individual destinado a proteger la ropa de las posibles salpicaduras de los productos químicos y/o biológicos que se manejan en el laboratorio. Se debe de llevar siempre abrochada y es conveniente que sea de manga larga. Las gafas: Se usan para proteger los ojos del trabajador de las posibles salpicaduras con productos irritantes o cáusticos y también para protegerlo de posibles radiaciones nocivas. Si el trabajador utiliza lentillas, se  debe de tener en cuenta que en caso de accidente es difícil retirarlas de los ojos para lavarlos y pueden, además, retener partículas de polvo que pueden producir lesiones en el globo ocular. Los guantes: Los guantes se utilizan para la protección de la piel de las manos y evitar así que entren en contacto con productos irritantes, tóxicos o nocivos para el manipulador. Es conveniente no llevar anillos con el uso de guantes, salvo que sean lisos y sin salientes. Los guantes son de uso obligado en los laboratorios biosanitarios. La mascarilla: Las mascarillas se usan para evitar la entrada de gases tóxicos o partículas al aparato respiratorio. Constan de dos partes: filtro y adaptador facial. El filtro es el componente que retiene los elementos nocivos y el adaptador permite un ajuste adecuado a cada usuario. ELEMENTOS DE PROTECCIÓN EN CASOS DE EMERGENCIA Estos sistemas son empleados para actuar rápidamente en situaciones de urgencia tras un accidente en el laboratorio. Fuentes lavaojos: Son un sistema para descontaminar rápidamente los ojos y la cara. Duchas de seguridad: Es el sistema más habitual utilizado en la actualidad ante accidentes con quemaduras químicas y es recomendable que su funcionamiento vaya asociado a una alarma acústica, con el fin de alertar al resto del personal sobre la existencia de una emergencia Manta ignífuga: Se utiliza en casos de fuegos pequeños y cuando se prende la ropa. Extintores: Son dispositivos que contienen en su interior sustancias que al ser proyectadas sobre el fuego hacen que este se apague. El tipo de sustancia que portan depende del tipo de fuego existente. En los laboratorios los extintores que más se usan contienen CO2 Derrames: Los derrames se cuentan entre los accidentes de laboratorio más comunes y entrañan cierta peligrosidad. Su gestión implica tres acciones que deben ejecutarse de forma inmediata: ▪ Neutralización - Va a depender de las características químicas del producto derramado. Absorción El material absorbente que se use dependerá de la naturaleza del derrame. Algunos ejemplos son: Serrín para líquidos no inflamables ni tóxicos ni corrosivos Carbón activo para líquidos inflamables tóxicos o corrosivos Absorbentes-neutralizadores comerciales, para cualquier derrame líquido según indicaciones de la casa comercial. Celulosa para absorber directamente derrames de pequeñas cantidades. Eliminación El residuo se utiliza en un envase adecuado y se elimina en el contenedor específico. Los derrames de productos en polvo se recogen directamente, evitando la formación de aerosoles y polvo en suspensión. Los derrames de productos volátiles tóxicos por inhalación recogidos con celulosa deben ser eliminados rápidamente en envases adecuados con cierre hermético; o bien poner la celulosa en una cabina de aspiración de gases con filtro de carbón activo hasta su evaporación y posterior tratamiento como residuo químico.Durante la realización de estas actividades: Debe restringirse el acceso al laboratorio Las personas responsables de la recogida deben estar equipadas con los EPI adecuados al producto derramado. Se debe tener especial cuidado con derrames de líquidos inflamables y volátiles. 4.5. NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN UN LABORATORIO Deben conocerse la toxicidad y los riesgos de los compuestos y productos con los que se trabaje. No se deben transportar tubos de ensayo o frascos con reactivos en los bolsillos de la bata. Para ello, se emplearán los soportes adecuados destinados a ello. Todos los productos biológicos deben ser tratados como si fueran infecciosos.  No calentar directamente los recipientes de vidrio a la llama. Los frascos de reactivos se deben tapar inmediatamente después de su uso y los tapones deben colocarse en la mesa boca arriba. Al terminar una tarea, se den recoger los materiales y reactivos empleados y colocarlos en sus lugares de almacenaje adecuados. Es de uso obligatorio las vitrinas o campanas extractoras cuando se manipulen productos ácidos, corrosivos, irritantes, tóxicos. En los procesos de mezclado de agua y sustancias ácidas, añadir siempre el ácido sobre el agua. Los transvases de líquidos de un recipiente a otro se deben hacer lentamente y usando un embudo. Si algún reactivo se derrama en la mesa, se debe retirar rápidamente de ella, neutralizándolo si es necesario con el producto adecuado. Se deben emplear centrífugas con tapa para evitar proyecciones y accidentes. No se debe intentar detener la centrífuga con la mano. La colocación de productos en el almacén debe seguir las normas de incompatibilidad. RIESGO BIOLÓGICO Los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos se clasifican en cuatro grupos de riesgo, según el RD 664/1997, de 12 de mayo. AGENTE BIOLÓGICO GRUPO 1 Agente biológico que es poco probable que cause enfermedad en el hombre. AGENTE BIOLÓGICO GRUPO 2 Agente patógeno que puede causar una enfermedad en el hombre. Existe tratamiento eficaz para combatir la enfermedad. AGENTE BIOLÓGICO GRUPO 3 Agente patógeno que puede causar enfermedad en el hombre. Existe tratamiento eficaz para combatir la enfermedad. Puede propagarse a la colectividad. AGENTE BIOLÓGICO GRUPO 4 Agente patógeno que puede causar una enfermedad en el hombre. No existe tratamiento eficaz para combatir la enfermedad. Puede propagarse a la colectividad. Los niveles de bioseguridad en el laboratorio se basan en la evaluación del riesgo y dependen de la muestra utilizada, las instalaciones, los equipos y los procedimientos utilizados en el laboratorio. Así podemos clasificar los laboratorios en cuatro niveles de seguridad: Laboratorio básico, con nivel de bioseguridad 1. Laboratorio básico, con nivel de bioseguridad 2. Laboratorio de contención, con nivel de bioseguridad 3. Laboratorio de contención máxima, con nivel de bioseguridad 4. LABORATORIO BÁSICO. NIVEL DE BIOSEGURIDAD 1 Este tipo de laboratorios de nivel básico se destina a la enseñanza y a la docencia a todos los niveles y también para la investigación. Al aplicar las técnicas microbiológicas, en general se manejan cepas de microorganismos que no son generadoras de enfermedad en humanos adultos sanos (E. Coli) LABORATORIO BÁSICO. NIVEL DE BIOSEGURIDAD 2 Este tipo de laboratorios de nivel básico también se destinan a la enseñanza y a la docencia a todos los niveles, pero se amplía su uso para la investigación y el diagnóstico clínico (enterobacter, salmonella, klebsiella spp…) Se incluye un símbolo de advertencia de peligro biológico, se procede al uso de CSB, es conveniente el control del flujo del aire hacia el interior y un sistema de ventilación controlada. Se dispondrá de un autoclave como medio de descontaminación y esterilización del material contaminado. LABORATORIO DE CONTENCIÓN. NIVEL DE BIOSEGURIDAD 3 Este tipo de laboratorios de contención también se destinan a la enseñanza y a la docencia a todos los niveles, así como a la investigación y al diagnóstico clínico. En ellos es necesario proteger al personal, a  la comunidad y al medio ambiente y deben de figurar en un registro controlado por las autoridades sanitarias. Está diseñado para trabajar con microorganismos del grupo de riesgo 3 (Mycobacterium tuberculosis, mycobacterium leprae, virus del nilo occidental…) LABORATORIO DE CONTENCIÓN MÁXIMA. NIVEL DE BIOSEGURIDAD 4 Este tipo de laboratorio son unidades que manejan patógenos peligrosos, por lo que están sometidos a un control por parte de las autoridades sanitarias (Ejemplo: viruela, ébola, fiebre hemorrágica Crimea- Congo…) Se utilizan cabinas de seguridad biológica de clase III. Se realizará el aislamiento del laboratorio respecto al tráfico de personas. Se procederá a la vigilancia de la seguridad del personal mediante un sistema de televisión con circuito cerrado. GESTIÓN DE RESIDUOS Los laboratorios de biología molecular y citogenética deben disponer de un plan de gestión de residuos tóxicos y peligrosos, en virtud de su actividad. El plan de gestión de residuos tóxicos y peligrosos debe incluir medidas para la recogida selectiva, la clasificación y el almacenamiento temporal de residuos hasta su recogida por una empresa gestora. En concreto se deben especificar medidas para gestionar: Residuos biosanitarios especiales Residuos químicos Residuos citotóxicos Residuos radioactivos En Galicia la legislación sobre gestión de residuos sanitarios queda concretada en el Decreto 460/1997 del 21 de noviembre (derogada por el Decreto 38/2015 del 26 de Febrero) por el que se establece la normativa para la gestión de los residuos de los establecimientos sanitarios de la Comunidad Autónoma de Galicia. DEFINICIONES: Residuos sanitarios: cualquier sustancia u objeto generados por las actividades sanitarias de los cuales se desprenda o tenga la intención u obligación de desprenderse su poseedor, en virtud de las disposiciones legales en vigor en esta materia. Actividades sanitarias: las desarrolladas en hospitales, clínicas, consultas médicas, centros sociosanitarios, laboratorios de análisis clínicos, de salud pública y de investigación médica, centros de atención primaria y de planificación familiar, centros de salud y cualquier otro que tenga relación con la salud humana. Serán consideradas, así mismo, actividades sanitarias, las correspondientes a centros, servicios y establecimientos veterinarios asistenciales y centros de investigación animal. Centro sanitario: establecimiento, de titularidad pública o privada, donde se realizan actividades sanitarias. Gestión de residuos: conjunto de actividades encaminadas a dar a los residuos el destino final más adecuado de acuerdo con sus características. Comprende las operaciones de manipulación, segregación, recogida, envasado, almacenamiento, transporte, tratamiento y eliminación de los mismos. Gestión intracentro: comprende las operaciones de gestión que se lleven a cabo en el interior de los centros sanitarios. Gestión extracentro: comprende las operaciones de gestión que se lleven a cabo en el exterior de los centros sanitarios y especialmente las desarrolladas a partir de la recogida de los mismos, incluyendo el transporte, tratamiento y eliminación. Segregación: separación y clasificación de los residuos en función de criterios establecidos de acuerdo con su peligrosidad real. Tratamiento: toda actividad que, a través de procesos químicos, físicos o biológicos, persigue la anulación de la toxicidad y demás características nocivas y peligrosas para la salud humana, recursos naturales y medio ambiente, contenidas potencialmente en los residuos generados por las actividades sanitarias. Eliminación: toda actividad que suponga el confinamiento definitivo de los residuos. Residuo sanitario biocontaminado: residuo peligroso específico de la actividad sanitaria que, debido a su contaminación con agentes patógenos o por contener altas concentraciones de microorganismos, es de potencial riesgo para las personas que entren en contacto con ellos. CLASIFICACIÓN: La clasificación de residuos sanitarios de Galicia: A) RESIDUOS SANITARIOS NO PELIGROSOS: CLASE I: Residuos domésticos. Son residuos generados en los centros sanitarios similares a los producidos en los hogares. CLASE II: Residuos no domésticos. Son residuos generados en los centros sanitarios diferentes de los producidos en los hogares. Se incluyen en esta clase: Clase IIa: residuos específicos de la actividad sanitaria, que son los generados en los centros sanitarios, diferentes de los producidos en los hogares, como resultado de la actividad sanitaria propiamente dicha. Clase IIb: residuos no específicos de la actividad sanitaria, que son los generados en los centros sanitarios, diferentes de los producidos en los hogares, y que no son resultado de la actividad sanitaria propiamente dicha. B) RESIDUOS SANITARIOS PELIGROSOS: CLASE III: Residuos sanitarios biocontaminados, son residuos que requieren una gestión diferenciada tanto en el interior de los centros como en el exterior, en todas las etapas de la gestión. Se incluyen en esta clase: Residuos procedentes de la actividad sanitaria de pacientes afectados por patologías relacionadas en el anexo I del presente decreto. Residuos de cultivos o reservas de agentes infecciosos y material de desecho en contacto con ellos, incluyendo los filtros de alta eficacia de las campanas de flujo laminar. Residuos de vacunas con agentes vivos o atenuados. Residuos de animales de experimentación, cadáveres y restos anatómicos de animales infectados o inoculados con agentes infecciosos responsables de las patologías incluidas en el anexo I del presente decreto. CLASE IV: Residuos de citotóxicos y citostáticos, son residuos de citostáticos y citotóxicos y todo material utilizado en su preparación o en contacto con ellos. CLASE V: Otros residuos peligrosos, son los residuos peligrosos generados en los centros sanitarios no incluidos en las clases III y IV. ANEXO I: RESIDUOS SANITARIOS DE GALICIA Cualquier residuo de materiales, objetos o sustancias que estén en contacto con pacientes afectados de las siguientes enfermedades infecciosas: Fiebres hemorrágicas víricas, tales como: Fiebre hemorrágica del Congo-Crimea; Fiebre de Lasa; Marbug; Ébola; Fiebre hemorrágica argentina (Junin); Fiebre hemorrágica boliviana (Machupo). Complejo encefalítico transmitido por artrópodos vectores (arbovirus): Absettarow, Hanzalova, Hypr, Kumlinge, Kiasanur Forest Disease, fiebre hemorrágica de Omsk, Russian spring-summer encephalitis. Herpes virus simiae (Monkey B virus); Rabia; Carbunco (Bacillus anthracis); Muermo; Mieloidosis; Difteria; Tularemia; Viruela (erradicada); Creutzfeld-Jakob u otras producidas por priones. Residuos contaminados con heces de pacientes afectados por las siguientes infecciones: Cólera; Disentería amebiana. Residuos contaminados con secreciones respiratorias de pacientes con las siguientes infecciones: Tuberculosis; Fiebre Q. Filtros de diálisis de máquinas reservadas a pacientes portadores de las siguientes infecciones de transmisión sanguínea: Hepatitis B; Hepatitis C; Virus de la inmunodeficiencia humana. Residuos de actividades de análisis o experimentación microbiológica, contaminados con agentes infecciosos o productos biológicos derivados, tales como: ▪ Cultivos de agentes infecciosos y material de desecho en contacto con ellos: placas de Petri, hemocultivos, extractos líquidos, caldos, instrumental contaminado, etcétera. ▪ Reservas de agentes infecciosos. ▪ Vacunas vivas o atenuadas, salvo materiales manchados de un solo uso. Residuos de cadáveres, partes del cuerpo y otros residuos anatómicos de animales de experimentación que sean inoculados con los agentes infecciosos responsables de las infecciones que se citan en los puntos 1, 2, 3 y 4, así como residuos procedentes de los lechos de estabulación de tales animales. PROCEDIMIENTOS DE GESTIÓN DE RESIDUOS: La recogida de los residuos sanitarios en el interior de los centros que los generan deberá atender a criterios de separación, higiene, inocuidad y economía, y cumplir la normativa de prevención de riesgos laborales. Se implantará un sistema de recogida diferenciada para los residuos sanitarios de acuerdo con  la clasificación establecida en el punto anterior. La separación, identificación y envasado de los residuos generados se realizará rigurosamente en origen. Los envases y sus cierres estarán concebidos y realizados de manera que se evite cualquier pérdida del contenido y construidos con materiales no susceptibles de ser atacados por el contenido ni de formar con el combinaciones peligrosas. Asimismo, serán sólidos y resistentes para responder con seguridad a las manipulaciones necesarias y se mantendrán en buenas condiciones, sin defectos estructurales y sin fugas aparentes. Los residuos recogidos en bolsas se transportarán y se almacenarán en contenedores que, cuando no sean de un solo uso, serán de estructura rígida y que permita una fácil limpieza y desinfección. Los envases deberán estar perfectamente cerrados antes del transporte y nunca se podrán arrastrar ni utilizar métodos de transporte que afecten a su integridad. Los carros o contenedores empleados en el transporte de los envases serán exclusivos para este fin y que, en caso de no ser desechables, permitirán su fácil limpieza y desinfección, serán resistentes a la corrosión y sin elementos cortantes o punzantes, diseñados de manera que impidan la caída de envases sobre el trabajador; serán revisados y sustituidos en caso de presentar algún defecto. Los residuos sanitarios, debidamente separados y envasados, podrán almacenarse en lugares específicamente habilitados a este fin. Queda prohibido depositar los residuos en otro lugar que no sean los almacenes habilitados para esta finalidad, así como el depósito de las bolsas a la intemperie. Las condiciones del almacenamiento se ajustarán a lo establecido por la Consellería competente en materia de medio ambiente. El transporte de los residuos en el interior de los centros sanitarios deberá responder a criterios de rapidez, higiene, inocuidad y seguridad, evitando o minimizando acciones o manipulaciones que puedan implicar cualquier tipo de riesgo para el personal encargado de su recogida y transporte interior, personas trabajadoras y usuarias. A) GESTIÓN DE RESIDUOS DE CLASE I: Los residuos domésticos se separarán de manera selectiva y conforme a la normativa vigente en materia de residuos, y a lo establecido en los planes de residuos que sean de aplicación y en las ordenanzas municipales que correspondan. B) GESTIÓN DE RESIDUOS DE CLASE II: Los residuos no domésticos se recogerán en envases o recipientes que faciliten su tratamiento y en condiciones que eviten los riesgos para la salud humana y el medio ambiente. Las bolsas de plástico destinadas a la recogida y almacenaje de residuos deberán ser opacas, impermeables y lo suficientemente resistentes como para, de una manera segura, contener la clase de residuo para la que fueron diseñadas. La gestión de los residuos de cortantes y punzantes de la clase IIa se realizará de igual modo que la de los residuos sanitarios de la clase III. C) GESTIÓN DE RESIDUOS DE CLASE III Y IV: Estos residuos se recogerán en recipientes adecuados al tipo de residuos y al punto de producción, y que cumplan las siguientes características: a) Rígidos y de libre sustentación. b) Opacos, impermeables y resistentes a la humedad. c) Resistentes a perforación interna o externa. d) Provistos de cierre hermético. e) Composición que garantice que en su destrucción se eviten o minimicen las emisiones tóxicas. Solo podrán ser reutilizados los recipientes utilizados para contener residuos de la clase III, y después de someterse a un proceso de preparación para la reutilización que deberá ser autorizado de la manera prevista en el artículo 15. Los recipientes y los contenedores utilizados en el almacenamiento y transporte intracentro se etiquetarán de acuerdo con lo establecido en la normativa general de residuos. Se rotularán con los pictogramas de biorriesgo o citotóxico, o con ambos, y con sus textos asociados, cuando contengan residuos de estas clases, tales como los que aparecen en el anexo VI. Los residuos cortantes y punzantes se depositarán en envases específicos y dispondrán de dispositivos de seguridad que impidan su apertura. D) GESTIÓN DE RESIDUOS DE CLASE V: El envasado, etiquetado y separación de estos residuos se hará según la legislación vigente para este tipo de residuos y, en concreto, según la Ley 22/2011, de 28 de julio, de residuos y suelos contaminados, y la Ley 10/2008, de 3 de noviembre, de residuos de Galicia.