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Organización de la célula María Pérez Millet Organización de la célula Bloque 1 TEMA 1: Biología celular: fundamentos y técnicas de estudio 1. Perspectiva histórica de la Biología Celular La biología molecular, la biología celular y la genética son el núcleo central de las Ciencias Biomédicas. A mediados del siglo pasado comenzó a hacerse más evidente lo entrelazados que estaban entre sí la bioquímica, la citología y la genética, dando lugar de esta forma a un nuevo campo de estudio que integró a estas tres disciplinas: la biología celular. 1.1. La Teoría Celular La Teoría Celular, paradigma de la biología del siglo XIX, se basa en los siguientes postulados: ‣ Los seres vivos están formados por una o más células. ‣ La célula es la unidad viva más simple. 1. Biología 1. Biología Celular: Celular: concepto concepto y perspectiva y perspectiva histórica histórica Biología Biología molecular, molecular, Biología Biología celularcelular y Genética: y Genética: el núcleo el núcleo centralcentral de lasde las Ciencias Ciencias Biomédicas Biomédicas ‣ Los científicos J. Schleiden (botánico) La Teoría La Teoría Celular Celular y T. Schwann (fisiólogo), identificaron Losvivos Los seres seresestán vivosformados están formados por unapor unacélulas o más o más células una estructura microscópica común La célula es la unidad viva La célula es la unidad viva más simplemás simple en animales y plantas, el núcleo, que había sido ya previamente referida por R. Brown. Publicaron juntos la obra Investigaciones microscópicas sobre la concordancia de la estructura y el crecimiento de las plantas y los animales (1839) y asentaron el primer y segundo principio M. Schleiden M. Schleiden T. Schwann T. Schwann las Todas las células se originan a partir adepartir otrasde otras células de la teoría celular histórica Todas células se originan células R. Virchow ‣ Todas las células se originan a partir de otras células. R. R.Virchow Virchow (patólogo) revolucionó la biología y la medicina de la época explicando que el origen de las enfermedades no Laes La teoría teoría es extensiva extensiva al sistema al sistema nervioso nervioso BCB 1 de 304 S. Ramón S. Ramón y Cajal y Cajal  M. Schleiden T. Schwann Todas las células se originan a partir de otras células Organización de la célula María Pérez Millet está en los tejidos o en los órganos en general, sino en R.las células individuales de forma Virchow primaria. Acuño el tercer postulado de la Teoría celular: omnis cellula e cellula. ‣ La teoría celular es extensiva al sistema nervioso. A La teoría es extensiva al sistema nervioso finales del siglo XIX, S. Ramón y Cajal postuló la doctrina de la neurona, que descartaba la teoría S. Ramón y Cajal reticular (que daba por hecho que el sistema nervioso era un tejido conectado, no formado por células individuales) y explicaba que las neuronas (Becker) son la formación básica y funcional del sistema nervioso. 1.2. Niveles de organización subcelular 1. Pequeñas moléculas orgánicas 2. Macromoléculas 3. Estructuras supramoleculares 4. Orgánulos y otras estructuras 5. La célula BCB 2 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet 2. Células procariotas y eucariotas. Origen y herencia de los orgánulos celulares 2. Células 2.1. procariotas Diferencias y células básicas entre eucariotas. células eucariotas Origen y herencia de los orgánulos celulares y procariotas (Lodish) ‣ La diferencia fundamental entre las células procariotas y eucariotas es la presencia de un sistema de endomembranas, es decir, la compartimentalización, que es la base de la especialización y organización funcional de eucariotas. 2.2. Hipótesis acerca del origen y evolución de los eucariotas ‣ La aproximación genética para la determinación de relaciones evolutivas ha demostrado que el grupo de organismos procariotas que comúnmente se englobaban bajo el término “bacterias” ha resultado no contener uno, sino dos grupos de seres vivos con tantas diferencias entre sí como entre procariotas y eucariotas. Así, los procariotas se dividen en 2 dominios: Archaea y Bacteria. BCB 3 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet ‣ Existen dos hipótesis principales acerca del origen del primer eucariota: (a) En el árbol de los tres dominios, los eucariotas y las arqueas son grupos monofiléticos hermanos con la misma antigüedad. (b) Según la hipótesis de los dos dominios, apoyada por nuevos métodos filogenéticos y taxonómicos, las bacterias y las arqueas constituyen las dos líneas celulares iniciales, por lo que los eucariotas habrían surgido por simbiosis entre ellas. La arquea habría constituido la célula huésped para la mitocondria, mientras que la bacteria habría sido el origen de los órganulos endosimbiontes. ‣ La semejanza entre arqueas y bacterias es relevante en determinados aspectos, ya sean físicos, como la estructura de las subunidades grande y pequeña del ribosoma de crenoarqueas y eucariotas; o moleculares, en cuanto a la maquinaria de manipulación del material genético (replicación, transcripción y traducción). Lo veremos más adelante en el apartado 2.4. 2.3. La teoría endosimbiótica sobre el origen de la célula eucariota La teoría endosimbiótica sobre el origen de la célula eucariota α-proteobacteria cianobacteria MITOCONDRIA CLOROPLASTO BCB 4 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet ‣ Lynn Margulis publicó en 1966 la teoría de la endosimbiosis seriada, que describe el origen de las células eucariotas como consecuencia de sucesivas incorporaciones simbiogenéticas de diferentes células procariotas. Las pruebas más robustas que apoyan esta teoría son la existencia mitocondrias y cloroplastos como orgánulos endosimbióticos surgidos a partir de alfa- proteobacterias y cianobacterias, respectivamente. Margulis también sugirió la asociación previa con una espiroqueta que habría resultado en el flagelo de la célula eucariota ancestral, pero no es una hipótesis totalmente aceptada por la comunidad científica. 2.4. Comparación de algunas características de células de bacterias, arqueas y eucariotas ‣ Las arqueas son difíciles de distinguir de las bacterias por su apariencia externa, pero a nivel molecular se parecen más a los eucariotas en lo referido a la manipulación del material genético. Un ejemplo bastante interesante es que el aminoácido codificado por el codón de inicio de la traducción es metionina (y no formilmetionina) en arqueas y eucariotas. Sin embargo, en los aspectos moleculares referidos a procesos metabólicos, parece que las bacterias y arqueas son más similares entre sí. 3. Relaciones topológicas entre los distintos compartimentos celulares 3.1. Posible origen de la envoltura nuclear y los sistemas endomembranosos ‣ Para entender las relaciones que existen entre los compartimentos de la célula, resulta útil considerar cómo pueden haber evolucionado. Se cree que los precursores de las primeras células eucariotas fueron células relativamente sencillas que, como la mayoría de las bacterias y las arqueas, tienen una membrana plasmática pero no membranas internas. En estos BCB 5 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet organismos, la membrana plasmática realiza todas las funciones dependientes de membrana, como el bombeo de protones, la síntesis de ATP, la secreción de proteínas y la síntesis de lípidos. ‣ ‣ Las células eucariotas han evolucionado de forma que tienen un tamaño varias veces mayor a las procariotas. Esto implica al mismo tiempo una disminución de la relación superficie-volumen, con lo cual el área de la membrana plasmática no sería suficiente como para realizar todas las funciones necesarias en la célula. Este problema se alivia con la existencia del sistema de endomembranas de una célula eucariota. ‣ ‣ El primer eucariota debió de surgir previa compartimentalización interna de una célula procariota. En la actualidad, la hipótesis más aceptada acerca de la aparición del núcleo y el sistema de endomembranas (como el retículo endoplasmático al que está asociado) es la que se muestra a la derecha. El material genético, anclado a la cara interna de la membrana—como también se aprecia en algunos procariotas—, debió sufrir un repliegue de la membrana en forma de invaginación que posteriormente lo envolvería y lo convertiría en lo que hoy se conoce como núcleo. De forma que podemos decir que la membrana plasmática es el origen de la envoltura nuclear. 3.2. Compartimentos topológicamente equivalentes ‣ La aparición y desarrollo de los sistemas endomembranosos de las células eucariotas conlleva una especialización funcional entre compartimentos relacionados evolutivamente (que también llamamos topológicamente equivalentes). ‣ Evidentemente, la evolución de las membranas internas ha ido en paralelo con la especialización de sus funciones. Ya hemos visto que el RE y el núcleo podrían haber evolucionado por invaginación y estrangulamiento de la membrana plasmática hacia el interior celular, rodeando el material genético pero al mismo tiempo conformando unos nuevos compartimentos rodeados de membrana que encierran un interior o lumen que es equivalente topológicamente al exterior de la célula. Esta relación topológica se mantiene para todos los orgánulos que intervienen en las vías secretora y endocítica (RE, aparato de Golgi, endosomas, lisosomas), siendo parte del transporte vesicular. ‣ ‣ Por otro lado, las mitocondrias y los plastos se incluyen en otro sistema de transporte que no se cruza con el anterior, y difieren de estos últimos orgánulos principalmente en su origen evolutivo, procedente de la endosimbiosis con bacterias “engullidas”, como hemos visto anteriormente. Consideramos por tanto que el lumen de estos orgánulos evolucionó del citosol de la bacteria endosimbionte. Estos orgánulos tienen su propio genoma y una doble membrana, formada por una membrana interior que se corresponde con la membrana plasmática original de la bacteria y una membrana externa procedente de la membrana plasmática de la célula que la “engulló”. La presencia de esta doble membrana permite a estos orgánulos permanecer aislados del extenso tráfico vesicular que conecta el exterior celular con el lumen de los orgánulos membranosos. Por eso, a este sistema de transporte se le denomina transporte trasmembrana, e incluye a plastos, mitocondrias y peroxisomas. ‣ ‣ En resumen: las membranas internas de las mitocondrias (y también de los cloroplastos) delimitan compartimentos no relacionados evolutivamente con los otros orgánulos celulares. BCB 6 de 304  Las membranas internas de las mitocondrias (y también de los cloroplastos) delimitan compartimentos no relacionados evolutivamente con los otros orgánulos celulares Organización de la célula María Pérez Millet ‣ Por otra parte, el núcleo y el citosol forman parte de un sistema común de transporte de proteínas no cruzado con el sistema de endomembranas, el transporte regulado. ¡! Solamente los compartimentos topológicamente equivalentes comparten idénticas vías de tráfico de proteínas. 3.3. Tráfico Sólo intracelular de proteínas: los compartimentos sistemas de topológicamente transportecomparten equivalentes y clasificación idénticas vías de tráfico de proteínas Sistemas de compartimentos para el transporte de proteínas: 1 Transporte regulado entre núcleo y citosol 2 Transporte transmembrana (mitocondrias, plastos, peroxisomas) 3 Transporte vesicular (ruta biosintético-secretora) ‣ En la imagen superior vemos los sistemas de compartimentos para el transporte de proteínas. La síntesis de todas estas empieza en los ribosomas del citosol (a pesar de las pocas que se sintetizan en los ribosomas de las mitocondrias y los plastos). Su posterior destino depende de su secuencia de aminoácidos, que puede contener señales de clasificación que dirigen su entrega a localizaciones fuera del citosol o las superficies de los orgánulos. Algunas proteínas no tienen señales y permanecen en el citosol como residentes permanentes. 1. Transporte regulado entre núcleo (nucleoplasma) y citosol (citoplasma). Las proteínas y moléculas de RNA se desplazan entre el citosol y el núcleo a través de los complejos de los poros nucleares de la envoltura nuclear. Estos actúan como puertas selectivas que sustentan el transporte activo de macromoléculas y complejos macromoleculares específicos, aunque también permiten la libre difusión de moléculas más pequeñas. BCB 7 de 304  transporte vesicular sólo puede transportar proteínas entre compartimientos que son topológicamente equivalentes (véase Figura 12-5). CLAVE: - transporte regulado 1\Jr lo general, cada sistema de transporte de proteínas está controlado mediante seña- =transporte transmembrana =transporte vesicular clasificación presentes en la proteína transportada, que son reconocidas por recepto- 'UlSificación complementarios. Por ejemplo, si una proteína grande tiene que ser Organización de la célula da hacia el núcleo, debe tener una señal de clasificación que sea reconocida por los ores de clasificación que la guiarán a través del complejo de poro nuclear. Si una pro- María Pérez Millet ne que ser transferida de forma directa a través de una membrana, debe tener una 2. Transporte transmembrana (mitocondrias, plastos, peroxisomas). En de clasificación en la membrana que sea reconocida por el translocador Del mismo 1una proteína tiene que ser incorporada a cierto ópo de vesfculas o retenida en cier- bicapa lipldica este tipo de transporte intervienen translocadores de proteínas nulos, sus señales de clasificación deben ser reconocidas por un receptor comple- o de la membrana apropiada. 1 protelna de membrana transmembrana que transportan directamente proteínas específicas a través de una membrana desde el citosol hacia un espacio cuencias señal dirigen a las proteínas a su destino rcorrecto COMPARTIMIENTO topológicamente distinto..'Orla de sei'lales de clasi.ficación de las proteínas residen en una región continua de la DADOR ia de aminoácidos de 15-60 residuos de longitud característicos. A menudo estas ·las señal se encuemran en el extremo N-terminal; una vez se ha completado el pro- 3. Transporte vesicular o ruta biosintético-secretora. Los intermediarios cla ,ificación, unas peptJdasas señal especializadas eliminan la secuencia sei'lal de la En algunos casos, las señales de clasificación están compuestas por varias secuen- veslcula que se produce por de transporte son vesículas rodeadas de membrana que conducen gemación, cuyo rnas de aminoácidos que adoptan una disposición tridimensional característica de contenido va a mos de la superficie de la proteína, denominadas una reglón sei\al. ser transportado proteínas de un compartimento topológicamente equivalente a otro. :dn secuencia señal especifica un destino particular en la célula. En general, las pro- veslcula que están destinadas a ser transferidas al ER tienen, en su extremo N-terminal, se- de transporte Las vesículas de transporte y los fragmentos de orgánulos se van en el citoplasma señal que en su parte central presentan entre 5 y 10 restos de aminoácidos hidro- Muchas de estas prote(nas pasarán después desde el ER al complejo de Golgi; no FUSIÓN l cargando de moléculas procedentes del lumen de un compartimento a medida que geman y se separan de su membrana; descargan su Figura 12-7 Gemación de veslculas y fusión durante el transporte vesicular. Las carga en un segundo compartimento al fusionarse con lacomponentes membrana veslculas aparecen por gemación de un compartimiento (dador) y se fusionan con otro compartimiento (aceptor o diana). En el proceso, determinados solubles (puntos rojos) son transferidos de un lumen a otro. Nótese que la membrana también es que lo rodea. Por ejemplo, transferida la transferencia y que la orientación original,de proteínas tanto para solubles las protefnas como para los lfpidos en el compartimiento original, se mantiene en la membrana del compartimiento aceptor. desde el RE hasta el complejoAsl de pues, Golgi se las protefnas de produce membrana conservan sude mismos dominios siempre orientados hacia el citosol. esta orientación manera. asimétrica, con los 4. Unidad y diversidad celular Diferentes tipos de células producen diferentes conjuntos de proteínas como resultado de una expresión génica diferencial, es decir, lo que diferencia a dos tipos celulares no es su material genético, sino los genes que están activos. A las proteínas codificadas por genes que se activan en tipos celulares determinados se les llama proteínas especializadas, y se distinguen precisamente de las proteínas constitutivas, que se sintetizan siempre sea cual sea el tipo celular. En las imágenes superiores observamos dos electroforesis bidimensionales realizadas sobre las proteínas expresadas en determinado momento en dos tejidos distintos (células del cerebro y del hígado humanos). Si nos fijamos con atención y detalle, podremos ver que algunas de estas proteínas son comunes en ambos tejidos, otras se expresan en más cantidad en uno que en otro y algunas que exclusivamente se expresan en un tipo celular. La expresión génica diferencial no solamente se aprecia en el caso de células de diferente linaje, sino que el patrón de producción proteica de un tipo celular depende además del estado funcional de la célula, es decir, de la actividad que esté realizando. Así, por ejemplo, un linfocito activará genes para la producción de anticuerpos en caso de haber reconocido un antígeno. Los tamaños de las células son muy variables, por ejemplo como ocurre en el caso de una neurona, que puede llegar a medir 1 m, y un linfocito, de unos pocos µm. Así se pone de manifiesto que la morfología y la función de las células están estrechamente relacionadas. BCB 8 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet A pesar de la diversidad celular que existe, los principios básicos de organización morfo- funcional son compartidos por todas las células eucariotas. Pongamos como ejemplo a uno de los eucariotas más sencillos, Saccharomyces cerevisiae, que reúne las características esenciales de eucariotas y por tanto es útil como organismo modelo en investigación. 5. Técnicas de estudio de la Biología Celular. Principios básicos de microscopía 5.1. Microscopía óptica convencional con tinción ‣ Una limitación fundamental de todos los microscopios es que un tipo de radiación determinada no puede utilizarse para examinar detalles estructurales mucho más pequeños que su propia longitud de onda. Así pues, el límite máximo de resolución de un microscopio óptico está determinado por la longitud de onda de la luz visible, que abarca desde 0,4 µm (para el violeta) hasta 0,7 µm (para el rojo lejano). En la práctica, las bacterias y las mitocondrias, que tienen aproximadamente 500 nm (0,5 µm) de diámetro, son las estructuras más pequeñas que podemos observar nítidamente con el microscopio óptico; los detalles más pequeños que estas dimensiones quedan borrosos por los efectos de la naturaleza casi ondulatoria de la luz. ‣ En la figura de la derecha observamos los tamaños de las células y sus componentes dibujados a escala logarítmica, indicando el rango de objetos que se pueden resolver con facilidad a simple vista y con microscopios ópticos y electrónicos. ‣ Las células humanas, excepto aquellas que contienen pigmentos naturales como los eritrocitos, son incoloras. Esto implica que necesitan teñirse para poder visualizarse en el microscopio con luz blanca. Las tinciones pueden realizarse específicamente para distinguir diferentes partes de la célula: esto se consigue aprovechando las propiedades químicas de los compuestos celulares. Por ejemplo, el citoplasma se puede teñir con una sustancia ácida dada la abundancia de proteínas básicas; mientras que el núcleo puede teñirse con una sustancia ácida dado que el ADN es una molécula ácida. Los colorantes que existen son variados y pueden combinarse para resaltar determinadas estructuras celulares. ‣ La región teñida de la célula absorberá luz de varias longitudes de onda, dependiendo de la tinción, pero permitirá el paso de otras longitudes de onda. De esta forma, se obtiene una imagen en color de la célula que es visible en un microscopio óptico de campo claro convencional. Células de la mucosa bucal en microscopía de campo claro. Tinción con azul de toluidina. BCB 9 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet ‣ Hemos de tener en cuenta que en las preparaciones para este tipo de microscopía las células han pasado por un proceso de fijación y tinción por el que han perdido su actividad biológica. 5.2. Microscopía óptica sin tinción (de contraste o de interferencia) ‣ Este tipo de microscopía aprovecha el carácter ondulatorio de las ondas luminosas en lugar de la absorción de determinada longitud de onda. Cuando la luz pasa a través de una célula viva, la fase de la onda luminosa varía en función del índice de refracción de la célula: la luz que pasa a través de una zona relativamente gruesa o densa de la célula, como por ejemplo el núcleo, se retrasa. En consecuencia, la fase de la luz queda desplazada respecto a la de la luz que ha pasado a través de una región más delgada adyacente del citoplasma. El microscopio de contraste de fases y, de una forma más compleja, el microscopio de contraste de fases interferencial, aumenta estas diferencias de fase de manera que las ondas llegan a estar casi desfasadas, lo que permite generar diferencias de amplitud cuando se combinan los conjuntos de ondas, creando así una imagen de la estructura de la célula. ‣ Ambos tipos de microscopios se utilizan ampliamente para observar células vivas, ya que evitan dañar a las células con el proceso de fijación, tinción… Esto permite observar los movimientos implicados en procesos tales como la mitosis y la división celular, incluso generar películas time- lapse para observar movimientos celulares que son demasiado lentos para poder ser vistos a tiempo real. Microscopía de contraste de fases Microscopía de contraste de fases Microscopía de Nomarsky o de contraste diferencial de Monitorización de una célula vegetal en división interferencia (DIC) Videomicroscopía de lapso de tiempo, DIC Microscopía de Nomarsky Monitorización de una célula vegetal en división o de contraste diferencial de Videomicroscopía de lapso de tiempo, DIC interferencia (DIC) ‣ Es de destacar la importancia de esta técnica microscópica en medicina reproductiva (valoración de la calidad del esperma, fecundación in vitro…). sperm swimming ICSI 8-cell embryo BCB 10 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet 5.3. Cultivos celulares ‣ El acceso a las células del organismo es difícil y conlleva la modificación de las células en su entorno real. El cultivo celular es el proceso mediante el que células, ya sean procariotas o eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. ‣ Estas se crecen pegadas a placas o suspendidas en frascos con medio de cultivo, que permiten la manipulación de las células para la realización de experimentos. Las células se cultivan y mantienen a una temperatura apropiada y mezcla de gases (habitualmente, 37°C, 5% CO2 y 95% O2) en un incubador celular. Las condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo celular, y la variación de las condiciones para un tipo celular concreto, puede dar lugar a la expresión de diferentes fenotipos. ‣ El cultivo de células animales empezó a ser una técnica rutinaria de laboratorio durante los años 50, pero el concepto de mantener líneas de células vivas separadas del tejido de origen fue descubierto en el siglo XIX. Los cultivos primarios duran poco, menos que el tiempo necesario para realizar determinados experimentos. Por eso, se recurre a alternativas: las líneas celulares inmortalizadas (H2K, MSC-1…). Son poblaciones de células de un organismo multicelular que normalmente no proliferan indefinidamente, pero, debido a la mutación, se han eludido de la senescencia celular y en su lugar pueden dividirse indefinidamente. Por tanto, las células pueden ser cultivadas durante períodos prolongados in vitro. Estas células suelen ser células cancerosas extraídas de determinado tejido. Proceden de bancos de células y están presentes en todos los laboratorios de investigación que requieren este tipo de técnicas. Microscopía óptica de campo Microscopía de contraste Microscopía de fluorescencia claro diferencial de interferencia 5.4. Estudio de las células en preparaciones histológicas (in situ) ‣ Dado que la mayoría de las muestras tisulares son demasiado gruesas para que sus células puedan ser examinadas directamente a gran resolución, a menudo son cortadas en rodajas muy finas y transparentes llamadas secciones. Los pasos a seguir para conseguir estas secciones se enumeran a continuación: 1. Fijación: para preservar las células dentro del tejido y evitar el deterioro, éste debe ser tratado con un fijador. Entre los fijadores más comunes se encuentra el glutaraldehido, BCB 11 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet que forma enlaces covalentes con los grupos amino libres de las proteínas, entrecruzándolos, y por tanto estabilizándolos e inmovilizándolos en su posición. 2. Inclusión: por lo general los tejidos son blancos y frágiles, incluso después de la fijación, de forma que antes de antes de obtener las secciones es necesario congelarlos o incluirlos en un medio de soporte para endurecerlos. Los medios de inclusión más utilizados son ceras o resinas. En estado líquido, estos medios penetran y rodean el tejido fijado; entonces, pueden ser endurecidos (por enfriamiento o por polimerización) para que formen un bloque sólido que pueda ser seccionado con facilidad con un microtomo. 3. Corte: el corte se realiza con el microtomo, un aparato dotado de una cuchilla afilada, por lo general de acero o de vidrio, que actúa como un corta fiambres. Las secciones (típicamente de 0,5-10 µm de grosor) se depositan sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio. 4. Tinción: muy pocas cosas del contenido de la mayoría de las células (que tienen un 70% de agua en peso) impiden el paso de los rayos de luz, es decir, las células son esencialmente incoloras, incluso fijadas y seccionadas. Mediante técnicas como la microscopía de contraste de fases o de contraste de fases interferencial se pueden observar, pero estos métodos no revelan apenas información sobre la química subyacente. Por eso, existen 3 aproximaciones principales para trabajar con secciones finas de tejidos que revelan las diferencias entre los tipos de moléculas presentes. Tinción con colorantes orgánicos con afinidad específica por determinados componentes subcelulares. Por ejemplo, la hematoxilina tiene afinidad por moléculas con carga negativa por lo que puede revelar la distribución del DNA, RNA y proteínas ácidas en la célula. Hibridación in situ, que revela la distribución celular y la abundancia de determinadas moléculas de RNA en el material seleccionado. Utilización de sondas y marcadores fluorescentes, como veremos en el siguiente apartado. 5.5. Inmunocitoquímica o inmunohistoquímica ‣ La inmunocitoquímica (o inmunohistoquímica, si nos referimos de forma general al tejido) se basa en el uso de anticuerpos (que son específicos para sus respectivos antígenos) y su visualización mediante cromóforos o fluoróforos (en este caso por inmunofluorescencia). ‣ Los cromóforos son sustancias con color que no necesitan ser Células HeLa teñidas con visualizadas con un microscopio de fluorescencia. Los fluoróforos son anticuerpos a la vimentina sustancias que emiten fluorescencia cuando son excitadas con una (rojo) y a los complejos del longitud de onda determinada. poro nuclear (verde). BCB 12 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet ‣ Marcaje secundario o inmunocitoquímica indirecta ‣ La exacta especificidad de los anticuerpos frente a los antígenos los convierte en poderosas herramientas para un biólogo celular. Además, los anticuerpos fluorescentes resultan muy útiles para marcar determinadas moléculas de la célula y localizarlas mediante microscopía de fluorescencia. ‣ Cuando se utilizan anticuerpos para marcar determinado antígeno, existen dos métodos principales. Uno de ellos es el método directo, que emplea directamente el antígeno concreto ya marcado con una sonda. Sin embargo, el método indirecto, que es el que vemos en este apartado, es más frecuente y útil ya que es más barato y amplifica la señal (por ejemplo, la fluorescente) del marcaje. ‣ ‣ Este método consiste en la utilización de dos anticuerpos: uno de ellos, el anticuerpo primario (AntiA), es específico del antígeno en cuestión, que en este caso llamaremos antígeno A, y se corresponde con la proteína que queremos localizar o visualizar. Después de la incubación con el anticuerpo primario, que no está marcado, se incuba la muestra con los anticuerpos secundarios (también inmunoglobulinas), que están unidos covalentemente a un marcador, como un fluoróforo, y reconocen al anticuerpo primario al unirse a su parte inespecífica. Esto permite amplificar la señal ya que pueden unirse varios anticuerpos secundarios al anticuerpo primario que está unido al antígeno. ‣ ‣ Los anticuerpos primarios se obtienen a partir de animales. Para ello, primero se inyecta el antígeno de interés en el animal, de forma que este produce anticuerpos que pueden extraerse del plasma sanguíneo. ‣ ‣ Es importante saber que algunos métodos de amplificación no utilizan sondas fluorescentes, como marcador, sino enzimas que en presencia de los reactivos adecuados produce una sustancia que puede provocar un precipitado coloreado. Es el caso de la fosfatasa alcalina, que produce fosfato inorgánico y este causa la aparición de un precipitado rojo. ‣ El microscopio de fluorescencia ‣ Las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda más larga. Si iluminamos un componente de este tipo con luz de la longitud de onda que absorbe y lo visualizamos a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de la longitud de onda que emite, la molécula brillará sobre un fondo oscuro. ‣ Los colorantes fluorescentes utilizados para teñir las células se visualizan con un microscopio de fluorescencia. Este microscopio es similar a un microscopio óptico convencional, excepto BCB 13 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet que la luz incidente, procedente de una fuente muy potente, atraviesa dos series de filtros, uno para filtrar la luz antes de que llegue a la muestra y otro para filtrar la luz obtenida de la muestra. El primer filtro solo permite el paso de las longitudes de onda que excitan al colorante fluorescente particular, mientras que el segundo filtro bloquea esta luz y solo deja pasar aquellas longitudes de onda emitidas por el colorante una vez que ha sido excitado. ‣ El microscopio confocal permite resultados superiores a los obtenidos mediante microscopía óptica convencional ya que proporciona imágenes muy nítidas de los marcajes celulares con inmunofluorescencia al iluminar mediante un haz láser un único plano horizontal de la muestra. ‣ ‣ Detección inmunocitoquímica de estructuras y orgánulos celulares (inmunofluorescencia) ‣ En esta preparación se han utilizado 2 anticuerpos para marcar 2 estructuras distintas. El filtro de color permite ver en azul los núcleos y en verde el citoplasma. Superponiendo las imágenes pueden observarse ambas estructuras. BCB 14 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet Marcaje Rojo Núcleo Núcleo Microtúbulos Núcleo Membrana Mitocondrias Filamentos de Verde (epítopo: proteínas Cinetocoro (asociadas al actina de membrana) citoesqueleto) Azul — Aparato de Golgi Cromosomas Citoesqueleto ‣ Marcadores de tipo celular ‣ Se pueden aprovechar las técnicas de inmunofluorescencia para marcar diferencialmente tipos celulares o células con determinada actividad. Para ello, se ha de seleccionar 1 proteína que se exprese solamente en una de las poblaciones de células que observemos. ‣ ‣ Por ejemplo, a la derecha vemos 2 imágenes de un cultivo primario de neuronas y células gliales de rata. En verde se marca la tubulina, la β-tubulina clase III específica neuronal se marca en rojo y en azul el DNA. Las neuronas se distinguen claramente de las células gliales en la segunda foto, ya que son las únicas marcadas con el fluoróforo rojo. ‣ En la imagen inferior vemos 2 subpoblaciones de neuronas del córtex cerebral en desarrollo que expresan diferencialmente dos proteínas, involucradas en circuitos neuronales distintos. ‣ Identificación de células tumorales ‣ En las imágenes de la parte inferior de la página vemos el diagnóstico histopatológico de un carcinoma de mama mediante el marcaje inmunohistoquímico del tejido mamario con un anticuerpo contra el oncogén Her2neu (el precipitado de color marrón indica que las células expresan el oncogén). ‣ ‣ La fotografía a) sirve de control; en la b) hay una ligera señal de cáncer, mientras que en b) ésta señal se hace más moderada y la intensidad del color del precipitado en la imagen c) indica que el gen está muy activo y es motivo de pronóstico de cáncer avanzado. BCB 15 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet 5.6. Microscopio Electrónico de Transmisión (MET, TEM) ‣ Los microscopios electrónicos utilizan un haz de electrones en vez de un haz de luz ya que esto les permite un límite de resolución muy pequeño, mayor que el del microscopio óptico. El funcionamiento de este tipo de microscopios se basa en que la longitud de onda de un electrón disminuye a medida que aumenta su velocidad. En las fotos inferiores se aprecia la diferencia de calidad de imagen entre una fotografía tomada con el microscopio óptico y con el electrónico. ‣ ‣ Los electrones son disparados a través de un cátodo o filamento desde la parte superior de una columna cilíndrica (de 2 m de altura) en vacío para evitar que se dispersen al colisionar con las moléculas de aire. Los electrones son acelerados mediante el filamento por un ánodo cercano que les permite pasar a través de un diminuto orificio y formar un haz de electrones que viaja por la columna. Unas bobinas magnéticas enfocan el haz como lo harían con la luz las lentes en un microscopio óptico. La muestra se coloca en el vacío de la columna, en la trayectoria del haz de electrones. La muestra se suele teñir con un material electrodenso. De esta forma, algunos de los electrones que la atraviesan son dispersados por las estructuras teñidas con el material electrodenso, y el resto de electrones son enfocados para formar una imagen con el detector. Puesto que los electrones que han sido dispersados ya no forman parte del haz, las regiones densas de la muestra aparecen en la imagen como áreas de reducido flujo de electrones y se ven oscuras. MO MET BCB 16 de 304 Organización de la célula María Pérez Millet ‣ Ya hemos comentado que el el caso de la MET las células también se tiñen, pero en este caso con sondas electrodensas que dispersen los electrones. El método (indirecto) es análogo al que vimos en inmunohistoquímica, llamado inmunodetección con partículas de oro coloidal. En este, el procedimiento habitual también consiste en incubar una sección ultrafina con un anticuerpo primario específico y después con un anticuerpo secundario conjugado con esferas de oro coloidal (de 2 a 100 nm). Al ser un material electrodenso, las partículas de oro pueden observarse en el microscopio como puntos negros. Además, pueden conjugarse anticuerpos diferentes con partículas de oro de diferentes tamaños, pudiéndose localizar así múltiples proteínas en la misma muestra. ‣ En la imagen observamos las diferentes proteínas que componen el corpúsculo basal (spindle pole body), marcadas con diferentes tamaños de partículas de oro. 5.7. Microscopio Electrónico de Barrido (MEB, SEM) ‣ Un microscopio óptico de barrido (scanning electron microscope) produce directamente una imagen de la estructura tridimensional de la superficie de una muestra. Mientras que el MET forma la imagen a partir de los electrones que han atravesado la muestra, el MEB utiliza los electrones dispersados o emitidos por la superficie de la muestra. La muestra a examinar normalmente se fija, se seca y se recubre con una capa delgada de un metal pesado. La muestra es barrida con un haz muy estrecho de electrones, que ‘rebotan’ sobre aquello que se haya recubierto con el metal y forman una imagen en la pantalla de ordenador. Su resolución no es muy alta y se utiliza principalmente para estudiar células enteras y tejidos en lugar de orgánulos. BCB 17 de 304