Unit 2: Cleaning, Disinfection and Sterilization of Laboratory Material (PDF)

UT 2: LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL DEL LABORATORIO ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 2. LA LIMPIEZA 2.1. LOS DETERGENTES ◦ 2.1.1. CARACTERÍSTICAS DE LOS DETERGENTES ◦ 2.1.2. CLASIFICACIÓN DE LOS DETERGENTES 2.2. FORMAS DE LAVADO DEL MATE...

UT 2: LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL DEL LABORATORIO ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 2. LA LIMPIEZA 2.1. LOS DETERGENTES ◦ 2.1.1. CARACTERÍSTICAS DE LOS DETERGENTES ◦ 2.1.2. CLASIFICACIÓN DE LOS DETERGENTES 2.2. FORMAS DE LAVADO DEL MATERIAL 2.3. PRUEBAS DE QUE EL MATERIAL ESTÁ LIMPIO 3. LA DESINFECCIÓN 3.1. MÉTODOS DE DESINFECCIÓN ◦ 3.1.1. MÉTODOS MECÁNICOS Y FÍSICOS ◦ 3.1.2. MÉTODOS QUÍMICOS ◦ 3.1.3. APLICACIÓN DE LOS DESINFECTANTES 4. LA ESTERILIZACIÓN 4.1. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN ◦ 4.1.1. MÉTODOS FÍSICOS ◦ 4.1.2. MÉTODOS QUÍMICOS 4.2. CONTROL DE LA ESTERILIZACIÓN 1. INTRODUCCIÓN Tras su uso el material de laboratorio debe ser colocado inmediatamente en una solución de detergente, quitando cualquier tipo de restos que queden en el material. Siempre hay que proceder a la limpieza del material y aparatos inmediatamente después de su uso si es posible. Las contaminaciones por la falta de limpieza y cuidado pueden interferir en los resultados de los análisis. Para asegurarnos que el material con el que vamos a trabajar está en las condiciones adecuadas se llevarán a cabo 3 procesos: LIMPIAR, DESINFECTAR, ESTERILIZAR 2. LA LIMPIEZA Podemos definir limpieza como la acción de eliminar la suciedad, es decir, cualquier sustancia que no forme parte de aquello que queremos limpiar. Para ello se combina la frotación con la acción química de los detergentes. No implica la destrucción de los microorganismos que se encuentran en el objeto que se va a limpiar, sólo reduce la suciedad y los microorganismos. Es un paso previo a la desinfección o a una esterilización. La limpieza se debe de hacer a 3 niveles: PERSONAL: Según el nivel de peligrosidad del laboratorio hay que ir con pijama, una bata o mono de seguridad. Normalmente la vestimenta se lava en el propio centro, porque se somete a un lavado agresivo y además, evitamos el flujo de contaminantes de laboratorio a casa y de casa al laboratorio. El pelo largo debe estar recogido porque la caída de un pelo puede ser un artefacto en el análisis. Hay que lavarse las manos y usar guantes. LABORATORIO: Tanto la mesa de trabajo como las estanterías y las zonas comunes estarán ordenados y limpios. Hay que tener cuidado con el polvo. El laboratorio se debe mantener limpio y ordenado, no solo por las posibles interferencias en el análisis que puedan causar los agentes externos, sino también por la seguridad de los trabajadores que en él trabajan. Un laboratorio poco contaminado indica que se han llevado bien los protocolos de limpieza y así aumenta la seguridad. MATERIAL: El material debe ser lavado después de usarse siguiendo un protocolo de limpieza. El modo más común es a mano o usando máquinas de lavado automáticas. 2.1. LOS DETERGENTES El detergente es una sustancia que tiene la propiedad de dispersar finamente en el agua u otro líquido, un sólido, como por ejemplo, la suciedad o las impurezas de un objeto. 2.1.1. CARACTERÍSTICAS DE LOS DETERGENTES Estos compuestos varían en su estructura química, pero todos ellos tienen moléculas tensioactivas o surfactantes, es decir, que rompen la tensión superficial del agua. Se caracterizan por 3 propiedades básicas, cuya combinación los hace efectivos:  Poder humectante: El detergente ayuda a romper la tensión superficial del agua, consiguiendo así que el agua penetre mejor en un material. Dispersión: El detergente rompe y desintegra la suciedad compacta y la reduce a partículas muy finas. Suspensión: El detergente envuelve las partículas de suciedad que previamente ha dispersado, formando una emulsión. Estas partículas emulsionadas serán arrastradas por el agua durante el enjuague. Si no se produjera esta emulsión de la suciedad, las partículas se volverían a adherir a la superficie. 2.1.2. CLASIFICACIÓN DE LOS DETERGENTES Los detergentes se clasifican en: Iónicos: Dependiendo de su carga ◦ aniónicos: carga negativa ◦ catiónicos: carga positiva ◦ anfóteros: ambas cargas No iónicos Todos ellos, por definición, son moléculas tensioactivas. Existen muchas moléculas tensioactivas: JABONES: Son tensioactivos aniónicos conocidos desde la antigüedad, aunque no se suelen considerar detergentes en la práctica. Se obtienen al oxidar un ácido graso de cadena larga con una sal alcalina, frecuentemente de sodio o de potasio. A este proceso se denomina saponificación. SULFONATOS DE ALQUILBENCENO: Son tensioactivos aniónicos. Son los detergentes más usados por su fuerte acción surfactante. SALES DE AMINA Y LOS COMPUESTOS DE AMONIO CUATERNARIO: Son los detergentes catiónicos más usados. Tienen la capacidad de absorber las cargas negativas de las superficies. Impiden el crecimiento bacteriano y se utilizan en la formulación desinfectante y detergentes bactericidas. 2.2. FORMAS DE LAVADO DEL MATERIAL 1. Limpieza a mano frotando: Por arrastre mecánico de la suciedad con cepillos, agua y jabón. Seguidamente se enjuaga con agua del grifo y después con agua destilada. Es el método habitual en el laboratorio (todo el material). Los portaobjetos, tras el lavado habitual y una vez secos, se desengrasan con una  mezcla de alcohol-éter a partes iguales y se guardan en un recipiente hermético con alcohol etílico. 2. Limpieza por inmersión: Se colocan los instrumentos del laboratorio en la solución de limpieza totalmente cubiertos por ella durante 20-30 minutos. Se termina enjuagando con agua destilada. Podemos aumentar la temperatura de la solución para obtener un mejor resultado. Las pipetas graduadas se enjuagan con agua destilada y, si se considera conveniente, se sumergen totalmente, en posición vertical, en agua jabonosa o mezcla crómica. 3. Limpieza a máquina (lavavajillas) 4. Baño de ultrasonidos: Se puede limpiar tanto el material de vidrio como el de plástico. 5. Limpieza analítica de trazas: dependiendo del material a eliminar: ◦ Para eliminar trazas de metales se emplea una solución de ácido nítrico 1N en inmersión durante 1 hora. Después se enjuaga con agua destilada. ◦ Para eliminar trazas orgánicas (sangre, orina, tejidos,…) se emplean lejías o disolventes orgánicos. Después se introducen en ácido clorhídrico 1N y finalmente se enjuaga con agua destilada. ◦ Para eliminar trazas de grasa u otras impurezas se usa la mezcla crómica que destruye por oxidación toda la materia orgánica presente. Es una disolución de dicromato sódico o potásico en ácido sulfúrico muy concentrado. Esta mezcla es especialmente adecuada para la limpieza y desengrasado del material de vidrio. La disolución se vierte en el recipiente a limpiar y se deja actuar durante la noche. 2.3. PRUEBAS DE QUE EL MATERIAL ESTÁ LIMPIO MATERIAL DE VIDRIO La prueba de que el material de vidrio está completamente limpio se obtiene si al mojarlo con agua destilada ésta humedece homogéneamente toda la superficie, sólo si es así podemos considerar que el material está limpio. En caso contrario indicará que habrán impurezas. El material de laboratorio que haya estado en contacto con productos infecciosos o potencialmente infecciosos (no está confirmado) debe desinfectarse o esterilizarse antes de volver a ser utilizado. Se debe realizar un control de calidad del lavado del material de vidrio. Este control puede ser: Control diario: Se elige al azar un utensilio de vidrio limpio y seco, se examina en busca de machas de agua. Si las encontramos, todo el material deberá ser lavado de nuevo, enjuagado y secado. Deberá reflejar en las hojas de control de calidad. Control semanal: Se observa la presencia de machas de agua, lo cual indica un enjuague insuficiente. Se puede realizar: ◦ Un escurrido con agua destilada, se humedece el material con ésta y se observa si moja homogéneamente o no toda la superficie. Si existen zonas sucias se depositan las gotitas de agua donde la suciedad y quedan ahí retenidas. ◦ Una solución de bromosulfoftaleína de 20g/l. Enjuagar con esta mezcla el recipiente de vidrio elegido al azar. El desarrollo de una coloración rosada es indicativo de la presencia de restos de detergentes. ◦ Se debe aprovechar el control semanal para descartar el material de vidrio dañado o astillado. MATERIAL DE PLÁSTICO El material de plástico reutilizable lo limpiaremos igual que el de vidrio, pero hay que tener en cuenta que el plástico puede ser atacado por disolventes orgánicos y la mezcla crómica. Si ha estado en contacto con productos infecciosos o potencialmente infecciosos debe desinfectarse o esterilizarse antes de volver a ser utilizado. 3. LA DESINFECCIÓN Es el proceso por el que un material, un instrumento o una solución química quedan libres de formas vegetativas de microorganismos (metabólicamente activos), aunque no ofrece la seguridad de una esterilización. No siempre son necesarios los mismos niveles de desinfección. Existen 3 niveles:  Desinfección de baja intensidad: Puede destruir la mayoría de las formas vegetativas bacterianas y también algunos virus y hongos. No destruyen las esporas bacterianas. Desinfección de intensidad media: Destruye todas las formas vegetativas bacterianas y a la mayoría de los virus y los hongos, pero no destruye las esporas bacterianas. Desinfección de alta intensidad: Destruye todos los microorganismos excepto algunas esporas bacterianas. 3.1. MÉTODOS DE DESINFECCIÓN La desinfección se puede llevar a cabo mediante procedimientos mecánicos y físicos o con productos químicos. Sea cual sea el método escogido, previamente hay que lavar el instrumento. 3.1.1. MÉTODOS MECÁNICOS Y FÍSICOS EL CALENTAMIENTO: Existen diferentes métodos de desinfección por calentamiento: La pasteurización: Se sumerge el objeto en agua a unos 70ºC durante 10 minutos. Este procedimiento consigue eliminar las bacterias y la mayoría de los hongos, virus y protozoos. La ebullición: Se sumerge el objeto en agua hirviendo (100ºC) durante 10 minutos. Es una alternativa útil si resulta imprescindible volver a utilizar ciertos materiales. LA IRRADIACIÓN CON ULTRAVIOLETA: La acción durante 20 segundos de lámparas de radiación ultravioleta mata la mayoría de los gérmenes. Las radiaciones UV son poco penetrantes, por lo que solo son efectivas para desinfectar objetos si son de superficie lisa y si la fuente de las radiaciones se sitúa cerca de ellos, de forma que la radiación pueda incidir directamente en toda la superficie. Las radiaciones UV se emplean para desinfectar superficies de trabajo y para mantener el nivel de desinfección del agua tratada y evitar que se contamine mientras circula por el circuito del agua. LOS ULTRASONIDOS: Las cubetas se llenan de solución desinfectante (p.e. con detergente catiónico). Los ultrasonidos hacen vibrar a gran velocidad las partículas de la solución, a la vez que se producen pequeñas burbujas que entran en todos los recodos del material y arrancan la suciedad y matan los microorganismos. EL FILTRADO CON FLUJO LAMINAR: Los sistemas con filtros de flujo laminar se usan para desinfectar el aire en salas o en cabinas de seguridad. Este tipo de desinfección es necesaria cuando se trabaja con determinados microorganismos, para reducir el riesgo de contagio del personal o también de contaminación de la muestra o trabajo. Un equipo capta el aire de la sala o de la cabina, lo pasa a través de filtros que retienen gérmenes y lo devuelve a la sala o cabina. La captación, filtración y devolución del aire se va produciendo de forma continuada. Dependiendo del tipo de filtros que se usen, el aire filtrado tendrá uno u otro nivel de desinfección, e incluso, se puede llegar a considerar que es prácticamente estéril. 3.1.2. MÉTODOS QUÍMICOS Los productos químicos desinfectantes son sustancias capaces de producir la muerte de los microorganismos patógenos. Se denominan propiamente desinfectantes a los que se aplican sobre las superficies de trabajo y objetos. Cuando estos productos químicos se usan sobre algunos tejidos biológicos se denominan antisépticos. Los desinfectantes químicos que más se usan son: Alcohol etílico de 70º: Elimina muchas bacterias y algunos virus, hongos pero no esporas. Tiene un espectro antibacteriano limitado. Es uno de los productos de uso más común para desinfectar las superficies de trabajo y como antiséptico de uso externo (piel). Glutaraldehído: Se emplea en disolución acuosa al 2% durante 20-45 minutos como desinfectante de alto nivel. Se consigue la esterilización tras 10-12 horas. Formaldehído: se prepara al 8 %. También es muy tóxico y se debe manipular con las mismas protecciones que con el glutaraldehído. Peróxido de hidrógeno: se utiliza al 6 %. No necesita calor y el ciclo de uso solo dura 55-75 minutos. No deja ningún residuo tóxico. Hipoclorito sódico (lejía): Es un potente bactericida. Es de acción rápida pero transitoria, porque su agente activo, el cloro, se evapora. Es el más común y se utiliza para desinfectar suelos, paredes, etc. No se puede usar como antiséptico porque es corrosivo.  Clorofenoles: Se utilizan para limpieza de paredes, sobre todo asociados a detergentes catiónicos. También se usa para la desinfección de manos. Compuestos yodados: Son potentes bactericidas, viricidas y fungicidas, el que más se usa es la povidona yodada que se puede usar como solución jabonosa, alcohólica o acuosa y a diferentes concentraciones. Biguanidas: Se usan en solución alcohólica o acuosa para desinfectar la piel. Ejmp: clorhexidina. Oxidantes: Como el agua oxigenada, tienen un efecto rápido. 3.1.3. APLICACIÓN DE LOS DESINFECTANTES Los desinfectantes químicos son sustancias líquidas que pueden aplicarse mediante inmersión, loción o pulverización: Inmersión: Consiste en sumergir el objeto en una solución desinfectante durante 10 minutos, así se consigue una desinfección a nivel bajo. Removiendo el líquido de vez en cuando se consigue que el desinfectante llegue mejor a todos los rincones internos y externos del objeto. Loción: Consiste en frotar el objeto con una bayeta o una esponja mojadas en un desinfectante adecuado. Se aplica a los objetos grandes y en algunas partes de los equipos de los laboratorios. Pulverización: El desinfectante se proyecta uniformemente en pequeñas gotas sobre la superficie del objeto que quiere tratarse. Se aplica en superficies y en algunas partes de los equipos del laboratorio. Los desinfectantes se deben aplicar con cuidado y hay que tomar precauciones para su manejo y conservación. 4. LA ESTERILIZACIÓN Es el procedimiento físico o químico en el que el material queda libre de microorganismos, incluyendo las esporas. Por su agresividad, este procedimiento nunca se debe aplicar sobre tejidos vivos. 4.1. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN Se pueden utilizar procedimientos físicos (los más habituales) y procedimientos químicos. 4.1.1. MÉTODOS FÍSICOS CALOR: Es el método que más se utiliza para la esterilización. Su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura que se alcanza. En distinto grado, todos los microorganismos son vulnerables al calor. El aumento de la temperatura provoca la desnaturalización de las proteínas, la fusión y desorganización de membranas, así como procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos. Los objetos se pueden esterilizar con: Calor húmedo: Produce la desnaturalización y la coagulación de las proteínas. La estufa de vapor (autoclave) es el instrumento que más se usa para la esterilización, y consiste en la aplicación de vapor de agua dentro de la autoclave, aumentando la presión del interior y, en consecuencia, la temperatura hasta 120 ºC. Se mantienen estas condiciones durante 20 minutos. Si estas condiciones no se cumplen, para esterilizar medios de cultivo por lo general se utiliza la tindalización, que consiste en alcanzar los 100ºC durante 30 minutos y repetir el ciclo 3 días consecutivos. En la autoclave se pueden esterilizar objetos de plástico, caucho, tejido, cristal, goma, metal, cerámica y líquidos. Calor seco: Oxida las proteínas e incluso carboniza la materia orgánica. Se puede aplicar de 3 formas: ◦ Flameado: El material se expone a la llama de un mechero bunsen durante un mínimo de 20 segundos. Se utiliza en el laboratorio de microbiología para esterilizar las asas de siembra y las bocas de tubos o matraces de vidrio durante la preparación de cultivos microbianos. ◦ Hornos de incineración: En este caso se destruye tanto el microorganismo como el objeto. Se utiliza para eliminar determinados instrumentos contaminados o cultivos. RADIACIONES IONIZANTES: Su acción depende del tipo de radiación, el tiempo de exposición y la dosis de radiación. Se aplican rayos gamma. Son radiaciones muy penetrantes que esterilizan el material aunque esté envuelto en plástico e incluso dentro de cajas de cartón o madera. Las instalaciones deben estar bien aisladas. Este método se suele usar en las industrias que fabrican material desechable como: catéteres intravenosos, placas de Petri o material de plástico de un solo uso como pipetas, puntas de pipeta o asas de siembra. RAYOS ULTRAVIOLETAS: Es un tipo de radiación ionizante. Son poco penetrantes y afectan al material genético de los microorganismos. Es un método habitual para esterilizar las superficies de trabajo de siembras, campanas de flujo y quirófanos. FILTRACIÓN: Es el principal método de laboratorio para esterilizar disoluciones de materiales termolábiles (se destruyen a altas temperaturas). Consiste en colocar la disolución a través de filtros con poros de tamaños especiales capaces de retener los distintos microorganismos. Es un método de esterilización parcial, ya que algunos agentes como los virus, no quedan retenidos en las membranas de filtración. 4.1.2. MÉTODOS QUÍMICOS Un producto químico tiene utilidad para esterilizar materiales de laboratorio que no soportan temperaturas superiores a 60ºC, como los que contienen fibra óptica o los plásticos termolábiles, por lo que es necesario esterilizarlos en frío mediante sustancias químicas. El problema es que las sustancias químicas, usadas en las concentraciones y tiempo que las hacen letales para los microorganismos, también son tóxicas para las personas, de modo que hay que utilizarlos con precauciones especiales. Las principales sustancias que se utilizan son: Óxido de etileno: Es la que más se emplea. Se usa en forma de gas introducido en una cámara especial donde se han colocado previamente los materiales que se van a esterilizar. La cámara se mantiene a 40 ºC unas 3-8 horas. En estas condiciones se destruyen todos los microorganismos, incluidas las esporas. Tienen un gran poder de penetración, por lo que se pueden utilizar en materiales ya empaquetados. Se usa para esterilizar materiales sensibles al calor, tanto de laboratorio como materiales médicos termolábiles (suturas, catéteres, equipos de anestesia, etc.) El glutaraldehído: Tienen grandes cualidades bactericidas, fungicidas y viricidas, pero es un irritante de la piel, los ojos y las vías respiratorias, además es sensibilizante, por lo cual su uso se restringe a casos imprescindibles. Se usa para esterilizar material destinado a endoscopias y de otros aparatos o materiales no resistentes al hipoclorito sódico, al calor ni a otros tratamientos. También se utiliza  para la limpieza, desinfección y esterilización de suelos, paredes, armarios, mesas, quirófanos y zonas de alto riesgo. El peróxido de hidrógeno (agua oxigenada): Se usa en estado de plasma (estado intermedio entre líquido y gas). Se utiliza porque no necesita calor, el ciclo dura entre 55 y 75 minutos y no requiere ventilación posterior porque no deja ningún residuo tóxico. El problema es que es muy caro. 4.2. CONTROL DE LA ESTERILIZACIÓN Para asegurar que la esterilización se ha llevado a cabo con una eficiencia del 100%, se recomienda efectuar los controles oportunos siguientes: Controles físicos: Se revisa el funcionamiento mecánico de los dispositivos mediante termoelementos, manómetros, higrómetros, termómetros, etc, que actualmente ya vienen incorporados en la mayoría de los sistemas de esterilización. Es importante también supervisar las graficas de registros. Con ello nos aseguramos de que se han alcanzado los parámetros de temperatura y presión en la autoclave o en la estufa. Indicadores químicos: Los termocromos o indicadores colorimétricos térmicos son principalmente compuestos a base de sales de diferentes metales. Los indicadores se añaden a un papel especial, este papel se introduce en la autoclave o una estufa y se observa si cambian de color, lo que indicará que han alcanzado la temperatura deseada. Suelen presentarse en forma de cinta adhesiva o de tiras de papel que se ponen en los paquetes que se van a esterilizar. Se utilizan en la esterilización de estufas y autoclaves. Indicadores biológicos: Estos controles microbiológicos confirman si el proceso es capaz de alcanzar la pequeñísima probabilidad de supervivencia microbiana. Son preparados comerciales que contienen esporas de Bacillus stearothermophilus. Se utiliza para verificar que un procedimiento de esterilización que hemos usado ha funcionado correctamente y ha logrado destruir todos los microorganismos, incluidas las esporas. Hay que seguir las instrucciones del fabricante: se introducen en el autoclave los envases con las esporas junto al material que se va a esterilizar. Terminado el proceso de esterilización, se deben incubar. Si no crece nada, se debe considerar que la esterilización los ha destruido.