Bioquímica - Tema 2 - Inhibición Enzimática PDF

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BIOQUÍMICA Tema 2. Biomoléculas Mecanismos de regulación de la actividad enzimática: inhibición enzimática. Grisel Del Toro García, PhD Lic. Amanda Troya Pérez [email protected], [email protected], [email protected] [email protected] Departamento Docente de Farmacia Instituto de Farmacia y Alimentos Universidad de La Habana Tema 2: Biomoléculas Conferencia No. 4: Mecanismos de regulación de la actividad enzimática. Sumario 1 2 3 Objetivo Analizar los diferentes mecanismos mediante los cuales los inhibidores regulan la actividad catalítica de las enzimas. Bibliografía: Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principios de Bioquímica. 5ta edición. Ediciones Omega, S.A. 2009. ISBN 978-84-282-1486-5. Parte I. Capítulo 6, pág. 201-205. En la carpeta de la asignatura encontrarán capítulos de este libro, además pueden acceder a los otros materiales de referencia como el Atlas de Bioquímica. Buscar, siempre que lo estimen necesario, información en internet, pero cuidado, que sea de fuentes científicas confiables, por ejemplo, pueden acceder al Google Académico. Se resaltan y resumen contenidos esenciales que el estudiante debe entender, profundizar en la bibliografía, analizar, aprender, para poder luego integrar y aplicar.  1 Factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas enzimáticamente Este contenido lo pueden encontrar en Parte I. Capítulo 6. ¿Qué factores pueden afectar la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente? o Concentración de sustrato La influencia de la concentración del sustrato en la velocidad de la reacción lo estudiamos en la conferencia anterior, para enzimas que siguen una cinética de M-M. Analizamos como, con la [Ez] constante … o A [S] relativamente bajas, aumenta la velocidad, V0 tiene una dependencia lineal con respecto a [S], la reacción es de orden 1. o A mayor [S] se observa una meseta, los incrementos de V0 son menores, la reacción en ese tramo tiene orden mixto. o A [S] mucho mayores, la velocidad se mantiene constante independientemente de la concentración de sustrato, se alcanza la velocidad máxima, la reacción tiene en ese tramo orden 0. o o Concentración de enzima Según la ecuación que describe la cinética enzimática mono sustrato: Ez, S y P representan enzima, sustrato y producto, respectivamente. EzS el complejo de la enzima con el sustrato. k1 k2 Ez + S EzS Ez + P k-1 Al analizar la ecuación, es lógico pensar que debe existir una relación proporcional entre la concentración de enzima y la velocidad de la reacción. Al graficar V/[Ez], tendríamos un comportamiento lineal, comportamiento que es válido siempre y cuando la concentración de sustrato no sea limitante, siempre saturante. Orden 1 con respecto a la [Ez]. Si no se cumplen estas condiciones entonces no habría linealidad, la [S] sería limitante y el orden de la reacción sería mixto, diferente de 1. o ph Las enzimas son proteínas: o Sus propiedades son muy sensibles al pH. o La mayoría solo son activas en un estrecho intervalo de pH, típicamente entre 5 y 9. o Presentan un pH característico (óptimo) en el que su actividad es mayor; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye.  El pH actúa sobre una combinación de factores: o la fijación del sustrato a la enzima, o la actividad catalítica de la enzima, o la ionización del sustrato, o la variación de la estructura proteica. La relación entre la actividad de la enzima y el pH depende principalmente del comportamiento ácido base de la Ez y el S. El perfil de la curva de velocidad (actividad) en función del pH de muchas enzimas es acampanado, aunque para otras puede variar. Figura 1. Intervalo de pH óptimo para algunas enzimas. La forma de la curva de velocidad vs pH varía con la [S], porque el valor de Km de muchas enzimas varía con el pH. Estas curvas deben construirse a partir de experimentos realizados con concentraciones saturantes de sustrato, en un rango de pH (V0 = Vmax). pH óptimo: pH donde Vmax (experimental) es la mayor. El pH óptimo de una Ez puede no ser idéntico al pH de su entorno celular, el cual puede encontrarse en la pendiente ascendente o descendente de su curva V0 vs pH. Esto demuestra que el pH constituye un factor importante en la regulación intracelular de la actividad de muchas enzimas. Los valores de pK de los grupos del CA pueden ser determinados frecuentemente, midiendo la dependencia con el pH de la pendiente 1/[s] y la velocidad máxima aparente. o La temperatura La velocidad de la mayoría de las reacciones químicas aumenta con el incremento de la temperatura. A mayor T, mayor energía cinética de las moléculas reaccionantes, por lo que aumentan las colisiones productivas por unidad de tiempo.  o Ez = moléculas proteicas complejas, su actividad catalítica es producto de una estructura tridimensional altamente ordenada y precisa, que permite la yuxtaposición de grupos R de aminoácidos determinados, para formar sitios de unión estereoespecíficos del S y el centro catalítico. o La estructura tridimensional se mantiene por un número grande de enlaces no covalentes, débiles, por lo que una molécula enzimática es una estructura frágil y delicada. o Si la molécula absorbe demasiada energía, se pierde la estructura tridimensional, la Ez se desnaturaliza, y pierde su actividad catalítica. o A mayor T el incremento de la velocidad (resultante del aumento de las colisiones Ez + S), puede ser anulada por el aumento de la velocidad de desnaturalización. o Como consecuencia, un gráfico de V0 vs T muestra, generalmente, un máximo que algunas veces se denomina «temperatura óptima». o Constante dieléctrica (m) Fuerza que se opone a la atracción entre dos iones con cargas opuestas. Afecta la estabilidad de la Ez por modulación de las interacciones electrostáticas que estabilizan la conformación nativa de la Ez en disolución. o Influencia de otros metabolitos en la reacción enzimática Activadores Cualquier sustancia que aumente la V de una reacción enzimática. Incrementan la eficiencia catalítica al aumentar el número de moléculas de S que son transformadas a P por un mol de la Ez en la misma unidad de tiempo. Inhibidores Cualquier sustancia que disminuya o anule la V de una reacción enzimática.  2 Inhibición enzimática: efecto de los inhibidores enzimáticos Este contenido lo pueden encontrar en Parte I. Capítulo 6, pp. 201-205. La acción catalítica de las enzimas es regulable, están sujetas a controles que pueden ir desde el genético, a nivel de la síntesis de la proteína enzimática, hasta la regulación de la actividad por cambios conformacionales reversibles de la molécula, debido a señales específicas. Esto permite que la velocidad de las reacciones enzimáticas pueda variar en un amplio rango de acuerdo a las condiciones celulares. Uno de los principios fundamentales de la regulación en las células vivas y uno de los procedimientos de diagnóstico más importantes, es la inhibición de la actividad enzimática. Inhibición Enzimática El proceso donde una molécula pequeña y específica, o un grupo de moléculas (iones metálicos o no), controla de forma exacta la actividad metabólica y el recambio de los sistemas celulares. Inhibidor Una molécula que se incorpora al complejo funcional enzimático y disminuye la actividad catalítica en condiciones fisiológicas establecidas. Las enzimas catalizan todos los procesos celulares, razón por la cual los inhibidores enzimáticos se encuentran entre los agentes farmacéuticos más importantes. Pueden ser medicamentos (antibióticos), preservos, venenos y toxinas, pesticidas. Ejemplos Ácido-acetil-salicílico (Aspirina)-(AINE). Mecanismo de acción: inhibe la Ez que cataliza el 1er. paso en la síntesis de prostaglandinas, compuesto que interviene en algunos procesos que reducen el dolor. Penicilina Mecanismo de acción: inhibe una Ez que las bacterias usan en la construcción de su pared celular. El estudio de los inhibidores enzimáticos también ha proporcionado información valiosa sobre los mecanismos enzimáticos y ha ayudado a definir algunas rutas metabólicas. Se clasifican en dos grupos: los inhibidores enzimáticos reversibles y los irreversibles, en dependencia de su interacción con la enzima. Los inhibidores irreversibles son conocidos como inhibidores suicidas. Figura 2. Clasificación de los inhibidores enzimáticos en su asociación con la enzima. Como se observa en el esquema de la figura 3, existen tres tipos de inhibidores reversibles. Figura 3. Clasificación de los inhibidores reversibles a partir de su asociación con la enzima. Sustancia que disminuye, neutraliza o regula la actividad enzimática Competitivo Unión del I al Centro Activo El I se une a la Ez covalentemente y la No Competitivo Unión del I a un inutiliza lugar diferente del permanentemente. CA Acompetitivo Unión del I sólo al complejo EzS Considerando la asociación del inhibidor con la enzima se clasifican los mecanismos de Inhibición Enzimática en: Inhibición Irreversible, Inhibición Reversible Competitiva, Inhibición Reversible No Competitiva e Inhibición Reversible Acompetitiva (Incompetitiva). La inhibición reversible se clasifica según … o El fenómeno cinético que induce el inhibidor en cuestión. o La modificación del equilibrio del estado de transición Ez-S. o La variación de Km a Km aparente (Kma) según las condiciones del fenómeno. o La modulación de la cinética según Linerweaver-Burk, y según resultados experimentales. A continuación, las características de cada mecanismo Figura 4. Características de la Inhibición Reversible Competitiva (IRC). Un inhibidor competitivo puede ser un análogo o derivado no metabolizable del verdadero S, un S alternativo de la Ez o un producto de la reacción. En cualquiera de los casos se produce un complejo final inactivo, a partir del cual se puede disociar el I y ser sustituido por una molécula de S, antes de que la reacción pueda tener lugar para esa molécula enzimática en particular. Figura 5. Modelos que describen la Inhibición Reversible Competitiva. A-Reacción enzimática. B, C, D-Reacción en presencia de un inhibidor competitivo. A B C D ¿De qué factores depende el efecto de un Inhibidor Competitivo? De la … Concentración del Inhibidor [I] Concentración del Sustrato [S] Afinidad relativa del Sustrato y el Inhibidor por la Ez. Ejemplo: A una concentración definida del inhibidor y de la enzima … Si la [S] es baja, el I competirá favorablemente con el S por los sitios de unión en la Ez, entonces el grado de inhibición es grande. Sin embargo, A las mismas concentraciones de Ez e I Si la [S] es alta, el I tendrá menos éxito al competir con el S por los sitios de unión disponibles en la Ez, el grado de inhibición será menos marcado. A muy altas concentraciones de sustrato, estas moléculas estarán presentes en un número elevado, muy por encima del número de moléculas de inhibidor y el efecto del inhibidor será imperceptible. Por tanto, el valor de Vmax para la reacción no cambiará. Sin embargo, como resultado de la inhibición el valor aparente de Km (es decir, la concentración de sustrato a la mitad de la Vmax), incrementa. Veamos un ejemplo de Inhibición Reversible Competitiva (IRC) Figura 6. Succinato deshidrogenasa (SDH), enzima del Ciclo de los Ácidos Tricarboxílicos (CAT), cataliza la conversión del succinato en fumarato. ¿Qué ocurre en presencia del malonato (inhibidor)? El malonato se parece al succinato, existe una analogía estructural entre ellos, ambos poseen dos grupos carboxilatos en los extremos; por tanto, la Ez SDH es capaz de reconocer al malonato de igual forma que reconoce al succinato. La efectividad del inhibidor (malonato) para inhibir competitivamente a la SDH sugiere que el sitio de fijación está diseñado para fijar ambos grupos carboxilatos. Con la resultante de que el malonato no puede ser deshidrogenado y no se lleva a cabo la reacción, no se puede obtener fumarato. Se ha formado un complejo Ez-I inactivo, no reactivo.  ¿Cómo es posible reconocer la IRC? Un camino… Figura 7. Gráfica de la Inhibición Reversible Competitiva. Curva 1: reacción enzimática, los parámetros cinéticos Km (0,5 Vmax) 1 - Sin Inhibidor y la Vmax a mayor concentración del S se lograr la Vmax o 100% de saturación de los sitios catalíticos, la formación completa de los productos Curva 2: reacción enzimática en presencia de I 2 - Con Inhibidor A una [I] constante, aumentar [S] Compiten S e I por el CA de la Ez, se enlentece la reacción, gana quien esté en mayor concentración, en este caso el % de inhibición disminuye, Km aumenta en presencia de un inhibidor competitivo hacia una Kma (aparente) Disminuye la velocidad de la reacción, pero la Vmax permanecerá constante, no se afecta la eficiencia catalítica de la Ez. Otro camino… gráfica de los dobles recíprocos Plotear 1/V0 vs 1/[S], se obtienen rectas con diferentes pendientes para variadas concentraciones del I Todas las rectas cortan el eje 1/V0 por el mismo punto. Figura 8. Gráfica de los dobles recíprocos en la Inhibición Reversible Competitiva. Analizando los parámetros cinéticos y = mx + n n = 1/Vmax Vmax no varía, la eficiencia catalítica no se afecta ¿Cómo se elimina el efecto inhibitorio? cuando [S] >>>>>>>> [I] ¿Cómo se afecta Km en presencia de un inhibidor competitivo? [I] Km = [S] cuando V0 = Vmax/2 Km se incrementa a Kma Kma = Km 1+ KI ¿Ha leído alguna vez cuál es la terapia para el envenenamiento con metanol? Figura 9. Características de la Inhibición Reversible No Competitiva (IRNC).  Un inhibidor no competitivo puede unirse a la molécula de Ez y producir un complejo inactivo, independientemente de que la molécula de sustrato se haya unido o no a la enzima. El inhibidor, por lo tanto, debe unirse a un sitio diferente del sitio de unión del sustrato. Un inhibidor no competitivo clásico no produce ningún efecto sobre la unión del sustrato y viceversa, de modo que el inhibidor se une a la enzima y al complejo enzima-sustrato, y el sustrato se une a la enzima y al complejo enzima-inhibidor, sin provocar, ninguno de los dos ligandos, alteración en la constante de disociación del otro ligando. Sin embargo, el complejo EzSI es inactivo. Es posible que el inhibidor distorsione lo suficiente a la enzima como para prevenir la posición adecuada del centro catalítico, de modo que EzSI es un complejo no productivo. Otra posibilidad es que el inhibidor no pueda unirse al complejo enzima-sustrato y por tanto no existe la ruta EzS + I EzSI, o viceversa. I y S no son mutuamente excluyentes, pero el complejo EzSI es inactivo Este inhibidor competitivo lo encontrará en el libro, además, con el nombre de inhibidor mixto, por el hecho de que es capaz de unirse tanto a la Ez como al complejo EzS. El sistema mixto más simple es aquel en el cual el complejo EzI presenta una menor afinidad que la enzima Ez, por el sustrato S y el complejo EzSI no es productivo. El sistema puede ser considerado como una mezcla de la inhibición competitiva parcial y la inhibición no competitiva total. Un inhibidor de tipo mixto, como sugiere el nombre, afecta tanto los valores de Vmax como los de Km, de una reacción enzimática. Figura 10. Modelos que describen la Inhibición Reversible No Competitiva.  ¿Cómo es posible reconocer la IRC? Un camino… Graficar 1/V0 vs 1/[S] con diferentes [I], se obtienen rectas con diferentes pendientes y diferentes intersecciones con el eje Y (1/V0). Con un único punto de intersección en el eje x (1/[S]) ----- -1/Km. Figura 11. Gráfica de los dobles recíprocos en la Inhibición Reversible No Competitiva (mixta). SIN INHIBIDOR Varía Vmax que expresa la eficiencia catalítica del sistema. El inhibidor no competitivo no modifica la afinidad de la Ez por el S, pero sí afecta la eficiencia catalítica. Al incrementar [I] disminuye Vmax y Km no varía. Figura 12. Gráfica de la Inhibición Reversible No Competitiva. 1. Sin inhibidor 2. Con inhibidor Por lo tanto, se puede predecir que el valor de Vmax en presencia del inhibidor no competitivo, será menor que el valor de Vmax observado en ausencia del inhibidor. Figura 13. Modelos que comparan la Inhibición Reversible Competitiva y la Inhibición Reversible No Competitiva. Figura 14. Características de la Inhibición Reversible Acompetitiva (Incompetitiva) IRAC). Figura 15. Modelos que describen la Inhibición Reversible Acompetitiva (IRAC). El Inhibidor solo se fija al complejo EzS y se forma el complejo Ez-S-I inactivo Figura 16. Gráfica de la Inhibición Reversible Acompetitiva. Km disminuye, Vmax disminuye y por tanto la eficiencia catalítica también El equilibrio muestra que a cualquier [I], una concentración infinitamente grande de S no podrá desplazar toda la enzima a la forma EzS, ya que estará presente siempre algo del complejo no productivo EzSI. Consecuentemente, se puede predecir que Vmax en presencia de un inhibidor incompetitivo, será menor que Vmax en ausencia del inhibidor. Sin embargo, a diferencia de la inhibición no competitiva, el valor aparente de Km disminuirá. La disminución ocurre porque la reacción contribuye a la disminución de EzS, ocasionando que la reacción se desplace hacia la derecha. Bajo ciertas condiciones, un inhibidor de tipo mixto puede producir los mismos efectos que un inhibidor incompetitivo. La relación entre Km y [S] es opuesta a la de la inhibición competitiva. El grado de inhibición depende de la [S], pero a diferencia de la IC, el grado de inhibición aumenta a medida que [S] aumenta. Esto es lo esperado, debido a que el inhibidor incompetitivo combina sólo con el complejo EzS y la concentración de EzS aumenta, a medida que [S] aumenta. Un inhibidor incompetitivo inhibe por su efecto sobre Vmax.  ¿Cómo es posible reconocer la IRAC? Graficar 1/V0 vs 1/[S] (dobles recíprocos) a [I] constantes, se observa que aumenta el porcentaje de inhibición al aumentar la [S]. Al incrementar [I] la pendiente m permanece constante pues Km y Vmax variarán en igual grado. Figura 17. Gráfica de los dobles recíprocos en la Inhibición Reversible Acompetitiva. Los inhibidores antes mencionados son inhibidores totales porque la inhibición puede llegar a ser total a altas concentraciones de inhibidor. También estas inhibiciones se conocen como lineales porque las representaciones graficas secundarias a partir de los gráficos primarios de los dobles recíprocos son lineales. Efecto General de los Inhibidores sobre la Cinética Enzimática 1. En la Ez hay grupos fijadores y grupos catalíticos (CA). 2. En la inhibición competitiva se afectan los grupos fijadores aumentando Km sin variar Vmax. 3. En la inhibición no competitiva se afectan los grupos catalíticos, afectándose directamente la eficiencia catalítica: Vmax disminuye y Km no varía. 4. En la inhibición acompetitiva se modifican Vmax y Km: Vmax disminuye y Km disminuye. Figura 18. Cuadro resumen sobre la Inhibición Enzimática.  ¿Ha leído alguna vez cuál es la terapia para el envenenamiento con metanol? Ejemplo de utilidad terapéutica La Inhibición Reversible Competitiva se utiliza en terapéutica para tratar pacientes que han ingerido metanol, disolvente que se utiliza como anticongelante en la industria. El metanol se metaboliza a formaldehido por acción de la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH). El formaldehido lesiona muchos tejidos siendo la ceguera un resultado frecuente debido a que los ojos son especialmente sensibles al mismo. El etanol, como inhibidor, compite de manera efectiva con el sustrato metanol por enlazarse a la ADH. Por esta razón, la terapia para el envenenamiento con metanol es la infusión intravenosa de etanol, la cual hace que la formación de formaldehido sea suficientemente lenta para que la mayor parte del metanol se pueda excretar inocuamente por la orina. El etanol se comporta en este caso como un inhibidor reversible competitivo por lo que estamos en presencia del mecanismo de IRC. El etanol inhibe la actividad enzimática, enlentece la reacción de formación del formaldehído, disminuye la velocidad; porque se enlaza a la Ez impidiendo que el metanol lo haga. Si se grafica el comportamiento cinético, se obtendría que la Vmax permanecerá constante, no ocurren cambios conformacionales en la Ez por la unión con etanol, disminuye la velocidad y más lentamente se alcanza la saturación de los sitios catalíticos; la Km aumenta a Kma, lo cual indica que se necesita más sustrato para hacer efectiva la reacción.  Algunos elementos importantes que deben conocer y no olvidar nunca … Todas las Ez son proteínas, por lo cual en su actividad catalítica influirán factores como la temperatura y el pH, entre otros; debido a que sus variaciones afectan la estructura tridimensional o conformación nativa de la misma. Si se debilita la estructura se altera la función. La Inhibición Enzimática (IEz) permite el control de la actividad metabólica y el recambio de los sistemas celulares. Los inhibidores enzimáticos se encuentran entre los agentes farmacéuticos más importantes. Se clasifican en inhibidores enzimáticos reversibles e inhibidores enzimáticos irreversibles (suicidas), en dependencia de su interacción con la enzima. En dependencia del tipo de inhibidor los mecanismos de IEz se clasifican en: Inhibición Reversible Competitiva: Vmax constante y aumenta Km Inhibición Reversible No Competitiva: disminuye Vmax (afecta la eficiencia catalítica de la Ez) y Km constante Inhibición Reversible Acompetitiva: disminuye Vmax y disminuye Km Para reconocer e identificar ante determinada situación planteada, el mecanismo de inhibición que se manifiesta, es importante conocer las características de cada mecanismo, así como el comportamiento de los parámetros cinéticos Km y Vmax. La situación les puede ser planteada mediante una imagen, un texto o un gráfico de coordenadas. Los conocimientos que adquiera el estudiante sobre este tema le serán útiles para cursar exitosamente asignaturas de perfil Biomédico como Farmacología, Biofarmacia, Toxicología y Bioquímica Clínica …… les invitamos a continuar con el estudio del Tema 3, para conocer las funciones del material genético…..