Cinética Enzimática PDF

Here is the converted markdown format: # Tema 4: CINÉTICA ENZIMÁTICA 1. Cinética de las reacciones enzimáticas. 2. Ecuación de Michaelis - Menten. 3. Determinación de parámetros cinéticos. 4. Inhibición enzimática. *Reacciones enzimáticas.* - Catalizador: sustancia que aumenta la rapidez o vel...

Here is the converted markdown format: # Tema 4: CINÉTICA ENZIMÁTICA 1. Cinética de las reacciones enzimáticas. 2. Ecuación de Michaelis - Menten. 3. Determinación de parámetros cinéticos. 4. Inhibición enzimática. *Reacciones enzimáticas.* - Catalizador: sustancia que aumenta la rapidez o velocidad de una reacción química sin verse alterada en el proceso global. - Sustrato: sustancia sobre la que actúa una enzima (e.g. polipéptidos). - Los catalizadores modifican la velocidad de los procesos, pero no afectan la posición de equilibrio de una reacción. - Un proceso termodinamicamente favorable no pasa a ser más favorable por la presencia de catalizadores; igualmente, tampoco cambian un proceso desfavorable a favorable. - Conceptos esenciales: velocidad de reacción; energía libre The image shows the chemical equation and structure for the catalysis of hydrogen peroxide into water and oxygen, as well as a protein structure. $2H_2O_2 -> 2H_2O + O_2$ (G) *Reacciones de primer orden.* **Velocidad de reacción y cómo se puede medir:** **Ejemplo:** conversión irreversible de sustancia A en sustancia B: $A -> B$ La flecha simple aquí significa que la reacción inversa (B→A) es despreciable; el estado de equilibrio se encuentra muy a la derecha (todo B). **Velocidad de reacción, o velocidad (v)**, se define en cualquier instante como la velocidad de formación del producto. La velocidad v es la cantidad de A que desaparece en una unidad especifica de tiempo. Es igual a la velocidad de aparición de B, o la cantidad de B que aparece en una unidad específica de tiempo. En este caso, la velocidad es el aumento en concentración de B con el tiempo: $v = d[B] / dt$ Las unidades de v son concentración por unidad de tiempo. Ejemplo: Ms-1 Por cada molécula B formada, debe desaparecer una molécula A. Por tanto, $V = - d[A] / dt$ El signo negativo indica que [A] está decreciendo con el tiempo: la velocidad disminuye a medida que avanza la reacción. Matemáticamente, expresamos esto diciendo que la velocidad es proporcional a [A]: (ecuación 3) $v =\frac{d[B]}{dt} = -\frac{d[A]}{dt} =k_1[A]^n$ - factor n → dependencia de velocidad observada con respecto a [A]. n = 1, la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración del reactivo A, y la reacción se llama reacción de primer orden. - La constante k1 se llama constante de velocidad y para una reacción de primer orden, tiene unidades de (tiempo)-1: s-1 o min-1 La constante de velocidad k1 proporciona una medida directa de lo rápido que es una reacción. El ejemplo más común de una reacción de primer orden es el decaimiento de elementos radiactivos. El orden de una reacción se determina experimentalmente comparando los datos cinéticos (representación gráfica de [A] respecto a tiempo) con modelos matemáticos que describen los $[A]_t = [A]_0e^{-k_1t}$ cambios de [A] para cada tipo de reacción. Esta ecuación nos dice que la concentración de A disminuye exponencialmente con el tiempo. Una característica del decaimiento exponencial es la vida media $(t_{1/2})$: tiempo necesario para que [A] disminuya a la mitad. Para una reacción de primer orden, la vida media es inversamente proporcional a kl Para probar si una reacción es de primer orden, solo necesitamos hacer un gráfico de In [A] frente a t. El resultado será consistente con una reacción de primer orden si obtenemos una recta con pendiente de -k1 y una intersección de $[A]_0$. *Reacciones de segundo orden.* Las reacciones bioquímicas son más complejas e implican uniones de varias moléculas. Una reacción de segundo orden ocurre cuando dos moléculas deben unirse para formar un producto: $Mb +O_2 \xrightarrow{k_1} MbO_2$ La velocidad depende de ambos sustratos y viene dada por: $v = -\frac{d[Mb]}{dt} = -\frac{d[O_2]}{dt} = k_1[Mb]^n [O_2]^m$ La reacción es de primer orden en [Mb] (n = 1) y de primer orden en [02] (m= 1) y de segundo orden global $(\text{n + m = 2})$. La constante de velocidad en una reacción de segundo orden K1 se expresa en $(\text{concentración})^{-1} (\text{tiempo})^{-1}$ La unión del sustrato (S) a una enzima para formar un complejo enzima- sustrato es un proceso de segundo orden: $Enz + S \rightarrow [Enz \cdot S] \rightarrow Enz + Product$ Las reacciones enzimáticas incluyen muchos procesos complejos de varios pasos. A menudo se pueden simplificar en una cadena de reacciones. El paso limitante de velocidad es la reacción más lenta y determina la velocidad observada experimentalmente para todo el proceso. The image shows the chemical structure of heme, a porphyrin ring complexed with an iron atom, surrounded by the amino acid histidine and other chemical groups. Product - Constante de equilibrio. En la naturaleza: $A \xrightleftharpoons[k_{-1}]{k_1} B \quad v = \frac{d[A]}{dt} = k_1[A]^n - k_{-1}[B]^m = \frac{d[B]}{dt}$ ✓ Si n y m = 1 → $k_1$ y $k_{-1}$ son, respectivamente, las constantes de velocidad para las reacciones directa e inversa de primer orden. - Estado de equilibrio es donde no hay cambio aparente en [A] o [B] en el tiempo: - La constante de equilibrio K se define mediante las constantes de velocidad de ambas reacciones: $K = \frac{[B]}{[A]} = \frac{k_1}{k_{-1}}$ Image contain Time vs concetration plot $K = \frac{[P]}{[S]} = \frac{k_F}{k_R} = \frac{10^{-4}}{10^{-6}} = 100$ Una enzima no puede alterar las leyes de termodinámica y, en consecuencia, no puede alterar el equilibrio de una reacción química. La concentración de equilibrio de P es 100 veces la de S, esté o no presente la enzima. Las enzimas aceleran el alcance del equilibrio, pero no cambian su posición. La posición de equilibrio es función únicamente de la diferencia de energía libre entre reactivos y productos. Conceptos de Energía libre y estado de transición. The image shows a representation of the catalytic cycle of an enzyme, including the binding of reactants to form the enzyme-substrate complex, the transition state, and the release of the product Las diferencias de energía entre reactivos y productos determinan si las reacciones pueden tener lugar y el grado en que la enzima acelera la reacción. - Energía libre de Gibbs (G), es una propiedad termodinámica que es una medida de la energía útil, o la energía que es capaz de realizar un trabajo. Para entender cómo las enzimas operan, tenemos que considerar sólo dos propiedades termodinámicas de la reacción: 1. La diferencia de energía libre $(\Delta G)$ entre los productos y los reactivos: determina si la reacción tendrá lugar espontáneamente. 2. La energía requerida para iniciar la conversión de reactivos en productos determina la velocidad de la reacción $(\Delta G^\neq)$: las enzimas afectan solo a esta conversión. La diferencia de energía libre entre los reactivos y los productos proporciona información sobre la espontaneidad, pero no sobre la velocidad, de una reacción: 1. Una reacción puede ocurrir espontáneamente solo si AG es negativa: reacciones exergónicas. 2. Un sistema está en equilibrio y no puede ocurrir ningún cambio neto si AG = 0 3. Una reacción no puede tener lugar espontáneamente si $\Delta G > 0$. Para que suceda una reacción así, se requiere una entrada de energía libre para impulsarla: endergónicas. 4. 4. El AG de una reacción depende únicamente de la energía libre de los productos (el estado final) menos la energía libre de los reactivos (el estado inicial): independiente del mecanismo molecular de la transformación. Por ejemplo, la $\Delta G$ para la oxidación de la glucosa a $CO_2$ y $H_2O$ es lo mismo si tiene lugar por combustión o por una serie de enzimas catalizadas por pasos en una célula. 5. la $\Delta G$ no proporciona información sobre la velocidad de una reacción. - $\Delta G$ indica que la reacción puede ocurrir espontáneamente, pero no indicar si procederá a una velocidad perceptible. ¿Cómo podemos explicar la mejora de la velocidad en términos de termodinámica? El estado de transición es una estructura molecular transitoria que ya no es el sustrato pero que aún no es el producto. El estado de transición es menos estable y menos abundante a lo largo de la reacción porque es el que tiene la máxima energía libre. La diferencia de energía libre entre el estado de transición y el sustrato se llama energía libre de activación de Gibbs o simplemente la energía de activación, y es simbolizada por $\Delta G^\neq$. La esencia de la catálisis es facilitar la formación del estado de transición. Las enzimas aceleran las reacciones disminuyendo $\Delta G^\neq$ la energía de activación: La combinación de sustrato y enzima crea una vía de reacción cuya energía de estado de transición es menor que la de la reacción en ausencia de enzima. Debido a que la energía de activación es menor, más moléculas tienen la energía necesaria para alcanzar el estado de transición. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Ecuación de Michaelis - Menten. Leonor Michaelis y Maud Leonora Menten 1913: expresiones matemáticas para explicar la afinidad enzima sustrato, eficiencia enzimática, y modos de inhibición. Desarrollo de inhibidores de enzimas: Cristalografía de rayos X; estudios de RMN en solución; otros... Mecanismos enzimáticos analizados mediante cinética enzimática Grados en Enología y Química. Tema 1: INTRODUCCIÓN A LA BIOQUÍMICA: Bioquímica y Biotecnología. Prof. Frances Arnold. [http://fhalab.caltech.edu](http://fhalab.caltech.edu) Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Ecuación de Michaelis - Menten. La ecuación de M-M es un modelo simple de las reacciones enzimáticas. Se apoya en dos asunciones: 1ª Asunción. Reacción simple: un solo sustrato y producto: Al analizar la velocidad inicial de una reacción catalizada por enzimas (es decir, antes de que aparezca una concentración significativa de $\text{P}$) y suponiendo que la transformación química de ES a EP es limitante de la velocidad (es decir, k1, k -1, y k3 >> k2), la ecuación se simplifica: kcat es la constante aparente de velocidad para la conversión de sustrato a producto (paso que condiciona la velocidad de reacción). La velocidad de reacción, definida como la velocidad observada de formación de productos, se puede expresar como: Asumimos que, en las condiciones iniciales de la reacción, la reacción inversa entre E y P es despreciable. La formación catalítica del producto, con regeneración enzimática, será entonces una reacción simple de primer orden y su velocidad estará determinada únicamente por la concentración de ES y el valor de kcat. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Ecuación de Michaelis - Menten. (ecuación 9) La Kcat es el número de reacciones enzimáticas que puede catalizar una sola molécula de enzima saturada por unidad de tiempo; normalmente se expresa en s-1 La kcat no depende de la concentración de la enzima, por lo que es un parámetro adecuado cuando se quieren comparar enzimas diferentes. Si v y [ES] pueden medirse para una enzima y un sustrato específicos, se puede derivar Kcat para esa reacción en particular, la constante de velocidad. En la práctica, [ES] es difícil de medir en experimentos de cinética enzimática. Sin embargo, los parámetros más fáciles de medir son: 1. la velocidad de reacción observada 2. la concentración inicial del sustrato 3. la concentración total de enzima añadida a la reacción, que debe ser la suma de enzima libre y enzima unido al sustrato (ecuación 10) Por tanto, es más sencillo expresar la velocidad, v, en términos de sustrato [S] y la concentración total de enzima $[E]_t$. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Ecuación de Michaelis - Menten. 2ª Asunción.- Tras un periodo de tiempo muy corto, la concentración del complejo [ES] alcanza un estado estacionario. Sugiere que E y S debe estar en equilibrio con ES, con una disociación de equilibrio Ks constante. Sin embargo, en 1925 G. E. Briggs y J. B. S. Haldane presentan el modelo de estado estacionario: A mayor [ES], más rápido se disociará el complejo ES en productos (Kcat) o de vuelta a los reactivos (K -1). La concentración de ES aumenta al principio de la reacción, pero rápidamente alcanza un estado estacionario, en el que permanece casi constante. Este estado estacionario persistirá hasta que casi todo el sustrato haya sido consumido. Debido a que el estado estacionario ocurre durante casi todo el tiempo de reacción, podemos calcular la velocidad de reacción suponiendo condiciones de estado estacionario. En el estado estacionario, las tasas de formación y ruptura de ES son iguales. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Ecuación de Michaelis - Menten. Por lo tanto, asumiendo el estado estacionario podemos expresar la velocidad de reacción como: Formación ES Ruptura ES (ecuación 10) (ecuación 9) Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Ecuación de Michaelis - Menten. Puntos importantes a tener en cuenta: 1. KM es una relación de las constantes de velocidad para una reacción específica es una característica de esa reacción (cada relación enzima sustrato tiene una KM definida). 2. KM tiene unidades de concentración. 3. A altas concentraciones de sustrato, donde $[\text{S}] >>> K_M$, la reacción se aproxima a un máximo de velocidad, $V_{max}$ A $V_{max}$ cada molécula de enzima está unida por sustrato. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Ecuación de Michaelis - Menten. A $V_{max}$ cada molécula de enzima está unida por sustrato. Así, $[\text{ES}] = [\text{E}]_t$, () Ecuación de Michaelis - Menten Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Ecuación de Michaelis – Menten. Significado de KM y Kcat. KM: es una medida de la concentración del sustrato necesaria para que se produzca una catálisis eficaz (solo en reacciones sencillas se puede asociar con afinidad). Numéricamente, es igual a la concentración del sustrato a la que la velocidad de reacción ha alcanzado la mitad de su máximo. Kcat: medida directa de la tasa de formación del producto en condiciones óptimas (enzima saturada). Las unidades de Kcat generalmente se dan como s-1 o min-1 , por lo que el recíproco de Kcat puede pensarse como el tiempo requerido por una molécula de enzima para "transformar” a una molécula de sustrato. Se puede pensar en Kcat como el número de moléculas de sustrato rotadas por molécula de enzima por unidad tiempo. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Ecuación de Michaelis – Menten. Significado de KM y Kcat. Kcat/KM: Esta relación a menudo se considera como una medida de la eficiencia enzimática. Un valor grande de Kcat (es decir, rápida transformación) o un valor pequeño de $K_M$ (es decir, ½ $V_{max}$ se produce a relativamente baja [S]) hará que Kcat / KM sea mayor. Otra forma de verlo: cuando [S] esta a baja concentraciones, en este caso [S] $<<$$KM$, la mayor parte de la enzima se encuentra libre, entonces $[E]_t \approx [E]$. - Cercano a constantes de difusión. - Constante de velocidad de segundo orden para la reacción entre sustrato y enzima libre. - Proporciona una medida directa de la eficiencia y especificidad de la enzima. - Permite la comparación directa de la efectividad de una enzima hacia diferentes sustratos Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Determinación de parámetros cinéticos. Para determinar si una reacción catalizada por enzimas sigue el modelo de Michaelis-Menten se mide velocidad de reacción en función de la concentración de sustrato, determinando así las constantes KM y Kcat. Experimentalmente, se usan ensayos de actividad todos a la misma concentración de enzima pero a diferentes concentraciones de sustrato y se miden las velocidades iniciales: sabiendo la [S] inicial con precisión, y que el cambio de [S]/t es casi lineal en las etapas iniciales (gráfica a), podemos obtener datos precisos sobre la v en función de [S]. Una enzima que obedece a la cinética de Michaelis-Menten (gráfica b). Obteniendo esta curva, y usando programas informáticos, averiguamos KM y Kcat. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Determinación de parámetros cinéticos. Diagrama de Lineweaver-Burk reorganización para dar la expresión de un gráfico lineal. - Test rápido de adherencia a cinética de Michaelis-Menten - Mejor evaluación de constantes cinéticas importantes. - Discrimina entre diferentes tipos de inhibición y regulación enzimática. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Efecto de la $T_a$ y pH sobre actividad enzimática. Incrementar la temperatura aumenta la energía cinética y la frecuencia de colisión de las moléculas que reaccionan. Puede interrumpir las interacciones no covalentes que mantienen la estructura tridimensional: desnaturalizarse. - Rango de $t_a =$ la temperatura normal de las células en las cuales reside +/- pequeña varaciones (humanos 45 a 55 °C) - Dependencia de $[H^+]$: actividad óptima en los valores de pH entre 5 y 9. Existe un equilibrio entre la desnaturalización enzimática en un pH alto o bajo y los efectos sobre el estado cargado de la enzima, los sustratos, o ambos. Importante en mecanismos de catálisis ácido/base, reconocimiento de las moléculas de sustrato con grupos disociables Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Cooperatividad y Centros alostéricos. Definición: Las proteínas oligoméricas son aquellas compuestas por más de una subunidad (cadena polipeptídica). Unión cooperativa: La unión inicial del ligando a una subunidad cambia la conformación de otras subunidades para facilitar su unión a otras moléculas de ligando. Unión alostérica. La enzima puede unirse a otras moléculas que cambiarían la conformación del sitio activo para favorecer o evitar la unión del sustrato al sitio active. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Cooperatividad y Centros alostéricos. Por lo general, las enzimas alostéricas determinan la velocidad, y desempeñan un papel fundamental en el control y la integración, de los procesos metabólicos. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Inhibición enzimática. - Los estudios de inhibición enzimática son importantes porque proporcionan conocimientos críticos sobre los mecanismos de la catálisis enzimática. - Igualmente, la acción terapéutica de muchos fármacos depende de su actuación como inhibidores de enzimas. - Comprender los mecanismos de inhibición enzimática permite proporcionar información sobre el modo de acción de tales fármacos. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Inhibición enzimática irreversible. - Dos grandes grupos de inhibidores: 1. Inhibidores reversibles: unión no covalente del inhibidor y siempre se puede revertir, al menos en principio, por eliminación del inhibidor. En algunos casos, una unión no covalente puede ser tan fuerte como para parecer irreversible en condiciones fisiológicas. 2. Inhibidores irreversibles: las moléculas se unen covalentemente a la enzima y la inactiva. Se encuentra con frecuencia en la acción de toxinas específicas y venenos, muchos de los cuales matan al incapacitar enzimas clave. Ejemplo: omeoprazol. Zhang et al., Chem. Biol. 2012 Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Inhibición enzimática reversible competitiva. - Una molécula es un inhibidor competitivo cuando compite con el sustrato para unirse al mismo sitio en el enzima y no puede someterse a la conversión química, reduciendo la disponibilidad de la encima para llevar a cabo la catálisis. - En presencia del inhibidor competitivo, la enzima actuará como si la KM aumentara - La tasa de inhibición competitiva sobre la reacción es estrictamente dependiente de las concentraciones relativas de I y S. La KM original para el el sustrato no cambia per se; más bien, en presencia de un competitivo - inhibidor aumenta la [S] necesaria para alcanzar ½ Vmax. - En la inhibición competitiva, el valor de Vmax no cambia porque a medida que incrementamos [S], v se aproxima a Vmax (igual que en ausencia de de inhibición). - Dado que a una [I] determinada, el sistema todavía obedece a una ecuación de la forma de Michaelis-Menten, la representación de Lineweaver-Burk es linear, cambia la KM, pero no Vmax. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Inhibición enzimática reversible no competitiva. - Un inhibidor no competitivo se une fuertemente al complejo ES pero muestra baja o nula afinidad por la enzima libre. - Un inhibidor no competitivo se une a un segundo sitio en la superficie de una enzima (no el sitio activo) e impide la conversión del sustrato unido a producto. - Un inhibidor no competitivo reduce tanto la Vmax (dependiente de Kcat ) y Km aparentes. Estos efectos no pueden ser revertidos por el aumento de [S]. - En presencia de un inhibidor no competitivo, tanto Vmax como KM aparecen reducirse por un factor de 1/a′ Vinculándose sólo a el complejo $ES$, un inhibidor no competitivo aumenta la $S$ efectiva, lo que reduce la KM aparente. La inhibición no competitiva se distingue experimentalmente de la inhibición competitiva por dos observaciones: 1. La inhibición no competitiva no puede ser revertida por el aumento de [S]. 2. El diagrama de Lineweaver-Burk produce líneas paralelas en lugar de intersecciones. Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Inhibición enzimática reversible mixta. - Esta forma de inhibición ocurre cuando una molécula o un ion puede unirse a tanto la enzima libre como el complejo ES - Nuevamente, distinguimos las constantes de equilibrio Kl y $K’_1$, respectivamente, para la unión del inhibidor a E y ES. En el caso de que $K_I =K’_I$, el modo mixto de inhibición también se denomina inhibición no competitiva. - La unión del sustrato al complejo El (flechas verdes en el esquema anterior) normalmente se reduce significativamente en comparación con la unión a libre enzima. - En el gráfico de Lineweaver-Burk para mixtos la inhibición refleja esta disminución de Vmax y aumento de KM Grados en Enología y Química. Tema 4: Cinética enzimática. Ejemplo actual. alpha-synuclein polymers, catalytic activity. Horvath & Wittung- Stafshede. ACS Chem. Neuros. 2023