IDENTIFICACIÓN DE LA BASE GENÉTICA DE LAS ENFERMEDADES HUMANAS PDF

Tema 9 IDENTIFICACIÓN DE LA BASE GENÉTICA DE LAS ENFERMEDADES HUMANAS 1  La identificación de los genes particulares implicados en las enfermedades, y de las variantes que contienen que subyacen o contribuyen a las enferme...

Tema 9 IDENTIFICACIÓN DE LA BASE GENÉTICA DE LAS ENFERMEDADES HUMANAS 1  La identificación de los genes particulares implicados en las enfermedades, y de las variantes que contienen que subyacen o contribuyen a las enfermedades humanas, se realiza de tres formas: 1. Análisis de ligamiento, que tiene como base la familia, y que hace uso de genealogías familiares. 2. Análisis de asociación, que tiene como base la población. Aprovecha toda la historia de una población para buscar una frecuencia aumentada o disminuida de un alelo o de un conjunto de alelos en particular, en una muestra de individuos afectados extraída de la población y comparada con un grupo control de individuos no afectados de esa misma población. Es particularmente útil para enfermedades complejas que no muestran un patrón de herencia mendeliana. 3. Secuenciación directa del genoma de individuos afectados y de sus progenitores y/o de otros individuos de la familia o de la población 2  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación Una característica fundamental de la biología humana es que cada generación se reproduce a través de la combinación de gametos haploides que contienen 23 cromosomas, derivados de la recombinación de los cromosomas homólogos. Durante la meiosis I, los cromosomas homólogos se alinean en pares a lo largo del huso meiótico, y las cromátidas intercambian material genético. 3  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación Al final de la meiosis I habrá tanto cromátidas recombinantes como parentales o no recombinantes. 4  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación Meiosis I Las cromátidas segregan en la meiosis II y cada una termina en un gameto diferente. Meiosis II Gameto Gameto Gameto parental Gameto parental recombinante recombinante 5  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación A consecuencia de lo anterior: 1. Los alelos en loci de diferentes cromosomas se distribuyen de forma independiente. 6  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación 2. La combinación de alelos presentes en dos loci de una misma cromátida puede cambiar cuando hay un entrecruzamiento entre cromátidas no hermanas, siempre que el punto de corte y recombinación se sitúe entre los loci. A A a a A A a a B B b b B b B b La probabilidad de que haya un entrecruzamiento entre dos loci de una cromátida aumenta con la distancia entre los loci. 7  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación 3. Si la distancia entre dos loci de un cromosoma es muy pequeña, la probabilidad de recombinación entre ellos será muy baja y en este caso se dice que los loci están ligados. A A a a A A a a B B b b B B b b 8  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación Haplotipo Se denomina haplotipo a cualquier combinación de alelos de distintos loci de un mismo cromosoma. La recombinación meiótica genera nuevos haplotipos si se produce entre los loci correspondientes. 9  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación Ligamiento Cuando dos genes se encuentran en el mismo cromosoma y muy cerca uno de otro, los fenómenos de recombinación meiótica entre ellos son muy raros, y se transmiten realmente como una sola unidad. En este caso se dice que entre estos genes hay ligamiento completo. En este caso los haplotipos o combinación de alelos de estos genes se transmite sin cambios de generación en generación. A medida que aumenta la distancia entre dos genes de un mismo cromosoma la probabilidad de que haya recombinación meiótica entre ellos aumenta. Si la distancia entre dos loci es muy grande, la probabilidad de entrecruzamiento meiótico entre ellos será muy alta, y las proporciones de gametos no recombinantes o parentales y recombinantes se aproximará a 50:50, al igual que si los loci estuviesen en cromosomas distintos. 10  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación Genes ligados y no ligados La frecuencia con la que forman cromosomas recombinantes en la meiosis da una medida de la localización relativa de los genes en el cromosoma. 11 La aparición de variantes en las combinaciones de alelos de genes de un mismo cromosoma depende de los puntos del cromosoma en los que se produzcan fenómenos de recombinación meiótica. Recombinación distal al centrómero genera solo gametos parentales Recombinación entre centrómero y genes genera solo gametos parentales Recombinación entre genes genera gametos parentales y recombinantes. Recombinación distal al centrómero y a los genes genera solo gametos parentales. 12 Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación 13  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación Recombinación Si se consideran dos loci de un mismo cromosoma, en una meiosis se producirán como máximo un 50% de cromátidas recombinantes y un mínimo de un 50% de cromátidas parentales respecto a estos loci. La recombinación proporciona un enorme potencial de variación genética, produciendo gran cantidad de gametos diferentes. 14  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación Frecuencia de recombinación La frecuencia de entrecruzamiento entre dos loci de un cromosoma es proporcional a la distancia que los separa, denominada distancia interlocus. A medida que aumenta la distancia entre dos genes, aumenta la proporción de gametos recombinantes. Esta correlación sirve de base para la construcción de mapas cromosómicos, que indican las posiciones relativas de los genes en los cromosomas. La frecuencia de recombinación variará dependiendo de la distancia entre los dos genes. Este fenómeno fue explicado por primera vez en 1911 por dos genetistas de Drosophila, Thomas H. Morgan y su alumno Alfred H. Sturteva. 15  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación Cálculo de la frecuencia de recombinación Para medir el ligamiento cuantitativamente, podemos calcular la frecuencia de recombinación (FR) : La frecuencia de recombinación es del 50% para genes (o loci en general) que se encuentran en cromosomas diferentes, o que están muy distanciados en el mismo cromosoma. En ese caso se dice que los loci en cuestión no están ligados. Si la frecuencia de recombinación entre dos loci es de menos del 50% se dice que 16 están ligados.  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación Recombinación entre dos loci (1 y 2) del mismo cromosoma.A, Los loci en cuestión están muy apartados y es probable que haya entrecruzamiento entre ellos en cada meiosis. Habrá recombinación en el 50% de los cromosomas resultantes de la meiosis. B, Los loci están tan cerca que no se observa un entrecruzamiento entre ellos, con independencia de la presencia de entrecruzamientos en otras zonas del cromosoma. C, Los loci están cerca en el mismo cromosoma, pero lo suficientemente lejos como para que ocurra entrecruzamiento entre ellos en el intervalo entre los dos loci en algunas meiosis, pero en menos del 50%. Menos de la mitad de los cromosomas formados en la meiosis serán 17 recombinantes.  Base genética para el análisis de ligamiento y de asociación Una frecuencia de recombinación del 1% (1 centimorgan) equivale a 1 millón de pares de bases aproximadamente. Los loci situados a menos de 1 millón de pares de bases presentan frecuencias de recombinación inferiores al 1%. En la especie humana, hay por término medio de 2 a 4 fenómenos de recombinación por cada par de cromosomas homólogos. 18  Equilibrio y desequilibrio de ligamiento Suponemos dos loci (1 y 2) presentes en el mismo cromosoma. El locus 1 tiene dos alelos en la población (A y a), presentes con la misma frecuencia: frec(A) = 0,5 frec(a) = 0,5 El locus 2 tiene también dos alelos en la población: S (causante de enfermedad) y s (no causa enfermedad), de modo que las frecuencias son: frec(S)= 0,1 frec(s)=0,9 Hay cuatro haplotipos o combinaciones de alelos posibles: A-S, A-s, a-S, a-s 19  Equilibrio y desequilibrio de ligamiento Cuando las frecuencias en las que aparecen los haplotipos son las esperadas a partir de las frecuencias alélicas correspondientes, por combinarse de forma aleatoria, se dice que hay equilibrio de ligamiento. En este caso, la frecuencia de un haplotipo es igual al producto de las frecuencias de los alelos que lo forman. Frecuencias alélicas locus 2 frec(S)=0,1 frec(s)=0,9 Frecuencias frec(A)=0,5 frec (A-S)=0,05 frec(A-s)=0,45 alélicas locus 1 frec(a)=0,5 frec(a-S)=0,05 frec(a-s)=0,45 20  Equilibrio y desequilibrio de ligamiento Cuando las frecuencias en las que aparecen los haplotipos divergen de lo esperado, y no son iguales al producto de las frecuencias alélicas, se dice que hay desequilibrio de ligamiento, y se produce porque la recombinación entre los loci 1 y 2 es limitada por su proximidad física en el mismo cromosoma. Frecuencias alélicas locus 2 frec(S)=0,1 frec(s)=0,9 Frecuencias frec(A)=0,5 frec (A-S)=0 frec(A-s)=0,5 alélicas locus 1 frec(a)=0,5 frec(a-S)=0,1 frec(a-s)=0,4 21  Análisis de ligamiento Análisis de ligamiento, en el que la base es la familia. El análisis de ligamiento saca partido de manera explícita a las genealogías familiares para seguir la herencia de una enfermedad entre los miembros de una familia, y para analizar la presencia constante y repetida de una herencia conjunta de la enfermedad junto con alelos de marcadores determinados. Cuando un alelo determinado de un marcador que presente diversos alelos (p. ej. un SNP con dos alelos), se transmite junto con el alelo causante de una enfermedad, es porque el marcador está en el mismo cromosoma y físicamente próximo a la mutación patogénica. De lo contrario, la recombinación meiótica generaría haplotipos en los que el alelo patogénico se podría encontrar en el mismo cromosoma con cualquiera de los alelos del SNP, con frecuencias similares a las frecuencias de los alelos del SNP en la población. De este modo, el análisis de ligamiento permite localizar la posición en el genoma del gen cuya mutación se relaciona con una enfermedad hereditaria. 22  Análisis de ligamiento Los marcadores de DNA usados en análisis de ligamiento han de tener secuencia y localización genómica conocidas, y deben ser polimórficos, es decir, deben presentar diversos alelos para que puedan detectarse fenómenos de recombinación. Entre los marcadores usados en análisis de ligamiento se distinguen: Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphisms). Microsatélites. SNPs. 23  Análisis de ligamiento En la siguiente genealogía con transmisión de la neurofibromatosis de tipo 1 (NF1), se ha genotipado para cada persona un SNP con dos alelos (1 y 2) que, al igual que el gen NF1, está situado en el cromosoma 17. Los genotipos de SNP se indican debajo del número de cada individuo en la genealogía. 24  Análisis de ligamiento El examen de las generaciones I y II nos permite determinar que, suponiendo que haya ligamiento entre NF1 y el SNP, la mutación causante de enfermedad del gen NF1 debe estar en la misma copia del cromosoma 17 que el alelo 1 del SNP en esta familia. El individuo I-2, que es homocigoto para el alelo 2, no está afectado por la enfermedad. Solo el padre afectado (I-1), que es un heterocigoto para el SNP, podría haber transmitido una copia del cromosoma 17 que contiene tanto el alelo de la enfermedad NF1 como el alelo 1 del SNP a la hija (II-2). 25  Análisis de ligamiento El ordenamiento de estos alelos en cada cromosoma se denomina fase de ligamiento. Los haplotipos del individuo II-2 son N1/n2 , donde N indica el alelo mutado causante de NF1, n aquí es el alelo normal, y 1 y 2 son los dos alelos del SNP. Por tanto, el individuo II-2 tiene una copia del cromosoma 17 que contiene tanto la mutación causante de la enfermedad N como el alelo 1 del SNP, y su otra copia del cromosoma 17 contiene el alelo normal n y el alelo 2 del SNP. 26  Análisis de ligamiento El esposo de esta mujer (individuo II-1) no está afectado por la enfermedad y es homocigoto para el alelo 2 del SNP, por lo que debe tener los haplotipos n2/n2. Si el locus NF1 y el SNP están ligados, los hijos de esta unión que están afectados por NF1 deberían tener normalmente el alelo 1 del SNP y los no afectados, el alelo 2. Esto se cumple en siete de los ocho hijos de la generación III. En un caso se ha producido una recombinación (individuo III-6). Esto arroja una frecuencia de recombinación de 1/8 o del 12,5%, lo que respalda la hipótesis del ligamiento entre NF1 y el SNP. 27  Análisis de ligamiento Aunque 1 cM (1% de recombinación) corresponde aproximadamente a un millón de pares de bases (1 Mb) de DNA, esta relación es aproximada y hay factores que afectan a la probabilidad de recombinación entre dos loci: 1. Los entrecruzamientos son un 50% más frecuentes durante la ovogénesis que durante la espermatogénesis. 2. Los entrecruzamientos tienden a ser especialmente frecuentes cerca de los telómeros de los cromosomas. 3. Algunas regiones cromosómicas pequeñas (de pocos kb) muestran tasas de entrecruzamiento más de 10 veces superiores a las de cualquier otro lugar del genoma. El genoma humano contiene miles de estos puntos calientes de recombinación (recombination hot spots ), que suponen más de la mitad de todos los eventos de recombinación. 28  Análisis de asociación El análisis de asociación tiene como base la población. Se busca una frecuencia aumentada o disminuida de un alelo o de un conjunto de alelos de diversos marcadores (p. ej. SNPs), en una muestra de individuos afectados por una enfermedad extraída de la población, y comparada con un grupo control de individuos no afectados de esa misma población. Se trata de hallar determinados alelos que se asocian con una enfermedad. Este método es más adecuado para descubrir las contribuciones genéticas a enfermedades con herencia compleja. La presencia de un alelo particular en un locus con una mayor o menor frecuencia en los individuos afectados, en comparación con los controles, se denomina asociación con la enfermedad. 29  Análisis de asociación Los análisis de asociación se hacen considerando 1 millón de SNPs distribuidos por todo el genoma (genome-wide association studies o GWAS). Se analiza la asociación de los distintos alelos de los SNPs considerados con la enfermedad de interés. La asociación de un alelo con la enfermedad indica que el SNP correspondiente se encuentra próximo a la mutación patogénica. 30  Análisis de asociación En los GWAS hay que genotipar cada uno de los SNPs considerados, lo que puede hacerse con micromatrices (arrays) de hibridación de DNA. 31  Diseño de un estudio de asociación Los estudios de asociación pueden ser de dos tipos: 1. Estudios de casos y controles: los individuos que tienen la enfermedad se seleccionan en una población, y después se selecciona un grupo correspondiente de controles sin la enfermedad y se determinan los genotipos de los individuos de los dos grupos, que se usan para elaborar una tabla de dos por dos. 2. Estudios transversales o de cohortes. Se escoge una muestra aleatoria de toda la población y se analiza para determinar si tiene (transversal) o si, después de un seguimiento a lo largo del tiempo, desarrolla (cohortes) una enfermedad particular; se determinan los genotipos de todas las personas en la población del estudio. 32  Secuenciación directa del genoma Se puede realizar una secuenciación directa del genoma de individuos afectados y de sus progenitores y/o de otros individuos de la familia o de la población. Este método es especialmente útil para los trastornos mendelianos raros en los que el análisis de ligamiento no es posible porque simplemente no hay bastantes familias de este tipo en las que realizar el análisis o porque el trastorno es genéticamente letal que siempre se origina por nuevas mutaciones y nunca se hereda. 33  Secuenciación directa del genoma Esquema de filtrado representativo para descartar los millones de variantes detectadas en la secuenciación completa de los genomas de una familia formada por dos padres no afectados y un niño afectado, hasta seleccionar un pequeño número de variantes cuya relevancia biológica y patológica puede ser evaluada. 34  Secuenciación directa del genoma La enorme colección de variantes inicialmente detectada es sometida a filtros que descartan variantes que es poco probable que sean causantes de la enfermedad, asumiendo que las variantes de interés se encuentran cerca de un gen, alteran su función, y son raras. Con los genes candidatos que superan los filtros se evalúa si la herencia de las variantes del gen se ajusta al patrón de herencia de la enfermedad (en este caso autosómico recesivo). 35  Secuenciación directa del genoma También se evalúa si tiene sentido biológico el que una variante en el gen candidato pueda ser causante del fenotipo observado. Y se comprueba si otros individuos afectados por la enfermedad en cuestión tienen también mutaciones en ese gen. 36