Recombinacion Y Transposicion PDF

2 UNIDAD 4. RECOMBINACIÓN Y TRANSPOSICIÓN 1. CONCEPTOS GENERALES DE RECOMBINACIÓN DEFINICIÓN → Cualquier proceso que dé lugar a la formación de un nuevo DNA a partir de moléculas distintas. Es un proceso de redistribución de la información genética que permite al organismo intercalar parte de una...

2 UNIDAD 4. RECOMBINACIÓN Y TRANSPOSICIÓN 1. CONCEPTOS GENERALES DE RECOMBINACIÓN DEFINICIÓN → Cualquier proceso que dé lugar a la formación de un nuevo DNA a partir de moléculas distintas. Es un proceso de redistribución de la información genética que permite al organismo intercalar parte de una cadena de ADN en otra. Es esencial para la evolución ya que permite generar nuevas combinaciones alélicas, recuperar combinaciones y crear nuevas reorganizaciones de genes. Además puede regular la expresión génica. Hay 2 tipos: 1. RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA → ocurre entre zonas con mucha homología, es decir, entre regiones equivalentes, aunque no exactamente iguales. 2. RECOMBINACIÓN HETERÓLOGA → se produce entre regiones distintas y puede ser: específica de sitio (en dianas específicas) o no específica de sitio o transposición (segmento corto de DNA se mueve de un lugar a otro) 2. RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA Es una potente fuerza evolutiva que permite la diversidad genética, la conservación de la identidad genética y reparar el DNA. PROCARIOTAS EUCARIOTAS MANTENIMIEN TO DEL GENOMA Reparación roturas de doble cadena y re-inicio de horquillas de replicación detenidas Reparación roturas de doble cadena y re-inicio de horquillas de replicación detenidas GENERACIÓN DIVERSIDAD Promoción de intercambio genético entre gDNA y el que entra por transducción o conjugación. Realizar el entrecruzamiento y asegurar la segregación de cromosomas en la división. En mitosis puede ocurrir pero es MUY raro. Los pasos generales de la recombinación homóloga son: MODELO DE HOLLIDAY Propuesto 1964 1. Realización de cortes en el DNA 2. Alineación de las dos moléculas de ADN homólogas 3. Formación de la estructura de Holliday 2.1 4. Desplazamiento de esta unión a lo largo de las cadenas 5. Resolución de la unión de Holliday Primero se alinean las cadenas homólogas y se rompe 1 cadena de cada duplex. A continuación se forma la unión de Holliday, que es una unión cruzada de las cadenas a nivel de la rotura, la cual se va desplazando a lo largo de las cadenas. En este punto aparecen los heteroduplex. Para la resolución de la unión hay dos posibilidades de escisión que generarán 2 combinaciones génicas: 7 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 44fff47f1-772 (Horizontal) Sin embargo, este no es el modelo real. Se ha comprobado que el inicio de la recombinación ocurre a partir de roturas bicatenarias por lo que realmente ocurre: rotura bicatenaria + reparación. Hay enzimas que producen esta rotura (Spo11 en euc.) e implican la síntesis adicional de ADN. GENÉTICA MOLECULAR 2 1. Productos recombinados o de “empalme” → entrecruzamiento en los genes flanqueantes a un gen concreto. (Vertical) 2. Producto en “parche” o no recombinado → solo cambia un gen concreto. 2.2 MODELO DE ROTURA Y REPARACIÓN DE DOBLE CADENA cromosomas. A continuación un fragmento invade la doble hebra del otro cromosoma y abre una burbuja. A partir de los extremos 3’ de estos fragmentos de ssDNA se empieza a sintetizar DNA y se forma una doble unión de Holliday. Para la resolución de la unión hay dos posibilidades de escisión que generarán dos combinaciones génicas: 1. Productos recombinados o de “empalme” → entrecruzamiento; un resolución de cada tipo 2. Producto en “parche” o no recombinado → no hay entrecruzamiento; dos resoluciones =. 8 Primero se alinean las cadenas homólogas y se rompen las dos cadenas de uno de los Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 44fff47f1-772 GENÉTICA MOLECULAR 2 En E. coli está el sistema RecBCD → El CHI (crossover hotspot instigator) es un punto del DNA cuya secuencia es GCTCCTGG y es reconocido por la proteína RecBCD 1. Rec B = helicasa 3’ → 5’ + nucleasa 3. Rec D = helicasa 5’ → 3’ 2. Rec C = reconoce CHI La cadena que invade la doble hélice se desplaza hasta encontrar una secuencia homóloga y se produce apareamiento en la misma. Rec A es una proteína de intercambio de cadenas que está implicada en la búsqueda de la homología (puede albergar varias cadenas), en la generación de regiones de apareamiento y estira el DNA hasta detectar complementariedad de bases entre dos moléculas de DNA. En eucariotas está muy conservada → Rad51 y Dmc1. Para la migración y la resolución se emplean proteínas Ruv: 1. Ruv A → se une a las cuatro hebras de la unión de Holliday 2. RuvB → ATPasa que se une en extremos opuestos de la unión y permite el desplazamiento. La hidrólisis de ATP hace que RuvAB gire el DNA 3. RuvC → endonucleasa que reconoce específicamente la unión y permite la resolución. Corta preferentemente en ATTG, siempre que se encuentre en una unión de Holliday. 2.3 RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA EN EUCARIOTAS FACTORES QUE CATALIZAN LA RECOMBINACIÓN PASO EN E. COLI EN EUCARIOTA Inducción roturas bicatenarias - Spo11 Procesamiento roturas DNA para generar monocadenas para la invasión Helicasa nucleasa RecBCD Apareamiento de DNA homólogos e invasión cadenas Proteína RecA Rad51, Dmc1 Reconocimiento unión de holliday y migración de las ramas RecBCD - Resolución de la unión RuvC - En eucariotas la recombinación ocurre en la profase I meiótica, en la cual de un precursor 2n se generan 4 gametos n genéticamente distintos (exclusiva de líneas germinales). La rotura de los heteroduplex y su reparación puede provocar conversiones génicas → divergencia en la segregación esperada de los alelos que altera la frecuencia genotípica en gametos. Durante este proceso se elimina parte de una cadena y se sintetiza con la hebra complementaria como molde. 9 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 44fff47f1-772 GENÉTICA MOLECULAR 2 3. RECOMBINACIÓN HETERÓLOGA: RECOMBINACIÓN CONSERVATIVA ESPECÍFICA DEL SITIO (CSSR) RECOMBINACIÓN HETERÓLOGA → Se produce entre regiones no equivalentes dando lugar a reordenaciones en el genoma, por lo que es una gran fuente de variabilidad. En el proceso participan recombinasas, de las cuales hay dos familias → serina recombinasas y tirosina recombinasas. RECOMBINACIÓN CONSERVATIVA ESPECÍFICA DEL SITIO (CSSR) → ocurre entre dos secuencias definidas llamadas sitios de recombinación, en las cuales hay una secuencia de unión específica a recombinasa (ubicadas simétricamente) y una secuencia de corte y resellado por recombinasa (región crossing-over). Pueden ocurrir tres reordenaciones → inserción de un segmento de DNA en un sitio específico (ej. integración fago λ), deleción de un segmento de DNA o inversión de un segmento de DNA. La especificidad de recombinación se produce por la complementariedad de 15 a 30 bases de 2 cadenas de DNA. Esto es reconocido por una recombinasa y puede ser tirosina-recombinasa o serina-recombinasa EL FAGO λ Su DNA se integra en sitios predeterminados del DNA bacteriano. En el proceso no intervienen proteínas Rec y los DNA solo se recombinan en un sitio, gracias a la formación de un complejo sináptico. Conceptos que hay que saber: ○ attP → sitio de integración del fago (attachment Phage) ○ attB → sitio de integración de la bacteria (attachment Bacteria) ○ Región O → 15 pb que es idénticas en ambos, ○ Profago → forma integrada y flanqueada a la izquierda por attL (BOP') y a la derecha por attR (POB') ○ Int (integrasa) → actividades típicas de una recombinación: endonucleasa y ligasa. Cortes de 7pb en attP y attB para permitir la unión ○ IHF (Integration Host Factor) → Orienta las moléculas doblando el DNA de un modo determinado para permitir la recombinación Ventaja evolutiva de los sitios específicos de integración del fago → si el DNA se inserta aleatoriamente hay un alto riesgo de desaparición de la especie por aparición de mutaciones insercionales. Limitando la inserción a determinados sitios poco críticos, evitamos el potencial mutagénico de la inserción 10 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 44fff47f1-772 GENÉTICA MOLECULAR 2 3.1 FUNCIONES BIOLÓGICAS DE LA RECOMBINACIÓN HETERÓLOGA 1. CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA → se activan / inactivan genes alternativos. Ej. recombinasa Hin (H-inversion) de Salmonella y activación de los genes flj de la flagelina (producción flagelos 2. ACTIVACIÓN DE GENES EN EUCARIOTAS → ej. locus MAT en levaduras 3. REENSAMBLAJE DE GENES DEL SIST. INMUNITARIO EN VERTEBRADOS → la recombinación genética en linfocitos permite generar distintos anticuerpos y receptores de linfocitos T que se requieren para la respuesta inmune. Hay genes V, D y J que se reorganizan en el desarrollo y la recombinación genera hasta 107 combinaciones posibles. 4. OBTENCIÓN DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS (biotec) → se insertan sitios de recombinación que flanquean el gen marcador y se promueve la recombinación entre los sitios y la deleción del gen, ○ El sistema Cre/lox → el gen cre una recombinasa específica de secuencia llamada Cre. Los sitios que reconoce y recombina Cre se llaman secuencias loxP (34pb). De por sí, con las secuencias loxP no ocurre nada pero si la célula expresa cre, la recombinación de Cre con estas secuencias produce un corte entre los sitios loxP, se unen las secuencias de DNA por loxP y se degrada el DNA cortado. LoxP proviene originalmente del bacteriófago P1, pero pueden ser artificialmente insertadas en animales o plantas para producir el corte preciso de DNA, sin que existan problemas de cortar otras partes del genoma. 4. RECOMBINACIÓN HETRÓLOGA: TRANSPOSICIÓN La transposición es un proceso de recombinación no homóloga que mueve un fragmento de DNA de un sitio a otro dentro de la misma cadena o entre cadenas distintas. Estos elementos son TRANSPOSONES O ELEMENTOS TRANSPONIBLES y son fuente de muchas mutaciones espontáneas. En general, la inserción no requiere afinidad de secuencia y puede producirse en cualquier parte del genoma y si lo que se inserta son exones o promotores ocurren mutaciones. Los primeros fueron descubiertos por Barbara McClintok en 1950, cuando publicó un trabajo sobre los elementos Ac/Ds. Hay dos tipos de repeticiones características en los transposones: 1. Repeticiones terminales invertidas → 9-40 pb complementarias de forma invertida. 2. Repeticiones directas flanqueantes → 3-12 pb que se producen durante el proceso donde se ha insertado el transposón. Longitud variable pero = por transposón. Se producen porque el transposón genera cortes escalonados donde se inserta. 11 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 44fff47f1-772 GENÉTICA MOLECULAR 2 4.1 TRANSPOSICIÓN CONSERVATIVA VS REPLICATIVA La transposición conservativa es aquella en la que cuando el transposón se mueve el sitio del que proviene queda vacío por lo que no aumenta el número de copias del transposón en la célula. Sin embargo la transposición replicativa supone que quede una copia del transposón del sitio del que salta aumentando el número de copias. En la transposición conservativa la transposasa genera roturas de dobles en la secuencia de origen y a cada lado de la secuencia donde se va a insertar (los extremos 3’ de la región receptora integra el fragmento). En la transposición replicativa una resolvasa resuelve el cointegrado haciendo una recombinación recíproca → une extremos del DNA aceptor original y libera el genoma donante de nuevo con su transposón. En este caso las transposasa genera roturas de una sola hélice en la secuencia de origen. 4.2 ELEMENTOS TRANSPONIBLES EN PROCARIOTAS Las secuencias de inserción (IS) es el elemento más simple en bacterias y llevan la información genética para sintetizar la transposasa necesaria para su movimiento. Los transposones compuestos están formados por 2 copias de IS. Cada una tiene secuencias invertidas y hay repeticiones directas flanqueando ambas. El DNA entre las dos IS no es necesario para el movimiento pero puede portar info. genética como para la resistencia a antibióticos. Además, la transposasa producida por una de las dos es responsable de la transposición de ambas. Los transposones no compuestos no tienen secuencia IS. Poseen genes que codifican para la transposasa y producen repeticiones directas flanqueantes cuando se insertan al azar. 4.3 ELEMENTOS TRANSPONIBLES EN EUCARIOTAS Los elementos transponibles de DNA son similares a los de las bacterias y tienen repeticiones invertidas cortas. Pueden ser autónomos (gen para la transposasa) o no autónomos (no tienen gen de la transposasa, se mueven usando la de otro elemento). En todos los organismos existen ambos. Los retrotransposones son los más abundantes y tienen 2 repeticiones directas largas (LTR) que tienen las repeticiones invertidas. Se trasladan a partir de intermediarios de RNA (transposición replicativa) y la integrasa es la encargada de catalizar la inserción del elemento transponible. 12 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 44fff47f1-772 GENÉTICA MOLECULAR 2 Los retrotransposons con cola poli-A no tienen regiones terminales invertidas sino que son distintas: 5’-UTR y 3’-UTR + cola poli-A. Estos codifican para ORF1, proteína de unión al RNA) y ORF2, que actúa como transcriptasa reversa y endonucleasa. Ocurre el splicing reverso; ○ El promotor está en la región 5’-UTR y se transcribe a RNA con los genes ○ En la traducción es cuando se generan las dos ORF, las cuales forman un complejo ORF1/ORF2 que se une al RNA. ○ El elemento se inserta en una región diana del DNA, normalmente rica en T. ○ Para la inserción se realiza un corte en una de las cadenas, se forma un heteroduplex (DNA-RNA) y se sintetiza la primera cadena de cDNA. Se degrada el RNA mientras se sintetiza la segunda cadena del cDNA. Finalmente se ensambla el nuevo DNA con el viejo. Los elementos SINEs (Short Interspersed Nuclear Element) son retrotransposones poli-A no autónomos que no codifican transposones. Es el nombre colectivo para las secuencias o elementos Alu (13ç5 genoma humano) que se transponen con las proteínas ORF2 de los LINEs. Los elementos LINEs (Long Interspersed Nuclear Element) son retrotransposones poli-A autónomos que codifican para proteínas ORF1 y ORF2 y que suponen el 20% del genoma humano. 13