Resumen de Proteínas - Análisis Bioquímicos

UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN EL METABOLISMO BÁSICO DE LAS PROTEÍNAS 1. INTRODUCCIÓN Las proteínas so...

UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN EL METABOLISMO BÁSICO DE LAS PROTEÍNAS 1. INTRODUCCIÓN Las proteínas son unas macromoléculas fundamentales en el desarrollo de la Vida. Sus múltiples funciones demuestran su importancia en la fisiología de todos los seres vivos. Sus alteraciones, por tanto, tendrán una gran trascendencia en el estado sanitario de los individuos, por lo que la valoración de su metabolismo a través de su determinación laboratorial es una herramienta muy útil en el campo clínico. En este tema vamos a estudiar sus características generales y su metabolismo, así como sus alteraciones, las pruebas laboratoriales destinadas a diagnosticarlos y los patrones de alteración más típicos. BLOQUE I: GENERALIDADES DE LAS PROTEÍNAS 1. CONCEPTO Las proteínas, componente en mayor proporción de las células, son macromoléculas (polímeros) formadas por AMINOÁCIDOS (monómero), mediante enlaces o uniones peptídicas (luego veremos esto qué es). El término proviene de la palabra griega “proteios” que significa: “prominente, de primera calidad”. 2. FUNCIONES Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más versátiles y más diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan:  ESTRUCTURAL: es la función más importante (Ej: colágeno, queratina, glucoproteínas de la membrana plasmática…)  DEFENSIVA (ANTICUERPOS, FIBRINÓGENO, TROMBINA…)  ENZIMÁTICA (Ej: sacarasa y pepsina)  CONTRÁCTIL (actina y miosina)  HOMEOSTÁTICA: colaboran en el mantenimiento del pH (ya que actúan como un tampón químico) y del equilibrio hídrico.  MANTENIMIENTO DE LA PRESIÓN SANGUÍNEA (ONCÓTICA): albúmina, fundamentalmente.  TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES (Ej: rodopsina)  TRANSPORTADORA (hemoglobina, lipoproteínas…)  RESERVA: (caseína láctea, ovoalbúmina…)  HORMONAL (insulina, glucagón…) 3. ESTRUCTURA 3.1. MONÓMEROS: AMINOÁCIDOS Ácido carboxílico (GRUPO CARBOXILO = -COOH) con grupo amino (-NH2) en carbono alfa (el primer C si no contamos el del grupo carboxílico). Los aminoácidos pueden ser: - NO PROTEICOS (ornitina, citrulina...hasta unos 150). Algunos tienen funciones propias (por ejemplo, son neurotransmisores y otros son simplemente intermediarios metabólicos que aparecen en las reacciones metabólicas. - PROTEICOS: sólo hay 20, que se diferencian por su cadena R. Y son en los que nos vamos a centrar. Según un criterio físicoquímico, los aminoácidos se clasifican en:  apolares o hidrófobos (alanina...)  polares no ionizables o hidrofílicos (serina...) Página 1 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ.  polares ionizables aniónicos o ácidos (ácido aspártico...)  polares ionizables catiónicos o básicos (lisina...) CH3-CH-COOH CH2OH-CH-COOH HOOC-CH2-CH-COOH NH2-(CH2)4-CH-COOH I I I I NH2 NH2 NH2 NH2 Alanina Serina Ac. Aspártico Lisina Los aminoácidos pueden ser sintetizados, excepto los llamados ESENCIALES: Valina, Leucina, Isoleucina, Treonina, Metionina, Lisina, Fenilalanina, Triptófano (algunos autores incluyen también la Histidina, Arginina y Cisteína porque para determinadas edades o estados fisiológicos, lo son). Los otros aminoácidos proteicos son la Glicina, Alanina, Serina, Glutamina, Ac. Glutámico, Ac Aspártico, Prolina, Tirosina y Asparagina. Propiedades ácido-base de los aminoácidos Los aminoácidos son capaces de neutralizar los cambios de pH del medio (al menos, parcialmente). Esto es gracias a sus grupos carboxilo y amino que, según el pH del medio se ionizan de diferente forma: pH DEL MEDIO FORMA IÓNICA QUE ADQUIERE EL CAPACIDAD TAMPONADORA del aa aa BÁSICO ANIÓN ACTÚA COMO ÁCIDO = CEDE PROTONES ÁCIDO CATIÓN ACTÚA COMO BASE = CAPTA PROTONES INTERMEDIO ANFÓTERO Puede actuar como ácido o como “PUNTO ISOELÉCTRICO” = pH al que base se consigue una carga neta 0 (diferente para cada aa) Esta propiedad de poder controlar el estado de ionización de las proteínas con el pH del medio en el que se encuentran es uno de los fundamentos de la técnica de ELECTROFORESIS, gracias a la cual podemos estudiar las proteínas de un paciente y diagnosticar diferentes patologías. La veremos más adelante… Página 2 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 3.2. PÉPTIDOS PÉPTIDO = unión de dos aminoácidos mediante el llamado ENLACE PEPTÍDICO = unión covalente de tipo amida entre el grupo amino de uno y el carboxilo de otro, mediante un enlace covalente de tipo amida y con la eliminación de una molécula de agua. Los aminoácidos unidos por enlace peptídico se denominan RESIDUOS. - OLIGOPÉPTIDO = unión de menos de 10 aminoácidos. - POLIPÉPTIDO = 10-100 - PROTEÍNAS = más de 100 aa Aunque generalmente nombramos a las proteínas, hay algunos péptidos que desempeñan funciones fundamentales en nuestro organismo, como la hormonal (oxitocina, ADH) o la transportadora (glutation, que transporta aminoácidos al exterior celular). 4. NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Para que se forme una proteína funcional, se parte de una simple secuencia lineal de aminoácidos pero, a partir de ella, se generan diferentes estructuras, cada vez más complejas. Por ello hablamos de 4 niveles de organización que se conocen como estructura primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria. NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS NIVEL DE ORGANIZACIÓN CONSISTE EN DEBIDO A OBSERVACIONES (ESTRUCTURA) PRIMARIA SECUENCIA DE ENLACES PEPTÍDOS DIFERENCIAS SEGÚN NÚMERO, AA CLASE Y ORDEN DE LOS AA Página 3 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. SECUNDARIA DISPOSICIÓN PUENTES DE APARECEN 2 DISPOSICIONES: ESPACIAL (3D) HIDRÓGENO ENTRE - HÉLICE ALFA: estructura EL H UNIDO AL N DE helicoidal, a modo de giro o UN AA CON EL O DE acodamiento, como la hélice OTRO AA. de colágeno (proteína formada mayoritariamente por prolina) - ESTRUCTURA BETA (O EN HOJA O LÁMINA PLEGADA): proporciona rigidez y dureza a la proteína. Las cadenas pueden unirse en forma paralela o antiparalela. TERCIARIA CONFORMACIÓN UNIONES ENTRE LOS DOS FORMAS: GLOBAL entre –R DE LOS AA - GLOBULARES (ovillo) varias alfa hélice CONDICIONADAS - FIBROSAS (enrolladas y/o láminas POR PUENTES alrededor de un eje) beta. DISULFURO, FUERZAS ELECTROSTÁTICAS, PUENTES DE HIDRÓGENO… CUATERNARIA ASOCIACIÓN DE VARIAS Ejemplos: CADENAS - la hemoglobina, que está Cada cadena = formada por 4 subunidades SUBUNIDAD O - inmunoglobulinas que están PROTÓMERO) formadas por cuatro cadenas o subunidades, dos llamadas pesadas y otras dos ligeras DESNATURALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS: alteración de la funcionalidad (ACTIVIDAD BIOLÓGICA) Y de su hidrosolubilidad debido a la PÉRDIDA DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL (cuaternaria, terciaria, secundaria, según el caso), quedando solamente la primaria. Puede deberse a: - temperaturas elevadas (superiores a 50-60° C, generalmente) - pH extremos. - sustancias químicas - estrés físico… En general, mientras se mantenga la estructura primaria, la proteína podrá renaturalizarse si se reponen las condiciones ambientales ideales. 5. CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS (TIPOS) Las proteínas se clasifican, según su composición en:  HOLOPROTEÍNAS (formadas sólo por aminoácidos): según su estructura se distinguen: Página 4 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ.  Fibrosas: suelen ser haces paralelos, normalmente con función estructural. Son proteínas insolubles en agua. Entre ellas destaca el COLÁGENO, que es el principal componente del tejido conjuntivo y fundamental en la matriz extracelular de piel, cartílago, hueso, córnea y tendones. Otras proteínas fibrosas son la MIOSINA y actina (proteínas contráctiles), las QUERATINAS (forman parte de la epidermis, uña, pelo...), ELASTINA (forma parte de la piel, cartílagos, vasos sanguíneos... estructurada en forma de redes flexibles y elásticas) y la FIBRINA (se origina a partir del fibrinógeno e interviene en la coagulación).  Globulares: son más complejas que las fibrosas. Son solubles en agua o en disoluciones polares. Pertenecen a este grupo las ALBÚMINAS (ovoalbúmina, lactoalbúmina y seroalbúmina), las GLOBULINAS (no son solubles en agua pero sí en disoluciones acuosas como lo es el plasma) y las HISTONAS (proteínas asociadas al ADN).  HETEROPROTEÍNAS (formadas por una parte proteica y otra no proteica llamada GRUPO PROSTÉTICO). Según la naturaleza del grupo prostético, se clasifican en:  Lipoproteínas (estudiadas en el tema del metabolismo lipídico)  Glucoproteínas (son ejemplo el FIBRINÓGENO, LAS INMUNOGLOBULINAS Y LAS PROTEÍNAS DE LA MEMBRANAS CELULARES)  Cromoproteínas (son ejemplo la HEMOGLOBINA Y LA MIOGLOBINA, que llevan como grupo prostético el denominado GRUPO HEMO - con Fe2+ - mientras que las PEROXIDASAS, CATALASAS Y CITOCROMOS llevan el grupo hemino - Fe3+ -) La hemoglobina transporta el oxígeno a través de la sangre, la mioglobina en los músculos, las peroxidasas y catalasas son enzimas y los citocromos son proteínas transportadoras de electrones de la cadena respiratoria. Página 5 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. BLOQUE II: METABOLISMO DE PROTEÍNAS 1. BALANCE NITROGENADO Ya hemos visto las funciones que tienen las proteínas. Son moléculas que están en continua producción, uso, eliminación y reutilización en el organismo. Las proteínas presentan un equilibrio dinámico permanente entre la síntesis y la degradación, es decir, las proteínas están en continuo recambio: como todas las proteínas tienen un tiempo de vida determinado o vida media, que va de días a años, tiene que haber también un aporte diario (dieta) que compense las que se pierden = MANTENIMIENTO DEL BALANCE NICROGENADO (BN) = EQUILIBRIO ENTRE EL N INGERIDO Y EL N ELIMINADO.  Se estima que un mamífero recambia alrededor del 5% de sus proteínas cada día, con una pérdida diaria de 30-40 gramos de proteína endógena, aún en buenas condiciones de alimentación.  Se estima que una dieta balanceada debe contener entre 10 a 20% de energía como proteína de alto valor biológico (huevos, leche, carnes, pescado o cereal+legumbre). SÍNTESIS PROTEICA DEGRADACIÓN PROTEICA ÓRGANOS TIPO CELULAR TIPO DE PROTEÍNA CAUSA ÓRGANOS ENCARGADO PRODUCIDA HÍGADO HEPATOCITOS ALBÚMINA PÉRDIDAS AL PIEL EXTERIOR INTESTINO GLÁNDULAS EXOCRINAS SISTEMA RESPIRATORIO BAZO, GL, CÉLULAS ANTICUERPOS CATABOLISMO HÍGADO MÉDULA ÓSEA, PLASMÁTICAS ENDÓGENO SISTEMA RETÍCULO-ENDOTELIAL INTESTINO, PULMONES… Página 6 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 2. DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN DE LAS PROTEÍNAS DIETA >> AA = ÚNICA FUENTE DE N ÚTIL PARA LA SÍNTESIS DE AA NO ESENCIALES Y OTROS COMPUESTOS NITROGENADOS. INGESTIÓN EN ESTÓMAGO E INTESTINO DELGADO PEPTIDASAS >>>PROTEOLISIS DE LOS ENLACES PEPTÍDICOS. DIGESTIÓN EXOPEPTIDASAS: CARBOXIPEPTIDASA O AMINOPEPTIDASA (páncreas) ENDOPEPTIDASAS: PEPSINA (estómago), TRIPSINA (páncreas) Y QUIMOTRIPSINA (páncreas) ENZIMÁTICA ABSORCIÓN DE AA A TRAVÉS DE LA PARED DEL ENTEROCITO MEDIANTE TRANSPORTADORES ESPECÍFICOS ENTRADA EN EL DIPÉPTIDOS Y TRIPÉPTIDOS PASAN A AA TAMBIÉN ENTEROCITO DISTRIBUCIÓN A LOS TEJIDOS PASO A CIRCULACIÓN COTRANSPORTE ASOCIADO AL SODIO ENTRADA A LAS SISTEMA DE LA GAMMA GLUTAMIL TRANSPEPTIDASA CÉLULAS PARA SU USO ENZIMA SÍNTESIS EN ACCIÓN EN EFECTO PEPSINA MUCOSA GÁSTRICA ESTÓMAGO (PH 2) Proteínas >> péptidos EN FORMA INACTIVA ACTIVACIÓN POR LA (PEPSINÓGENO = ACIDEZ PROENZIMA) OTRAS PEPTIDASAS Mucosa intestinal, INTESTINO Péptidos >>> oligopéptidos Gran variedad: páncreas. (PH BÁSICO) y raramente aa. Aminopeptidasas, carboxipeptidasas… TRIPSINA PÁNCREAS INTESTINO SÓLO ROMPE EL ENLACE COMO TRIPSINÓGENO ACTIVACIÓN POR LAS PEPTÍDICO DETRÁS DE (INACTIVO) ENTEROQUINASAS CIERTOS AA QUIMOTRIPSINA PÁNCREAS INTESTINO SÓLO ROMPE EL ENLACE COMO ACTIVACIÓN POR LA PEPTÍDICO DETRÁS DE QUIMOTRIPSINÓGENO TRIPSINA CIERTOS AA (INACTIVO) Página 7 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 3. USO Y DEGRADACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS Una vez en la célula, se utilizan para: a) SÍNTESIS DE MOLÉCULAS PROPIAS: a. Nuevas proteínas: para reponer, renovar… b. otros compuestos nitrogenados: neurotransmisores, bases nitrogenadas, hormonas… b) OBTENCIÓN DE ENERGÍA: + de forma directa: dan acetil- Co A, que se incorpora al ciclo de Krebs. A este le seguirá la respiración oxidativa celular, en la que se produce ATP + de forma indirecta: se produce piruvato y este da lugar a glucosa por gluconeogénesis. No existen células especializadas en el almacenamiento de proteínas, por lo que un exceso de aminoácidos en la dieta acaba por convertirse en reserva lipídica. En condiciones de ayuno el organismo obtiene energía principalmente a partir de lípidos de reserva y aminoácidos, ya que el glucógeno representa menos del 1% de reserva de energía. Los aminoácidos se obtienen de: - primero de las proteínas plasmáticas - luego de vísceras, como hígado y páncreas. - Por último, en casos estremos, de los músculos: que representan más del 60% de la proteína corporal, pero son más lentos para aportar aminoácidos. La degradación de los aminoácidos se lleva a cabo sobre todo en las CÉLULAS HEPÁTICAS. LOS HEPATOCITOS TIENEN LA VENTAJA DE PODER REALIZAR EL CICLO DE DEGRADACIÓN COMPLETA DE TODOS LOS AMINOÁCIDOS (ES DECIR, lo catabolizan SIN LIBERAR NI SIQUIERA PEQUEÑAS CANTIDADES DE AMONIO –NH4+ - , QUE ES MUY TÓXICO PARA EL ORGANISMO). Otros tejidos, como el muscular, el renal, el intestinal o el nervioso sólo degradan aminoácidos específicos, y no siempre de forma completa. La degradación de los aminoácidos implica dos procesos: 1) DESAMINACIÓN: eliminación del N 2) OXIDACIÓN DEL ESQUELETO CARBONADO: para obtener energía Página 8 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 1) DESAMINACIÓN: VÍDEO: DESAMINACIÓN (10 MIN) https://www.youtube.com/watch?v=L5cxXtrCJmM - CONSISTE EN: eliminación del N del grupo amino - OBTENCIÓN DE:  N EN FORMA DE IÓN AMONIO (NH4+): es muy tóxico para el organismo.  Ácido glutámico: él mismo neutraliza el ión amonio, dando glutamina >>> la glutamina es llevada al hígado, donde se revierte a ácido glutámico y amonio, que pasa al ciclo de la UREA para ser eliminado. - ÓRGANOS DONDE SE REALIZA: hígado, corazón, riñón y músculo esquelético - MEDIANTE: enzimas TRANSAMINASAS O AMINOTRANSFERASAS.  Necesitan VITAMINA B6 (piridoxina) COMO COFACTOR ENZIMÁTICO.  Las más abundantes son:  AST= Aspártico Aminotransferasa (o GOT = Glutámico Oxalacético Transferasa)  ALT = Alanino Aminotransferasa (o GPT = Glutámico Pirúvico Transaminasa). 2) OXIDACIÓN DEL ESQUELETO CARBONADO VÍDEO: OXIDACIÓN DEL ESQUELETO CARBONADO (10 min) https://www.youtube.com/watch?v=evrFU4pnTQw Eliminado el amoníaco de los aminoácidos en los procesos vistos de desaminación, el esqueleto carbonado se degrada siguiendo vías peculiares de cada aa, dando un pequeño número de metabolitos intermediarios. Según las características de estos metabolitos, los aa se clasifican en cetogénicos, glucogénicos y mixtos.  Los aminoácidos cetogénicos dan acetil-CoA y acetoácetico, y pueden oxidarse totalmente o participar en la biosíntesis de cuerpos cetónicos y lípidos. La leucina y la lisina son cetogénicos.  Los glucogénicos pueden dar glúcidos, por gluconeogénesis. La mayoría de los aminoácidos son glucogénicos.  Son mixtos la isoleucina, la fenilalanina, la tirosina y el triptófano. Página 9 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 4. EXCRECIÓN DEL NITRÓGENO (eliminación al exterior del organismo) VÍDEO: CICLO DE LA UREA https://www.youtube.com/watch?v=XVXIB42T9x8 Ya hemos dicho que el IÓN AMONIO que se obtiene al catabolizar el grupo amino ES MUY TÓXICO, sobre todo para el cerebro. Para mantener niveles no perjudiciales en los tejidos, el propio ácido glutámico capta el amonio transformándose en glutamina (reacción catalizada por la glutamina sintetasa). Después, el hígado capta la glutamina y la reconvierte en ácido glutámico liberando amoníaco, que entra en el CICLO DE LA UREA (en el caso de la especie humana, que elimina el 80-90% del N por esta vía. Otros animales eliminar el N al exterior en forma de ácido úrico – aves- , o incluso de amoníaco, directamente – peces-). LA UREA OBTENIDA YA PODRÁ ELIMINARSE VÍA RENAL (orina). Reacción global de la síntesis de urea: 2 NH3 + CO2 + 3 ATP + 3 H2O ------------------------------------- ► urea + 2 ADP + AMP + Pi En esta reacción se observa que para eliminar el N se ha de consumir energía. 5. ALTERACIONES EN EL METABOLISMO PROTEICO (es decir, de su ANABOLISMO y de su CATABOLISMO) ANABOLISMO O SÍNTESIS DE PROTEÍNAS ALTERACIÓN ANABOLISMO O SÍNTESIS CATABOLISMO O DEGRADACION DISMINUCIÓN FALTA DE MONÓMEROS = AA FALTA DE ENZIMAS DEGRADATIVOS malnutrición, caquexia, síndromes de enfermedades genéticas o malabsorción, ayuno, etc… metabólicas, intoxicaciones… FALTA DE CÉLULAS SINTETIZADORAS (HEPATOCITOS, CÉLULAS PLASMÁTICAS…) por defectos congénitos, tóxicos como fármacos o radiaciones, por inflamación y/o necrosis como en hepatitis, cirrosis, metástasis hepáticas o medulares, inmunodeficiencias, etc… AUMENTO FISIOLÓGICO = EMBARAZO - AUMENTO DE PÉRDIDAS (producción de hormonas, EXTERNAS: (hemorragia, proteinuria, anticuerpos, estructuras uterinas…) gastroenteropatías, quemaduras) - AUMENTO DE CONSUMO DE PATOLÓGICO: PROTEÍNAS CON FUNCIÓN BIOLÓGICA CONCRETA Y DEFINIDA: -NEOPLASIAS: mieloma Fibrinógeno, Complemento… Página 10 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. - CAUSAS REACTIVAS: inflamación, - AUMENTO DEL CATABOLISMO enfermedades del Colágeno, déficits CELULAR EN LOS TEJIDOS: de Fe con aumento de Transferrina… inflamación, neoplasias, etc… Así, en función de la relación existente entre la síntesis y la degradación, podrá presentarse un cuadro de: - HIPERPROTEINEMIA (por deshidratación, enfermedades crónicas…) - HIPOPROTEINEMIA (por un exceso relativo de agua, pérdida proteica – síndrome nefrótico, enteropatías, quemaduras…- o por disminución de la síntesis – dietética, malabsorción, hepatopatía…) Página 11 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. BLOQUE III ANÁLISIS LABORATORIAL DEL METABOLISMO PROTÉICO 1. PREMISAS  El plasma sanguíneo contiene una concentración aproximada de unos 7 g/dl de proteínas.  Aunque se utiliza como sinónimo el término de proteínas totales, plasmáticas o séricas no significan lo mismo, ya que al referirse al suero no se considera el fibrinógeno (0.3 g/dl) >>> suero presenta menos cantidad de proteínas que el plasma.  Por otra parte hay algo menos de proteínas en la sangre arterial que en la venosa y significativamente menos al principio del día que al final.  La conservación del suero entre 5 y 10° C puede mantenerse durante una semana.  POR ELECTROFORESIS se separan 5 fracciones: Albúmina; alfa, beta y gamma globulinas y fibrinógeno.  Cumplen diversas funciones como la de transporte de sustancias, regulación de la presión oncótica, coagulación, inmunitaria... ORIGEN CAUSA DE PORQUE… CAUSA DE AUMENTO PORQUE… DISMINUCIÓN DE DE PROTEÍNAS PROTEÍNAS PROCESADO CONTAMINACIÓN SE DETERIORAN LAS NO TAPAR LOS TUBOS SE EVAPORA EL BACTERIANA PROTEÍNAS ADECUADAMENTE AGUA (muy fácil) DETERMINADOS DISMINUYEN EL PH >>> PLÁSTICOS DESNATURALIZACIÓN HEPARINA DISMINUYE LA (conservante) ALBÚMINA PACIENTE REPOSO Atrofia muscular PROLONGADO DESNUTRICIÓN FALTA DE MONÓMEROS GÉNERO FEMENINO FISIOLÓGICO, en comparación en g. masculino EDAD AVANZADA FISIOLÓGICO por metabolismo más bajo. 2. TÉCNICAS BÁSICAS DE ANÁLISIS DEL METABOLISMO PROTEICO PARA ESTUDIAR EL METABOLISMO PROTEICO PODEMOS REALIZAR:  UN ANÁLISIS CUANTITATIVO DE CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS: o EN SANGRE o EN ORINA…  UN ANÁLISIS CUALITATIVO DE LAS DIFERENTES FRACCIONES PROTEICAS: ver patrones normales y anormales.  CUANTIFICAR SUS PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN Las técnicas que se realizan para analizar el metabolismo proteico son: 1) Proteinograma 2) Refractometría 3) Reacción de Biuret 4) Turbidimetría 5) Nefelometría 6) Inmunofijación Página 12 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 7) Amoníaco Sanguíneo 8) Prueba de la Fenilcetonuria 1. PROTEINOGRAMA 1.1. CONCEPTO El proteinograma es una representación gráfica (CURVAS) de la distribución de las 5 diferentes fracciones de las proteínas plasmáticas que pueden distinguirse mediante electroforesis: LA ALBÚMINA Y LAS CUATRO DE LAS GLOBULINAS (ALFA 1, ALFA 2, BETA Y GAMMA)  CADA PROTEÍNA APARECE FORMANDO UN PICO CARACTERÍSTICO, EN FORMA Y POSICIÓN >>> podemos observar a simple vista si el patrón es normal o no.  el TAMAÑO del pico indica la cantidad de proteínas de ese grupo >>> PODEMOS CUANTIFICAR CADA GRUPO PROTEICO INDIVIDUALMENTE. 1.2. MÉTODO LABORATORIAL Dicha curva se obtiene mediante el método de ELECTROFORESIS. - Fundamento físico químico:  los aminoácidos/proteínas son moléculas que pueden variar su estado de ionización en función del pH del medio (tampón) >>> UTILIZAREMOS UN TAMPÓN PH 8,6, DE MODO QUE QUEDARÁN CON CARGA NEGATIVA >>> SE DESPLAZARÁN AL POLO POSITIVO (ÁNODO). PEROOOO…¿SEGURO QUE EL POLO POSITIVO SE LLAMA ÁNODO? TIPO DE SISTEMA POLO POSITIVO POLO NEGATIVO EJEMPLO DADOR DE CÁTODO ÁNODO PILA ENERGÍA ACEPTOR DE ÁNODO CÁTODO ELECTROFORESIS ENERGÍA  Al quedar cargados, si son sometidos a un campo eléctrico, se desplazarán hacia el polo de carga opuesta en función de su: o Carga: CUANTO MAYOR SEA SU CARGA NETA NEGATIVA, MÁS SE DESPLAZARÁN. o Masa: a mayor masa, menos migrarán (ALBÚMINA ES LA MENOR DE TODAS). Por todo ello:  LA ALBÚMINA CONSTITUIRÁ LA FRACCIÓN QUE MÁS MIGRE PORQUE QUE TENDRÁ MAYOR CARGA NEGATIVA Y MENOR PESO MOLECULAR (66 KDa, frente a la gamma globulina que tiene 150 Da).  Por orden de más a menos migración estarán: ALBÚMINA, ALFA 1 GLOBULINAS, ALFA 2 GLOBULINAS, BETA GLOBULINAS Y GAMMA GLOBULINAS. Página 13 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. Habitualmente se realiza una electroforesis sobre gel de agarosa o poliacrilamida (PAGE) y posterior tinción con Rojo Ponceau o Negro Amido para poder visualizar las bandas. Las electroforesis en acetato de celulosa están desfasadas a nivel clínico. 1.3. UTILIDAD CLÍNICA DEL PROTEINOGRAMA La principal utilidad es la detección de gammapatías monoclonales1, aunque orienta en otras patologías como las hipoproteinemias, síndrome nefrótico, cirrosis, reacción de fase aguda, déficit de hierro, hemólisis... 1 GAMMAPATÍAS MONOCLONALES: grupo de enfermedades de tipo neoplásico en las que prolifera un grupo de células plasmáticas que producen un mismo tipo de Ig (generalmente anormales) y dejan de producir el resto de Ig. Página 14 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 1.4. PATRONES DE ALTERACIÓN DEL PROTEINOGRAMA. Ya hemos dicho que el proteinograma normal tiene una morfología característica y un orden de migración de las proteínas concreto. Determinadas patologías en las que se altera el proteinograma se manifiestan con patrones claramente diferentes y, también, característicos de esos casos clínicos. Las principales alteraciones del proteinograma son:  Hipoproteinemia: por hipoalbuminemia  Deficiencias de α1 antitripsina, inmunoglobulinas, complemento  Paraproteinemia: presencia de proteínas anormales o en cantidad excesiva (reacción de fase aguda, mielomas, macroglobulinemia, linfomas B…) Página 15 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 1) HIPOPROTEINEMIAS En las hipoproteinemias por malnutrición o pérdidas, disminuyen todas las fracciones, pero la más acentuada se ve en la albúmina. 2) INANICIÓN SEVERA, MALABSORCIÓN O INANICIÓN + reducen la albúmina por debajo de 20 g/l. + El sistema inmune se afecta enormemente, produciéndose hipogammaglobulinemia y, por tanto, menor resistencia a las infecciones. 3) ENTEROPATÍAS CON PÉRDIDAS DE PROTEÍNAS Disminuyen todas las fracciones, pero la fracción Alfa2 puede ser relativamente superior por coexistir respuesta de fase aguda (haptoglobina) o retención de proteínas grandes (macroglobulina). 4) SÍNDROME NEFRÓTICO La pérdida de proteínas ocurre en base a su PM. Se pierden más rápidamente las más pequeñas (albúmina, AAT, transferrina, inmunoglobulinas) y las grandes, como las AMG, son retenidas, dando un patrón electroforético complementario entre el suero y la orina. 5) PROTEINURIA TUBULAR Por no reabsorción tubular de pequeñas proteínas. Da un patrón de fracciones αβγ en la orina, con solo una pérdida mínima de albúmina en orina. 6) PATRÓN DE FASE AGUDA Aumenta la haptoglobina y disminuye ligeramente la albúmina. La medición inmunológica de la CPR puede estar hasta 1000 veces aumentada. 7) PATRÓN DE RESPUESTA TARDÍA O PATRÓN CRÓNICO Es una prolongación de la respuesta aguda (Haptoglobina elevada, albúmina ligeramente disminuida) y un incremento policlonal de inmunoglobulinas que ensanchan la fracción γ. 8) CIRROSIS HEPÁTICA Da un patrón típico: albúmina disminuida, incremento de y globulinas policlonales (que se producen para compensar la disminución de la presión oncótica) y una continuidad β-y (denominado PUENTE Β-Y). Página 16 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 9) GAMMAPATÍAS MONOCLONALES Son trastornos inmunológicos o también pacientes tratados con inmunosupresión crónica o trasplantes. En las gammapatías monoclonales hay un transformación oncológica (MIELOMA)de una línea de células plasmáticas, de manera que producen Ig anormales (PLASMOCITOMA) >>> producción de gammaglobulinas de cadena pesada. La evaluación de laboratorio de los mielomas exige realizar electroforesis de suero y orina, inmunoelectroforesis para tipar las cadenas pesadas y ligeras y cuantificación de inmunoglobulinas para tener una base de monitorización del tratamiento y evolución de la enfermedad. 10) HIPOGAMMAGLOBULINEMIAS Presentan ausencia de fracción y. Se observan en los recién nacidos por inmadurez de su sistema inmunitario, y en los estados de inmunodeficiencias de células B o por quimioterapia antineoplásica. 2. REFRACTOMETRÍA - Método: manual, muy sencillo. - Instrumento: refractómetro de mano. - Fundamento: refracción de la luz por parte de las proteínas. - Resultado: mide el índice de refracción de la disolución. En el visor se pueden observar diferentes escalas, según la sustancia a medir. En el caso de las proteínas aparece la equivalencia del índice de refracción en concentración de proteínas totales (g/100 ml). Se obtienen valores más elevados que en la reacción del Biuret. - Procedimiento:  Se ajusta a 0 con agua destilada y se adapta el objetivo.  Se coloca una gota en el centro de la superficie, se cierra la tapa.  Se - Incompatible con: sueros lipémicos, ictéricos o hemolizados. 3. REACCIÓN DE BIURET - Tipo de método: químico, espectrofotométrico. 540 nm. - Fundamento: el enlace peptÍdico da coloración violeta con las sales cúpricas en medio alcalino. Reactivo de BIURET = sulfato cúprico + hidróxido potásico, entre otros). - Utilidad: determinación de concentración de proteínas (g/dl) en:  Suero (proteinemia)  Orina (proteinuria)  LCR (proteinorraquia), aunque en este tipo de muestra es poco sensible. 4. TURBIDIMETRÍA Página 17 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. - Método: espectrofotométrico, 540 nm. - Fundamento: la dispersión de la luz provocada por proteínas en suspensión es proporcional a su concentración. - Instrumento: turbidímetro o cualquier espectrofotómetro convencional. - Procedimiento:  Se desnaturalizan las proteínas de la muestra mediante ácido tricloroacético (ATCA) o sulfosilacílico.  Se mide introduce la muestra en aparato.  Se mide la luz no dispersada que llega al receptor.  Se obtiene el valor de luz dispersada y se obtiene la concentración de proteínas. - Utilidad:  Proteinuria  Proteinorraquia. 5. NEFELOMETRÍA (en desuso) - Método: espectrofotometría. - Fundamento: igual que la Turbidimetría, pero se mide la luz dispersada, directamente. - Instrumento: nefelómetro. - Utilidad: estudio de proteína C reactiva (PCR), prealbúmina, antitripsina, haptoglobina, transferrina, ceruloplasmina, factores del complemento, inmunoglobulinas, mioglobina (más precoz que la CK), ASLO (antiestreptolisina O)… A PARTIR DE LA FORMACIÓN DE INMUNOCOMPLEJOS. 6. INMUNOFIJACIÓN - Método: inmunoelectroforético (electroforesis + formación de complejos Ag-Ac). - Procedimiento:  Separación de las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel de agarosa.  Fijación e inmunoprecipitación de las proteínas, para que queden fijadas a la localización de migración mediante la adición de antisueros anti IgG, anti IgA, anti IgM, anti kappa y anti lambda.  Lavado para eliminar las proteínas que no hayan precipitado ni unido a antisueros.  Tinción de las bandas.  Determinación de patrones anormales. - Utilidad: en sospecha de mieloma múltiple (neoplasia de células plasmáticas = productoras de Ac) o, lo que es lo mismo, identificación de gammapatías monoclonales = producción de inmunoglobulinas anormales (llamadas proteínas monoclonales o M) Página 18 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 7. AMONÍACO SANGUÍNEO (NH3) - Método: del salicilato. Espectrofotometría. Químico, indirecto. - Fundamento:  amoníaco libre + hipoclorito >>>> monocloramina.  monocloramina + salicilato >>>> complejo verde, con intensidad proporcional a la concentración de amoníaco. - Valores normales: no superan los 110 mg/dl - Causas de hiperamoniemia:  Daño hepático: no lo puede convertir en urea (hepatitis, cirrosis, intoxicación, fármacos…)  Alteraciones genéticas que afectan al ciclo de la urea. - Utilidad: diagnóstico de enfermedades hepáticas graves y de encefalopatías hepáticas. 8. PRUEBA DE LA FENILCETONURIA (PKU) FENILALANINA = aminoácido esencial, con efectos en la producción de melanina y para la producción de neutrotransmisores como la adrenalina, noradrenalina y dopamina. FENILCETONURIA = enfermedad genética caracterizada por la falta de la fenilalanina hidroxilasa, enzima que convierte la fenilalanina en tirosina. Por tanto, se acumula la fenilalanina (causa lesiones cerebrales severas, con convulsiones, retraso mental…y muerte) y parte de ella se elimina por orina (fenilcetonuria, que se caracteriza con orina con olor a moho). IMPORTANTE: aunque su nombre haga referencia a la orina, la muestra a analizar es sangre. - Edad: bebés recién nacidos (“prueba del talón”). - Método: cromatografía en capa fina. - Procedimiento:  Se toman unas gotas de sangre del talón sobre un papel de filtro.  Se transfieren a un soporte de silicagel.  Se sumerge la placa en el solvente de forma vertical, 60-90min.  Se deja secar.  Se repite la inmersión y el secado.  Se revela.  Observación de las bandas de aminoácidos: identificación de la que se corresponde con la fenilalanina. Página 19 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. CROMATOGRAFÍA DE LOS AA EN GENERAL: 3. PRINCIPALES FRACCIONES PROTEICAS ESTUDIADAS 1) Transtirretrina 2) Albúmina 3) Globulinas 4) Proteínas reactantes de fase aguda 5) Proteína de Bence Jones 6) Mioglobina Página 20 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 1) TRANSTIRRETRINA (TTR = TRANSPORTS TIROXINE AND RETINOL) *SE DENOMINABA PREALBÚMINA PORQUE EN LA ELECTROFORESIS MIGRA POR DELANTE DE LA ALBÚMINA, PERO PUEDE DAR LUGAR A CONFUSIÓN PORQUE NO ES SU PRECURSORA.  Localización: suero  Síntesis en: HÍGADO y PLEIXOS COROIDEOS.  Función: Ayuda a transportar hormonas tiroides y vitamina A (retinol) por el torrente sanguíneo y el líquido cefalorraquídeo.  Vida media: corta (solo 2 días, frente a la albúmina, por ejemplo, que es de tres semanas), pero es extremadamente sensible a los cambios en el metabolismo proteico.  Uso clínico: o monitorizar la EFICACIA DE LA NUTRICIÓN PARENTERAL HOSPITALARIA o indicador precoz de cambio del estado nutricional (su velocidad de síntesis es muy sensible a una nutrición adecuada y a alteraciones de la función hepática, donde se sintetiza) >>> importante en pacientes agudos. 2) ALBÚMINA  Localización: suero  Cantidad: Supone algo más de la mitad (60%) de las proteínas plasmáticas.  Funciones: 1. Mantiene el equilibrio hídrico (influye en la PRESIÓN ONCÓTICA) 2. transporte de sustancias (bilirrubina, ácidos grasos, calcio, cortisol, estrógenos, tiroxina, diversos fármacos (xenobióticos)...) 3. Actúa también como reservorio móvil de aminoácidos.  Alteraciones de sus niveles:  La HIPERALBUMINEMIA se produce, la mayoría de ocasiones, por deshidratación (incremento relativo)  La HIPOALBUMINEMIA se produce por infección crónica debido al catabolismo elevado, insuficiencia hepática, síndrome nefrótico, hemorragias, quemaduras...Conlleva: + edemas y ascitis (trastornos en la distribución de líquidos por alteración de la presión oncótica), para compensar este descenso de presión oncótica se producen otras proteínas (en cada patología, unas características, por lo que se puede identificar la enfermedad por el proteinograma). + hipocalcemia (por ser la albúmina transportadora del calcio plasmático, (hipocalcemia secundaria a hipoalbuminemia)).  Vida media: DOS SEMANAS  Uso clínico: o ÍNDICE DE DESNUTRICIÓN PERO DE APARICIÓN TARDÍA, útil para desnutrición ya establecida. o nos informa de los VALORES DE GLUCEMIA QUE HA TENIDO EL PACIENTE DURANTE LAS 2 -3 SEMANAS PREVIAS A LA EXTRACCIÓN DE LA MUESTRA (período más corto que el correspondiente a la hemoglobina glicada que veremos después). Esto es porque la albúmina, como todas las proteínas séricas, se glica (igual que lo hace la hemoglobina de los hematíes), dando FRUCTOSAMINA. Si el paciente ha tenido niveles de glucemia altos las 2-3 semanas previas a la extracción, los niveles de fructosamina saldrán elevados. Además, cuanto mayor sea la hiperglucemia en ese período, más fructosamina. - Métodos de determinación de la albúmina a) determinación de la albuminemia Página 21 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. a.1. Los métodos más empleados son los TESTS COLORIMÉTRICOS = se usan colorantes que se liguen específicamente con la albúmina >> la absorbancia de la muestra será proporcional a la cantidad de albúmina (A mayor absorbancia, mayor cantidad de albúmina) y se podrá cuantificar mediante patrones o rectas de calibración. El test colorimétrico más utilizando es con verde de bromocresol a pH 4.2. Se preparan dos tubos, uno con 200 microlitros de suero problema y otro con 200 microlitros de estándar de albúmina a los que se añade 4 microlitros de solución de verde de bromocresol. A los 10 minutos se realiza la lectura con el espectrofotómetro a 630 nm frente a blanco reactivo. a.2. Otra forma de determinar la albuminemia es cuantificándola a partir DEL FRACCIONAMIENTO ELECTROFORÉTICO. b) determinación de la albuminuria El glomérulo renal impide que las proteínas de mayor tamaño se filtren. Las pequeñas, como la albúmina, sí pueden pasar, pero son reabsorbidas en los túbulos renales. En condiciones normales se deben encontrar cantidades muy pequeñas de albúmina en orina (menos de 30 mg en 24 horas). Puede aumentar por fiebre, ejercicio intenso, estrés…y, evidentemente, cuando hay daño renal. b.1. Como técnica cualitativa para la albuminuria: o suele emplearse la TIRA REACTIVA ( aunque esta técnica se puede considerar semicuantitativa) de urinoanálisis, que puede servir como cribado >>> se identifica que puede haber daño renal y, a partir de ahí, comienza el protocolo diagnóstico completo en ese paciente. o Otra técnica es la COAGULACIÓN POR CALOR + ACIDIFICACIÓN: se deja hervir la orina en un tubo de ensayo (dos minutos) hasta que aparezca turbidez. Si esto ocurre se añaden unas gotas de ácido acético para diferenciar:  si el enturbiamiento se debe a albúmina >> persiste la turbidez  o se debe a fosfatos carbonatos >> desaparece la turbidez. b.2. La valoración cuantitativa de la albuminuria se realiza por MÉTODOS TURBIDIMÉTRICOS. 3) GLOBULINAS - Características: proteínas muy heterogéneas (es decir, pueden formar moléculas de muchos tipos/funciones diferentes: proteínas, lipoproteínas, glucoproteínas…). - Se subclasifican en alfa- globulinas (α1 y α2), beta-globulinas y gammaglobulinas (inmunoglobulinas O ANTICUERPOS).  En la fracción alfa destaca la antitripsina, macroglobulina, haptoglobina, a-lipoproteínas...  En la fracción beta destacan β-lipoproteínas, transferrina, hemopexina, algunos componentes del complemento...  Las gammaglobulinas constituyen al menos el 11% de todas las proteínas plasmáticas. Se diferencian las de tipo A, D, E, G y M. - Uso clínico: múltiple, debido a su gran diversidad (desde patologías asociadas al metabolismo de los lípidos, enfermedades infeccionas, autoinmunes, anemias…) Página 22 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. - Las técnicas de análisis son, según el caso: electroforesis o técnicas de inmunodiagnóstico (ELISA…) 4) PROTEÍNAS REACTANTES DE FASE AGUDA - Concepto: Aumentan en situaciones de estrés o inflamación tales como: Infecciones, Traumatismos, cirugía, necrosis hísticas... - Nombres: son la antitripsina, la glucoproteína ácida, la haptoglobina, la ceruloplasmina, el fibrinógeno y, fundamentalmente, la PROTEÍNA C REACTIVA (PCR) por ser la más sensible y precoz. - Uso clínico: cuantificación y monitorización de la evolución del paciente en casos de inflamaciones agudas, como los citados. - Técnicas de análisis: inmunoelectroforesis. ARTÍCULO CIENTÍFICO: UTILIDAD DE LOS REACTANTES DE FASE AGUDA EN EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO: http://www.scielo.org.bo/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-89582019000200013 Página 23 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 5) PROTEÍNA DE BENCE JONES - Características: globulina monoclonal. Se trata de cadenas ligeras de inmunoglobulinas. - Uso clínico:  Su detección en orina (al ser pequeñas, pasan por las nefronas) sugiere mieloma múltiple (aparece en 2/3 de los casos).  También aparece en otras patologías como metástasis óseas, linfomas, ciertas leucemias... - Técnica de análisis:  inmunoelectroforesis.  Observación al microscopio: calentamiento de la orina a 50-60 grados produce su precipitación. Se redisuelven entre 90-100 grados, lo que sirve para identificarlas.  No reaccionan con los reactivos típicos usados para detectar proteinuria >>> falsos negativos. 6) MIOGLOBINA - Características: proteína citoplasmática, portadora de oxígeno que se encuentra en el músculo cardíaco y esquelético. - Uso clínico: MARCADOR DE DAÑO CARDÍACO (NO USAR COMO ÚNICO porque no es cardioespecífico) - Ventajas: - elevada sensibilidad (que las isoenzimas de la CPK), aunque no detecta infartos poco extensos. - capacidad de detección precoz (aumenta ya a la hora de empezar la sintomatología, por lo que es mejor que las isoenzimas de la CPK) >>> posibilidad de administrar el tratamiento dentro del período crítico >>> mejor pronóstico. - capacidad de detección de la reperfusión >>> pronóstico - Técnicas de análisis:  Radioinmunoanálisis: en desuso porque se tardaba demasiado tiempo en obtener los resultados.  Inmunoanálisis sin isótopos radiactivos.  Tiras reactivas, muestras de orina: al ser una proteína pequeña pasa a orina y puede detectarse mediante tiras reactivas, ya que reacciona como lo hace la hemoglobina. Página 24 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. 4. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS EN LCR - LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO: fluido transparente producido por los plexos coroideos, que se localiza en el espacio subaracnoideo, ventrículos cerebrales (100-150 ml en c.n.) Tiene funciones de amortiguación de fuerzas externas y de cambios de presión interna, nutrición del tejido nervioso, es vía de eliminación de metabolitos… - Composición: agua, sodio, potasio, calcio, cloro, sales inorgánicas (fosfatos) y componentes orgánicos (producidos por las células gliales). - Obtención: Punción lumbar, 1-5 ml. También se puede obtener por punción de la cisterna magna o de los ventrículos. - La PROTEINORRAQUIA oscila entre 20 y 50 mg/dL en condiciones normales = muy inferior a la proteinemia que es normal alrededor de 7000 mg/dL). - Aumenta en alteraciones de la barrera hematoencefálica que aumentan su permeabilidad (meningitis, tumores...), llegando hasta 400 mg/dL. - La proteína más abundante en LCR es la albúmina, ya que, por su menor peso molecular atraviesa con mayor facilidad la barrera hematoencefálica. - Técnica de análisis:  electroforesis en gel de agarosa.  Inmunoturbidimetría. 5. ANÁLISIS DE OTROS FLUIDOS (ASCÍTICO, PLEURAL, SINOVIAL…) En estos casos, una de las pruebas básicas es la determinación de si se trata de TRASUDADO o de EXUDADO: (< 3 g/dL de proteínas) o de EXUDADO con una destacada significación diagnóstica. EXUDADO: Fluido > 3 g/dL de proteínas, extravasado desde los vasos sanguíneos hacia los tejidos cercanos por alteración de la permeabilidad vascular (exudación) A CAUSA DE UNA INFLAMACIÓN (de origen infeccioso o no). - Composición: células, proteínas y materiales sólidos. - Causas:  Agentes físicos: calor, frío, radiación ionizantes, traumas…  Agentes químicos: cáusticos, ácidos…  Agentes biológicos: virus, baterías, hongos, parásitos. Página 25 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. TRASUDADO: líquido NO INFLAMATORIO contenido en una cavidad serosa, por aumento de la P hidrostática o reducción de la P oncótica sanguínea. CARACTERÍSTICA TRASUDADO EXUDADO Origen No inflamatorio: aumento Inflamatorio (aumento de la de P hidrostática o permeabilidad vascular) reducción de la P oncótica Aspecto Claro, transparente, Denso, turbio, puede que con ligeramente amarillo coágulos, color variable (amarillo/verdoso/rojizo/blanco…) olor inoloro Puede ser maloliente densidad < 1.016 >1.016 Proteínas < 3 g/dl >3 g/dl LDH pleural 200 U/l leucocitos hematíes pH >7,3 < Glucosa >60mg/dl < Colesterol ejemplo Insuficiencia cardíaca Infección pulmonar aguda, congestiva, síndrome neoplasia, exudados nefrótico, postquirúrgicos… hipoalbuminemia, hipotiroidismo (mixedema), cirrosis… - Técnicas de análisis: igual que el de las proteínas totales en suero. ARTÍCULO CIENTÍFICO: DERRAMES PLEURALES EXUDADOS Y TRASUDADOS: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1817-59962018000300008 Página 26 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. Patologías en las que aparece trasudado y exudado ACTIVIDADES 1. Haz un esquema en el que se comparen las características principales de las enzimas que digieren las proteínas de la dieta. 2. Representa de forma esquemática el proceso completo de metabolización de los aminoácidos 3. Resume en una tabla las características de las principales proteínas plasmáticas. 4. Haz un glosario con los términos del tema que desconocías o no tenías claro. 5. Explica con tus palabras qué es un proteinograma y su utilidad clínica. 6. Haz un esquema con los patrones electroforéticos más importantes. Página 27 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. ANEXO (NO ESTUDIAR): AMINOÁCIDOS Tabla de α-Aminoácidos que se Encuentran en las Proteínas Página 28 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. pK1 pK2 pK Aminoácid Símbol Estructura* (COO (NH2 Grupo- o o H) ) R Aminoácidos con grupos Alifáticos Glicina Gly - G 2.4 9.8 Alanina Ala - A 2.4 9.9 Valina Val - V 2.2 9.7 Leucina Leu - L 2.3 9.7 Isoleucina Ile - I 2.3 9.8 Aminoácidos no aromáticos con Grupos-R hidroxilo Serina Ser - S 2.2 9.2 ≈13 Treonina Thr - T 2.1 9.1 ≈13 Aminoácidos con Grupos-R que contienen azufre Cisteina Cys - C 1.9 10.8 8.3 Página 29 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. Metionina Met - M 2.1 9.3 Aminoácidos ácidos y sus amidas Ácido Asp - D 2.0 9.9 3.9 Aspártico Asparagina Asn - N 2.1 8.8 Ácido Glu - E 2.1 9.5 4.1 Glutámico Glutamina Gln - Q 2.2 9.1 Aminoácidos básicos Arginina Arg - R 1.8 9.0 12.5 Lisina Lys - K 2.2 9.2 10.8 Histidina His - H 1.8 9.2 6.0 Aminoácidos aromáticos Fenilalanina Phe - F 2.2 9.2 Página 30 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. Tirosina Tyr - Y 2.2 9.1 10.1 Triptofano Trp - W 2.4 9.4 Iminoácidos Prolina Pro - P 2.0 10.6 * El esqueleto de los aminoácidos es rojo y los grupos-R negros ANEXO: GLOBULINAS MÁS IMPORTANTES  α 1-Antitripsina (AAT): Supone el 90% de las proteínas de la región α1 Su principal acción es neutralizar la actividad de ciertas proteasas, por ejemplo la elastasa liberada por los leucocitos en el proceso inflamatorio (la AAT mantiene controladas las reacciones exageradas de proteinolisis endógena, por eso en las deficiencias congénitas de AAT los pacientes desarrollan enfisema pulmonar, que puede prevenirse administrando IV o por inhalación dicha AAT). Vida media 4 días. Es un reactante inespecífico de fase aguda (se eleva en infecciones, inflamaciones, enfermedades malignas). Aumenta en respuesta a estrógenos (embarazo y terapia hormonal anticonceptiva)  α2-Macroglobulina: También tiene acción inhibitoria de proteasas porque se une a ellos. En las pancreatitis al liberarse enzimas proteolíticos y en los carcinomas de próstata disminuye por consumo. En caso de hipoalbuminemia en un síndrome nefrótico, como esta proteína no puede filtrarse asume la función de mantenimiento de la presión oncótica.  Haptoglobina. Se determina para detectar la hemolisis intravascular. Se combina con la hemoglobina liberada en la hemólisis formando un complejo que se transportándola al sistema retículoendotelial, se metaboliza allí rápidamente (en minutos), disminuyendo la concentración de haptoglobina libre en suero que no se compensa con la síntesis hepática. Puede servir para monitorizar la tasa de hemolisis lenta en prótesis valvular y hemoglobinopatías. También hay disminución en enfermedades hepáticas por falta de síntesis. Aumenta en respuesta al estrés, infección, inflamación, o necrosis.  Hemopexina Fija el hemo liberado en la degradación de la hemoglobina. Página 31 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. Cuando hay hemolisis intravascular, la cantidad de Hb libre supera la capacidad de fijación de la Haptoglobina, esta Hb plasmática circulante se degrada a hemo que es fijada por la hemopexina, los complejos hemo-hemopexina son eliminados por los hepacitos disminuyendo por tanto su concentración sérica, por ello, su descenso sirve como marcador adicional de hemólisis.  Proteína C reactiva (PCR): Llamada así porque se vio que reaccionaba con el polisacárido C del pneumococo. También lo hace frente a otras sustancias (ADN, nucleótidos, ciertos lípidos, parece servir como una molécula scavenger…) Aumenta en cualquier inflamación o necrosis, infarto agudo de miocardio, enfermedad autoinmune (fiebre reumática aguda, artritis reumatoide), infecciones bacterianas…por lo tanto, es un reactante de fase aguda muy sensible. Es una proteína anormal sintetizada por el hígado en un proceso inflamatorio agudo. Funcionalmente es análoga a la IgG, pero no es antígeno específica como ésta. Migra en gamma electroforético formando una banda monoclonal. Lo utilizan los reumatólogos para monitorizar evolución de enfermedades reumáticas auto -inmunes. Epidemiológicamente las personas con valores altos de PCR presentan mayor riesgo de ictus o IAM.  β-lipoproteínas: Se observa debido a las apoproteínas presentes. Sin embargo, las otras lipoproteínas no se aprecian en electroforesis con tinción proteica.  Transferrina: Es la principal βglobulina. Transporta el hierro 3+ desde los depósitos de ferritina hasta la médula. El Valor normal está entre 200 y 400 mg/dl y se determina como capacidad de fijación del hierro (IFC). Se observa muy aumentada en déficits de este elemento. La administración de Fe aumenta la saturación produciéndose a continuación la normalización de los niveles de transferrina. La saturación crónica de la transferrina aparece en la hemocromatosis (transtorno hereditario que provocará cirrosis, diabetes y cardiomiopatía por exceso de hierro) En las nefropatías con pérdidas de proteínas se pierde transferrina en la orina eliminándose hierro con ella, originándose anemias hipocrómicas. En el LCR (líquido cefalorraquídeo) existe una variante de esta proteína denominada β2-transferrina, que migra diferente en electroforesis, además de la transferrina idéntica a la del suero, en una inmunoelectroforesis en gel de agarosa se identifican 2 bandas si hay presencia de LCR (marcador de LCR), lo que puede ser muy importante en el diagnóstico de las fracturas craneales y otros traumatismos craneales.  Fibrinógeno: Se produce en el hígado. Es esencial para la coagulación, al convertirse en fibrina por acción de la trombina. El fibrinógeno es una globulina que migra entre las fracciones beta y gamma, pero normalmente no se valora en la electroforesis, ya que se realiza de suero sanguíneo. Además de ser un factor de la coagulación es un reactante de fase aguda. Los valores normales se sitúan alrededor de 300 mg/dL. Valores elevados son un factor de riesgo de enfermedad cardiovascular mientras que los niveles bajos son propios de enfermedad hepática, malnutrición y coagulopatías de consumo. ANEXO: AMPLIACIÓN DEL CATABOLISMO DE LOS AMINOÁCIDOS 1) DESAMINACIÓN - TIPOS DE DESAMINACIÓN:  Desaminación hidrolítica: de aspargina a ac. Aspártico y de glutamina a glutámico.  Desaminación no oxidativa: de serina a pirúvico y de treonina a cetoglutárico.  Transaminación + desaminación oxidativa: la más frecuente.  En la transaminación, un aminoácido cede su grupo amino a un cetoácido (normalmente el cetoglutárico) para dar otro cetoácido (que ingresará en una ruta catabólica) y un aminoácido (normalmente el glutámico),  Este último que posteriormente se oxidará. Página 32 de 33  UD 5 DETERMINACIONES ANALÍTICAS PROTEÍNAS ANÁLISIS BIOQUÍMICOS. ESTELA GARCÍA ORDAZ. - DESTINO DE LOS PRODUCTOS OBTENIDOS EN LA DESAMINACIÓN: a) El N tendrá diferentes destinos metabólicos: o APROVECHAMIENTO PARA LA SÍNTESIS DE OTRAS MOLÉCULAS (“reutilización”):  aa no esenciales = TRANSAMINACIÓN >>> proteínas  otros compuestos nitrogenados: bases nitrogenadas, porfirinas, creatinina… o ELIMINACIÓN: como el amonio (NH4+) es altamente tóxico se ha de transformar en otras moléculas menos tóxicas antes de ser excretado (como el ácido úrico y la urea, a través del “CICLO DE LA UREA”, que veremos después). b) EL ÁCIDO GLUTÁMICO puede seguir dos destinos: o DA LUGAR A ASPARTATO, que entrará en el ciclo de la urea (para poder ser eliminado por la orina) o SUFRE UNA DESAMINACIÓN OXIDATIVA, gracias a la enzima glutamato deshidrogenasa (GDH), para dar:  cetoglutárico (que posibilitará una nueva transaminación)  y amoníaco (en forma de amonio). TRANSAMINACIÓN + DESAMINACIÓN OXIDATIVA Y DESTINO FINAL DEL GLUTÁMICO aa >>>>> grupo amino + cetoácido1 cetoácido2 ruta catabólica aa (ac. Glutámico) oxidación aspartato cetoácido 1 + amoníaco ciclo urea glutamina 2) CICLO DE LA UREA De forma resumida, este ciclo consiste en lo siguiente: una molécula de amoníaco se une con dióxido de carbono para dar carbamil. Éste se unirá a la Ornitina obteniéndose Citrulina que tras unirse al aspártico (aporta el otro nitrógeno) dará arginosuccínico que originará Fumárico y Arginina. La hidrólisis de la Arginina produce Urea y Ornitina, que cerrará el ciclo. La urea será eliminada del organismo por vía urinaria. Página 33 de 33