Tema 5 Genética PDF

Tema 5 CITOGENÉTICA CLÍNICA Y ANÁLISIS GENÓMICO 1  CITOGENÉTICA CLÍNICA Y ANÁLISIS GENÓMICO El estudio de los cromosomas, su estructura y su herencia corresponde a la citogenética clínica en cuanto a su aplicación en la medicina. Cambios e...

Tema 5 CITOGENÉTICA CLÍNICA Y ANÁLISIS GENÓMICO 1  CITOGENÉTICA CLÍNICA Y ANÁLISIS GENÓMICO El estudio de los cromosomas, su estructura y su herencia corresponde a la citogenética clínica en cuanto a su aplicación en la medicina. Cambios en el número o la estructura de los cromosomas pueden producir trastornos clínicos, denominados trastornos cromosómicos. El análisis genómico se usa para buscar alteraciones que van más allá de alteraciones numéricas o estructurales detectables mediante métodos de citogenética clínica clásica. El análisis genómico utiliza métodos como las micromatrices cromosómicas y la secuenciación del genoma completo. 2 Niveles de resolución para distintas técnicas de análisis citogenético y genómico. La técnica más resolutiva es la secuenciación. 3 Los trastornos cromosómicos son responsables de problemas reproductivos, malformaciones congénitas y discapacidad intelectual, y desempeñan un importante papel en la patogenia del cáncer. Para el análisis cromosómico por motivos clínicos, las células tienen que ser capaces de proliferar en cultivo, condición que, en células accesibles, se da en los leucocitos de la sangre, en especial en los linfocitos T. 4 Básicamente, el procedimiento es: 1. Obtener una muestra de sangre periférica. 2. Recoger los leucocitos y colocar en un medio de cultivo tisular. Estimularlos para que se dividan. 3. Tras unos días, detener las células en metafase mediante agentes químicos inhibidores del huso mitótico. 4. Tratar con solución hipotónica que libera los cromosomas; fijar; extender sobre portaobjetos y teñir. 5 Mientras los cultivos de leucocitos duran poco (3-4 días), hay otros tipos celulares permiten cultivos más duraderos, e incluso pueden almacenarse, permitiendo el uso de estudios adicionales: Fibroblastos obtenidos mediante biopsias de piel. Leucocitos de la sangre transformados a células linfoblastoides inmortales por infección con el virus de Epstein-Barr. Células procedentes de biopsias de médula ósea ,que contiene una elevada proporción de células en división, aunque es un método invasivo. Amniocitos, que son células fetales obtenidas del líquido amniótico o biopsia de las vellosidades coriónicas. 6 7 8 Identificación de cromosomas mediante técnicas citogenéticas La tinción de Giemsa permite distinguir bandas más oscuras, ricas en A y T, que corresponden a heterocromatina (no se transcribe), y bandas más claras, ricas en C y G y correspondientes a regiones que se transcriben. Según la posición del centrómero se distinguen cromosomas metacéntricos, submetacéntricos y acrocéntricos; también telocéntricos, pero no en cariotipos humanos normales. Los cromosomas 13, 14, 15, 21 y 22 poseen DNA satélite, que es DNA repetitivo que se encuentra en el extremo del cromosoma y que está separado del resto por una constricción secundaria. Los satélites contienen genes del rRNA 18S y 28S. 9 10  CITOGENÉTICA CLÍNICA Y ANÁLISIS GENÓMICO La tinción de Giemsa permite detectar de 400 a 800 bandas en un cariotipo haploide, dependiendo del grado de compactación de los cromosomas. En los ideogramas se representan las cromátidas hermanas muy próximas, indistinguibles. Los centrómeros separan los brazos p (corto) y largo (q) y se consideran constricciones primarias. 11  CITOGENÉTICA CLÍNICA Y ANÁLISIS GENÓMICO Patrón de bandas G de los cromosomas 5, 6 y 7. 12 Análisis cromosómico de alta resolución. Para aumentar la sensibilidad del análisis cromosómico, se usa el método de bandeo de alta resolución (también denominado bandeo de prometafase) mediante la tinción de los cromosomas que se han obtenido en una etapa precoz de la mitosis (profase o prometafase), cuando todavía están en un estado relativamente descondensado. Está indicado cuando se sospecha la existencia de una pequeña anomalía estructural en un cromosoma. Posibilitó descubrir varios síndromes de microdeleción causados por deleciones o duplicaciones genómicas menores en el rango de tamaño de 2-3 Mb. 13 Ideogramas y microfotografías electrónicas de cromosomas en estado de metafase, prometafase y profase (de izquierda a derecha). 14 Hibridación in situ fluorescente (FISH) A principios de los años 90 se desarrolló la técnica FISH. Detecta la presencia o ausencia de una secuencia particular de DNA y evalúa el número o la organización de un cromosoma o de una región cromosómica in situ, es decir, en la misma la célula. Como sondas se utilizan secuencias de DNA humano específicas para detectar la región correspondiente del genoma en preparaciones cromosómicas o en núcleos en interfase. También se utilizan sondas de DNA repetitivo de regiones cromosómicas específicas. Las sondas de repeticiones centroméricas se utilizan para determinar el número de copias de un determinado cromosoma. 15 Arriba: FISH realizado con sondas específicas de DNA de copia única que hibrida con las bandas 4q12 (rojo) y 4q31.1 (verde). Abajo: FISH realizado con sondas de DNA satélite alfa que hibrida con los centrómeros de cromosomas 18 (azul), X (verde) e Y (rojo) 16  Análisis genómico EI análisis molecular del genoma, incluida la secuenciación del genoma completo, se puede llevar a cabo sobre cualquier material clínico apropiado, siempre y cuando sea posible obtener DNA de buena calidad. No es necesario que las células estén en fase de división, y se pueden usar muestras de tejidos, tumores, y sangre periférica. Análisis genómico mediante micromatrices Se analiza simultáneamente todo el genoma representado como una matriz ordenada de segmentos genómicos en un portaobjetos microscópico que contiene distintos segmentos de DNA que representan todo el genoma. En un método basado en la hibridación genómica comparativa (CGH), se detectan las ganancias y pérdidas del número relativo de copias en el genoma completo mediante la hibridación de dos muestras (un genoma de control y una de un paciente) con estas micromatrices. 17  Análisis genómico mediante micromatrices A, Esquema de un análisis de matriz basado en hibridación genómica comparativa (CGH), donde el genoma de un paciente (color verde) se fragmenta, se marca con un fluoróforo, y se co-hibrida en la matriz con un genoma de referencia fragmentado y marcado con un fluoróforo diferente (color rojo). Las preparaciones de DNA marcado se mezclan, y se dejan hibridar con sus secuencias complementarias en la matriz. Se miden las señales de ambos fluoróforos. 18  Análisis genómico mediante micromatrices A, Si una región del genoma presenta una ganancia en el genoma del paciente respecto a la muestra de referencia, la posición correspondiente de la matriz emitirá más fluorescencia verde que roja. Si una región del genoma del paciente ha sufrido una deleción con pérdida de material genético, la posición correspondiente de la matriz emitirá más fluorescencia roja que verde, y si no ha habido pérdida ni ganancia de material genético, las intensidades verde y roja serán similares (color amarillo). 19  Análisis genómico mediante micromatrices B, Resultado típico donde se representa el logaritmo de la relación de intensidades de ambas fluorescencias en distintas regiones del genoma. C, Resultado de un ensayo de hibridación genómica comparada (CGH) en matriz, que indica una duplicación de alrededor de 800 kb en la banda Xq28. 20 Análisis genómico mediante micromatrices 21 Análisis genómico mediante micromatrices 22  Análisis genómico mediante secuenciación del genoma completo Dada la eficacia actual de la secuenciación de genomas completos y la disminución de sus costes, cada vez resulta más práctico plantear la secuenciación de muestras de pacientes en un contexto clínico. Para detectar anomalías numéricas de un cromosoma entero, no suele ser necesario secuenciar por completo un genoma; incluso un número limitado de secuencias correspondientes a un cromosoma particular de interés debería mostrar si esas secuencias se encuentran en el número esperado (p. ej., equivalente a dos copias por genoma diploide para un autosoma) o si están sobrerrepresentadas o infrarrepresentadas significativamente. 23 En la secuenciación del genoma de un paciente, la aparición de múltiples secuencias del cromosoma rojo indica una aneuploidía o alteración del número normal de cromosomas. 24 Sin embargo, para detectar reordenamientos equilibrados del genoma, en los que no se gana ni se pierde DNA, se requiere una secuencia genómica más completa. En este caso, se encuentran secuencias raras que corresponden a dos regiones diferentes y normalmente no contiguas en la secuencia de referencia (en el mismo cromosoma o en cromosomas diferentes). Este método se ha utilizado para identificar reordenamientos genómicos implicados en algunos tipos de cáncer, y translocaciones causantes de defectos congénitos. 25 La aparición de secuencias que evidencian la fusión de dos regiones cromosómicas distintas que normalmente se encuentran distantes indica la existencia de una translocación cromosómica. 26  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Las anomalías cromosómicas pueden ser numéricas o estructurales, pudiendo afectar a uno o varios cromosomas autosómicos, sexuales o ambos. En la imagen de la derecha, incidencia de anomalías cromosómicas en recién EE nacidos. 27  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS EE 28  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Dosis génica, equilibrio y desequilibrio. En los trastornos cromosómicos y genómicos, las enfermedades asociadas se producen por aspectos cuantitativos de la expresión génica. Por el contrario, en los trastornos monogénicos la patogenia se relaciona con aspectos cualitativos de la función de un gen. Anomalías del número de cromosomas. Heteroploide: número de cromosomas ≠ 46. Euploide: número de cromosomas múltiplo de 23 (dotación haploide). Es el caso de la triploidía (3n) y tetraploidía (4n). La triploidía suele ser resultado de la fecundación de un óvulo con dos espermatozoides (dispermia). Otros casos se deben a fallos en una de las divisiones meióticas en cualquiera de los progenitores, que producen un óvulo o un espermatozoide diploide. Los tetraploides son siempre 92,XXXX o 92,XXYY, y se deben probablemente a un fallo de la finalización de una división temprana del cigoto. EE Aneuploide: el número de cromosomas no es múltiplo de 23. Es el trastorno cromosómico humano más común y el de mayor importancia clínica. La mayoría de los pacientes aneuploides presenta una trisomía (tres copias de un cromosoma) o, con menos frecuencia, una monosomía (una sola copia). Ambas pueden ocasionar consecuencias fenotípicas graves. 29  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Aunque se puede producir una trisomía de cualquier parte del genoma, la trisomía de todo un cromosoma suele ser incompatible con la vida. La trisomía más frecuente en nacidos vivos es la trisomía 21, síndrome de Down, cariotipo 47,XX + 21 o 47,XY + 21. Otras trisomías observadas en nacidos vivos son la trisomía 18 y la trisomía 13. Es debido a que los autosomas 13, 18 y 21 son los tres cromosomas con un número menor de genes, por lo que sus respectivas trisomías suponen un exceso de expresión génica más limitado que las trisomías de otros cromosomas. No se conocen, por ejemplo, casos de nacidos vivos con trisomía 1. La monosomía EE de todo un cromosoma es casi siempre letal, aunque una importante excepción es la monosomía del cromosoma X, que causa el síndrome de Turner. 30  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Detección de una trisomía en una célula en interfase mediante FISH Un cromosoma se encuentra por triplicado y otro en número de copias normal (dos) EE 31  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS No disyunción meiótica Las aneuploidías suelen deberse a no disyunción meiótica. Se trata de un fallo en la separación de un par de cromosomas durante una de las dos divisiones meióticas, en general durante la meiosis l. Las consecuencias genómicas de la no disyunción durante la meiosis I o la meiosis ll son diferentes. EE 32  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS No disyunción meiótica Cuando la no disyunción se produce en la meiosis I la mitad de los gametos tiene dos copias (una parental y otra maternal) del cromosoma afectado y la otra mitad no tiene ninguna. Cuando la no disyunción se produce en la meiosis II un 25% de los gametos producidos contiene dos copias del mismo cromosoma (parental o maternal), la mitad de los gametos son normales y el 25% no tiene cromátida. EE 33  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Anomalías cromosómicas estructurales Son consecuencia de rotura y recombinación anómala, y pueden ser de dos tipos: Reordenamientos desequilibrados, con pérdida o ganancia de material genético: deleciones y duplicaciones, cromosomas marcadores y en anillo, isocromosomas, cromosomas dicéntricos. Reordenamientos equilibrados, en los que el genoma tiene el complemento cromosómico normal, sin pérdida o ganancia de material genético: translocaciones recíprocas e inversiones (paracéntricas, pericéntricas). EE 34  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS A, Deleciones terminales e intersticiales, cada una generando un fragmento acéntrico que se pierde normalmente. B, Duplicación de un segmento cromosómico, que conduce a trisomía parcial. C, Cromosoma en anillo con dos fragmentos acéntricos. D, Generación de un isocromosoma para el brazo largo de un cromosoma. Los isocromosomas tienen dos brazos idénticos (dos brazos p o dos q de un cromosoma) 35  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS E, Translocación robertsoniana entre dos cromosomas acrocéntricos, lo que con frecuencia conduce a un cromosoma pseudodicéntrico (dos centrómeros, pero uno solo activo), que tiene los brazos largos de los dos cromosomas acrocéntricos que participan en la translocación. F, Translocación recíproca entre dos cromosomas, con intercambio de los segmentos translocados. 36  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS A, Translocación equilibrada entre dos cromosomas, con intercambio recíproco entre la parte distal de los brazos largos de los cromosomas A y B, con formación de cromosomas derivados. B, Formación de un cuadrivalente en la meiosis I, necesario para alinear segmentos homólogos de los dos cromosomas derivados y Los cuadrivalentes pueden dar lugar a la formación de sus homólogos de gametos desequilibrados. normales. 37  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Patrones de segregación Adyacente-1 Alternante Adyacente-2 en un portador de una translocación, lo que produce gametos equilibrados o desequilibrados, que se muestran en la parte Desequilibrado Desequilibrado Normal Equilibrado Desequilibrado Desequilibrado inferior. La segregación adyacente- 1 (en rojo, cromosomas superiores a un gameto, cromosomas inferiores al otro) solo conduce a gametos desequilibrados. 38  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Adyacente-1 Alternante Adyacente-2 La segregación adyacente-2 (en verde, cromosomas izquierdos a un gameto, derecho cromosomas al otro) también conduce solo a gametos desequilibrados. Desequilibrado Desequilibrado Normal Equilibrado Desequilibrado Desequilibrado Solo la segregación alternante (en gris, cromosoma superior izquierdo / inferior derecho a un gameto, inferior izquierdo / superior derecho a otro gameto) puede conducir a gametos equilibrados. 39  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Translocaciones robertsonianas Son el reordenamiento más frecuente en el ser humano. En este proceso dos cromosomas acrocéntricos se fusionan cerca de sus regiones centroméricas y pierden los brazos cortos. Las translocaciones robertsonianas son no recíprocas, y el cariotipo resultante tiene sólo 45 cromosomas, incluido el cromosoma translocado , compuesto por los brazos largos de dos cromosomas acrocéntricos. Los brazos cortos de los cinco pares de cromosomas acrocéntricos contienen DNA satélite y cientos de copias de genes de RNA ribosómico, por lo que la pérdida de los brazos cortos de dos cromosomas acrocéntricos no es perjudicial, y el cariotipo resultante se considera equilibrado aun habiendo solo 45 cromosomas. La translocación robertsoniana más frecuente en el ser humano es con mucha diferencia rob(13;14)(q10;q10), que produce un fenotipo normal. 40  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Translocaciones robertsonianas Aunque los portadores de translocaciones robertsonianas sean fenotípicamente normales, pueden tener descendencia con trisomía. 41  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Inversiones Un mismo cromosoma sufre dos roturas y el segmento entre las dos roturas invierte su orientación y vuelve a religarse. Las inversiones pueden ser paracéntricas si ambas roturas se producen en un mismo brazo, y pericéntricas si se produce una rotura en cada brazo del mismo cromosoma. 42  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Inversiones Los portadores de inversiones cromosómicas suelen tener fenotipo normal por ser alteraciones equilibradas, sin pérdida ni ganancia de material genético. Sin embargo, por recombinación meiótica pueden generar gametos viables con dotación cromosómica desequilibrada, con duplicación y ausencia de fragmentos cromosómicos, lo que sucede si la inversión es pericéntrica. 43  EFECTOS DE INVERSIÓN PARACÉNTRICA (NO INCLUYE AL CENTRÓMERO) EN LA FORMACIÓN DE GAMETOS c c inv Meiosis N Inv N N inv N Cromosomas Cromosomas no recombinantes recombinantes desequilibrados: Apareamiento y (equilibrados) dicéntrico entrecruzamiento (izquierda) y c: centrómero inv: inversión acéntrico (derecha), ambos inviables  EFECTOS DE INVERSIÓN PERICÉNTRICA (INCLUYE AL CENTRÓMERO) EN LA FORMACIÓN DE GAMETOS inv Meiosis c N N Inv N Apareamiento y Cromosomas no Cromosomas entrecruzamiento recombinantes recombinantes (equilibrados) (desequilibrados) c: centrómero inv: inversión  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Mosaicismo de las anomalías cromosómicas: en un mismo individuo hay dos o más complementos cromosómicos diferentes. La causa es una no disyunción mitótica en una etapa temprana del desarrollo embrionario. Las personas con mosaicismo están menos afectadas en caso de trisomía. Anomalías cromosómicas en el cáncer: las anomalías cromosómicas son un rasgo distintivo del cáncer. La asociación del análisis citogenético y genómico con el tipo de tumor y con la eficacia terapéutica ya es una parte importante del tratamiento de pacientes con cáncer. EE 46  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Las anomalías cromosómicas causan frecuentemente abortos espontáneos. 47  ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS Preguntas ¿Cuáles de las siguientes personas son fenotípicamente normales o se espera que lo sean? a. Una mujer con 47 cromosomas, incluyendo un pequeño cromosoma supernumerario derivado de la región centromérica del cromosoma 15. b. Una mujer con cariotipo 47,XX, + 13. c. Un hombre con una deleción de una banda del cromosoma 4. d. Una persona con una translocación recíproca equilibrada. e. Una persona con una inversión pericéntrica del cromosoma 6. ¿Qué clase EE de gametos puede producir cada uno de estos individuos? ¿Qué tipo de descendencia pueden tener, asumiendo que el otro progenitor es cromosómicamente normal? 48