BIO = UNIT 2: UT2 Fundamentos de la Biología Molecular y la Citogenética PDF

UT2. Fundamentos de la Biología molecular y la citogenética Biología Molecular y Citogenética UT3 1. Objetivos................................................................................

UT2. Fundamentos de la Biología molecular y la citogenética Biología Molecular y Citogenética UT3 1. Objetivos............................................................................................................................... 3 2. Introducción.......................................................................................................................... 3 3. Ácidos nucleicos.................................................................................................................... 3 4. ADN....................................................................................................................................... 4 4.1. Estructura primaria del ADN............................................................................................. 5 4.2. Estructura secundaria del ADN......................................................................................... 5 4.3. Estructura terciaria del ADN.............................................................................................. 6 5. ARN........................................................................................................................................ 7 5.1. Tipos de ARN...................................................................................................................... 7 6. Propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos........................................................... 10 6.1. Propiedades en disolución............................................................................................... 10 6.2. Desnaturalización y renaturalización del ADN................................................................. 11 6.3. Viscosidad......................................................................................................................... 12 6.4. Absorción en el ultravioleta............................................................................................. 12 7. Replicación del ADN............................................................................................................ 13 7.1. Características generales de la replicación...................................................................... 13 7.2. Proteínas que intervienen en la replicación..................................................................... 14 7.3. Fases de la replicación...................................................................................................... 15 8. Transcripción....................................................................................................................... 16 8.1. Fases de la transcripción.................................................................................................. 17 9. Traducción........................................................................................................................... 20 9.1. Iniciación de la síntesis de proteínas................................................................................ 21 9.2. Elongación de la cadena polipeptídica............................................................................. 21 9.3. Terminación de la síntesis de proteínas........................................................................... 22 10. Enzimas asociadas a los ácidos nucleicos empleadas en Biología Molecular................. 22 10.1. Nucleasas........................................................................................................................ 22 10.2. Endonucleasas de restricción......................................................................................... 23 Página 2 Biología Molecular y Citogenética UT3 10.3. ADN polimerasas............................................................................................................ 25 10.4. ADN ligasas..................................................................................................................... 26 10.5. Transcriptasa inversa o retrotranscriptasa.................................................................... 26 10.6. Topoisomerasas............................................................................................................. 26 10.7. Desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt)................................................................. 26 1. Objetivos Conocer la relevancia del material genético en la fisiología celular Saber de qué está compuesto el material genético. Identificar la estructura y los distintos grados de compactación del ADN. Analizar los cambios del ADN a lo largo del ciclo celular. 2. Introducción Antes de introducirnos en las funciones y técnicas de un laboratorio de citogenética y biología molecular es muy importante aclarar los conocimientos básicos en torno al material genético y el ciclo celular. La información contenida en esta unidad es de vital importancia para el entendimiento de los diversos conceptos, técnicas y herramientas de trabajo que se explicarán a continuación. 3. Ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos están constituidos por la unión de numerosos nucleótidos, de 4 tipos. Estos nucleótidos están constituidos por 3 componentes: ▪ Un componente ácido: Grupo Fosfato (PO43-) ▪ Un componente neutro: Azúcares. El azúcar siempre es una pentosa, bien la -D- ribosa (ARN) o la - D-desoxirribosa (en ADN). ▪ Un componente básico: Bases Nitrogenadas. Son compuestos heterocíclicos que contienen nitrógeno. Casi todos son moléculas planas. Hay dos tipos de bases nitrogenadas: Página 3 Biología Molecular y Citogenética UT3 - Bases Pirimidínicas: presentan un único anillo aromático, y son la Citosina (C), la Timina (T) y el Uracilo (U). La timina sólo está presente en el ADN y el uracilo en el ARN. - Bases Púricas: presentan dos anillos aromáticos, y son la Adenina (A) y la Guanina (G). Figura 4. Estructuras químicas de los nucleótidos y desoxirribonucleótidos presentes en el ARN y ADN, respectivamente. 4. ADN El ácido desoxirribonucleico (ADN) está formado por una secuencia de nucleótidos, cuya pentosa es la desoxirribosa y sus bases nitrogenadas son la adenina, la citosina, la guanina y la timina. Es la biomolécula que contiene la información genética de un individuo, estando presente en el núcleo de todas las células eucariotas y libre en el citoplasma de las procariotas. Se identifican tres niveles de organización (primaria, secundaria y terciaria) responsables de sus propiedades físicas, así como los procesos de los que participa dicha molécula. Página 4 Biología Molecular y Citogenética UT3 4.1. Estructura primaria del ADN Consiste en la secuencia de desoxirribonuleótidos de una sola cadena, unidos entre sí por enlaces fosfodiéster, entre el grupo fosfato del carbono 5´de un nucleótido y el grupo hidroxilo (-OH) libre del carbono 3´ del siguiente nucleótido. Figura 8. Representación esquemática de la estructura del ADN. La formación de la cadena polinucleotídica sigue una dirección 5 ́- 3 ́ dado que los nucleótidos se agregan en el extremo 3 ́terminal de la cadena de ácido nucleico que crece. Por tanto, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos, o polinucleótidos, con un esqueleto lineal formado por unidades alternas de fosfato y azúcar (pentosa), que es la parte constante de la secuencia. 4.2. Estructura secundaria del ADN Hace referencia al modelo descrito por Watson y Crick, que es capaz de explicar cómo se produce la transmisión de la información genética. Este modelo propone que: ▪ El ADN está formado por dos cadenas de polinucleótidos enrolladas alrededor de un eje imaginario, formando una doble hélice de 2nm (20 Amstrongs) de diámetro. El enrollamiento es dextrógiro(dirección agujas del reloj) y plectonémico( una gira sobre la otra). ▪ Las dos cadenas de polinucleótidos son antiparalelas, una monocadena está orientada en un sentido (5’-3’) y la otra en el sentido contrario (3’-5’). ▪ Las bases nitrogenadas se encuentran orientadas hacia el interior de la doble hélice, perpendiculares a su eje imaginario. ▪ Cada vuelta completa está formada por 10 pares de nucleótidos. Dado que cada pareja está situada a una distancia de 0,34nm de la siguiente, la longitud de cada vuelta es de 3,4 nm. ▪ En la doble hélice podemos distinguir un surco mayor y un surco menor. ▪ Existe complementariedad entre las dos cadenas, ya que sus bases nitrogenadas están enfrentadas formando puentes de hidrógeno entre ellas. Adenina y Timina se unen mediante dos enlaces de hidrógeno, y Guanina y Citosina, mediante tres. Página 5 Biología Molecular y Citogenética UT3 Figura 9. (Izda) Estructura secundaria de la molécula de ADN-B descrita por Watson y Crick. (Dcha) Apareamiento por puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas. 4.3. Estructura terciaria del ADN La estructura terciaria del ADN presenta diferentes niveles de condensación y empaquetamiento, los cuales se consiguen gracias a que la doble hélice de ADN se asocia con proteínas histonas. - El primer nivel de condensación es el nucleosoma, el cual está formado por una proteína histona rodeada de la doble cadena de ADN, formándose una estructura denominada collar de perlas. - El segundo nivel de condensación es la fibra de cromatina de 30nm o solenoide, el cual se consigue gracias a la condensación y compactación en espiral de las proteínas histonas que se han unido al ADN formando los nucleosomas. - El tercer nivel de empaquetamiento se consigue porque continúa la formación de espirales unas sobre otras, consiguiendo un superenrollamiento del ADN, apareciendo la estructura de condensación de cromatina extendida de 300nm, y posteriormente de cromatina condensada de 700nm. Esta cromatina continúa con su empaquetamiento para alcanzar el mayor grado de condensación que presenta el ADN, que es el cromosoma. Figura 11. Grados de compactación del ADN Página 6 Biología Molecular y Citogenética UT3 5. ARN Ya hemos dicho previamente que el ARN son polímeros de nucleótidos cuya pentosa es la ribosa y sus bases nitrogenadas son adenina, guanina, citosina y uracilo. Además de estas cuatro bases, pueden aparecer otras que son derivados metilados de éstas (sobre todo en los ARNt). Salvo en algunos virus, cuyo material genético es ARN bicatenario (como los reovirus), los ARN, en general, son monocatenarios con estructura primaria, que en algunas ocasiones pueden formar horquillas, generando zonas bicatenarias con estructura secundaria de doble hélice similar a la del ADN. Cuando las zonas bicatenarias están separadas por regiones no complementarias, se forman bucles. Figura 14. La existencia de complementariedad interna entre las bases de una molécula de ARN, da lugar a la formación de bucles y regiones bicatenarias. La función del ARN es copiar la información del ADN (transcripción) y transportarla al citoplasma, para que tenga lugar la traducción o síntesis de proteínas. 5.1. Tipos de ARN Hay varios ARN que tienen la misma composición química pero diferente estructura y función. Los principales son: ARN mensajero o ARNm ARN ribosómico o ARNr ARN de transferencia o ARNt ARN mensajero (ARNm) Supone entre el 2-5% del ARN total de una célula. Está constituido por múltiples moléculas de diferentes tamaños. Su estructura es lineal, excepto en algunas zonas donde se forman horquillas. Se sintetiza en el núcleo de la célula, tomando como molde una hebra de ADN. Su función principal es copiar al información genética del ADN y llevarla a los ribosomas para la síntesis de proteínas. La información se encuentra en grupos de tres nucleótidos o codones, los cuales determinan qué aminoácido se ha de incorporar en la proteína. Página 7 Biología Molecular y Citogenética UT3 El nombre de mensajero deriva de su papel de intermediario, porque actúa como vehículo de transporte de la información genética entre el ADN y las proteínas. Las moléculas de ARNm procariota son policistrónicas, llevan la información para la síntesis de varias proteínas distintas. Por el contrario, las moléculas de ARNm eucariotas son monocistrónicas, solo llevan información para la síntesis de una única proteína. ARN ribosómico (ARNr) Es el más abundante, aproximadamente el 80% del total. Tienen las cuatro bases nitrogenadas principales y algunas metiladas. Desempeña una función estructural, presenta zonas con estructura de doble hélice y unido a proteínas básicas, forma los ribosomas. El ARNr supone el 60% de los ribosomas y las proteínas el 40% restante. Participan activamente en la lectura del ARNm. Los ARNr se clasifican según su coeficiente de sedimentación, así encontramos:  En las células procariotas: 5S, 16S y 23S.  En las células eucariotas: 5S, 5.8S, 18S y 28S. Presentan múltiples regiones complementarias, por lo que tienen una estructura secundaria muy compleja, con numerosas horquillas y bucles. Figura 15. Estructuras secundarias de los ARNr 5S y 16S de procariotas, con múltiples bucles y regiones en horquilla. Página 8 Biología Molecular y Citogenética UT3 ARN de transferencia (ARNt) Está formado por moléculas pequeñas, cuya función es la de actuar como portador de aminoácidos específicos hasta los ribosomas. Además de las bases normales, A, G, C y U, contienen un elevado número de bases nitrogenadas diferentes, normalmente derivados metilados. Contienen entre 75 y 90 nucleótidos dispuestos en forma de trébol. Existen 50 tipos de ARNt, pero comparten algunas características similares: - En el extremo 5´ presentan un triplete de bases nitrogenadas en el que siempre hay guanina y un ácido fosfórico libre. - En el extremo 3´, todos contienen la secuencia nucleotídica CAA sin aparear, que actúa como aceptor del aminoácido específico que transporta. - Cada ARNt posee una secuencia de tres nucleótidos o anticodón complementaria a la del codón del ARNm y determina que cada codón sea leído como un aminoácido específico por el ribosoma. -Contienen hasta un 10% de bases nitrogenadas distintas de las habituales, como la dihidrouridina (DHU o UH2), metilguanosina (mG), dimetilguanosina (m2G), pseudouridina (), metilinosina (mI) e incluso timidina. Los ARNt actúan como moléculas activadoras y transportadoras de los aminoácidos durante la biosíntesis de una proteína. Figura 16. Estructura del ARNt Página 9 Biología Molecular y Citogenética UT3 En la molécula del ARNt podemos distinguir: Brazo D: se llama así por contener dihidrouridina. Aquí se une la enzima responsable de unir el correspondiente aminoácido al extremo 3´. Brazo T: contiene la secuencia TC. Es el sitio de unión al ribosoma. Brazo del anticodón. Otros tipos de ARN ARN heterogéneo nuclear (ARNhn). Es una mezcla de moléculas lineales largas, precursoras del ARNm (pre-ARNm). Se localiza en el núcleo de la célula y dan lugar a los ARNm tras un proceso de maduración, que entonces salen al citoplasma. ARN pequeño nuclear (ARNsn).Es un conjunto de pequeñas moléculas de ARN que se localizan en el núcleo y se unen a proteínas, dando lugar a ribonucleoproteínas con actividad enzimática. Concretamente, intervienen en la maduración del ARNm. ARN pequeño nucleolar (ARNsno). Se encuentra unido a diferentes proteínas formando el nucléolo. Tiene un coeficiente de sedimentación de 45S y cuando se fragmenta da lugar a los ARNr 5.8S, 18S y 28S. 6. Propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos Las moléculas de ácidos nucleicos, constituidas por largas cadenas de nucleótidos, se caracterizan por las siguientes propiedades fisicoquímicas: 6.1. Propiedades en disolución La base nitrogenada confiere carga positiva a la cadena de ácido nucleico, mientras que el grupo fosfato confiere carga negativa, dando lugar al carácter polar de los ácidos nucleicos. Este carácter polar, hace que sean solubles en agua (gracias a la formación de enlaces por puente de hidrógeno entre los grupos fosfato y los grupos -OH de los azúcares con las moléculas de agua) e insolubles en disolventes orgánicos. A pH fisiológico, los grupos fosfato tienen carga negativa, y se comportan como ácidos. Pero casi siempre se encuentran neutralizados con iones Ca2+ y Mg2+ y los grupos positivos de proteínas básicas (por ejemplo, las histonas). Las bases púricas y pirimidínicas mantienen la doble hélice del ADN mediante enlaces por puente de hidrógeno entre bases complementarias, que alcanzan la máxima estabilidad a pH 4-7. Fuera de estos límites fisiológicos, la doble hélice de ADN es inestable. Página 10 Biología Molecular y Citogenética UT3 6.2. Desnaturalización y renaturalización del ADN Los ácidos nucleicos se desnaturalizan por efecto de agentes químicos (urea, formaldehído, cambios en el pH) o físicos (aumento temperatura), perdiendo su conformación tridimensional, y en especial, la doble hélice. La desnaturalización se debe a la desestabilización de los puentes de hidrógeno entre bases, las dos hebras del ADN se separan y pasan a una conformación al azar (llamada de ovillo aleatorio), sin que se altere la estructura primaria (no hay ruptura de enlaces covalentes). La temperatura es el agente desnaturalizante más representativo y actúa de la siguiente forma: Figura 5. Esquema del comportamiento de una molécula de ADN frente a cambios en la temperatura. Se denomina temperatura media de fusión (temperatura de melting, Tm) aquella a la que se desnaturaliza el 50% de la doble cadena de ADN. En este parámetro influye mucho el contenido en pares G+C, puesto que al estar unidas por 3 enlaces, son más difíciles de romper. Así a mayor contenido en pares GC, mayor será la temperatura requerida para separa el 50% de la doble cadena de ADN. Podríamos decir que la Tm refleja la composición promedio de un ADN. Figura 6. Efecto de la temperatura en la estructura del ADN. Página 11 Biología Molecular y Citogenética UT3 En general, el proceso de desnaturalización se emplea para el estudio de la estructura del ADN, mientras que la renaturalización se emplea en técnicas de hibridación. La combinación de desnaturalización y renaturalización es muy importante en la técnica de PCR. 6.3. Viscosidad Debido a la rigidez relativa de la molécula de ADN (en doble hélice) y a su inmensa longitud en relación al diámetro, las disoluciones de ADN son muy viscosas. Esta propiedad tiene mucho interés en relación con el proceso de desnaturalización, ya que cuando el ADN se encuentra en forma monocatenaria, el plegamiento al azar de la cadena conduce a una viscosidad menor. Así, al aumentar la temperatura, el pH o la concentración de un agente químico desnaturalizante, se observa una disminución en la viscosidad de la disolución de ADN (figura 7). 6.4. Absorción en el ultravioleta Las distintas bases nitrogenadas pueden absorber luz ultravioleta con un máximo de alrededor de 260nm, por lo que puede emplearse esta medida para detectar y cuantificar la concentración de ácidos nucleicos. La estructura en doble hélice de la molécula de ADN, reduce considerablemente esta propiedad, debido al apilamiento de las bases nitrogenadas (efecto hipocrómico). Sin embargo, la desnaturalización conlleva la formación de ADN monocatenario, que manifiesta una mayor absorbancia a 260nm (efecto hipercrómico). Figura 7. Obsérvese la relación entre disminución de la viscosidad o aumento de A260 y el proceso de desnaturalización del ADN. Página 12 Biología Molecular y Citogenética UT3 7. Replicación del ADN La replicación se produce manera coordinada con la división celular (fase S). 7.1. Características generales de la replicación Es semiconservativa. Aunque inicialmente se pueden plantear tres mecanismos para la replicación: conservadora, dispersante y semiconservadora, los experimentos de Messelson y Stahl demostraron que sólo el tercero tiene lugar en las células. Cada molécula hija está formada por una cadena parental y una cadena recién sintetizada. Figura 1. Modelos de replicación del ADN Comienza en un origen de replicación. Existen unos puntos de iniciación concretos denominados origen de replicación. En procariotas, empieza en un único punto denominado Ori C. En eucariotas existen varios puntos de inicio denominados replicones, iniciándose la replicación simultáneamente en varios puntos de cada cromosoma. Es bidireccional y secuencial. A partir del origen de replicación, las dos cadenas de ADN se separan, produciéndose la síntesis de las nuevas cadenas en ambas direcciones, dando lugar a dos horquillas de replicación. Página 13 Biología Molecular y Citogenética UT3 Es semidiscontinua. Las ADN polimerasas sólo pueden añadir nucleótidos en sentido 5´→3´ ya que leen la cadena molde en dirección 3´→5´, por lo que la síntesis de nuevas cadenas siempre se produce en dirección 5´→3´. Pero esto plantea un problema, porque en esta síntesis bidireccional, una de las hebras se lee correctamente, pero la otra se lee en sentido contrario 5´→3´. Por tanto, la replicación continua sólo es posible en una hebra molde, hebra líder, mientras que en la cadena complementaria, la replicación se produce de forma discontinua, hebra rezagada. En esta última, la replicación se lleva a cabo mediante pequeños fragmentos, denominados fragmentos de Okazaki, que posteriormente se unen mediante la ADN ligasa. Figura 2. Síntesis de las hebras líder y rezagada durante la replicación 7.2. Proteínas que intervienen en la replicación. ADN polimerasas: catalizan la formación de los enlaces fosfodiéster en sentido 5´→3´. Estas enzimas no pueden iniciar una cadena, tan solo elongar una pre- existente de ADN o ARN, añadiendo desoxinucleótidos al extremo 3´OH libre. Los nucleótidos incorporados son complementarios a la secuencia de la cadena que está leyendo. En procariotas (E. coli) existen tres enzimas, las ADN polimerasas I, II y III, cada una con una función específica. De ellas, la principal encargada de la replicación del ADN es la ADN polimerasa III. En eucariotas, existen 5 tipos de ADN polimerasas:     y  (las dos últimas son las que actúan en la replicación). A su vez, gracia a su actividad exonucleasa 3´→5´ (correctora de pruebas) pueden subsanar los errores que cometen en la unión de nucleótidos. Helicasas: rompen los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las bases complementarias y por tanto, desenrollan y separan las dos cadenas de la doble hélice. Empieza en el origen de replicación y continúa en ambos sentidos a medida que avanzan las enzimas de replicación. Página 14 Biología Molecular y Citogenética UT2 Proteínas de unión a hebra sencilla (SSB y RPA): se unen las hebras de ADN molde separadas por acción de la helicasa, manteniéndolas separadas. SSB actúan en procariotas y RPA en eucariotas. Girasa y Topoisomerasas: permiten relajar la tensión de la doble hélice que se genera por la apertura de la burbuja de replicación. La separación de las dos cadenas genera un súperenrrollamiento en el resto de la doble hélice, que estas dos enzimas alivian mediante cortes y empalmes. La más conocida es la topoisomerasa II o ADN girasa. Primasa: enzima procariota con función ARN polimerasa que sintetiza cortos fragmentos de ARN (10 nucleótidos) complementarios a zonas concretas de la cadena de ADN que se está replicando, denominados cebadores o primers. Así, sobre la cadena molde se generan cortas regiones de híbridos ADN-ARN que son reconocidos por la ADN polimerasa para iniciar la elongación. Para la síntesis de la hebra conductora sólo se requiere un cebador, mientras que la retardada necesita de un cebador para cada fragmento de Okazaki. En eucariotas, esta función la ejerce la ADN polimerasa . ADN ligasa: une dos fragmentos de ADN de una misma cadena. Es la responsable de unir los fragmentos de Okazaki entre sí. 7.3. Fases de la replicación Aunque existen diferencias en los procesos de replicación de procariotas y eucariotas, ambos son bastante similares, por lo que vamos a estudiar el modelo de replicación en procariotas. Fase de iniciación La replicación se inicia cuando proteínas específicas reconocen el Ori C y se unen a él. Esta unión activa a las helicasas, que rompen los enlaces por puente de hidrógeno que mantienen unidas a las cadenas y se forma la burbuja de replicación. Las SSB, mantienen las dos hebras separadas. Esta separación provoca superenrollamientos y tensiones en las zonas vecinas, que son eliminados por acción de las topoisomerasas. A partir de ahí se forma una burbuja de replicación y comienza la síntesis de ADN en cada uno de los extremos de la burbuja (las cadenas forman un estructura en forma de Y conocida como horquilla de replicación). La acción de la helicasa permite que la burbuja de replicación se extienda en los dos sentidos a lo largo del cromosoma. Página 15 Biología Molecular y Citogenética UT2 Fase de elongación Síntesis de dos nuevas hebras de ácido nucleico (ADN) Esta síntesis se lleva a cabo con la actuación de la ADN polimerasa, que realizan la síntesis de las nuevas hebras en sentido 5’-3’, ya que la lectura de las hebras moldes se hace en sentido 3’-5’. La ADN polimerasa por sí sola no es capaz de iniciar la síntesis de las nuevas hebras, sino que necesita de un cebador para hacerlo, ese cebador normalmente es un pequeño fragmento de ARN que será eliminado una vez que haya finalizado el proceso de duplicación del material genético. Este cebador es sintetizado por la enzima ARN polimerasa, o también denominada primasa. Eliminación del cebador y rellenado del hueco En procariotas, la ADN polimerasa I es capaz de degradar el cebador de ARN y sintetizar un fragmento de ADN en el hueco resultante. Ligado La ADN polimerasa no puede unir los fragmentos de Okazaki entre sí, requiere de la ADN ligasa, que establece un enlace fosfodiéster en una reacción que consume energía. Corrección de errores Corrección de errores cometidos durante el proceso. La principal enzima que interviene en la corrección es la ADN polimerasa III. Del mismo modo, participan endonucleasas (cortar el segmento que presenta el error), ADN polimerasas I (rellenar el hueco que han dejado las endonucleasas) y las ADN ligasas (unir los extremos corregidos). 8. Transcripción Es el proceso encargado de la síntesis de una molécula de ARN a partir de la información genética contenida en la región codificante de ADN. Da lugar a una molécula de ARN complementaria y antiparalela a una de las hebras de ADN usada como molde. Como resultado, obtenemos ARNm, ARNr y ARNt. En eucariotas, este proceso se lleva a cabo en el núcleo de la célula. En procariotas, en el propio citoplasma (en el nucleoide). La transcripción puede ocurrir en un sólo gen (en eucariotas) o en un grupo de genes (procariotas). Para que se produzca, son necesarios los siguientes requisitos: Página 16 Biología Molecular y Citogenética UT2 Una cadena de ADN que actúe como molde. Sólo una de las hebras del ADN actúa como molde para la síntesis de ARN. Enzimas. La transcripción es un proceso controlado por las ARN polimerasas. En procariotas sólo hay una, pero en eucariotas existen tres: ARN polimerasa I (sintetiza el ARNr), ARN polimerasa II (sintetiza el ARNm) y ARN polimerasa III (sintetiza el ARNt). Ribonucleótidos trifosfato de A, G, C y U. La ARN polimerasa une los NTP en sentido 5´→3´ mediante enlaces fosfodiéster. 8.1. Fases de la transcripción El proceso de transcripción se lleva a cabo en cuatro fases: iniciación, elongación, terminación y maduración. Iniciación Es la etapa más compleja. Para su comienzo, la ARN polimerasa ha de reconocer una región del ADN con una determinada secuencia, llamada promotor. Figura 3. Fase de iniciación en procariotas. En los organismos procariotas existen dos centros promotores: Caja TATA o Caja Pribnow y Caja -35. Secuencias de consenso en los promotores Inicio del RNA Región -35 Región -10 TTGACA N17 TATAAT N7 Caja de Pribnow Figura 4. Secuencias consenso del promotor de procariotas. Página 17 Biología Molecular y Citogenética UT2 En eucariotas, el centro promotor más fuerte es la Caja TATA o Caja Hogness. Figura 5. Secuencias promotoras en eucariotas y factores de transcripción que las reconocen. En procariotas, el reconocimiento del promotor es llevado a cabo por la propia ARN polimerasa, mientras que en eucariotas, son los factores de transcripción los que interaccionan con las diversas secuencias del promotor. La ARN polimerasa es responsable de la formación de la burbuja de transcripción, provocando el desenrollamiento por delante, y el re-enrollamiento, por detrás de la burbuja. Elongación La ARN polimerasa lee el ADN en dirección 3´→5´, por lo que el crecimiento del ARN se realiza en sentido 5´→3´. Los nucleótidos se van añadiendo según las reglas de complementariedad, donde en lugar de Timina se incorpora Uracilo. De las dos cadenas de ADN sólo se transcribe una de ellas, llamada hebra molde o cadena codificadora. La otra cadena que no se transcribe se denomina cadena no molde, cadena informativa o cadena sin sentido. Durante la transcripción, la ARN polimerasa se desplaza a lo largo de la cadena molde e incorpora el nucleótido a la cadena de ARN en crecimiento. Sólo un pequeño fragmento de ARN de unos 8-9 nucleótidos se mantiene unido al ADN molde. Figura 6. Fase de elongación en procariotas Página 18 Biología Molecular y Citogenética UT2 Cuando la hebra de ARN que se está sintetizando posee una longitud de aproximadamente 30 nucleótidos, se le añade una caperuza de metilguanosina trifosfato, que aumenta su estabilidad y posteriormente será clave para su reconocimiento por el ribosoma en la traducción. Terminación La ARN polimerasa continúa la transcripción hasta encontrar una señal de parada o secuencia terminadora en el ADN, y entonces el ARN se libera. En procariotas, la señal de parada es una secuencia palindrómica que forma una horquilla en el ARN favoreciendo la separación del ADN molde. En eucariotas es una señal de corte (AAAUAA). Cuando se separa el ARN, se une una enzima al extremo 3´para añadir una cola de poli A (aproximadamente 200 adeninas). Figura 7. Modelos de terminación en organismos procariotas y eucariotas. Maduración del ARN Se llama transcrito primario o precursor de ARN a la molécula de ARN recién sintetizada mediante el proceso de transcripción. Es decir, es el ARN inmaduro que requiere una serie de cambios o modificaciones para ser funcional. En los organismos procariotas, se produce maduración de los ARNt y ARNr. El ARNm no requiere maduración (no existen intrones), por lo que puede ser traducido inmediatamente (incluso durante su síntesis). En los organismos eucariotas, los precursores de los tres tipos de ARN requieren de un proceso de maduración o procesamiento postranscripcional. Éste tiene lugar en el núcleo. Posteriormente, las moléculas de ARN maduro serán transportadas al citoplasma a través de los poros nucleares. En eucariotas, la mayor parte de los genes que codifican proteínas están fragmentados. Cada gen consta de varios fragmentos de intrones y exones intercalados: ▪ Los intrones se pueden definir como regiones no codificantes del gen, que se transcriben pero no se traducen. ▪ Los exones son regiones que se encuentran entre los intrones y se conservan en el ARN maduro. Son la parte codificante. Página 19 Biología Molecular y Citogenética UT2 Por ello el ARN sintetizado directamente mediante transcripción se denomina ARN heterogéneo nuclear (ARNhn) o pre-ARNm. Los intrones se eliminan en un proceso denominado de corte y empalme o splicing. En este proceso, se eliminan los intrones y se unen los exones para generar una secuencia continua codificante de ARN. En el splicing participan las ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (RNPsn), que se sitúan en los extremos de los intrones y se agrupan formando un complejo de corte y empalme que recibe el nombre da espliceosoma, de forma que la secuencia intrónica forma un bucle. Finalmente la cadena de ARN se corta en la base del bucle y se empalman los exones para dar lugar al ARNm maduro y la liberación de los intrones en forma de lazo. Figura 8. Esquema del proceso de corte y empalme o splicing del ARNm de eucariotas para eliminar las secuencias intrónicas. 9. Traducción La traducción sería el último paso de la expresión génica. Es el proceso de formación de proteínas a partir de la información contenida en los ARNm. La molécula intermediaria es el ARNt y su funcionamiento se debe a su estructura secundaria en forma de hoja de trébol. Cada molécula de ARNt es específica de cada aminoácido; según el anticodón que tenga, sujeta por el triplete CCA al aminoácido apropiado. Previamente a la traducción, debe producirse una fase de activación de aminoácidos. Es decir, su fijación al triplete CCA del ARNt, que es llevada a cabo por las enzimas aminoacil-ARNt-sintetasa, que son específicas para cada aminoácido. Tanto en organismos procariotas como en eucariotas, la traducción consta de tres fases: iniciación, elongación y terminación. En todas ellas, intervienen complejos formados por ARNm, ribosomas y ARNt. Página 20 Biología Molecular y Citogenética UT2 9.1. Iniciación de la síntesis de proteínas Transcurre de forma semejante en procariotas y eucariotas y está controlado por los denominados factores de iniciación. Para ello se requieren dos señales de inicio: ▪ el triplete iniciador AUG (que codifica la metionina) ▪ la caperuza de metil guanosina trifosfato del extremo 5´del ARNm Gracias a los factores de iniciación, se produce el ensamblaje del ribosoma sobre el ARNm. Los ribosomas están constituidos por dos subunidades: - la subunidad pequeña tiene un sitio de unión al ARNm; - la subunidad grande, en organismos procariotas consta de tres sitios: o sitio A (o sitio del aminoacilo): donde entran los diferentes ARNt cargados con aminoácidos. o sitio P (o sitio peptidilo): donde se cataliza la adición de los aminoácidos al péptido en crecimiento o sitio E (exit): se produce la salida del ARNt vacío. En organismos eucariotas sólo existen los sitios A y P. La traducción comienza por el triplete AUG más próximo al extremo 5´. La subunidad pequeña del ribosoma reconoce a la caperuza y se une al ARNm dando lugar al denominado complejo de iniciación. Esto provoca que el codón AUG se sitúe en el sitio P donde a continuación se coloca el ARNt cargado con la metionina iniciadora (o formil-metionina, en el caso de organismos procariotas). Posteriormente se produce la unión de la subunidad grande del ribosoma para formar un ribosoma completo. 9.2. Elongación de la cadena polipeptídica Es el crecimiento de la cadena polipeptídica y consta de la repetición de ciclos de elongación, cada uno de los cuales consiste en añadir un nuevo aminoácido a la cadena. Cada ciclo consta de tres fases: Primera fase: el sitio P está ocupado inicialmente por el ARNt-Met (o formil-Met) y en el sitio A, que está vacío, se introduce otro ARNt cargado con su correspondiente aminoácido, cuyo anticodón es complementario a codón siguiente al AUG. Segunda fase: se establece el enlace peptídico entre el aminoácido recién entrado y la Met. Así, la Met queda unida al aminoácido del ARNt del sitio A. Ahora el sitio P se encuentra ocupado por un ARNt sin aminoácido. Tercera fase: el ribosoma se desplaza a lo largo del ARNm en sentido 5´→3´una posición (un triplete). Este movimiento se denomina translocación. Esto provoca Página 21 Biología Molecular y Citogenética UT2 que el ARNt del sitio P se expulse (en procariotas se sitúa en el sitio E y es expulsado igualmente) y que el ARNt que lleva el péptido en crecimiento, quede posicionado en el sitio P. El sitio A queda vacío para el recibimiento de un nuevo ARNt cargado en el siguiente ciclo. Este proceso es catalizado por los factores de elongación. 9.3. Terminación de la síntesis de proteínas La síntesis de la cadena polipeptídica se detiene cuando en el sitio A aparece uno de los tres codones de terminación en el ARNm (UAA, UAG o UGA). En este momento, entra un factor proteico de terminación RF (del inglés, release factor) en el sitio A, que actúa como si fuera un ARNt y provoca la liberación del péptido. A continuación se disocia todo el complejo: las dos subunidades del ribosoma se separan y se liberan el ARNm y los ARNt. Si un ARNm es lo suficientemente largo, puede ser leído a la vez por varios ribosomas (entre cinco y cuarenta), formando una estructura denominada polirribosoma o polisoma. 10. Enzimas asociadas a los ácidos nucleicos empleadas en Biología Molecular. En las diferentes técnicas utilizadas en los laboratorios de biología molecular se emplean diferentes tipos de enzimas. Destacan las endonucleasas de restricción (ER), las ADN ligasas, las ADN polimerasas y la transcriptasa inversa. 10.1. Nucleasas Son enzimas que cortan y degradan los ácidos nucleicos mediante hidrólisis del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos. Se clasifican: En función de su diana: nucleasas de ADN o de ARN. Según el tipo de cadena que cortan: nucleasas de cadenas bicatenarias o monocatenarias (por ejemplo, la nucleasa S1). Según la situación del punto de corte: -exonucleasas: eliminan nucleótidos uno a uno desde un extremo (en dirección 5´→3´o 3´→5´). Página 22 Biología Molecular y Citogenética UT2 -endonucleasas: cortan en puntos intermedios de la molécula, por ejemplo, la ADNasa I. Según la especificidad del corte: cortan en sitios aleatorios o específicos, como las endonucleasas de restricción que vamos a estudiar con más detalle debido a su importancia biológica. 10.2. Endonucleasas de restricción Son enzimas bacterianas que hidrolizan enlaces fosfodiéster de ADN de doble cadena en secuencias específicas. También se denominan nucleasas de restricción. Se nombran con tres letras, tomadas del género y especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, seguidas a veces por una letra más, que identifica la cepa de la bacteria, y finalmente, por un número romano que indica el orden de descubrimiento: Algunos ejemplos son: - EcoRI: de Escherichia coli, cepa RY13, primera descubierta. - HindIII: de Haemophilus influenzae, cepa d, tercera aislada. - NotI: de Nocardia ottidis, primera aislada. - BamHI: de Bacilus amiloliquefaciens, cepa H, primera aislada. Su importancia radica en su gran especificidad para reconocer una secuencia corte de ADN bicatenario, denominado sitio de restricción o secuencia diana. En bacterias, suponen un sistema de defensa, puesto que degradan el ADN exógeno, principalmente de virus. Su propio ADN queda protegido de la acción de estas enzimas mediante la metilación de las bases nitrogenadas de la secuencia de restricción. Casi todas las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción son palindrómicas, es decir, tienen un eje de simetría de modo que la lectura de las secuencias en ambas direcciones es idéntica. Página 23 Biología Molecular y Citogenética UT2 Debido al corte del ADN por las ER, se generan extremos 3´y 5´que pueden ser romos (se cortan las dos cadenas en el mismo punto, generalmente en el centro del sitio de restricción) o cohesivos (el corte se produce en distintos puntos de ambas cadenas, generando pequeñas zonas monocatenarias y complementarias entre sí). Eco RI Alu I 5' G A A T T C 3' 5' A G C T 3' C T T A A G 5' 3' T C G A Figura 9. Ejemplo de extremos cohesivos, generados por Eco RI o romos (AluI). Obsérvese la palindromía de las secuencias diana. Los fragmentos de ADN resultantes de la acción de estas enzimas son muy útiles para: ✓ Crear ADN Recombinante La propiedad de poder generar extremos cohesivos es muy útil en Biología Molecular para crear molécula de ADN recombinante. Así se puede insertar un determinado gen de un organismo, en otro diferente para producir una determinada proteína en grandes cantidades. Por ejemplo, la insulina se produce en grandes cantidades en bacterias. ✓ Elaborar perfiles de restricción Cada molécula de ADN presenta un número relativamente pequeño de dianas de cada enzima de restricción. Como consecuencia, la digestión con esa enzima genera un discreto número de fragmentos de distintos tamaños que se pueden separar mediante electroforesis, generando un patrón de restricción. Esta técnica es muy útil para: - Identificar muestras pertenecientes a un mismo individuo (importante en identificación criminal y forense). - Realizar estudios filogenéticos (relación evolutiva entre organismos) - Detección de polimorfismos o mutaciones. En algunos casos, la mutaciones afectan a las secuencias diana de las ER, en este caso, el estudio del ADN con la correspondiente ER permite comprobar si los fragmentos contienen la mutación (muy interesante en el diagnóstico prenatal). Página 24 Biología Molecular y Citogenética UT2 Figura 10. Patrones de restricción de diferentes individuos y marcaje con sondas radiactivas para la búsqueda de similitudes en investigación forense. 10.3. ADN polimerasas La mayor parte de las técnicas de análisis de los ácidos nucleicos requiere una fase previa de amplificación para obtener un elevado número de moléculas idénticas (copias). Para ello se emplean las ADN polimerasas, que mediante replicación permiten realizar copias de regiones concretas del ADN. Las más utilizadas son las ADN polimerasas I y III que requieren para su actuación: o la presencia de los 4 dNTPs o un ADN molde o cebadores o Mg2+ como cofactor Las diversas polimerasas disponibles en el mercado se diferencian en:  La velocidad de polimerización: nº de nucleótidos incorporados/min.  La fidelidad en la replicación: proporción de errores.  La termoestabilidad: la temperatura a la que se inactivan.  La procesividad: nº de nucleótidos que incorporan antes de separarse de la cadena molde.  La presencia o ausencia de actividad exonucleasa 3´: aporta función correctora y reparadora. Estos mecanismos de corrección son muy importantes para controlar Página 25 Biología Molecular y Citogenética UT2 la elevada tasa de errores que se producen en la replicación y que pueden conducir a mutaciones. 10.4. ADN ligasas Son enzimas que forman enlaces covalentes entre el extremo 5´de una cadena polinucleotídica y el extremo 3´ de otra. También pueden reparar mellas en una de las cadenas de un ADNds. Son muy útiles en la tecnología del ADN recombinante, para unir fragmentos de ADN de distinta procedencia previamente cortados por la misma enzima de restricción. 10.5. Transcriptasa inversa o retrotranscriptasa. Es una ADN polimerasa (aislada de los retrovirus) capaz de sintetizar ADN de doble cadena a partir de un ARN monocatenario como molde. El ADN sintetizado se denomina ADN copia (ADNc). Su empleo es muy útil para: Amplificación de ARN mediante PCR. Las ADN polimerasas sólo pueden amplificar ADN, por lo que para la amplificación del ARN es necesaria su conversión previa mediante un proceso denominado RT-PCR. Realizar estudios masivos de ARN. Junto a técnicas de ADN recombinante se han podido elaborar genotecas (librerías) de ADNc, que son reflejo de la expresión génica de una célula en un momento dado. 10.6. Topoisomerasas Ya hemos visto anteriormente que son enzimas que relajan la tensión de la doble hélice en regiones próximas a las burbujas de replicación o transcripción. En biología molecular se utilizan para relajar estructuras superenrrolladas de ADN como paso previo a la aplicación de otras técnicas. 10.7. Desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) Es una ADN polimerasa que cataliza la incorporación de desoxinucleótidos al extremo 3´de una molécula de ADN. Pero a diferencia de otras polimerasas no requiere de cebador ni de cadena molde de ADN para ejercer su actividad. Página 26 Biología Molecular y Citogenética UT2 Se han aislado de células linfoides inmaduras y de células de ciertos linfomas y leucemias. Una de sus principales utilidades es el marcaje terminal de sondas con nucleótidos marcados. A tener en cuenta: ✓ La replicación es el proceso mediante el cual, a partir de una molécula de ADN progenitora o parental, se sintetiza una nueva, originándose así dos moléculas de ADN hijas, de secuencia idéntica a la de ADN original. ✓ El modelo de Watson y Crick explica el mecanismo el replicación semiconservativa. ✓ La diferente estructura del ADN en organismos procariotas y eucariotas, es responsable de pequeñas diferencias en los mecanismos de replicación. ✓ La replicación de las dos hebras ocurre simultáneamente, aunque la síntesis de una de las hebras hijas es rezagada respecto de la otra hebra líder. ✓ Cada fragmento de Okazaki necesita un cebador de ARN para su síntesis. ✓ La transcripción es el proceso encargado de la síntesis de una molécula de ARN a partir de la información genética contenida en la región codificante de ADN. ✓ La transcripción siempre se inicia den determinadas regiones denominadas promotores, que constan de diversas secuencias consenso. ✓ La ARN polimerasa lee el ADN en dirección 3´→5´. ✓ Tras la transcripción se genera un pre-ARN, que debe ser procesado para obtener un ARN maduro, excepto en el caso Página 27 Biología Molecular y Citogenética UT2 del ARNm de procariotas. ✓ El mecanismo más relevante de procesamiento del ARNm es la eliminación de intrones mediante splicing. ✓ La traducción consiste en la síntesis de proteínas mediante la unión covalente de aminoácidos, según el orden establecido por la secuencia de nucleótidos del ARNm y de acuerdo con el código genético. ✓ En la traducción participan los tres tipos de ARN: ARNm, ARNr y ARNt. ✓ La adición de cada aminoácido se realiza en un ciclo de tres fases catalizadas por factores protéicos. ✓ Un ARNm puede ser leído por varios ribosomas, generando un polirribosoma que puede estar en el citoplasma o unido a las membranas del retículo endoplásmico. ✓ El código genético es la relación de correspondencia entre las bases nitrogenadas del ARNm y los aminoácidos que codifica. ✓ Las enzimas de restricción son una herramienta muy importante en las técnicas de biología molecular. ✓ Las ER producen roturas en ambas hebras de ADN, simétricas respecto a un eje binario y pueden generar extremos romos o cohesivos. 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