U2 Realització de cultius cel·lulars PDF

## INTRODUCCIO Un cultiu cel·lular és un porcés que ens permet mantenir cèl·lules d'un organisme pluricel·lular in vitro, per preservar les mateixes característiques fisiològiques, bioquímiques i genètiques de quan formaven part d'un ésser viu. Es fa utilitzant un medi de cultiu artificial i manten...

## INTRODUCCIO Un cultiu cel·lular és un porcés que ens permet mantenir cèl·lules d'un organisme pluricel·lular in vitro, per preservar les mateixes característiques fisiològiques, bioquímiques i genètiques de quan formaven part d'un ésser viu. Es fa utilitzant un medi de cultiu artificial i mantenint les condicions controlades. Els cultius cel·lulars van realitzar-se rutinariament als laboratori a partir dels anys 50, principalment per estudiar numerosos virus. ## CURVA DE CREIXEMENT CEL: WAKAB: Fa referència a la concentració de cèl·lules per dies al cultiu. Existeixen tres fases: - Fase de lactància (primeres 24h): és un tram recte amb certa concavitat. - No hi ha creixement - nº cèl. constant/disminueix lleugerament - Fase de creixement exponencial (7-8 dies): tram recte amb pendent elevada. - Augment exponencial de nº de cèl·lules. - Fase estacionària (>7-8 dies): Tram recte sense pendent. - nº cèl·lules constant ## TIPUS DE CULTIUS CEL·LULARS Segons el nivell d'organització cel·lular hi ha: - Cultius d'òrgans: es manté un òrgan o part d'ell a un medi artificial i amb una atmósfera controlada. Aquest cultiu no es pot propagar i no desenvolupa un òrgan sencer, però manté les relacions entre teixits. - Cultius d'explantes: es manté un fragment de teixit a un cultiu monocapa nutrit amb un medi artificial. Les cèl·lules perfièriques del cultiu si poden multiplicar-se i propagar-se, però en sí, l'òrgan no. - Cultius de cèl·lules: es realitza a partir d'una suspensió de cèl·lules incubades a un medi de cultiu. Existeixen diverses formes de classificar els cultius cel·lulars segons criteris diferents: - Cultius en suspensió: les cèl·lules no s'adhereixen a cap superfície, només creixen disperes a un medi de cultiu. - Cultius en monocapa: les cèl·lules creixen al voltant d'una superfície, normalment al fons d'una placa de Petri. - Cultius tridimensionals: les cèl·lules interactúen en les 3 dimensions de l'espai, de manera similar a com ho farien en un òrgan viu. ## CBELLEMENT EN SUSPENSIÓ - **Adaptació al medi de cultiu**: període curt, les cèl·lules s'adapten al medi i les condicions de cultiu abans d'iniciar la proliferació (fase de latència). - **Proliferació en suspensió**: les cèl·lules comencen a proliferar (fase exponencial) - **Inhibició per densitat**: s'ha aconseguit un nombre crític de cèl·lules en relació amb el volum de medi i nutrients disponibles --> les cèl·lules deixen de crèixer encara que segueixen mantenint-se vives (fase estacionària). Perquè les cèl·lules reprenguin el creixement, es fa un subcultiu amb algunes cèl·lules en un nou recipient. ## CBELLEMENT EN MONOCADA: - Les cèl·lules creixen adherides sobre una superfície sòlida de plàstic o vidre. - Són cèl·lules dependents d'ancoratge. És el mètode de cultiu usat per a la majoria de les cèl·lules. Hi ha 3 etapes: - **Adhesió a una superfície**: en ella les cèl·lules comencen a adherir-se al suport (fase de latència). - **Proliferació i formació de colònies**: les cèl·lules comencen a proliferar i s'expandeixen per la superfície formant colònies. (fase exponencial) - **Inhibició per contacte**: amb el temps, les cèl·lules ocupen tota la superfície entrant a confluència, comença a haver-hi contacte entre elles i les cèl·lules inhibeixen el seu creixement. Les cèl·lules es mantenen vives encara que deixen de proliferar. Perquè les cèl·lules reprenguin el creixement, es fa un subcultiu amb algunes cèl·lules en un nou flascó. ## Factors que intervenen EN UN CULTIU - El cultiu de cèl·lules implica: - Extreure les cel·lules del seu entorn tissular fisiològic. - Introduir-les a l'interior d'un recipient adequat que les aïlla de l'exterior, immerses o banyades per un medi de cultiu artificial. - Col·locar el conjunt a l'interior d'un incubador que proporciona unes condicions ambientals adquades. - És a dir, implica un conjunt d'operacions complexes, que per a que es desenvolupin adequadament es necessari controlar una sèrie de factors o condicions, que són: - El suport físic on creixeran les cèl·lules - La composició química i propietats fisioquímiques del medi de cultiu. - L'atmosfera gasoa. - Les condicions d'incubació ## Ek Suport Fisic: - La major part de les cèl·lules en cultiu creixen en monocapa adherides a la superfícies del recipient. Per això cal tenir en compte: - El material o substrat amb el qual estan fabricats els materials. - El diseny i forma del material - Els tractaments de la superfície. ## Materials per recipients de cultiu: - Han de permetre l'adhesió de les cèl·lules - S'han d'esterilitzar fàcilment - Han de tenir suficient qualitat òptica com per poder visualitzar el cultiu amb un microscopi invertit. - Els recipients poden ser de: - Vidre: reutilitzable, fàcil de netejar i esterilitzar amb calor a l'autoclave i molt bona qualitat òptica per observacions microscòpiques. - Plàstic d'un sol ús: de baix cost, fàcil d'esterilitzar amb irradiació, amb bona qualitat òptica i és un estalvi de temps de treball perquè no cal reutilitzar-lo, cosa que disminueix el risc de contaminació. - Matrasos tridimensionals porosos: són de gels de col·làgen o esponges de cel·lulosa i s'utilitzen per cultivar tipus cel·lulars que s'introdueixen a l'interior de la xarxa tridimensional i creixen organitzantse de forma similar a com ho fan al seu teixit de procedència. - Microesferes de sephadex o policrilamida: Les cèl·lules creixen adherides a aquestes microesferes, que es mantenen en suspensió al senus del medi de cultiu. S'utilitzen per cultivar cèl·lules dependents d'anlatge cm si fos n cultiu en suspensió -> augment de la superfície de creixement disponible. ## Característiques i tipus de recipients de cultiu: - Existeixen una amplia varietat de recipients pel cultiu, que es caracteritzen per: - Superfície útil de cultiu - N° de cèl·lules que es sembren - Previsió nº de cèl·lules en confluència ### Plaques multipocillo: - Nº variable de pocillos (6-96) amb fons pla d'un diàmetre d'entre 8-35mm. - Tapa no hermètica - S'utilitzen per realitzar experiments puntuals simultànis amb diverses línies cel·lulars o diferents condicions de cultiu. - No s'aconsella pel manteniment de línies cel·lulars per no ser hermètics i presentar per això un major risc de contaminació. ### Plaques de Petri: - Plaques cel·lulars amb tapa. - Tamany variable, diàmetre entre 3,5 i 10 cm. - Superfície de cultiu d'entre 10 i 78 cm2. - Mateixes utilitats i limitacions que les plaques multipocillos. ### Flascons o ampolles roux: - Flascons plans amb tap de rosca de diverso tamanys. - Són ideals per cultius en monocaps i suspensió, i pel mantniments de linies cel·lulars. - Si enrosquem el tap realitzem un cultiu tancat, si el deixem semienroscat realitzem un cultiu obert (permet intercanvi de gasos amb l'incubador i preveuen de la contaminació). - Hi ha un tipus especial de flascó del cultiu la qual superfície de creixement és un portaobjectes. De forma que, un cop acabat el cultiu, es retira del medi de cultiu i la resta del flascó es desenganxa de la superfície. ### Ampolles per incubadors tipus roller: - Són ampolles cilíndriques de diversos tamanys. - Amb gran superfície de creixement. - Específiques per incubar-les sobre rodets que les fa girar lentament, de manera que les cèl·lules puguin crèixer en tota la superfície interior de l'ampolla. ## Tractament de superfícies: - Amb la fí de possibilitzar o millorar l'adhesió de les cèl·lules depenents d'anclatge a les superfícies de cltiu, aquestes es poden tractar amb proteïnes de matriu extracel·lular, com col-lagen, laminina, fibronectina, vitronectina, etc. - El tractament pot realitzarse abans del cultiu, inundant el recipient de cultiu amb una solució estèril de la proteïna, o bé, afegint-la al medi de cultiu com un component més. ## MEDIS DE CULTIU: COMPOSICIÓ I PROLIEJATS : - Els medis de cultiu són medis nutritius que substitueixen al medi natural en què es troba la cèl·lula fisiològicament. Són mescles complexes que deuen: - Aportar a la cèl·lula no només nutrients pel seu manteniment com organisme viu, sinó tot tipus de substàncies necessàries pel complet desenvolupament metabòlic que permeti a la cèl·lula proliferar. - Reunir una serie de característiques fisioquímiques que: - Generin condicions microambientals adequades pel desenvolupament cel·lular. - Permetin acumular temporalment productes de rebuig del metabolisme cel·lular. ## 1. Composició del medi de cultiu: - Sals minerals: la solució salina equilibrada és la base del cultiu en la qual es dissolen la resta de components. Aquestes poden ser: Clorur de sodi (NaCl), Clorur de potassi (KCI), Clorur de Calci (CaCl), Clorur de magnesi (MgCl), fosfats de sodi i bicarbonat de sodi. - Tampó: el medi de cultiu ha d'estar tamponat, ja que les cèl·lules són molt sensibles als cambis de pH. El tampó més utilizat és el bicarbonat, tot i que últimament es recomana fer servir el tampó HEPES en concentracions de 10-20mM pel seu gran poder amortiguador en el feix de pH òptim pel creixement cel·lular (7,2 - 7,6). - Glucosa: s'inclou als medis com a font d'energia. Pot anar acompanyada d'altres glúcids. - Aminoàcids: el medi de cultiu com a mínim ha de tenir tots els aminoàcids essencials. Es pot suplementar amb d'altres, depenent de les necessitats de les cèl·lules que es volen cultivar. - Vitamines: La composició en vitamines varia molt d'un medi a un altre i dependrà de la concentració de suero que s'usi. Les vitamines són necessàries perquè infueixen a la taxa de creixement i a la supervivència de les cèl·lules. - Suplements orgànics de baix pès molecular: aquí s'inclouen àcids grassos essencials i altres lípids, nucleòsids, piruvats, etc. - Indicador de pH: Com que el pH del medi és un paràmetre fundamental per la supervivència del cultiu, a la composició del medi s'inclou un indicador de pH. - El més utilitzat és el vermell de fenol: - Hormones i factors de creixement: aquí s'inclouen components essencials pel creixements de les cèl·lules, però la qual proporció al medi de cultiu és molt difícil d'estandaritzar. Per això, la majoria de la medis de cultius bàsics (medis no definits) solucionen aquest problema suplementant un suero animal. - El suero animal aporta hormones i factors de creixement, proteïnes, ferro, oligoelements, factors d'adehsió, inhibidors de proteases, etc. Els més utilitzats son el de ternera i el de boví fetal per tot tipus de cultius i el suero humà per cultivar linies cel·lulars humanes. - Antibiòtics i antifungics: - Prevenen la contaminació del cultiu. - Poden utilitzar-se sols o en combinació i els més habituals son la gentamicina i la penicilina o estreptomicina. - El antifúngic més utilitzat és l'anfotericina B. ## 2. Propietats fisioquimiques: - pH: Les cèl·lules creixen en un marge de pH estret. El pH òptim és de 7,4 per a la majoria de les cèl·lules. Suporten un rang de 7,2-7,6. - El pH es fixa amb solucions tampó i es controla amb indicadors que viran de color quan canvia el pH - Osmolaritat: és la mesura per expressar la concentració total de substàncies en dissolucions. Els mitjans de cultiu han de ser isotònics o lleugerament hipotònics respecte de les cèl·lules que s'hi cultiven. Les cèl·lules en cultiu toleren una osmolaritat al rang de 260-320 mOsm/Kg - Viscositat: depèn principalment de la concentració de sèrum que es faci servir. Quan es fan servir mitjans lliures de sèrum, es poden afegir substàncies inerts que augmenten lleugerament la viscositat, com la carboximetilcel·lulosa o la polivinilpirrolidona. - Aquest paràmetre no sol ser limitant per al creixement de les cèl·lules - Tensió superficial: s'ha de mantenir baixa i no sol ser problema als cultius tradicionals. Únicament és certs cultius especials en suspensió en què es bombolla CO2 pot produir-se escuma en el cultiu. Per evitar-ho s'hi afegeixen agents antiescumants. ## KALELOSFERA GASOSA - L'atmosfera gasosa és la barreja de gasos que mantenen els cultius; els components més importants són l'O2 i el CO2. Aquests són subministrats i controlats per l'incubador. - Oxigen: és requerit per totes les cèl·lules per sobreviure. En general, la [O2 atmosfèric] és suficient per cobrir les necessitats de qualsevol cultiu cel·lular. Només requereixen una major concentració (95%) alguns cultius d'òrgans a causa de la mala difusió del gas fins a l'interior de l'òrgan. - CO2: té un paper molt important en els cultius cel·lulars ja que la fracció dissolta al medi està en equilibri l'ió bicarbonat (HCO3-). - Per això, la [CO2] influeix en el pH del medi quan aquest està tamponat amb bicarbonat. Per això, cada medi té una concentració recomanada de CO2 en fase gasosa, que va en funció de la quantitat de bicarbonat que conté. ## CONDICIONS DIFALCUBACIÓ. - L'incubador manté les condicions ambientals òptimes per al creixement de les cèl·lules controlant: - Temperatura: influeix en la taxa de creixement de les cèl·lules. Les cèl·lules de mamífer creixen bé a 37 °C, però les cèl·lules d'insectes ho fan a 28 °C. Això és perquè la seva Ta de creixement òptima va d'acord amb la Ta a la qual estan sotmeses de forma fisiològica. - Humitat: el vapor d'aigua ambiental ha de ser suficientment elevat per evitar l'evaporació de l'aigua que conté el medi de cultiu, ja que sinó es produiria un augment de la concentració dels components i l'osmolaritat amb les conseqüents variacions del pH. ## Tècniques d' Obtenció, manteniment i propagació de cultius Generalment, tot cultiu cel·lular constarà dels següents pasos: 1. Obtenció de la mostra 2. Establiment del cultiu 3. Renovació del medi 4. Congelació de les cèl·lules, si les volem mantenir molt de temps. ## MATERIAL NECESSARI: - En primer lloc, necessitem un espai preparat específicament per la realització de cultiius: la sala de cultiu (U1). ## ABFEENCIÓ DE LES MOSTRES - Les mostres més utilitzades per a la realització de cultius cel·lulars en citogenètica són les vellositats coriòniques, les de líquid amniòtic i les de sang perifèrica. - També es poden fer servir per mostres de tumors, tot i que en aquest cas, la presa de la mostra es relativament senzilla, ja que es relitza una biopsia del mateix. 1. Vellositat coriòniques: són uns plecs al costat de la placenta amb la mateixa dotaciócromosòmica que la del nadó, que per obtenir-ne una mostra es necessari realitzar una biopsia de les mateixez. Hi ha 2 possibles mètodes: - Via transcervical: s'intordueix un catèter per l'úter fins les vellositats coriòniques i es pren la mostra. - Via transabdominal: d'introdueix una agulla a través de l'abdomen i l'úter fins les vellositats coriòniques per recollir la mostra. 2. Líquid amniòtic: Es poden obtenir cèl·lules fetals a partir d'una mostra de líquid amniòtic, a partir d'una amniocentesis. Aquesta consisteix en l'introducció transabdominal d'una agulla, que recull un petit volum de líquid amniòtic. 3. Sang perifèrica: El tipus de mostra més comú pel diagnòstic citogenètic postnatal és la sang perifèrica. S'obté per venopuncció amb una agulla que es punxa a una vena i es recull sang venosa en untub connectat a l'agulla. 4. Mostres tumorals: es prèn una mostra a partir d'una biopsia de la masa tumoral. ## ESTABLIMENT DEL CULFILA: - El protocol per l'establiment d'un cultiu és diferentns segonns el tipus de mostra de la que es tracti: - Establiment de cultius primaria a partir de teixits - Establiment de culitus primaris a partir de cèl·lules de fluids biològics ## ESTABLIMEALT DEL CIULFILLS PRIMARIS A PARTIR DE FEIXIES: - El procediment és el següent: 1. Disgregació del teixit: consisteix a obtenir el tipus cel·lular en suspensió. Hi ha 2 mètodes: - Mètodes mecànics: es basa en tallar, picar o triturar suaument fragments d'òrgans i teixits. Posteriorment, es realitza un cribratge de cèl·lules: - Es col·loquen els trossos en un garbell amb un diàmetre de porus suficient perquè passin les cèl·lules. - S'acobla sota un tub falcó o placa Petri. - Es renten els trossos amb tampó o medi de cultiu. - Sobre el garbell romanen els trossos de teixit i les cèl·lules que s'han separat passen al tub o la placa suspeses al tampó o mitjà de cultiu. - Mètodes enzimàtics: es basa en el tractament del teixits amb enzims proteolítics que digereixen les proteïnes de la matriu extracel·lular, alliberant les cèl·lules adherides a ella. Les més utilitzades són: - Tripsina: Un enzim secretat a l'intestí durant la digestió. - Colagenasa: Un enzim que trenca els enllaços del col·lagen. - Papaína: en enzim estret de la papaya que trenca les proteïnes animals. - Elastasa: un enzim que trenca fibres elàstiques de la matriu extracel·lular. - El normal és que es faci servir una combinació d'ambdós mètodes. 2. Selecció de cèl·lules: després de la disgregació obtenim una barreja complexa de cèl·lules en suspensió que es pot utilizar per si mateixa o seleccionar-ne alguns tipus cel·lulars concrets. Es basa en: - Propietat específiques de les cèl·lules: Aquestes es poden separar per la seva diferent adhesió a substrats (endotelis, col·lagen, plàstic, Ilana de vidre). Per fer-ho, es fa passar la suspensió per filtres amb aquests substrats de manera que les cèl·lules d'interès queden retinguts. Després se n'elueixen amb un tampó adequat que disminueixi l'adhesió i es desprenguin. - Mètodes immunològic de selecció de cèl·lules: Es basen en l'ús d'anticossos específics ancorats a un suport sòlid que reconeixen cèl·lules d'interès. Hi ha diverses possibilitats: - Recobrir els pollets d'una placa multipoc, de manera que les cèl·lules quedin adherides a la superfície del pollet i la resta s'eliminin per rentats. - Recobrir esferes de material inert, de manera que les cèl·lules s'adhereixen a les esferes i posteriorment es filtra tot. Queden retingudes al filtre les esferes amb cèl·lules. - Recobrir esferes magnètiques, de manera que les cèl·lules ancorades a aquestes puguin retenir-se amb un imant mentre la resta es renten. - A partir dels teixits d'un individu, com les vellositats coriòniques o les biòpsies de tumors, es poden establir cultius primaris mitjançant la tècnica d'explantaments. - Disgregació del teixit: es tallen petits trossos de teixit i es tracten amb enzims com a proteases (tripsina, quimiotripsina, papaïna, col·lagenasa), per afavorir disgregació del teixit. A continuació, aquests explants es col·loquen en un flascó de 25 cm2 amb el medi de cultiu adequat. - Incubació: s'incuven durant uns dies a 37°C i 5% CO2 dins un incubador. Cada dia s'observen amb microscopi per visualitzar l'aparició de cèl·lules adherides al fons de la placa. - Retirada dels explants: al cap d'1-2 setmanes, es retiren amb cura els trossos de teixit i s'hi afegeix mitjà de cultiu nou. ## ESTABLIMENT DEL CLULUEILLS PRIMARIS A PARTIR DE CELLULES DE ELANIAS BIOLOGIES. - Per l'establiment de cultius primaris a paritr de cèl·ules de fluids biològics com la sang o el líquid amniòtic es necessari: - Centrifugar la mostra i descartar el sobrenadant. - Incubació: resuspender lescèl·lules en medi de cltiu i col·locar en un flascó de cultiu o en una placa dins de l'incubador. - El mantenimenr dels cultius implica habitualment el canvi de medi de cultiu i la realització de pases o subcultius. 1. Control periòdic al microscopi: Cada 2-3 dies se sol fer un control ràpid del creixement del cultiu. Per això, cal retirar-lo de l'incubador. És imprescindible mantenir les condicions d'esterilitat, o en cas contrari aquest pas pot resultar crític per a la viabilitat cel·lular. Sense extreure'l del recipient i el medi, les cèl·lules poden observar-se al microscopi invertit. 2. Canvi de medi de cultiu: Cada 2-3 dies cal canviar el medi de cultiu, per renovar els nutrients i eliminar els productes de rebuig. El procediment, molt senzill, es fa dins una campana de flux laminar en condicions d'esterilitat. - Per als cultius en monocapa, en primer lloc, s'aspira el medi de cultiu "vell", acuradament, intentant no fer malbé cap cèl·lula. Només es canvien 2/3 de medi de cultiu, per mantenir possibles substàncies beneficioses secretades per les cèl·lules. A continuació, s'hi afegeix mitjà de cultiu "nou”, prèviament escalfat a 37°C. - Per a cultius en suspensió, se centrifuga a 700-800 rpm el cultiu, es retiren 2/3 del volum del medi i se substitueix per mitjà nou. 3. Subcultiu o pase: - Cultiu en monocapa: Les cèl·lules que creixen en monocapa proliferen fins a assolir l'estat de confluència, és a dir, que ocupen tot l'espai disponible (6-7 dies). Aleshores cal fer un pase o subcultiu a una placa d'un diàmetre major oa diverses plaques del mateix diàmetre. La proporció habitual és fer el passi d'una placa o flascó a 3 plaques iguals, però en línies cel·lulars de ràpid creixement es pot fer una passada de les cèl·lules d'una placa fins a 10 plaques. - La tripsina digereix les proteïnes responsables de l'adhesió a la superfície, l'EDTA retiren del medi els ions Ca2+ que estabilitzen les interaccions substrat-cèl·lula. - Per fer un pase - S'aspira el medi de cultiu - Es renten les cèl·lules amb PBS (tampó), amb compte. - Es tracta el cultiu amb tripsina-EDTA - S'incuven a temperatura ambient o 37°C (depèn del tipus de cultiu) durant 1-5 minuts. - Es para l'acció de la tripsina afegint mitjà de cultiu amb sèrum (que conté inhibidors d'aquesta proteasa). - Es "raspen" les cèl·lules amb un rascador. - Es centrifuga - S'elimina el sobrenedant - Es resuspèn el pèl·let al mig de cultiu "nou" - Es reparteix en plaques amb medi de cultiu "nou" - Cultiu en suspensió: Es fa un recompte de viables i es calcula el factor de dilució necessari perquè la densitat cel·lular sigui l'adequada per reiniciar el creixement. - Per exemple, si la dilució adequada és 1/5. En aquest cas es preparen 5 recipients amb 4/5 de nou mitjà i s'afegeix a cadascun 1/5 del cultiu vell. Els 5 subcultius es passen a l'incubador per reiniciar el creixement cel·lular. D'aquesta manera es va expandint la població cel·lular. - Una altra possibilitat és anar augmentant la mida del recipient de cultiu, de manera que cada passi es realitza en un recipient més gran que l'anterior. ## Congelacio: - En moltes ocasions cal congelar les cèl·lules dels cultius cel·lulars per a la seva preservació. Així, es procedeix com en el cas de voler fer un subcultiu, però després de la centrifugació de les cèl·lules, es resuspenen enmig de cultiu + 5-10% DMSO (dimetilsulfoxid) o glicerol (agents crioprotectors --> eviten que les cèl·lules es trenquin durant la congelació). - La densitat final de cèl·lules enmig de congelació és al voltant de 10^6 cel/mL. Aquesta alíquota s'introdueix en un criovial (1mL/microtub) i es procedeix a la congelació: - -20°C durant 24h - 80°C durant 24h més - En nitrogen líquid indefinidament ## Determinació del número i la viabilitat cel·lular - Quan es fa un cultiu cel·lular, es sembren molt poques cèl·lules i deixem que creixin durant uns dies en condicions controlades. 1. Com sabem quantes cèl·lules ha de tenir un cultiu cel·lular? Amb la densitat cel·lular es calcula: - [nº de cèl·lules / mL del medi] 2. Com sabem quantes cèl·lules estan vives? Amb la fòrmula de la viabilitat cel·lular: - Per determinar la viabilitat cel·lular s'utilitza el colorant blau de tripán, que només atravessa les membraness trencades de les cèl·lules mortes, per no a les vives. Per això, quan observem cèl·lules tractades amb blau de tripán al microscpoi veiem: - Cèl·lules blaves: mortes, ja que tenen la membrana trencada. - Cèl·lules blanques: vives, amb membrana intacta. - Pel conteig de cèl·lules, utilitzem una càmera de Neubauer (manual) o contadors automàtics de cèl·lulès, que són portaobjectes especials al qual se li han dibuixat un diamant unes quadrícules de dimensions conegudes. - La càmera de Neubauer s'utilitza per contejos cel·lulars de tot tips, també en hemogrames. - En cultius cel·lulars, només trobarem lescèl·lules dels quatre quadrats de les cantonades, que contenen exactament 0,1 mm3 de suspensió cel·lular. - El conteig de les cèl·lules es farà recorrent cada quadrant en zig zag. - El procediment complet per compta les cèl·lules viables e inviables es la següent: 1. Es barreja un volum igual de dissolució comercial blau de tripán i de la suspensió cel·lular. El blau de tripán està molt dissolt per no intoxicar les cèl·lules. - Un cop s'han contat les cèl·lules, es realitzen els següents càlculs: - Factor de disolució = 2: es multiplica per 2 perquè hem diluït la nostra suspensio cel·lular a la meitat. - --> Es divideix entre 4 perquè hem contat 4 quadrats, és a dir, hem près 4 mesures 'repetides'. - --> Es multiplica per 10.000 perquè 100 nL = 0,0001 mL, i nosaltres estem buscal el volum en mililitres. - Per saber la viabilitat (o inviabilitat) de les cèl·lules en percentatge calculem: ## Contaminació dels cultius cel·lulars - La contaminació dels cultius cel·lulars fan referència a la presència de microorganismes no desitjats i es trobem en l'ambient de forma permanent (omnipresents). - Les méss freqüents són: (virus i mmicroplasmes noe s veuen a simple vista) 1. Bacteris: que sovint els trobarem com a cocs (boletes) o com a bacils (bastonets). Són fàcils de detectar veient-les al microscopi òptic, com a puntets que es mouen. També provoquen la trubidez del medi de cultiu i varien el pH del medi. 2. Llevats: Al microscopi es veuen com petites esferes. No provoquen variació del pH del medi ni la trubidez del medi del cultiu. Pan olor de pa o vinagre. 3. Fongs: Son els contaminants més habituals a llarg termini, i es poden observar a simple vista. 4. Virus: no es poden observar al microscopi, però si el seu efecte sobre les cèl·lules. 5. Micoplasmes: Són cèl·lules procariotes sense paret cel·lular, per lo que no són sensibles als antibiòtics que actúen contra la pared cel·lular com les penicilines. No s'observen al microscopi òptic, tot i que si es poden veure grànuls al citoplasma de les cèl·lules infectades. Es detecten amb la PCR o ELISA. - Els cultius primaris solen estar-ne lliure, però moltes línies cel·lulars si ho estan. 6. Contaminació per altres eucariotes (contaminació creuada)