UD2_TID Aplicaciones basada en reacciones primarias PDF

UNIDAD 2: TÉCNICAS BASADAS EN REACCIONES ANTÍGENOANTICUERPO PRIMARIAS. Técnico Superior Laboratorio Clínico y Biomédico 1 ÍNDICE INTRODUCCIÓN 1. INTERACCIÓN PRIMARIA ANTÍGENO-ANTICUERPO 2. INMUNOMARCACIÓN 2.1 Inmunomarcación directa 2.2 Inmunomarcación Indirecta 2.3 Inmunomarcación con Anticuerp...

UNIDAD 2: TÉCNICAS BASADAS EN REACCIONES ANTÍGENOANTICUERPO PRIMARIAS. Técnico Superior Laboratorio Clínico y Biomédico 1 ÍNDICE INTRODUCCIÓN 1. INTERACCIÓN PRIMARIA ANTÍGENO-ANTICUERPO 2. INMUNOMARCACIÓN 2.1 Inmunomarcación directa 2.2 Inmunomarcación Indirecta 2.3 Inmunomarcación con Anticuerpos conjugados con enzimas 2.4 Inmunomarcación con Anticuerpos conjugados a fluorocromos 2.4.1 Inmunofluorescencia directa 2.4.2 Inmunofluorescencia Indirecta 3. ENZIMOINMUNOENSAYOS 3.1 Enzimoinmunoensayos Homogéneos 3.1.1 Técnica de inmunoanálisis mediado por la enzima (EMIT) 3.2 Enzimoinmunoensayos heterogéneos 3.2.1 Análisis inmunosorbente con la enzima ligada (ELISA) 4. FLUOROINMUNOENSAYOS 4.1 Marcadores fluorescentes 4.2 Fluoroinmunoensayos homogéneos 4.3 Fluoroinmunoensayos heterogéneos 4.3.1 Fluoroinmunoensayo de sustrato fluorogénico 4.3.2 Fluoroinmunoensayo de absorción tardía 5. INMUNOENSAYOS QUIMIOLUMINISCENTES 5.1 Ensayo quimioluminiscente usando esteres de acridinio como marcadores 2 5.2 Inmunoensayo electroquimioluminiscente 6. TÉCNICA DE RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA) 7. INMUNOCROMATOGRAFÍA 8. WESTERN BLOT 8.1 Bloqueo 8.2 Tinción de las proteínas en el Filtro 8.3 Aplicaciones de la Técnica de Western Blot 3 INTRODUCCIÓN Las técnicas desarrolladas a partir de las reacciones Anticuerpo- Antígeno primarias van a requerir de la conjugación de determinadas moléculas para hacerlas visibles. Se caracterizan por tener una gran sensibilidad. Estas técnicas presentan una gran diversidad en función del marcador empleado, pudiendo dividirse en: Inmunofluorescencia Radioinmunoensayo Inmunoenzimáticas Inmunocromatografía Conoceremos los métodos de calibrado y estandarización de los resultados obtenidos, elementos indispensables para poder asegurar la obtención de resultados fiables en nuestros laboratorios. 4 1. INTERACCIÓN PRIMARIA ANTÍGENO-ANTICUERPO La interacción primaria Ag-Ac no es visible, por tanto empleamos distintos métodos que nos van a permitir visualizarla. “Marcamos" al Ac o al Ag mediante la conjugación(unión covalente) de determinadas moléculas. Estas moléculas pueden ser isotopos radiactivos, fluorocromos o enzimas, con el fin de poder hacer visible esa primera interacción. Dentro de esta categoría tenemos: 1. Fijación de complemento. 2. Inmunofluorescencia 3. Radioinmunoensayo 4. Pruebas Inmunoenzimáticas 5. Inmunocromatografía Dependiendo del marcador empleado, la técnica inmunológica recibirá un nombre u otro y se usará un sistema de detección u otro. Como inconveniente principal, tenemos que son unas técnicas más caras pero presentan una sensibilidad mayor, pudiendo detectar menores concentraciones de Ag o de Ac. TÉCNICAS MARCADOR INMUNOLÓGICA SISTEMA DE DETECCÓN Enzimas Microscopio óptico Microscopio de A-Inmunomarcación Fluorocromo fluorescencia. Citómetro de flujo. B-Radioinmunoanálisis Isotopo radiactivo Contador de radiación C-ELISA Enzima Espectrofotómetro. 5 2. INMUNOMARCACIÓN Las técnicas de Inmunomarcación que emplean anticuerpos conjugados nos van a permitir detectar la presencia de antígenos en tejidos, hablamos en este caso de imnunohistoquímica o la presencia de antígenos en las células, lo que se conoce como imnunocitoquímica.  La Inmunomarcación de los tejidos o Inmunohistoquímica se va a realizar sobre cortes de tejido fijados montados sobre un portaobjetos. A través de estas técnicas es posible detectar tanto antígenos celulares (de membrana, citoplasmáticos o nucleares), como antígenos extracelulares (presentes en la matriz extracelular,membrana basal, etc.).  La Inmunomarcación de células o Inmunocitoquímica puede efectuarse sobre células vivas o fijadas, las cuales pueden hallarse ensuspensión o adheridas a un soporte sólido (portaobjetos). Esta técnica permite detectar antígenos localizados en la membrana plasmática, enel citoplasma o en el núcleo de la célula. La Inmunomarcación puede ser directa o indirecta. 2.1 Inmunomarcación directa La Inmunomarcación directa se emplea un anticuerpo "marcado" que es específico para dicho antígeno, lo denominamos Anticuerpo primario. Para realizar esta técnica, vamos a incubar durante un determinado tiempo la muestra con el anticuerpo primario ya marcado, a una temperatura indicada. Después se retira el excesode anticuerpo mediante un lavado y se procede a la detección de la marca. 2.2 Inmunomarcación Indirecta Se basa en emplear un anticuerpo primario sin marcar que va a reconocer al antígeno buscado, en este caso necesitamos otro anticuerpo que sí está marcado, llamado Anticuerpo secundario, que es capazde reconocer al Anticuerpo primario. Por ejemplo, si el Ac primario es una IgG de ratón, el Ac secundario podrá ser anti-IgG de ratón hecho en conejo. Primeramente se incuba el anticuerpo primario con el antígeno, manteniendo la temperatura adecuada y lavándose el exceso de anticuerpo. A continuación, se incubará la mezcla con el anticuerpo secundario que es el que lleva la marcación. Por último, se lava con el fin de eliminar el exceso de anticuerpo y se procede a la detección de la marca. La Inmunomarcación directa es más rápida y sencilla, pero vamos a necesitar anticuerpos 6 primarios marcados diferentes para cada antígeno que se quiera detectar, siendo éstos bastante caros. En cambio, en la Inmunomarcación indirecta, un mismo anticuerpo secundario puede ser diseñado para reconocer diferentes anticuerpos primarios (generados en la misma especie), siendo además, una técnica más sensible que la Inmunomarcación directa. Como desventaja principal frente a la Inmunomarcación directa es que resulta más lenta. La Inmunomarcación puede presentar algunas variantes en función de cuál sea el marcador elegido para resaltar el anticuerpo, pudiendo ser una enzima o un fluorocromo. 2.3 Inmunomarcación con Anticuerpos conjugados con enzimas Esta técnica es la más empleada en la imnunohistoquímica (sobre tejidos) y también cuando se requiere detectar antígenos en células adheridas a portaobjetos. Una vez realizada la Inmunomarcación ya sea directa o indirecta, la presencia del Anticuerpo conjugado con la enzima se evidencia por el agregado de un sustrato incoloro. Se añade un sustrato que va a reaccionar con la enzima generar un precipitado coloreado en el lugar donde ocurrió la reacción y es visualizado al microscopio óptico. Los sustratos incoloros que viran a un producto coloreado se los conoce con el nombre de cromógenos (aminoetilcarbazolo diaminobencidina). El hecho de que existan distintos cromógenos capaces de generar productos de distinto color, permite que puedan detectarse antígenos diferentes en un mismo corte de tejido o célula. 2.4 Inmunomarcación con Anticuerpos conjugados a fluorocromos Esta técnica es comúnmente conocida como Inmunofluorescencia y es empleada tanto para la imnunohistoquímica como para la imnunocitoquímica. Los compuestos fluorescentes como la fluoresceína puede conjugarse con los Ac y, se marcan de esta forma y además, su especificidad no se ve afectada. La Fluoresceína puede ser excitada por la luz ultravioleta apareciendo la fluorescencia. La presencia del Anticuerpo conjugado con el flourocromo no necesita de ninguna reacción química para hacerse evidente. El mecanismo es sencillo: los fluorocromos emiten luz de una determinada longitud de onda, tras haber sido excitados por un haz de luz de longitud de onda menor; es decir, los fluorocromos absorben luz en una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta energía (longitud de onda más corta) en luz de menor energía (longitud de onda más larga). Entonces, una molécula que fluoresce puede ser fijada en el anticuerpo para 7 ser detectada usando para ello, luz UV. Cada fluorocromo es capaz de emitir luz dentro de un determinado espectro de longitud de onda. Por ejemplo, el Isotiocianato de Fluoresceína (FITC), emite en la gama del verde, mientras que la Ficoeritrina emite en la gama del rojo. Gracias al hecho de que los fluorocromos emiten a diferentes longitudes de onda, nosotros podremos detectar antígenos diferentes en un mismo corte de tejido o célula. Dependiendo de la naturaleza de la muestra se usará una u otra técnica para determinar la presencia del fluorocromo. La visualización se hace en un microscopio de fluorescencia. La imagen que vamos a observar en ellos, será el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que se observan y que habrán absorbido la excitación primaria y remitirán una luz con una mayor longitud de onda. En cambio, si estamos ante una muestra de células en suspensión, usaremos Citometría de flujo. 2.4.1 Inmunofluorescencia directa La utilidad de estas técnicas de Inmunofluorescencia es muy variada, así, tenemos las técnicas directas para investigar la presencia de antígenos de virus, parásitos, bacterias u hongos en las muestras tomadas de los pacientes, adquiriendo una gran relevancia en el diagnóstico de la Rabia, la infección por Cytomegalovirus, el virus Sincicial Respiratorio o el Herpes simplex 1 y 2. Todo ello, sin olvidar la utilidad que presenta esta técnica en su modalidad indirecta. 2.4.2 Inmunofluorescencia Indirecta Estas técnicas requieren Ac marcados con fluoresceína y dirigidos contra la inmunoglobulina humana, recibiendo el nombre de Ac Conjugado, pueden unirse a la inmunoglobulina humana sin tener en cuenta la especificidad de la misma. La inmufluorescencia indirecta requiere para poder ser desarrollada, de un determinado sustrato para el que existen Ac específicos frente al 8 mismo. Dichos Acs son el objeto de la búsqueda en un suero problema. Esta variantees muy aplicada en el diagnóstico de patologías así como en la investigaciónde Ac antinucleares, Ac antiToxoplasmas, Ac anti-VIH, etc. La ventaja principal de la Inmunofluorescencia indirecta reside en su gran utilidad para el diagnóstico pero su inconveniente más destacado es que los reactivos son muy costosos y se requiere de la disponibilidad de un microscopio de fluorescencia, que también es un aparato muy costoso. 3. ENZIMOINMUNOENSAYOS En estas técnicas los anticuerpo se marcan con un determinado sistema enzimático que va a modificar su estado en función de la reacción del antígeno con el anticuerpo. También pueden ser usadas para detectar y cuantificar anticuerpos. Entre ellas vamos a tener el enzimoinmunoanálisis(EIA) y el enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). Presentan una gran sensibilidad, por lo que suelen emplearse con la intención de llevar a cabo rastreos y/o cribados. También pueden llegar a determinarse los títulos mediante unas diluciones seriadas delas muestras, como se hace en las reacciones de aglutinación. La actividad enzimática se puede determinar por dos métodos diferentes: Métodos de punto final, una vez se ha producido la inmunorreacción, se añade el sustrato, se incuba durante un tiempo constante, momento en el cuál se detiene la reacción y se va a medir la absorbancia pudiendo así, determinar la cantidad de sustrato existente ya que se supone que se va a generar una cantidad constante de producto durante el período de incubación, determinando que la cantidad de producto es directamente proporcional a la cantidad de enzima y que, por tanto, dicha cantidad es directamente proporcional a la de Anticuerpo. Métodos cinéticos primero ocurre la inmunorreacción y después se procede a deducir la 9 cantidad de enzima existente, determinándose la variación en la absorbancia que se produce con el tiempoy esta variación estará relacionada con la cantidad de enzima presente. 3.1 Enzimoinmunoensayos Homogéneos Los llamados enzimoinmunoensayos homógeneos no necesitan que se separen las fracciones ligadas y las libres. Para este tipo de inmunoanálisis, el antígeno (hapteno) se va a acoplar a la enzima y se usa lareacción del Ag/Ac para modificar la actividad enzimática, ya sea inhibiendo o aumentando dicha actividad haciendo que sea prescindible separar las fracciones ligadas y libres. 3.1.1 Técnica de inmunoanálisis mediado por la enzima (EMIT) Se trata de una técnica competitiva que presenta un reactivo limitado. Se va a marcar la sustancia objeto de estudio con una determinada enzima. Después se une a un anticuerpo específico frente a dicha sustancia, se va a producir la inhibición de la actividad de dicha enzima ya que se va a impedir que el sustrato acceda al centro activo. Se va a mezclar la parte que contiene la sustancia que se pretende medir con una cantidad fija desustancia marcada con la enzima y una cantidad limitada de un anticuerpo específico frente a dicha sustancia. Se va a producir una competencia por el anticuerpo añadido, entre la sustancia que estaba presente en la parte investigada y esamisma sustancia que estaba marcada con la enzima. El resultado se deduce de la siguiente relación: Cuanto mayor sea la cantidad de sustancia investigada que se encontraba en la parte original, menor será la cantidad de enzima que se va a unir al anticuerpo y la actividad enzimática será mayor. Es decir, se puede afirmar que la actividad enzimática va a ser directamente proporcional a la concentración de la sustancia que estaba presente en la parte investigada. 10 Los resultados obtenidos se van a calcular con una curva de calibración que se obtiene al analizar calibradores que presentan una cantidad conocida y estipulada de la sustancia que se investiga. Extrapolando en dicha curva, seva a poder determinar de una manera sencilla, la cantidad de sustancia presente en el espécimen investigado. 11 3.2 Enzimoinmunoensayos heterogéneos En este tipo de técnicas se precisa llevar a cabo la separación de las fracciones ligadas y las fracciones libres una vez se haya llevado a cabo la reacción inmunológica, para después determinar la actividad enzimática. Esto es debido a que la enzima empleada se comporta igual en ambas fracciones. Estos enzimoinmunoensayos heterogéneos son muy apropiados tanto para aquellos compuestos de bajo peso molecular como para los compuestos de gran peso molecular (proteínas). 3.2.1 Análisis inmunosorbente con la enzima ligada (ELISA) Esta técnica es muy empleada en los laboratorios clínicos. Su acrónimo ELISA viene del nombre de la técnica en inglés “Enzyme-linked immunosorbentassay”, es decir, análisis inmunoabsorbente con la enzima ligada. Esta técnica ELISA se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción marcada enzimáticamente. El producto de dicha reacción va a poder medirse con el espectrofotómetro. Para poder determinar la cantidad real de antígeno, vamos a comparar la curva obtenida por dicho Ag con una curva estándar que se ha realizado con cantidades de Ag ya conocidas de antemano. Las fases sólidas que se emplean en la técnica ELISA son muy dispares y han ido evolucionando con el tiempo. Se lleva a cabo en microplacas de 96 pocillos de plástico que ha sido tratado con la intención de poder aumentar así, la capacidad de absorción de moléculas. Estas placas 12 presentan en el fondo de los pocillos una parte transparente o clara que nos va a permitir llevar a cabolas medidas ópticas con los espectrofotómetros especialmente adaptados a esta técnica y que reciben el nombre de Lectores ELISA. Con respecto a los lectores ELISA, se puede afirmar que son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. Las fases generales de un ensayo ELISA pueden dividirse en cuatro, aunque existen diferentes tipos de ensayos ELISA que mostrarán sus peculiaridadesen algunas de estas fases: 1. Se da la conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima como puede ser la peroxidasa o la fosfatasa alcalina. El anticuerpo conjugado al enzima se puede emplear en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno. 2. Se va a dar la unión del antígeno o del anticuerpo empleado a los pocillos gracias a que a la superficie de los pocillos de plástico ha sidotratada para que presente una gran afinidad por las proteínas. 3. Se lleva a cabo la formación de una o varias capas de inmunocomplejos. Existen diversas posibilidades, así, en el caso de unELISA Directo, el antígeno se encuentra unido a la placa y éste se puede detectar empleando un Anticuerpo anti-antígeno que se encuentre marcado. En cambio, en el caso del ELISA indirecto se va a emplear un anticuerpo primario anti-antígeno que no está marcado y,a continuación, se añadirá un anticuerpo secundario anti- anticuerpo primario marcado. Así, con el ELISA indirecto podemos ampliar la señal al poder unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. También puede existir el caso del Ensayo de competición delAntígeno, en el que es el Anticuerpo el que se encuentra unido a la placa y éste se va a incubar con una mezcla de Antígeno y de Antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente auna cantidad fija de antígeno marcado. 4. Por último, se lleva a cabo el propio revelado de la reacción enzimáticatras haber lavado el exceso de aquellas moléculas que, estandomarcadas no están fijadas en forma de inmunocomplejos. Para hacer este revelado, vamos a añadir el sustrato de la enzima, dejando reaccionar a las enzimas presentes en el pocillo con el sustrato de lasmismas y, 13 posteriormente, se lleva a cabo la lectura de la densidad óptica obtenida mediante el espectrofotómetro de lectura. Aplicaciones del ensayo ELISA:  Búsqueda de anticuerpos monoclonales.  Diagnóstico clínico.  Detección de Virus.  Clasificación de Ac en isotipos. Con el tiempo han ido apareciendo los distintos tipos de ensayos ELISA: a) Ensayo directo: también llamado como Ensayo ELISA simple de dos capas. Se emplea para detectar la presencia de antígeno en la solución analizada. En este caso, las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las cuáles se quiere determinar si se encuentra el antígeno problema. A continuación, se va aproceder a incubar esta solución con los anticuerpos marcados. Se van a incluir algunos controles negativos que deben ser del mismo tipo de solución que la muestra problema, es decir,si se trata de averiguar si existe un Ag en una muestra de sangre, la muestra control también deberá ser una muestra de sangre en la que se tiene la certeza que no está el antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido). b) Ensayo indirecto: Se van a emplear dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. Los controles positivos y negativos son los mismos. Tiene una mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Además de poder amplificar la señal, tiene otra gran ventaja respecto al ensayo directo y es que un mismo anticuerpo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos diferentes sin tener que elaborar un Ac primario marcado para cada Ag diferente. c) Ensayo sandwich: Es el más común de todos los ensayos ELISA.También se denomina como Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos. Se recubre el pocillo con el primer anticuerpo anti-antígeno, es decir, con el Ac que se unirá al Ag en el caso de estar presente en la muestra problema. Se lava el exceso del Ac y se añade la muestra problema. Si la muestra tiene el Antígeno, dicho Ag se quedará retenido en el pocillo puesto que va a ser reconocido por el Ac primario. Ahora, se lava el material que no se ha retenido y se lleva a cabo la adición de una soluciónque lleva el anticuerpo secundario anti-antígeno marcado, de forma que cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base 14 que lo retiene un segundo anticuerpo, como mínimo, que lo marca. Entre las ventajas que existen con este tipo de ensayos está el hecho de que presenta una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación deseñal que permite el segundo anticuerpo. 4. FLUOROINMUNOENSAYOS Los fluoroinmunoensayos son aquellos que van a emplear compuestos fluorescentes para el marcaje de las sustancias de interés. Entre ellospodemos destacar: - Marcadores fluorescentes - Fluoroinmunoensayos homogéneos - Fluoroinmunoensayos heterogéneos 4.1 Marcadores fluorescentes Para que un compuesto fluorescente pueda ser usado como marcador en un fluoroinmunoensayo, son principalmente:  La Fluoresceína.  La Rodamina. 4.2 Fluoroinmunoensayos homogéneos Los fluoroinmunoensayos homogéneos son aquellos análisis en los que la reacción antígenoanticuerpo va a conseguir alterar las propiedades fluorescentes del marcador usado de una forma considerable. En este caso, vamos a poder cuantificar la reacción de unión en cualquier momento si partimos de la mezcla homogénea. 15 En este caso, no se va a requerir que se lleve a cabo la separación de la fracción ligada y de la fracción libre tras haberse producido la reacción inmunológica. A lo largo del tiempo han aparecido diferentes modalidades deesta técnica, siendo, en la mayoría de los casos, variantes competitivas que se desarrollaron para poder medir compuestos de bajo peso molecular como es el caso de los fármacos y de las hormonas derivadas de los aminoácidos. Entre las principales desventajas de esta modalidad frente a los fluoroinmunoensayos heterogéneos aparece su menor sensibilidad y la posible aparición de problemas como consecuencia de la existencia de compuestos fluorescentes endógenos que pueden llegar a extinguir la fluorescencia de la sonda marcada. Entre los compuestos endógenos que pueden provocar estos problemas de interferencias tenemos las proteínas, porfirinas, fármacos o el NADH. Otro posible factor de interferencia en este proceso puede aparecer por la intervención que provoca la unión de una sonda fluorescente a las proteínasdel suero y que pueden causar la extinción de la fluorescencia la interferenciacausada 4.3 Fluoroinmunoensayos heterogéneos En este tipo de técnica se requiere separar las fracciones libres y lasfracciones ligadas de la reacción inmunológica antes de poderse medir la fluorescencia. Para ello, se han elaborado un gran número de variantes que pueden determinar la presencia de un gran número de sustancias y para lo cual, se emplea un gran número de soportes sólidos para la separación. 4.3.1 Fluoroinmunoensayo de sustrato fluorogénico Se puede definir al sustrato fluorogénico como una molécula sobre la actúa una enzima, y dicho sustrato tendrá propiedades fluorescentes per se o añadidas. Entonces, en estas técnicas vamos a emplear una serie de moléculas que van a suponer el sustrato de algunas enzimas específicas y enlas que se va a presentar una serie de propiedades fluorescentes que se vana ver alteradas en función de si existe o no actividad enzimática. 4.3.2 Fluoroinmunoensayo de absorción tardía En este tipo de técnica, se usa un instrumental especial acompañado de sondas especiales que consiguen aumentar la sensibilidad. Dichas sondas presentan una fluorescencia tardía con un desfase de unos 100 nanosegundos entre la excitación y la emisión. Con estose consigue disminuir la fluorescencia de fondo considerablemente ya que las sustancias de fondo van a presentar un 16 período de decaimiento corto, normalmente de unos 10 nanosegundos y nosotros vamos a medir la fluorescencia pasado ese período. Se ha usado esta técnica para medir diferentes analitos incluyendo IgG, Cortisol, o la insulina. 5. INMUNOENSAYOS QUIMIOLUMINISCENTES La base de este tipo de ensayos no difiere mucho de los inmunoensayos heterogéneos tales como la RIA y FIA. Eso sí, en este tipo de técnicas se vana emplear una serie de moléculas que generan quimioluminiscencia como sondas. Entre este tipo de moléculas encontramos:  Derivados del luminol.  Esteres de acridino.  Las piridopiridacinas  Los dioxetanos (con los que conseguimos una señal amplificada quepermite alcanzar inmunoanálisis muy sensibles).  En el caso de la electroquimioluminiscencia, derivados del nitrofeniloxalato y el tribipridil rutenio con tripopilamina (TPH). Para que los derivados del luminol puedan producir luz, se requiere de radicales –OH como iniciador químico o, en el caso de emplear peroxidasa como indicador de quimioluminiscencia potenciada, se necesitarán H y O. No obstante, los esteres de acridino que son estimulados químicamente con –OH, H u O, van a presentar un rendimiento cuántico quimioluminiscente mayor que en el caso de los derivados del luminol. Además, las sondas de compuestos quimioluminiscentes van a producir luz electroquímicamente en la superficie de los electrodos y van a poder usarse en algunos tipos de ensayos homogéneos. 5.1 Ensayo quimioluminiscente usando esteres deacridinio como marcadores Para este tipo de ensayos, los esteres de acridino se van a conjugar directamente con las proteínas que queremos buscar. Estos esteres pueden reaccionar oxidativamente con el H-O si se está en condiciones alcalinas y van a producirse una serie de intermediarios muy energéticos que van a descomponer el fragmento excitado, generándose así, la luz. Además, hay que tener en cuenta que la emisión de la luz por parte de los esteres de acridinio 17 es muy rápida, entorno a 5 o 10 segundos tras el inicio de la reacción de oxidación, conociéndose como quimioluminiscencia de tipoflash con una relación entre el espectro de emisión y el tiempo de emisión mucho más grande de lo que ocurre en la quimioluminiscencia de tipo resplandor que es generada por las enzimas. Entre las ventajas quepodemos destacar, tendríamos que decir que su sensibilidad es mucho mayorque la sensibilidad de un RIA y que nos va a llevar mucho menos tiempo. 5.2 Inmunoensayo electroquimioluminiscente También conocido como ECLIA y que va a emplear una serie de compuestos electroquímicos como sondas que generarán luz electroquímica, asociada conel ciclo reactivo de la reacción de oxidación-reducción. En este caso, la luminiscencia será generada por la oxidación de un compuesto marcador de tris (bipiridil) de rutenio (II) en la superficie de un electrodo, en presencia de tripropilamina, formándose especies de rutenio IIexcitadas. Cuando estas especies excitadas vuelven a su estado basal, emitirán una luz de 620 nm. La eficacia o rendimiento cuántico de la generación de la luz, dependerá de la proximidad entre el electrodo y el conjugado, es decir, será proporcional a la difusión del conjugado. Tenemos que tener en cuenta que los conjugados libres pueden llegar a generar más luz que los conjugados fijados a una fase que sea sólida como resultado de una reacción inmune. Es decir, así se puede acceder a un ensayohomogéneo pero con el inconveniente de que un ruido de fondo relativamentealto puede llegar a interferir con la propia sensibilidad del ensayo, tal y comose da en otros ensayos homogéneos. Podemos describir el protocolo de un ensayo para la determinación de analitos de la siguiente manera: 1) Se mezclan micropartículas magnéticas cubiertas de anticuerpos comofase sólida con la muestra que se quiere analizar para poder permitir la reacción inmune. 2) A continuación, lavamos para poder separar los conjugados que aún están libres de aquellos que ya están unidos. 3) Después, una solución con la fase sólida será introducida en undetector que tiene un electrodo para poder medir la quimioluminiscencia. Esta técnica, tendrá un límite de detección entre 0,2-0,4 nanogramos/mililitro, además requiere de un menor tiempo para la detecciónde la señal que otras técnicas tales como FIA y CLIA. 18 6. TÉCNICA DE RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA) La técnica de radioimnunoanálisis (RIA) permite cuantificar la presencia de pequeñas cantidades de un determinado Antígeno o de un Anticuerpo en unamuestra biológica. La técnica se basa en la inhibición competitiva de la uniónde un Antígeno marcado radiactivamente con su Anticuerpo específico, la competencia se hará con Antígenos que no están marcados presentes en la muestra a analizar. Para realizar la técnica debe contarse de antemano con: 1) Anticuerpos específicos contra la molécula a cuantificar (esa molécula puede ser un Antígeno o una inmunoglobulina). 2) La molécula a cuantificar (el antígeno) marcada radioactivamente. 3) La muestra a analizar (donde se encuentra la molécula a cuantificar). Tal como puede verse en el siguiente esquema, los complejos inmunes formados por la molécula marcada (conocidos como Ag caliente) y el anticuerpo específico, se enfrentan a la muestra que posee la molécula sinmarcar (denominado Antígeno frío). Si la concentración de Ag frío es mayor, se producirá el desplazamiento del Ag caliente y por lo tanto, la radioactividad de los complejos Ag-Ac irá disminuyendo, mientras que la radioactividad de la fracción de Ag libre aumentará. Realizando una curva patrón con concentraciones conocidas de Ag libre puede calcularse, luego, la concentración de Ag en la muestra biológica. 19 7. INMUNOCROMATOGRAFÍA Se trata de un proceso físico en los que los componentes que forman una determinada mezcla se van a poder separar por la distribución diferente quese produce entre una fase móvil y una fase estacionaria. Para ello, durante el desarrollo de la técnica, la fase móvil transportará al espécimen a lo largo de una determinada capa o columna (según sea el tipo de cromatografía) que es la que va a contener la fase estacionaria. Se verá que, mientras la fase móvil va fluyendo por la fase estacionaria, los solutos se van a distribuir entrelas dos fases. Se basa en que aquellas sustancias que son más afines a la fase móvil, van a viajar más rápido que aquellas sustancias 20 que no lo son tanto. Dentro de esta técnica existen una gran cantidad de variantes y para poder clasificarlas podremos establecer diferentes parámetros a partir de los cuálesvamos a poder diferenciar los distintos tipos, así, podremos fijarnos en:  El estado físico de las fases móviles y estacionarias. Según esta diferenciación, podemos encontrar varios tipos como son: • Cromatografía de gas-líquido (fase móvil gaseosa y fase estacionaria líquida). • Cromatografía de líquido-líquido (en este caso las dos serán fases líquidas).  Dependiendo del método de contacto entre estas fases. En este caso , vamos a poder diferenciar entre: • Cromatografía en columna: la fase estacionaria se coloca en una columna delgada por la que se mueve la fase móvil bajo la influenciade la gravedad o la presión. • Cromatografía en placa: dónde la fase estacionaria recubre una placa plana de vidrio, metal o plástico que se coloca en contacto con la fase móvil.  Según los mecanismos físicos de separación. En función de esta variable, vamos a poder diferenciar entre varios tipos , aunque en algunos casos pueden llegar a coexistir varios al mismo tiempo: • Cromatografía de adsorción. • Cromatografía de reparto. • Cromatografía de intercambio de ion. • Cromatografía de exclusión. • Cromatografía de afinidad. En el laboratorio clínico se emplean fundamentalmente los mecanismos de intercambio iónico y de reparto. 21 8. WESTERN BLOT De las tres técnicas de inmunoblotting, la más extendida a día de hoy es la Técnica de Western Blot, ya que se usa mucho en numerosas pruebas diagnósticas, como puede ser el diagnóstico del VIH. Además, la inmunotransferencia o transferencia de Western Blot se ha usado como herramienta esencial para poder caracterizar numerosos anticuerpos. El mecanismo se podría resumir de la siguiente manera: 1. Cogemos las proteínas de un extracto de células que han sido cultivadas y son separadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida que ha sido expuesto a condiciones desnaturalizantes para dichas proteínas mediante la adición de dodecil sulfato sódico (SDS). 2. Una vez separadas las proteínas en ese gel, se van a pasar a unamembrana de nailon mediante electrotransferencia. 3. Esta membrana se va a incubar con el suero. 4. Para poder detectar la reacción antígeno-anticuerpo específica, se pueden emplear varios métodos:  Sondas marcadas radiactivamente.  Empleando algunas enzimas como la peroxidasa.  Usando una reacción de quimioluminiscencia y una autorradiografía  En cada análisis es necesario que se hagan marcadores de peso molecular conocido y algunos controles positivos y negativos para poder disponer de una referencia. 22 Si empleamos técnicas de inmunodetección, que emplean la capacidad de reconocimiento que determinados anticuerpos presentan frente a sus antígenos; vamos a poder identificar y visualizar una proteína específica empleando la técnica de Western Blot. Normalmente, en esta técnica, suele emplearse el método de inmunodetección indirecta, mediante el cual, usamosun anticuerpo primario para poder localizar la proteína buscada en nuestro análisis. Después, se va a añadir un anticuerpo secundario y dicho anticuerpo secundario estará marcado con una enzima y será diseñado para que sea unanticuerpo anti-anticuerpo primario, es decir, que el anticuerpo primario funcione como antígeno del anticuerpo secundario. Este Ac 2º es usado para poder visualizar el lugar dónde se formaron los complejos Antígeno buscadoAnticuerpo primario. Este Anticuerpo secundario podrá ser marcado de diferentes formas y todas buscan la posibilidad de producir una señal que sea detectable como podría ser una señal sobre una película radiográfica o una mancha de un determinado color en un filtro. En algunas ocasiones, en lugar del Anticuerpo,secundario, se ha llegado a usar Proteína A (proteína de superficie que se encuentra en la pared celular del Staphylococcus aureus y que puedereconocer anticuerpos de la Inmunoglobulina G, pudiendo ser modificada para hacerla visible.) o Proteína G. 9.1.1 Bloqueo Normalmente, en todos los procedimientos de inmunodetección, se da un proceso llamado el Bloqueo que consigue prevenir la unión no específica del sistema de detección a la membrana, lo que puede llegar a producir una grancantidad de falsos positivos. El bloqueo también se va a dar en el caso del Western Blot. Para ello, se emplean numerosas soluciones bloqueantes y para 23 poder elegir una de ellas, se deberá tener en cuenta que dicho sistema de bloqueo sea compatible con el sistema de detección empleado. Así, las soluciones de bloqueo más comunes para el Western Blot son:  La solución de leche desnatada.  La solución de albúmina sérica bovina (BSA).  El bloqueo en Tween-20 se puede usar si hay una gran cantidad de falsos positivos. Hay que usar con cuidado los detergentes noiónicos como Tween-20 ya que pueden solubilizar las proteínas transferidas al filtro. 9.1.2 Tinción de las proteínas en el Filtro Se pueden teñir las proteínas en el propio filtro como posible control de la transferencia realizada. Se pueden teñir todas las proteínas presentes en el filtro, aunque existen otros métodos de tinción de proteínas que sólo va a teñir específicamente algunas de las proteínas, partiendo de unas mezclas bastante complejas que han sido separadas en geles y posteriormentetransferidas a filtros. Estos métodos específicos de tinción estarán basados en técnicas inmunohistoquímicas. Hay que tener en cuenta que las tinciones que consiguen marcar a las proteínas en los geles de poliacrilamida no sirven para la tinción de esas mismas proteínas en los filtros. En el caso de las proteínas unidas a filtros habrá que usar otras tinciones como es el caso de:  Tinta China: En este caso, la tinción puede llegar a ser muy sensible,se puede reproducir y es permanente y no va a interferir en los procedimientos de la inmunodetección, aunque sí que se va a poder tapar en algo los resultados obtenidos en el proceso inmunoquímico. La tinción se va a basar en la adherencia de las partículas de carbón de la tinta con las proteínas inmovilizadas. Para poder quitar dicha tinción se puede emplear el PBS.  El negro amido: Tiene la desventaja de que es menos sensible que latinta china y las bandas van a aparecer negras sobre un fondo de un color azulado. Si necesitamos desteñir, se empleará una solución de ácido acético con metanol. También conlleva el problema de que invalida cualquier inmunodetección posterior.  Tinción Ponceau S: En este caso, se va a emplear en una solución acuosa y se trata de una tinción rápida pero no llega a ser permanentey puede llegar a desaparecer con un procesado posterior. Gracias a sufácil desaparición, puede ser compatible con casi todos los procesos dedetección con anticuerpos.  Tinción mediante Oro Coloidal: Para hacer esta tinción, vamos a usar una solución 24 coloidal estabilizada a un pH de 3. Con este pH las partículas de oro están cargadas negativamente y se unenespecíficamente a las proteínas.  Tinción mediante biotina-estreptavidina: Esta técnica está basadaen la afinidad de la estreptavidina por la biotina. Primero se une la biotina a las proteínas unidas al filtro de nitrocelulosa y después se lavará el exceso de biotina no unida. Aquellas proteínas a las que se ha unido la biotina van a ser detectadas empleando estreptavidina unida a una enzima determinada, formando un complejo, cuyo producto vamos a poder visualizar. 9.1.3 Aplicaciones de la Técnica de Western Blot Actualmente esta técnica es muy utilizada en la confirmación del diagnósticode la infección por VIH. Estos diagnósticos están basados principalmente en algunas pruebas que pretenden detectar los anticuerpos frente al virus. La prueba de detección primaria es el enzimoinmunoanálisis (EIA). Esas pruebas han ido evolucionando de manera que los de tercera generación emplean una serie de proteínas recombinantes o algunos péptidos de cubierta, tanto del VIH-1 como del VIH-2, ofreciéndonos una sensibilidad muyelevada. No obstante, a día de hoy, se usan métodos de cuarta generación, en los que se emplea un medio sólido y que nos permite llegar a un diagnóstico mucho más rápido y certero, sin necesidad de esperar el períodoventana. Pues bien, todo resultado positivo del VIH deberá ser sometido a una confirmación mediante transferencia Western o inmunotransferencia. Para ello, se van a buscar antígenos específicos del VIH como pueden ser la presencia de anticuerpos en el suero del paciente frente a proteínas del centroespecíficas de virus. También puede diseñarseuna transferencia de western Blot frente a los Ac frente a la polimerasa o incluso la cubierta del VIH. 25