Tema 0: Introducción y Básicos (Proteómica y Metabolómica) - 4º Grado Biotecnología - UPV

TEMA-0.-INTRODUCCION-Y-BASICOS.pdf REBELRED Proteómica y Metabolómica 4º Grado en Biotecnología Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica y del Medio Natural Universidad Politécnica de Valencia Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 PROTEÓMICA Y METABOLÓMICA. GRUPO B. 4º BIOTECNOLOGÍA UPV. Profesor: López Gresa, María Pilar TEMA 0: INTRODUCCIÓN Y BÁSICOS La metabolómica puede deﬁnirse como la ciencia-ómica más emergente, que permite obtener un perﬁl metabólico de una muestra biológica compleja, a través de la combinación de técnicas analíticas que generan gran cantidad de datos y del análisis estadístico multivariable de ellos. CLAVE: ver las diferencias entre grupos y comprobar si son signiﬁcativas. La metabolómica permite analizar una gran cantidad de metabolitos en matrices complejas como bioﬂuídos y tejidos de manera automatizada y relativamente rápida. Si empleo el mismo timing para hacer extracciones, siempre van a salir igual, mas automatizado signiﬁcará mas reproducible. Este análisis genera un perﬁl de metabolitos cuya comparación, por medio de técnicas estadísticas multivariantes, permite identiﬁcar cambios metabólicos especíﬁcos para los distintos fenotipos objeto de estudio. Siempre se comparan dos cosas para saber lo que ocurre, quien es el grupo control, enfermo, tratado, de interes, etc. Siempre vere diferentes grupos de estudio segun un fenotipo observable (ej., calvos vs con pelo), clasiﬁcandolos. Veremos que metabolitos son distintos entre ambos grupos. El objetivo de esta parte de la asignatura consistirá en transmitir qué es un metabolito y como se identiﬁca. Explicaremos los distintos grupos de metabolitos y las mejores técnicas para su detección. Prestaremos especial atención a la elucidación estructural de distintos metabolitos. Nos centraremos no solamente en la descripción de los metabolitos, sino en el estudio estadístico de los datos analíticos. Estableceremos una conexión entre los metabolitos y los resultados obtenidos en el perﬁl metabolómico. Es posible observar las señales inducidas, identiﬁcarlas y obtener el contenido metabólico que diﬁere entre los dos grupos. De acuerdo con la ruta de biosíntesis, se pueden identiﬁcar proteínas y genes disfuncionales. La metabolómica representa la etapa ﬁnal de la cascada de análisis biológicos, mientras que la genómica se encuentra al principio de esta cadena. Sin embargo, el análisis genómico suele ser signiﬁcativamente más costoso que detectar metabolitos en muestras. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 ESTRUCTURA DEL PROCESO METABOLÓMICO 1. Toma de Muestra: Recolección de muestras biológicas (sangre, orina, tejidos, etc.). 2. Extracción: Aislamiento de los metabolitos presentes en la muestra. 3. Análisis: Aplicación de técnicas como espectrometría de masas o resonancia magnética Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. nuclear para obtener perﬁles metabólicos. 4. Procesado de Datos: Filtrado y normalización de los datos obtenidos para eliminar ruidos y errores. 5. Análisis de Datos Multivariantes: Uso de herramientas estadísticas y bioinformáticas para identiﬁcar patrones signiﬁcativos. 6. Identiﬁcación de Metabolitos: Determinación de las estructuras químicas de los metabolitos detectados. 7. Conﬁrmación y Validación de Resultados: Veriﬁcación de los hallazgos mediante experimentos adicionales o replicación en muestras independientes. “Ómica” deriva del suﬁjo latino “ome” = masa. Estudios “ómicos” son los estudios que implican un gran número de medidas. Tipos: ➔ Genómica: genes ➔ Transcriptómica: RNAs ➔ Proteómica: proteínas ➔ Metabolómica: metabolitos Ojetivo: comprensión global e integrada de un sistema biológico mediante el estudio de los diferentes componentes (genes, RNAs, proteínas y metabolitos) de cada proceso biológico. Inciso: se deben tomar muchas más precauciones al trabajar con proteínas. Además, el metaboloma también es altamente dinámico, ya que los metabolitos pueden degradarse en función del pH o la luz. ¡Repara tu patinete ya! Consigue un 10% de descuento en tu PitStop más cercano Proteómica y Metabolómica Banco de apuntes de la a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 METABOLÓMICA Metabolito: Producto del metabolismo. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Metabolismo: Conjunto de reacciones químicas que efectúan constantemente las células de los seres vivos con el ﬁn de sintetizar sustancias complejas a partir de otras más simples, o degradar aquellas para obtener éstas. Proceso de ida y vuelta Metaboloma: Conjunto completo de metabolitos orgánicos que se producen dentro de una célula bajo la dirección del genoma. Macromoleculas ya no cuentan. Metabolómica: Medida cualitativa y cuantitativa de un gran número de metabolitos presentes en un sistema biológico, que ofrece una amplia visión del estado bioquímico del organismo y que suele ser útil para evaluar la función génica. Fotograﬁa del estadio bioquimico ene se momento y lugar determinado, util para estudiar la funcion genica. Generalmente es CUALITATIVA, ej, en este grupo hay 3 veces mas de glucosa que en el otro grupo, sin escala. La metabonómica es la medida cuantitativa de la respuesta dinámica metabólica de los sistemas vivos a los estímulos ﬁsiopatológicos o modiﬁcaciones genéticas con la ﬁnalidad de descubrir enfermedades y factores de riesgo así como determinar biomarcadores. La diﬁcultad de la metabolómica reside en la diversidad de metabolitos. Metabolitos presentes en un organismo: ➔ Constitutivos: primarios y secundarios. ➔ No constitutivos: ﬁtoalexinas. ➔ Exógenos: debido a otros organismos, químicos 200.000 productos naturales descritos, 3.500-30.000 metabolitos en una sola planta, 4.000 nuevos metabolitos cada año, y solo 15% de todas las plantas han sido estudiadas. Debemos conocer los metabolitos constitutivos, es decir, aquellos presentes en la condición basal (por ejemplo, en el cromatograma del tomate que estamos estudiando). Es importante estudiar la matriz y los posibles tratamientos a los que pueda estar sometido el sujeto estudiado, para evitar confundir falsos biomarcadores. La tarea de un metabolomista es la de formar parte de la “BIOLOGÍA DE SISTEMAS”. El análisis de todos los metabolitos presentes en un organismo NO es el objetivo ﬁnal. El objetivo de la metabolómica es proporcionar bases de datos del metaboloma y relacionarlas con otras bases de datos (transcriptoma, proteoma, ecología, clínica,…) con el ﬁn de conocer o entender mejor a los organismos vivos. ¡Repara tu patinete ya! Consigue un 10% de descuento en tu PitStop más cercano a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 METABOLITOS VEGETALES La 1ª etapa de la metabolómica es conocer los metabolitos presentes en los organismos vivos. Características químicas de los grupos de metabolitos (azúcares, aminoácidos, ﬂavonoides, terpenos, alcaloides,…) detectados mediante distintos métodos analíticos (UV, MS, NMR). Metabolitos habituales en plantas. Metabolitos excepcionales con diferentes características analíticas. Es necesario distinguir la conﬁguración R o S (quiralidad) para los marcadores. A partir del ácido shikímico se obtienen los aminoácidos aromáticos (con anillo), cuyos electrones del orbital p pueden excitarse a un estado antienlazante, lo que se observa claramente. El triptófano, la fenilalanina y la tirosina dan una señal en el UV que absorbe a 280 nm, lo que permite detectar compuestos fenólicos debido a la presencia del anillo aromático. Los aminoácidos alifáticos (todos los no aromáticos, con largas cadenas carbonadas) provienen del ciclo de Krebs, del acetil-CoA, del piruvato. Los alcaloides son todos los compuestos nitrogenados que no son aminoácidos y se originan a partir de estos últimos. Los poliacetatos introducen dos átomos de carbono para formar ﬂavonoides. METABOLISMO PRIMARIO: Las reacciones bioquímicas fundamentales de los seres vivos que permiten la obtención de energía y poder reductor para la biosíntesis de los componentes principales de las células. Conservadas en los seres vivos. METABOLISMO SECUNDARIO: Reacciones de biosíntesis de compuestos que no son esenciales para los seres vivos pero que cumplen un papel ecológico. p. ej.: la atracción de insectos polinizadores y de animales comedores de frutas (para difundir las semillas), la defensa frente a plagas y la regulación y comunicación entre órganos de un individuo (hormonas) o entre individuos (feromonas). Enormemente variable entre distintos tipos de organismos. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 1. METABOLISMO PRIMARIO a. AC GRASOS-> LÍPIDOS b. MONOSACARIDOS / DI -> AZUCARES c. AAs -> PROT Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. i. ALIFATICOS ii. AROMATICOS d. BN -> AC NUCLEICOS e. AC ORGANICOS 2. METABOLISMO SECUNDARIO a. TERPENOS b. FENÓLICOS c. ALCALOIDES METABOLISMO PRIMARIO ÁCIDOS GRASOS Y LÍPIDOS Moléculas orgánicas compuestas por C, H y en menor medida de O, aunque también pueden contener N, P, S y que se caracterizan por ser insolubles en agua. Ácidos grasos. Saponiﬁcables. ○ Simples: C, H, O acilglicéridos: ésteres ácido graso y glicerol (grasas y aceites). céridos: ésteres ácido graso y un alcohol más largo (ceras). estéridos: ésteres ácido graso y un alcohol derivado del colesterol. ○ Complejos: C, H, O y otros elementos como N, P, S u otra biomolécula (glúcido). fosfolípidos: esﬁngo y glicero. glicolípidos: esﬁngo y glicero. Insaponiﬁcables. ○ Terpenos (isopreno). ○ Esteroides (esterano). Por ejemplo, el ácido acético (CH₃COOH): su cadena de carbono no es lo suﬁcientemente larga para proporcionar la apolaridad necesaria y ser insoluble en agua, ya que el grupo ácido es polar. Por esta razón, el ácido acético es soluble en agua. Sin embargo, a partir de cadenas con 4 o más átomos de carbono, los ácidos ya no son solubles en agua y se denominan ácidos grasos en lugar de ácidos orgánicos. IMPORTANTE: todos los ácidos grasos presentes en la naturaleza son de conﬁguración cis. La conﬁguración cis signiﬁca que los átomos más voluminosos están en el mismo lado del doble enlace, por lo que es fundamental no representar un ácido graso en conﬁguración trans. Sabemos que los ácidos grasos se sintetizan a partir del malonil-CoA y siempre tienen un número par de átomos de carbono. Los ácidos mirístico, palmítico y esteárico son los más importantes (conocer la cantidad de átomos de carbono en cada uno). ¡Repara tu patinete ya! Consigue un 10% de descuento en tu PitStop más cercano a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Los ácidos grasos insaturados son abundantes en semillas. El ácido oleico es beneﬁcioso para la salud, ya que disminuye los niveles de colesterol, a diferencia del ácido palmítico. Por otro lado, el ácido linoleico es el primer ácido graso esencial, ya que los humanos no podemos introducir insaturaciones más allá del carbono 9, por lo que debemos obtenerlo a través de la dieta. No podemos utilizar HPLC-UV porque los compuestos no presentan absorción (al carecer de insaturaciones conjugadas). Tampoco podemos emplear RMN, ya que es difícil diferenciarlos debido a su similitud estructural. Para utilizar GC-MS, la molécula debe ser de bajo peso molecular (~27-30 átomos de carbono) y apolar. En el caso de los ácidos grasos, el grupo carboxílico resulta problemático por su polaridad, así que lo bloqueamos mediante metilación, transformándolo en un grupo metoxilo apolar. Podemos aplicar otras técnicas si realizamos modiﬁcaciones adicionales, pero el GC-MS sigue siendo la mejor opción. En H1-RMN, cada señal corresponde a los protones de la molécula, y se sitúan en función de sus vecinos y cómo se desdoblan. La multiplicidad se determina mediante la regla del n+1, donde n es el número de protones (H) en los carbonos adyacentes. Por ejemplo, un grupo CH₃ terminal que tiene un CH₂ como vecino (n=2) resonará como un triplete (n+1=3). El siguiente carbono, un CH₂, que tiene como vecinos un CH₃ y un CH, tendría n=4, por lo que resonaría como un quintuplete (n+1=5). A la izquierda del espectro, se encuentran las señales de los protones cercanos a dobles enlaces. Si hay un ácido graso en el suero, a 1 ppm se observará un triplete, que es la señal característica de los ácidos grasos en metabolómica, ya que en el suero suelen presentarse muchas señales solapadas. En general, la RMN es difícil de usar para identiﬁcar ácidos grasos, excepto por la señal del metilo terminal. La mejor técnica es la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), que permite analizar solo compuestos volátiles (ligeros y apolares). El ácido linoleico, por ejemplo, tiene una cabeza polar que impide su volatilidad. Sin embargo, se puede transformar químicamente convirtiendo el grupo carboxilo (COOH) en un éster metílico (C-O-CH₃), que no formará puentes de hidrógeno y será apolar (metilación). ¡Repara tu patinete ya! Consigue un 10% de descuento en tu PitStop más cercano a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Receta para la metilación: Saponiﬁcar el ácido graso con sosa (NaOH), extraerlo con un disolvente apolar (como hexano), y luego metilarlo con metanol en condiciones ácidas. Es importante conocer solo los pasos esenciales de este proceso. Usar las mismas condiciones en el GC que para el análisis de metabolitos apolares. Se recurre a la GC-MS siempre que sea posible, ya que es una técnica económica, robusta y potente. Alternativamente, también se podría utilizar la HPLC-MS. Las reacciones más importantes de los ácidos grasos son: Esteriﬁcación: ácido graso + alcohol = éster + agua Saponiﬁcación: ácido graso + base fuerte = sal del ácido (jabón) + agua Autooxidación: los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados se rompen para formar los aldehídos correspondientes. En general, todos los ácidos grasos son lípidos saponiﬁcables, pero su comportamiento varía en función del tipo de alcohol con el que reaccionan. HIDRATOS DE CARBONO Los hidratos de carbono son estereoisómeros de polihidroxialdehídos o polihidroxicetonas con fórmula molecular general Cn(H2O)n. Tipos de carbohidratos según el grupo funcional: Aldosas: contienen un grupo funcional aldehído. Cetosas: contienen un grupo funcional cetona. Clasiﬁcación por número de átomos de carbono: Pentosas (C5). Hexosas (C6). Tipos de azúcares: Monosacáridos: aldosas y cetosas que contienen entre 3 y 8 átomos de carbono (C3-C8). Oligosacáridos: incluyen disacáridos y trisacáridos. Derivados de azúcares: alcoholes, ácidos, ésteres y glicósidos. Polisacáridos: ○ Pentosanas: arabana y la xilana. ○ Hexosanas: Glucosanas (glucógeno, celulosa, almidón, dextrano), Fructosanas, Manosanas, Galactanas. Heteropolisacáridos: incluyen compuestos como la pectina, agar-agar, y goma arábiga (de origen vegetal) y los mucopolisacáridos (de origen animal). Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Los hidratos de carbono son reductores porque los grupos alcohol pueden oxidarse para formar aldehídos, y estos a su vez pueden oxidarse para formar ácidos carboxílicos. En la naturaleza, los carbohidratos generalmente tienen conﬁguración D, lo que signiﬁca que el grupo -OH del penúltimo carbono está orientado a la derecha en su proyección de Fischer. Además, casi todos los átomos de carbono en las moléculas de carbohidratos son quirales, lo que les conﬁere actividad óptica, es decir, la capacidad de desviar el plano de la luz polarizada. Pueden ciclarse, formando un hemiacetal si el grupo -OH señalado ataca al grupo aldehído o cetona. Este proceso es reversible, lo que provoca que la molécula se abra y cierre continuamente, generando un nuevo carbono quiral, llamado carbono anomérico. Si la ciclación forma un anillo de 6 miembros, se denomina piranosa. Si forma un anillo de 5 miembros, se denomina furanosa. Dependiendo de la orientación del grupo -OH en el carbono anomérico respecto al grupo funcional: Si ambos están en el mismo plano, se llama isómero beta (β), siempre es más estable. Si están en distintos planos, se llama isómero alfa (α). Cursos de deportes acuáticos en Valencia ¡Rompe la rutina y sumérgete en la aventura! - Ocean Republik a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Para separar enantiómeros se necesita una columna quiral. Pero en RMN sí que se ven en picos diferentes, ya que tienen una constante de acoplamiento diferente (J). El carbono anomérico, al ser quiral, también puede generar un protón anomérico, que es clave para la elucidación estructural de monosacáridos en análisis metabolómicos. Este protón está menos apantallado y resuena a una frecuencia más alta en RMN, ya que está unido a un carbono que a su vez está unido a dos átomos de oxígeno. Este protón anomérico proporciona información sobre: La proporción de los isómeros alfa (α) y beta (β) en la muestra. La cantidad de glucosa o de otros monosacáridos presentes, centrándose en este protón. La amplitud del doblete que aparece en el espectro de RMN puede variar. ANÁLISIS DE HIDRATOS DE CARBONO LC-MS (Cromatografía Líquida - Espectrometría de Masas): Tiene baja sensibilidad para hidratos de carbono, por lo que es necesario derivatizar los compuestos para aumentar la sensibilidad o utilizar un detector electroquímico. Si no se dispone de GC-MS o RMN, es necesario contar con una columna muy especíﬁca para azúcares, capaz de separar y detectar moléculas prácticamente idénticas. GC-MS (Cromatografía de Gases - Espectrometría de Masas): Ofrece buena sensibilidad y resolución, pero requiere derivatización con trimetilsilano (TMS). La derivatización hace que los hidratos de carbono se vuelvan apolares, permitiendo que entren fácilmente en la fase gaseosa para el análisis. Sin embargo, no es posible simplemente metilar los grupos -OH, por lo que se añaden grupos trimetilsilano (Silicio con tres metilos) a cada grupo -OH. Este proceso convierte la molécula en apolar, sin aumentar mucho su tamaño. Aunque eﬁcaz, este procedimiento es laborioso y complicado, pero indispensable para analizar hidratos de carbono. RMN (Resonancia Magnética Nuclear): En el caso del RMN, los protones anoméricos son clave, ya que proporcionan información sobre la estructura y cantidad de los isómeros alfa y beta. ¡Repara tu patinete ya! Consigue un 10% de descuento en tu PitStop más cercano a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Prioridad en las técnicas analíticas: Primera opción: GC-MS (gases-masas). Segunda opción: RMN. Tercera opción: LC-MS (líquido-masas). AMINOÁCIDOS Compuestos orgánicos que se caracterizan por tener un grupo carboxilo (-COOH) y un grupo amino (-NH2). Pueden ser alfa, beta, gamma o delta aminoácidos, según el grupo amino se una al C1, 2, 3 o 4 contando a partir del grupo carboxilo. Son sólidos, cristalinos, de alto punto de fusión, solubles en agua, con actividad óptica (C es asimétrico) y con comportamiento químico anfótero (se ionizan como un ácido (-COOH cede H) o como una base (-NH2 capta H). Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Los dobles enlaces conjugados pueden detectarse mediante espectroscopía UV, ya que esta técnica es económica. En particular, los compuestos que absorben a 280 nm pueden detectarse, aunque no es posible cuantiﬁcar proteínas a 280 nm con precisión, ya que no todos los aminoácidos absorben a esa longitud de onda. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. La técnica ideal para la detección de compuestos conjugados es mediante cromatografía líquida acoplada a UV, aunque esta técnica no puede acoplarse a gases. Para el análisis de proteínas en general, es recomendable usar el método de Bradford, que es más ﬁable para la cuantiﬁcación de proteínas. En cuanto a los compuestos alifáticos, es posible derivatizarlos con trimetilsilano (TMS) y luego analizarlos mediante GC-MS (gases-masas). De igual forma, los compuestos aromáticos también pueden ser trimetilsilados. Si se tiene una mezcla de azúcares y aminoácidos de todo tipo, la derivatización con TMS es una solución eﬁciente para analizar todos los componentes en GC-MS. ÁCIDOS NUCLEICOS Compuestos químicos formados por C, H, O, N y P. Son polímeros de elevado PM. Por hidrólisis se pueden separar sus constituyentes, que son el ácido fosfórico, una pentosa (ribosa en el RNA o desoxirribosa en el DNA) y bases nitrogenadas. Usar liquidos uv, absorben a lambda 260nm (si solo me piden ac nucleicos). En el análisis de ¹H-RMN de las bases nitrogenadas: Las bases pirimidínicas (como la citosina) tienen dos protones susceptibles de resonar, que suelen aparecer como dobletes en el espectro. En el caso de las bases púricas (como la adenina), también se observan dos protones resonantes, pero estos aparecen como singuletes, ya que no presentan acoplamiento con protones adyacentes. Este patrón es característico para diferenciar las bases nitrogenadas en el espectro de RMN. ¡Repara tu patinete ya! Consigue un 10% de descuento en tu PitStop más cercano a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 ÁCIDOS ORGÁNICOS Compuestos orgánicos que poseen un grupo ácido (-COOH). Se concentran habitualmente en frutos de plantas. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Los metabolitos pequeños y polares pueden derivatizarse con TMS (trimetilsilano) y analizarse mediante GC-MS, especialmente útil para estudiar el metabolismo primario. Sin embargo, si se requiere identiﬁcar o cuantiﬁcar una molécula concreta, pueden usarse otras técnicas más eﬁcientes y especíﬁcas, como: LC-MS para compuestos que no sean fácilmente volátiles. RMN para obtener información estructural detallada. METABOLISMO SECUNDARIO TERPENOS Los terpenos son compuestos orgánicos derivados de la molécula de isopreno (C₅), que no contienen grupos funcionales en su forma básica, actuando simplemente como hidrocarburos. Cuando los terpenos son modiﬁcados químicamente se reorganiza su esqueleto hidrocarbonado y se convierten en terpenoides. Esto ocurre cuando los dobles enlaces en los terpenos se oxidan, transformándose en grupos hidroxilo (-OH). Los terpenos y terpenoides son componentes clave de los aceites esenciales de muchas plantas. Los terpenos se clasiﬁcan según el número de unidades de dos isoprenos (C₅+C₅) que contienen: Monoterpenos (C₁₀) Sesquiterpenos (C₁₅) Diterpenos (C₂₀) Sesterterpenos (C₂₅) Triterpenos (C₃₀) Tetraterpenos (C₄₀) Politerpenos ¡Repara tu patinete ya! Consigue un 10% de descuento en tu PitStop más cercano a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 La técnica analítica de elección para el análisis de terpenos y terpenoides es la GC-MS. Esto se debe a que los terpenos, al ser compuestos pequeños y apolares, son ideales para ser volatizados y analizados mediante esta técnica. La derivatización no suele ser necesaria en estos casos. Monoterpenoides (C10): Compuestos volátiles y aceites esenciales de plantas. Sesquiterpenoides (C15): Gran diversidad de compuestos (más de 100 esqueletos). Propiedades citotóxicas → lactonas sesquiterpénicas (no selectivas). Alto potencial para el descubrimiento de nuevos fármacos antitumorales. Diterpenoides (C20): Representados por el ﬁtol (alcohol de la cloroﬁla) y vitaminas A, E y K. Importante reconocer el núcleo básico (core) del diterpeno. Taxol: Un diterpenoide de interés particular por sus propiedades antitumorales. Steviósido: Un diterpeno glucosilado que contiene tres unidades de glucosa. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Triterpenoides (C30): Ampliamente distribuidos en el mundo vegetal. Estructura: Tetracíclica o pentacíclica. Saponinas: Son glicósidos que se caracterizan por tener grupos hidroxilo susceptibles de ser glicosilados en los carbonos C3 o C28. Esta modiﬁcación convierte a los Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. triterpenos en saponinas. Poseen una parte polar muy grande y una parte apolar igualmente signiﬁcativa. En una extracción con cloroformo y agua, la parte apolar se quedará en la fase de cloroformo y la parte polar en la fase acuosa, quedando en la interfase. Durante la agitación, se forman burbujas debido a la acción tensoactiva. Los triterpenoides con 30 átomos de carbono están en el límite de ser analizados en el gases-masas. Si están glicosilados, las llevo al liquido-masas o pueden ser hidrolizados para separar los azúcares y al gases-masas. No solo los triterpenoides pueden ser saponinas; también existen diterpenos glicosilados. Las saponinas tienen aplicaciones signiﬁcativas debido a sus propiedades antivirales, citotóxicas, hemolíticas y tensoactivas. Pueden ser utilizadas como adyuvantes en diversos medicamentos. Esteroides (C27): Derivan del esterano (ciclopentano perhidrofenantreno). Esteroles: Esteroides que contienen un grupo alcohol en la posición 3 (3-OH). Hormonas esteroideas: Esteroides que contienen un grupo cetona en la posición 3 (3-C=O). Saponinas: Glicósidos de esteroides. Debido a la presencia del grupo hidroxilo, el colesterol no es un metabolito volátil, por lo que es necesario trimetilsilarizarlo para su análisis mediante GC-MS o HPLC-MS. Carotenoides (C40): Compuestos formados por 8 unidades de isopreno. Son pigmentos fotosintéticos y precursores de la vitamina A (retinol). Color rojo: Ejemplos de carotenoides con fórmula C40H56. Color amarillo: Xantóﬁlas, con fórmula C40H56O2. Los carotenoides se encuentran principalmente en su forma trans (forma natural), pero pueden isomerizar a la forma cis bajo la exposición a la luz. Cursos de deportes acuáticos en Valencia ¡Rompe la rutina y sumérgete en la aventura! - Ocean Republik a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Por ello, es importante tener precaución con la exposición a la luz durante la toma y el procesado de la muestra, ya que pueden isomerizarse a la forma cis, lo cual se debe evitar. LC-UV es adecuada para su análisis debido a la presencia de numerosos dobles enlaces conjugados. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Análisis de terpenoides y esteroides: Los métodos analíticos basados en espectrometría de masas (MS) son más apropiados que los basados en resonancia magnética nuclear (NMR) para el análisis de estos compuestos. En NMR, el metilo y el protón anomérico de los azúcares son características comunes en los espectros. Muchos terpenoides están conjugados a azúcares, como en el caso de las saponinas, que son glicósidos de triterpenoides o esteroides. Para el análisis: GC-MS es adecuado para las agliconas (parte no glucosídica). LC-MS es preferible para los glicósidos. En el espectro de ESI-MS del esteviósido, que es un glúcido diterpénico, el peso molecular (PM) del glicósido no siempre corresponde al pico más alto en el espectro de masas. En el caso de las saponinas, una fragmentación típica es la pérdida de un azúcar, con una masa de 162 g/mol, que a menudo se reestructura con la adición de una molécula de agua. Espectro APCI-MS de la glicirrizina: La glicirrizina es un glúcido triterpénico (saponina) obtenido de la raíz del regaliz. Su estructura tiene la fórmula R = Glucurónico-Glucurónico, donde las unidades de ácido glucurónico provienen de la oxidación de la glucosa. En el análisis por APCI-MS (espectrometría de masas con ionización química a presión atmosférica), el ácido glucurónico suele estar muy presente en el espectro debido a su origen en la oxidación de la glucosa. En ocasiones, el pico molecular, que debería ser el último en el espectro, puede no aparecer si la glicosilación es muy agresiva o si el glicósido se fragmenta antes de llegar al detector. Cursos de deportes acuáticos en Valencia ¡Rompe la rutina y sumérgete en la aventura! - Ocean Republik a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Espectro 1H-NMR del ácido ursólico: El ácido ursólico es un triterpeno pentacíclico que se obtiene a partir de numerosas especies vegetales de la familia Labiatae. En el espectro de 1H-NMR, las señales de los grupos metilo son características de los terpenoides. Sin embargo, no todos los metilos aparecerán como singletes; solo aquellos que estén sobre carbonos cuaternarios mostrarán esta característica. COMPUESTOS FENÓLICOS Fenilpropanoides (C6-C3): Estructura básica C6-C3 (anillo fenílico + cadena de propano). El grupo C3 puede presentar diversas funciones químicas, como ácido carboxílico, aldehído, alcohol u oleﬁna. Ejemplos de fenilpropanoides presentes en aceites esenciales incluyen: Miristicina, safrol, y eugenol. Ácido cinámico: derivado de Cinnamomum. Otros ácidos importantes incluyen el ácido ferúlico, cumárico, cafeico y sinápico. El análisis por HPLC-UV es adecuado para muchos fenilpropanoides. Sin embargo, debido a la diversidad de estos compuestos, es recomendable utilizar HPLC-MS para obtener el peso molecular y diferenciar entre ellos. El eugenol es una molécula pequeña que, si se metila, puede identiﬁcarse fácilmente mediante GC-MS (cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas). Los otros fenilpropanoides mencionados suelen ser sintetizados por las plantas en respuesta al estrés. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Espectro 1H-NMR del ácido cafeico: El NMR es el método más conveniente. El ácido cafeico, que se presenta normalmente en su isómero trans, muestra una constante de acoplamiento grande (16 Hz), característica de la conﬁguración trans. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. En la mayoría de los casos, el ácido cafeico se encuentra conjugado con ácidos orgánicos o azúcares. El espectro 1H-NMR presenta 5 señales, correspondientes a los 5 protones unidos a átomos de carbono. Todas las señales aparecen como dobletes, ya que la regla del n+1 no se aplica completamente a los protones en sistemas aromáticos. En estos casos, todos los protones aromáticos resuenan como dobletes debido a los acoplamientos orto. Estilbenos (C6-C2): Tienen una estructura básica C6-C2 y se forman mediante una descarboxilación durante la biosíntesis, catalizada por la estilbeno sintetasa. Poseen una constante de acoplamiento similar a la de los fenilpropanoides (alrededor de 16 Hz en isómeros trans), pero los protones de los estilbenos resuenan a un mayor desplazamiento químico en el espectro 1H-RMN. En RMN, se desapantalla una señal, aparece entre 6,8 y 7 ppm HPLC-UV o HPLC-MS Los estilbenos se derivan de la unión de precursores fenilpropanoides (pero liberando 1 C más), aunque el detalle del enlace especíﬁco depende de las rutas biosintéticas particulares. Además, los estilbenos son conocidos por su alta capacidad antioxidante, lo que les conﬁere importancia en la defensa de las plantas y en aplicaciones nutricionales y farmacológicas. Cursos de deportes acuáticos en Valencia ¡Rompe la rutina y sumérgete en la aventura! - Ocean Republik a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Lignanos: Formados por la unión de dos unidades C6-C3 mediante enlaces β-β' (C18). Fitroestrógenos antioxidantes: ○ Gomisin: Se encuentra en Schisandra sp., con propiedades hepatoprotectoras. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. ○ Sesamin: Presente en Sesamum sp., utilizado como suplemento adelgazante en dietas. ○ Podoﬁlotoxina: Extraído de las raíces de Podophylum sp., es un precursor de los antitumorales como el etopósido y el tenipósido. Neolignanos: Presentan una estructura diferente, ya que no tienen unión β-β'. Ejemplos: Magnol, honokiol. Norlignanos: Contienen una unidad de carbono menos, con estructura C17. Cumarinas: Derivadas de la 2H-1-benzopiran-2-ona. Se encuentran en familias como Umbelliferae, Ranunculaceae, Leguminosae y Compositae. Clasiﬁcación: Cumarinas simples: Ejemplos como umbeliferona y escopoletina. Cumarinas complejas: Incluyen furanocumarinas, piranocumarinas y biscumarinas. El ciclo de las cumarinas puede abrirse en condiciones alcalinas. Se deben estudiar por ﬂuorescencia, ya que se mide perfectamente con UV, es incluso capaz de emitir luz por la cantidad de enlaces pi que hay en esta molécula (y los 2e- sueltos de los =O:). En el caso de RMN, todas las señales aromáticas entre 6 y 8 ppm. La oleﬁna (doble enlace) resuena entre 6,2 y 6,8. Poseen capacidad de reducir el tamaño de tumores. Derivan de los fenilpropanoides y, por lo tanto, provienen de la vía del shikimato. Actúan como marcadores de estrés en plantas. Flavonoides (C6-C3-C6): Compuestos formados por dos anillos C6 conectados por una unidad C3. Pueden presentar diferentes niveles de insaturación. Algunos contienen grupos funcionales como el hidroxilo (OH). Otros pueden tener carga positiva. La mayoría de los ﬂavonoides son de color amarillo. Sin embargo, algunos derivados, como las antocianinas, aportan el color rojo en las ﬂores. Cursos de deportes acuáticos en Valencia ¡Rompe la rutina y sumérgete en la aventura! - Ocean Republik a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Espectro UV de ﬂavonas y ﬂavonoles: 240-400 nm. Composición del espectro: Banda I (300-380 nm): Asociada al anillo B. Banda II (240-280 nm): Asociada al anillo A. Efecto batocrómico: La presencia de más grupos hidroxilo (↑OH) provoca un desplazamiento hacia el rojo del espectro, lo que se traduce en un aumento de la longitud de onda (↑λ) de los máximos de absorción. Los ﬂavonas y ﬂavonoles están totalmente caracterizados mediante espectroscopía UV. Espectro de 1H-RMN de ﬂavonoides: Anillo A: ○ H-6 y H-8: Señales en el rango de 6.0-6.5 ppm con un patrón de doblete (d) y constante de acoplamiento J = 2.5 Hz. Anillo C: ○ H-3: Señal en 6.3 ppm. Anillo B: ○ Los protones del anillo B están más desprotegidos (más desapantallados) que los del anillo A. Se detectan en el rango de 6.7-7.9 ppm. Quinonas: Presentes en animales, plantas y microorganismos. Tipos de quinonas: Antraquinonas Naftoquinonas Benzoquinonas Ejemplos importantes: Ubiquinona (coenzima Q) Vitamina K Mitomicina (antitumoral) Senósido (laxante) Alizarina (colorante) Colores característicos según el tipo de quinona: 1,4-quinonas: Color amarillo. 1,2-quinonas: Color rojo. La presencia de grupos hidroxilo (OH) intensiﬁca el color, haciéndolo más oscuro. Tautomería ceto-enólica: Sensibles al pH. Los grupos hidroxilo pueden oxidarse progresivamente hasta formar cetonas, cambiando la estructura y las propiedades de la molécula. EN RESUMEN: Los fenólicos se pueden estudiar por LC-UV o por LC-MS. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 ALCALOIDES Los alcaloides son compuestos orgánicos de origen natural que contienen nitrógeno. Todos menos los aminoácidos, si tienen N, son alcaloides. La presencia de este les conﬁere un carácter básico, lo que signiﬁca que pueden aceptar protones (base de Brønsted). Son Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. compuestos altamente especíﬁcos de las plantas, donde se encuentran de forma abundante, y generalmente presentan una marcada actividad farmacológica o toxicidad a bajas dosis. Pueden actuar como agonistas o antagonistas de neurotransmisores en el sistema nervioso, debido a la similitud estructural con estos compuestos. Por ello, algunos alcaloides son capaces de inducir adicción. La mayoría de los alcaloides se sintetizan a partir de aminoácidos, por lo que sus estructuras suelen estar relacionadas con estas biomoléculas precursoras. Clasiﬁcación según su Origen Biosintético: 1. Derivados de aminoácidos alifáticos: Se originan a partir de ornitina y lisina. Ejemplos: la nicotina y la hiosciamina. 2. Derivados de aminoácidos aromáticos: Proceden de fenilalanina y tirosina. Ejemplos: la efedrina y la mescalina. 3. Derivados del aminoácido aromático triptófano: Ejemplos: la psilocibina y la ibogaína. 4. De origen diverso: Incluye estructuras más complejas, como alcaloides imidazólicos, terpénicos y xánticos. Ejemplos: la cafeína y la teobromina. Los alcaloides se estudian mediante LC-MS, ya que estas permiten identiﬁcar y cuantiﬁcar de manera precisa las distintas estructuras presentes en una muestra compleja. Alcaloides derivados de ornitina: ¡Repara tu patinete ya! Consigue un 10% de descuento en tu PitStop más cercano a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Alcaloides Derivados de Lisina: 1. Alcaloides Quinolizidínicos ○ Familia: Fabaceae ○ Ejemplo: Esparteína Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. ○ Se utiliza en el tratamiento de taquicardias y tiene efectos oxitócicos, lo que signiﬁca que induce la contracción uterina. 2. Alcaloides Piperidínicos ○ Familia: Lobeliaceae ○ Ejemplo: Lobelina (presente en Lobelia inﬂata) ○ Funciona como un estimulante respiratorio, activando los centros respiratorios en el cerebro. 3. Alcaloides Piridínicos ○ Familia: Solanaceae ○ Ejemplo: Nicotina (presente en Nicotiana sp.) ○ Actúa como un estimulante respiratorio y también se emplea como insecticida por su alta toxicidad en invertebrados. Alcaloides Derivados de Fenilalanina y Tirosina: 1. Feniletilaminas ○ Estructura: Similares a los neurotransmisores endógenos, como la adrenalina (A), noradrenalina (NA) y dopamina (D). ○ Pueden tener efectos estimulantes o bloqueantes de neurotransmisores, actuando sobre el sistema nervioso central y periférico. Ejemplos: Efedrina: Un simpaticomimético que aumenta la liberación de neurotransmisores y estimula la actividad simpática. Mescalina: Un alucinógeno psicodisléptico que altera la percepción sensorial. 2. Isoquinoleínas ○ Benzilisoquinoleínas: Estructuralmente, poseen el patrón C6-C2-N-C2-C6, característico de su biogénesis. ○ Familias: Magnoliae, Ranunculae y Papaverae. ○ Ejemplos: Morﬁna: Un potente analgésico utilizado para el manejo del dolor severo. Berberina: Un compuesto con propiedades coleréticas y antifúngicas, utilizado en el tratamiento de infecciones y trastornos digestivos. Los alcaloides derivados de fenilalanina y tirosina poseen grupos aromáticos, lo que les permite ser detectados y cuantiﬁcados fácilmente mediante técnicas UV. Esta propiedad facilita su análisis en comparación con los derivados de lisina, que a menudo requieren métodos más especíﬁcos como LC-MS. Elimina la publicidad de este documento con 1 coin a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 Alcaloides Derivados del Triptófano: Se caracterizan por la presencia de un núcleo indólico, el cual proviene de la estructura del triptófano. Estos alcaloides indólicos presentan propiedades farmacológicas como antitumorales, antihipertensivos y antipsicóticos. Esta conﬁguración les conﬁere una alta aﬁnidad por los receptores de neurotransmisores, lo que explica sus efectos en el sistema nervioso y su acción farmacológica especíﬁca. Reserpina ○ Fuente: Rauwolﬁa serpentina. ○ Utilizado como antihipertensivo y antipsicótico. Actúa reduciendo la presión arterial y disminuyendo la actividad del sistema nervioso simpático al depletar las reservas de neurotransmisores como la noradrenalina. Yohimbina ○ Fuente: Pausinystalia yohimbe. ○ Conocido por sus propiedades afrodisíacas y estimulantes del sistema nervioso central, puede incrementar la liberación de noradrenalina y mejorar la función sexual. Vinblastina y Vincristina ○ Fuente: Catharanthus roseus (Vinca de Madagascar). ○ Alcaloides con potentes efectos antitumorales. Actúan inhibiendo la polimerización de los microtúbulos, interﬁriendo en la división celular y, por tanto, deteniendo el crecimiento de células cancerosas. Alcaloides de Origen Diverso: Pueden derivar de múltiples tipos de moléculas, como ácidos orgánicos o bases purínicas, y presentan una gran variedad de actividades biológicas. 1. Alcaloides Imidazólicos Pilocarpina: Actúa estimulando los receptores del sistema nervioso parasimpático. Se utiliza principalmente en el tratamiento del glaucoma. 2. Alcaloides Esteroídicos Solanina: Presente en plantas de la familia Solanaceae (como la patata y el tomate en altas concentraciones en sus partes verdes o no maduras). Es extremadamente tóxico. Inhibe la actividad de la colinesterasa y afecta el sistema nervioso central. 3. Alcaloides Diterpénicos Aconitina: Uno de los alcaloides más tóxicos conocidos. Actúa como un potente neurotóxico y cardiotóxico, alterando el ﬂujo de iones de sodio a través de las membranas celulares. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10969958 4. Alcaloides Purínicos (Xantinas) Cafeína, Teoﬁlina y Teobromina: Abundantes en el café (Coffea arabica), té (Camellia sinensis) y cacao (Theobroma cacao). Son estimulantes del sistema nervioso central. Aumentan la liberación de neurotransmisores como la dopamina y la noradrenalina, lo Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. que produce una mejora en el estado de alerta y reducción de la fatiga. A pesar de ser bases purínicas, no deben confundirse con las bases nitrogenadas del ADN y ARN, ya que sus estructuras son derivadas de la xantina. Estudio: HPLC-UV o HPLC-MS. Si tengo patrón: UV; si no tengo patrón: MS. Todo el metabolismo secundario, como los compuestos son muy poco abundantes, no se ven bien en el RMN. En los espectros de 1H-NMR, como en el de la nicotina, las señales son muy sensibles al ph: ¡Repara tu patinete ya! Consigue un 10% de descuento en tu PitStop más cercano

Tema 0: Introducción y Básicos (Proteómica y Metabolómica) - 4º Grado Biotecnología - UPV

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