Guia de Pràctiques P1 Biologia Cel·lular 2023-2024 PDF

Grau Medicina. UB. P1 BCBD 1 Grau Medicina. UB. P1 BCBD 2 Grau Medicina. UB. P1 BCBD PRÀCTICA 1  CULTIUS CEL·LULARS  MÈTODES PER DETECTAR CÈL·LULES EN LES FASES DEL CICLE CEL·LULAR OBJECTIUS GENERALS Aprendre les tècniques següents: Manipulació de cultius cel·lulars. Tècniques de detecció de cèl·l...

Grau Medicina. UB. P1 BCBD 1 Grau Medicina. UB. P1 BCBD 2 Grau Medicina. UB. P1 BCBD PRÀCTICA 1  CULTIUS CEL·LULARS  MÈTODES PER DETECTAR CÈL·LULES EN LES FASES DEL CICLE CEL·LULAR OBJECTIUS GENERALS Aprendre les tècniques següents: Manipulació de cultius cel·lulars. Tècniques de detecció de cèl·lules en fase S i mitosi: immunocitoquímica i FACS. INTRODUCCIÓ CULTIUS CEL·LULARS El cultiu cel·lular és una tècnica que permet estudiar de manera controlada cèl·lules vives fora de l’organisme del qual provenen. Es preparen a partir d’una suspensió cel·lular obtinguda mitjançant el trencament previ de les unions establertes entre cèl·lules i entre cèl·lules-matriu extracel·lular (ECM) d’un teixit (de manera mecànica o bé enzimàtica, utilitzant la proteasa tripsina); i el posterior aïllament o purificació dels diversos tipus cel·lulars que conformen el teixit (amb tècniques de centrifugació diferencial). Es distingeixen tres tipus principals de cultius: primaris, secundaris i línies establertes. Un cultiu primari és el primer cultiu de cèl·lules purificades que s’obté a partir d’un teixit. Un cultiu secundari s’obté mitjançant la tripsinització del cultiu primari. Les línies establertes són cèl·lules que per alguna raó s’han adaptat a un creixement prolongat in vitro, és a dir; poden dividir-se indefinidament. Un cultiu de cèl·lules normals (no transformades) creix fins a ocupar tota la superfície de la placa o flascó que les conté (monocapa). Aquesta propietat rep el nom d’inhibició per contacte. Els cultius de cèl·lules transformades no la presenten i creixen unes sobre les altres formant grumolls. 3 Grau Medicina. UB. P1 BCBD MANTENIMENT I CREIXEMENT (PROLIFERACIÓ) D’UN CULTIU CEL·LULAR Per al manteniment i proliferació de les cèl·lules en cultiu, és fonamental controlar una sèrie de factors que depenen del tipus cel·lular:  Físics (temperatura, pressió osmòtica, pH, esterilitat, gasos [CO2,O2...]): s’aconsegueix en sales de cultius controlades amb incubadors, campanes de flux laminar, subministrament de gasos, etc.  Nutricionals (carbohidrats, aminoàcids, vitamines, ions inorgànics, etc.): continguts en les formulacions del medis de cultiu.  Factors de creixement: es troben en el sèrum fetal animal. El més utilitzat és el sèrum fetal boví (Fetal Bovine Serum, FBS). Molt important: l’esterilitat. Totes les manipulacions dels cultius cel·lulars s’han de fer en condicions d’esterilitat (dins de campanes de flux laminar). Totes les solucions que s’han d’utilitzar han de ser completament estèrils (autoclavades). Campana de flux laminar per a la manipulació de cèl·lules, i imatge d’una incubadora. Fonts: Cell culture basics: Handbook, Invitrogen-Gibco, By Life Technologies. Vertex.es. 4 Grau Medicina. UB. P1 BCBD En aquesta pràctica treballarem amb les cèl·lules hTERT-RPE-1 (RPE). Es tracta d’una línia epitelial de cèl·lules normals de retina humana, immortalitzades amb l’enzim telomerasa (hTERT). Imatge de cèl·lules RPE feta amb el microscopi òptic invertit de contrast de fases. Fonts: ATCC i todotelescopios.com Totes les línies cel·lulars creixen en un medi de cultiu que els proporciona les condicions necessàries per sobreviure i multiplicar-se. La formulació d’aquest medi depèn dels requeriments específics de cada línia, i actualment els adquirim comercialment. Els medis de cultiu s’han de suplementar amb sèrum animal fetal (per exemple, FBS), que aporta els factors de creixement, i amb antibiòtics, que eviten les contaminacions bacterianes. Els medis suplementats es conserven a 4 °C, però cal escalfar-los (amb una estufa a 37°C ) abans d’utilitzar-los. El medi de la línia RPE s’ha de canviar dos cops a la setmana i, quan el cultiu arriba a una confluència del 80 %, cal ressembrar les cèl·lules en una placa o flascó més gran, o bé diluir-les. Aquestes condicions també són específiques de cada línia cel·lular. En la part pràctica aprendrem aquest procediment. Composició del medi de cultiu per a cèl·lules RPE (DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Si arriba el moment en què ja no volem treballar més amb aquestes cèl·lules o que simplement en tenim moltes i en volem guardar una part per a un proper experiment, les congelarem. Les cèl·lules en cultiu es poden congelar i mantenir en nitrogen líquid (-195,8 °C ), i descongelar posteriorment, sense que perdin viabilitat. Els protocols que se segueixen en minimitzen els danys. CULTIUS CEL·LULARS BIDIMENSIONALS I TRIDIMENSIONALS Tradicionalment, les cèl·lules es feien créixer sobre una superfície plana (placa o flascó de plàstic), és a dir, en dues dimensions (bidimensionals 2D). Actualment, a més d’aquest sistema de cultiu, s’està estenent l’ús de matrius tridimensionals (3D) com a suport per al creixement de les cèl·lules. Aquestes matrius es componen d’extractes naturals de matriu extracel·lular, o bé de compostos artificials (o dels dos). La raó d’aquest plantejament és el fet que les cèl·lules en el cos de l’animal no creixen en superfícies planes i dures i, per tant, aquestes matrius tridimensionals proporcionen a les cèl·lules un ambient més semblant al natural. A més, en aquest tipus d’experiment, les cèl·lules mimetitzen millor la morfologia i el comportament que tenen en els teixits, i els resultats són més extrapolables a la realitat. 5 Grau Medicina. UB. P1 BCBD De totes maneres, els cultius en 2D no han desaparegut, perquè els cultius 3D tenen una alta complexitat tècnica i es perd capacitat de control de les condicions experimentals. Els cultius 2D es continuen utilitzant rutinàriament com a primera aproximació en molts estudis, els quals sí que es duen a terme en 3D en una segona fase. Cèl·lules tractades amb una droga: diferències segons si el cultiu és en 2D o en 3D. Imatge adaptada de: Shete et al., Journal of Biomedical Nanotechnology 10: 2014 SINCRONITZACIÓ D’UN CULTIU EN DIVERSES FASES DEL CICLE CEL·LULAR Hi ha diversos protocols i combinacions de mètodes per sincronitzar cèl·lules. En aquesta pràctica comentarem els més usuals. SINCRONITZACIÓ EN LA FASE G0 I POSTERIOR ACTIVACIÓ DEL CICLE CEL·LULAR Les cèl·lules normals aturen el seu creixement (deixen de proliferar) quan arriben a la confluència en el cultiu, o bé quan no hi ha factors de creixement en el medi. D’aquesta manera, les cèl·lules queden aturades en la fase G0 del cicle cel·lular, que permet sincronitzar-les (totes estaran a G0). Posteriorment, aquestes cèl·lules es poden tornar a activar i proliferar si s’afegeixen factors de creixement al medi de cultiu. Un percentatge elevat de cèl·lules avançaran sincrònicament (població homogènia) a través de les successives fases del cicle cel·lular. Malauradament, la sincronia del cultiu es va perdent a mesura que s’avança en el cicle i es requereixen altres protocols per tal d’obtenir poblacions ben sincronitzades en les fases S, G2 o M. Les cèl·lules RPE es dupliquen cada 24 hores. Per sincronitzar-les en la fase G0 del cicle cel·lular, es deixen créixer fins a una confluència d’entre un 80-100 % en medi de cultiu (DMEM) suplementat amb factors de creixement (10 % FBS). A continuació, se’ls canvia el medi per DMEM amb poc o sense sèrum (0,10,5 % FBS). Es deixen a la incubadora durant dos o tres dies per tal que totes les cèl·lules entrin en fase G0 per deprivació de sèrum i inhibició per contacte. Passat aquest temps, es ressembren amb menys densitat, i, en aquest cas, es posa DMEM + 10 % FBS. La presència dels factors de creixement del sèrum fa que les cèl·lules proliferin i entrin sincrònicament en la fase G1. Les RPE presenten un primer pic de síntesi de DNA amb un màxim a les 20 hores després d’haver afegit el 10 % de FBS. Cap a les 24 hores es detecta el pic màxim de cèl·lules en mitosi. 6 Grau Medicina. UB. P1 BCBD SINCRONITZACIÓ EN LA FASE G1/S Els dos protocols més utilitzats són els següents. A partir d’un cultiu de cèl·lules asincròniques a un 40 % de confluència, cal afegir: HIDROXIUREA (2 mM) durant 16 hores. Aquesta droga és un inhibidor de l’enzim ribonucleòtid reductasa, que bloqueja la síntesi de desoxiribonucleòtids, i la replicació del DNA s’atura. O bé: TIMIDINA (2 mM) durant 16 hores. La síntesi de DNA s’atura per excés de timidina. SINCRONITZACIÓ EN LA FASE DE MITOSI A partir d’un cultiu de cèl·lules asincròniques amb un 40 % de confluència, cal afegir-hi: NOCODAZOL (0,05 µg/ml) durant 18-20 hores. Aquesta droga és un inhibidor de la polimerització dels microtúbuls i, per tant, bloqueja la formació del fus mitòtic i la mitosi s’atura. 7 Grau Medicina. UB. P1 BCBD MODEL DE SINCRONITZACIÓ CEL·LULAR IN VIVO: REGENERACIÓ HEPÀTICA DESPRÉS DE PRACTICAR UNA HEPATECTOMIA PARCIAL (HP) EN RATA En el fetge adult sa, els hepatòcits (cèl·lules majoritàries del fetge) estan quiescents (en fase G0) i pràcticament no es divideixen, però continuen fent les seves funcions. En resposta a una HP en què s’extreu un 70 % de la massa hepàtica, el fetge romanent comença un procés de regeneració, que dura set dies, fins que recupera la massa perduda. Després de l’HP, els hepatòcits reprenen el cicle cel·lular de manera bastant sincrònica, i al cap de 23-24 hores, un 30 % es troben en fase S. Més tard, cap a les 2829 hores, hi ha un pic de mitosi. DETECCIÓ DE CÈL·LULES EN FASE S I M DETECCIÓ DE CÈL·LULES EN FASE S PER INCORPORACIÓ DE BROMODEOXIURIDINA (BrdU) Per detectar les cèl·lules en fase S d’un cultiu, s’incuben amb un compost anomenat BrdU, que és un nucleòtid sintètic anàleg a la timidina. Les cèl·lules que passen per la fase S durant el període de temps d’incubació amb BrdU, la van incorporant en el seu DNA perquè es troba en excés respecte a la timidina (per probabilitat). El DNA d’aquestes cèl·lules queda marcat amb BrdU, que detectarem mitjançant la tècnica de la immunocitoquímica o per citometria de flux, utilitzant anticossos específics contra la BrdU. Per detectar les cèl·lules en fase S en fetge regenerant de rata, se sotmet la rata a una HP i a les 23 hores, se li injecta BrdU. Una hora més tard, se sacrifica la rata i se n’extreu el fetge. Els hepatòcits que durant aquesta hora hagin estat en fase S, hauran incorporat la BrdU en el seu DNA i quedaran marcats. Posteriorment, el fetge es processa per ser sotmès a una immunohistoquímica amb anticossos específics contra la BrdU. En els dos casos podrem detectar el percentatge de cèl·lules que estan o han passat per la fase S durant el període d’incubació amb la BrdU (present en el medi en el cas d’un cultiu cel·lular, o injectada a la rata abans de sacrificar l’animal). També podrem detectar algunes de les cèl·lules en mitosi perquè els seus cromosomes estan marcats amb BrdU. DETECCIÓ DE CÈL·LULES EN FASE M MITJANÇANT TINCIÓ AMB HEMATOXILINA Per detectar fàcilment les cèl·lules en mitosi podem tenyir-les amb hematoxilina, tant si provenen d’un cultiu com si es tracta de fetge que s’està regenerant. Aquest colorant bàsic té afinitat pel DNA i ens permet visualitzar bé els cromosomes mitòtics que estan molt condensats. 8 Grau Medicina. UB. P1 BCBD (Imatges de microscòpia òptica preses amb augments diferents) Imatges fetes al Departament de Biomedicina, UB CITOMETRIA DE FLUX I FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter) La citometria de flux és una tecnologia que ens permet fer una anàlisi multiparamètrica ràpida de cèl·lules individualitzades en suspensió mitjançant uns aparells anomenats citòmetres de flux. MESURA DE LA QUANTITAT DE CÈL·LULES D’UN CULTIU QUE ES TROBEN EN CADASCUNA DE LES FASES DEL CICLE CEL·LULAR Posem l’exemple d’un experiment en què ens interessa, entre altres paràmetres, mesurar el nombre de cèl·lules que tenim en cadascuna de les fases del cicle cel·lular en un moment determinat. Incubarem les cèl·lules en suspensió amb iodur de propidi (IP). Aquest és un compost fluorescent que s’intercala en el DNA de manera proporcional al contingut de DNA de cada cèl·lula. Cal permeabilitzar les cèl·lules amb un detergent per possibilitar l’entrada de l’IP a través de la membrana plasmàtica. Posteriorment, les analitzarem amb el citòmetre de flux. En l’aparell, les cèl·lules (totes tenen el DNA marcat amb IP) viatjaran individualitzades en fila per dins d’un capil·lar. En un moment determinat, un làser les anirà il·luminant (una a una) i emetran fluorescència en una quantitat proporcional a l’IP que han incorporat en el seu DNA. La fluorescència de cada cèl·lula serà captada pel detector i mesurada per l’analitzador de l’aparell, respectivament. 9 Grau Medicina. UB. P1 BCBD Citòmetre de flux i histograma en què es representen el nombre de cèl·lules que es troben en cadascuna de les fases del cicle cel·lular segons la seva quantitat de DNA. Font: Alberts et al., Molecular Biology of the Cell. Garland Science, 2008. Com que el contingut de DNA d’una cèl·lula en G0 o G1 (2n) es duplica durant la fase S (2n-4n), el marcatge del DNA amb IP ens permetrà distingir entre les poblacions següents: G0/G1 vs. S vs. G2/M (2n vs. 2n - 4n vs. 4n). El contingut de DNA de cada cèl·lula individualment es pot representar en un histograma enfront del nombre total de cèl·lules, i això ens dona la informació sobre el percentatge en cadascuna de les fases del cicle cel·lular en aquell cultiu determinat. Hi ha un tipus de citometria de flux molt sofisticada que es duu a terme amb un aparell anomenat FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter). FACS es podria traduir al català com a «classificador de cèl·lules activades per fluorescència». Aquesta tecnologia permet seleccionar, classificar i separar (individualment en contenidors separats) cèl·lules d’una suspensió que conformen poblacions diferents segons les seves característiques fluorescents. Per exemple, volem separar les cèl·lules que estan en fase S d’un cultiu de les que no. Les cèl·lules han d’haver estat incubades un temps determinat amb BrdU, i només les que han passat per la fase S l’hauran incorporat al DNA. El procediment consisteix a incubar les cèl·lules en suspensió amb un anticòs que reconegui específicament unes cèl·lules, i no unes altres; en aquest cas amb l’anticòs anti-BrdU marcat amb un fluorocrom. Posteriorment les analitzarem amb el FACS. La primera fase és exactament igual a la que hem explicat pel citòmetre de flux convencional, i no la repetirem. Després de l’anàlisi de la fluorescència emesa per cada cèl·lula, un mecanisme d’ultrasons trenca el corrent líquid (que conté les cèl·lules) en petites gotes, de manera que la probabilitat que una gota contingui més d’una cèl·lula és baixíssima. L’aparell té un sistema que dona una càrrega positiva o negativa a les gotetes segons les mesures de fluorescència que s’han detectat en cada cèl·lula. Seguidament, aquestes gotes carregades se sotmeten a una diferència de potencial elèctric que les desvia a contenidors diferents segons la seva càrrega. 10 Grau Medicina. UB. P1 BCBD FACS: Fluorescence Activated Cell Sorter. Font: Alberts et al., Molecular Biology of the Cell. Garland Science, 2008. 11 Grau Medicina. UB. P1 BCBD PRÀCTICA 1- MANIPULACIÓ DE CULTIUS CEL·LULARS. RESSEMBRAR Aquest pas, que hauria de ser el primer, en aquesta pràctica es fa més tard per raons logístiques. Les cèl·lules amb què treballarem són les preparades pel grup de pràctiques del dia abans (o pel professor, si són dels grups del primer dia) perquè es requereix fer una incubació de 20 hores amb BrdU. Nosaltres prepararem les cèl·lules per al grup de l’endemà. CULTIVAR LES CÈL·LULES RPE EN PLAQUES P35 I INCUBAR AMB BrdU A dins d’aquestes plaques hi posarem el cobreobjectes de vidre (de 12 mm) perquè les cèl·lules hi creixin a sobre i puguem fer-hi després la immunocitoquímica. El medi de cultiu és DMEM/HAM’S-F-12 (HAM) enriquit amb factors de creixement (10 % FBS). Els volums que farem servir s’han calculat segons la mida de les plaques: P60 (53 mm diàmetre intern) o P35 (34 mm diàmetre intern). Partim d’una placa P60 de cèl·lules RPE asincròniques (80 % confluència) en medi DMEM/HAM/10 % FBS (preparada pel grup d’estudiants del dia anterior o pel professor o la professora). 1. Treure el medi amb una pipeta. 2. Rentar 1 o 2 cops amb PBS. 3. Posar 1 ml de tripsina per tal que aquesta proteasa trenqui les unions entre cèl·lules i entre cèl·lules i ECM (en aquest cas les cèl·lules consideren el plàstic de la placa com a ECM). La tripsina ha de cobrir tota la superfície de la placa. Cal esperar de 2 a 4 minuts fins que les cèl·lules es desenganxin. I s’ha d’anar controlant el procés amb el microscopi invertit de contrast de fases. 4. Una vegada les cèl·lules s’han desenganxat, cal aturar la reacció ràpidament: s’hi afegeix 1 ml de DMEM/HAM/10 % FBS (20 °C). Observeu que el volum del medi és igual al de la tripsina. El FBS 10 % conté molècules que inhibeixen l’activitat de la tripsina. Cal posar-hi la proporció 1:1 (volum medi 10 % FBS : volum de tripsina utilitzada). 5. Passar les cèl·lules a un tub de 50 ml (tubs que anomenem Falcon). 6. Afegir-hi 8 ml de DMEM/HAM/10 % FBS (el volum total al tub serà de 10 ml). 7. Afegir 30 L de BrdU (concentració final 3 g/mL; estoc: 1 mg/ml esterilitzada per filtració). 8. Repartir les cèl·lules en cinc plaques P35 (2 ml/placa) que contenen cobreobjectes (els ha posat abans la professora per guanyar temps). Seran per al grup de pràctiques de l’endemà. 9. Incubar les cèl·lules amb la BrdU durant 20 hores. 10. Recollir els cobreobjectes per detectar les cèl·lules que han passat per la fase S mitjançant immunocitoquímica. 12 Grau Medicina. UB. P1 BCBD 2- DETECCIÓ DE LA INCORPORACIÓ DE 5-BROMODEOXIURIDINA (BrdU) PER IMMUNOCITOQUÍMICA Les cèl·lules amb les quals treballem han estat incubades durant 20 hores amb BrdU (anàleg de la timidina) en cultiu asincrònic. Només aquelles cèl·lules que durant aquest temps hagin passat per la fase S l’hauran incorporat al seu DNA. 1. Treure el medi de cultiu (conté la BrdU) de la placa i fer dos rentats amb PBS. Aquest pas el fa abans la professora per guanyar temps. La professora reparteix dos cobreobjectes per alumne. Per tant, partim de dos cobreobjectes on han crescut les cèl·lules RPE durant 20 hores en presència de BrdU al medi de cultiu. Un dels cobreobjectes serà el control negatiu de l’experiment. Només l’incubarem amb el segon anticòs. 2. Fixar les cèl·lules amb etanol-acètic (95:5) durant 30 minuts. 3. Rentar tres cops amb PBS. 4. Incubar amb 2mM HCl 5-10 minuts. 5. Rentar tres cops amb PBS. 6. Incubar un cobreobjectes amb el primer anticòs (40 L/ cobreobjectes de 12 mm), i un altre amb PBS (control negatiu) durant una hora. La professora reparteix l’anticòs. 7. Rentar tres cops amb PBS. 8. Incubar 1 hora amb el segon anticòs conjugat amb peroxidasa a una dilució 1:50 en PBS. 9. Rentar tres cops amb PBS. 10.Revelar amb DAB (diaminobencidina). El DAB és cancerigen i s’ha d’inactivar amb lleixiu abans de llençar. La solució que conté el DAB la prepara i reparteix la professora per restringir-ne la manipulació: 500 L DAB + 50 L H2O2 + 50 ml PBS. 11.Deixar pujar el color (marró) durant 5-10 minuts. 12.Rentar tres cops amb PBS. 13.Tenyir breument les cèl·lules amb hematoxilina (color lilós) per marcar tots els nuclis (30 segons). 14.Rentar tres cops amb PBS. 15.Rentar molt breument amb aigua destil·lada. 16. Muntar la preparació posant una gota (6 L) d’un medi de muntatge hidrosoluble (glicerol: aigua [9:1]) en un portaobjectes, i col·locar el cobreobjectes amb les cèl·lules a sobre (cap per avall). 17.Observar les preparacions pel microscopi. 13 Grau Medicina. UB. P1 BCBD 3- OBSERVACIÓ DE PREPARACIONS AMB EL MICROSCOPI ÒPTIC I. PREPARACIÓ DE CÈL·LULES INCUBADES AMB BrdU Immunocitoquímica amb anticossos anti-BrdU de cèl·lules que han estat incubades amb BrdU abans de fixar-les. 1) Observa els nuclis marcats amb BrdU (de color marró). a) A quines cèl·lules corresponen? b) Quin és el percentatge aproximat de cèl·lules marcades? c) Per què? 2) Si es tractés d’un cultiu de cèl·lules incubades amb BrdU durant quatre hores: a) Quin seria el percentatge aproximat de cèl·lules marcades? b) Per què? 3) Observa si hi ha cèl·lules marcades que es trobin en diferents estadis de la mitosi. Pots distingir alguna fase de la mitosi en concret? 4) Observa els nuclis marcats amb hematoxilina (de color lilós). II. a) Quin és el percentatge aproximat de cèl·lules marcades? b) Per què hi ha aquest percentatge tan elevat? c) Per què hem tenyit amb hematoxilina? PREPARACIÓ DE FETGE REGENERANT DE RATA 24 HORES DESPRÉS DE L’HP Immunohistoquímica amb anticossos anti-BrdU. La BrdU se li va injectar a la rata quatre hores abans de sacrificar-la. Quin és el percentatge aproximat de cèl·lules marcades? Per què? III. PREPARACIÓ DE FETGE REGENERANT DE RATA 26 HORES DESPRÉS DE L’HP Tinció amb hematoxilina. a) Es poden detectar cèl·lules en mitosi? b) Per què? c) Quines fases de la mitosi pots diferenciar? 4- OBSERVACIÓ DE CULTIUS CEL·LULARS AMB EL MICROSCOPI ÒPTIC INVERTIT DE CONTRAST DE FASES 14 Grau Medicina. UB. P1 BCBD 1) Cultius de cèl·lules normals immortalitzades: creixen adherides a la placa i formen una monocapa cel·lular. 2) Cultius de cèl·lules transformades que provenen d’un tumor sòlid: creixen adherides a la placa, formen agregats entre si i creixen unes a sobre de les altres. 3) Cultius de cèl·lules transformades que provenen d’un càncer de cèl·lules sanguínies: creixen en suspensió i formen, en alguns casos, petits agregats. 4) Cultiu en 3D de cèl·lules transformades que provenen d’un càncer colorectal humà: En aquest cas, a causa de la complexitat i la fragilitat d’aquest tipus de cultiu, s’observen aquestes imatges: o o Fotografia feta amb microscòpia òptica de contrast de fases d’un cultiu 3D viu. Fotografia d’un cultiu 3D fixat i posteriorment analitzat per immunocitoquímica amb anticossos anti-E caderina (verd), i en què s’han marcat l’actina polimeritzada amb fal·loïdina (vermell) i els nuclis amb DAPI (blau). Cultiu cel·lular, 3D Microscòpia òptica de contrast de fases Cultiu cel·lular, 3D Immunocitoquímica anti E-caderina (verd) Actina polimeritzada marcada amb fal·loïdina (vermell) Nuclis marcats amb DAPI (blau) Imatges d’un cultiu 3D de cèl·lules humanes de càncer colorectal. S. Brun. Dept. de Biomedicina, UB 15 Grau Medicina. UB. P1 BCBD Comentaris: 16