Sbobina Lezione 5 - Il meccanismo di N-glicosilazione PDF

LEZIONE 5 IL MECCANISMO DI N-GLICOSILAZIONE Abbiamo fatto tutte le modi che che avvengono all'interno del reticolo endoplasmatico e in particolar modo ci siamo soffermati sul meccanismo di n-glicosilazione, che abbiamo visto che è un meccanismo speci co che avviene proprio nel reticolo endoplasmati...

LEZIONE 5 IL MECCANISMO DI N-GLICOSILAZIONE Abbiamo fatto tutte le modi che che avvengono all'interno del reticolo endoplasmatico e in particolar modo ci siamo soffermati sul meccanismo di n-glicosilazione, che abbiamo visto che è un meccanismo speci co che avviene proprio nel reticolo endoplasmatico. Che cosa succede? Giusto per riprendere un po' questa immagine, questa è la proteina che sta nendo la sua sintesi, questo è il traslocone che permette il passaggio dal citosol nel lume del reticolo endoplasmatico, subisce il processo di n-glicosilazione. A questo punto due residui dei tre che caratterizzano questa catena di zuccheri viene eliminato e permette il riconoscimento da parte, in questo caso, della calreticulina che è appunto uno chaperone molecolare che opera al livello del lume del reticolo endoplasmatico consentendo il riconoscimento delle proteine non ripiegate, cioè le proteine che devono andare incontro al processo di ripiegamento. Una volta che è stato riconosciuto dalla calreticulina viene rilasciata, a questo punto che cosa succede? Viene eliminato l'ultima unità di glucosio e viene riconosciuta da quelli che chiamiamo sensori di ripiegamento, quindi sostanzialmente delle proteine che agiscono andando a controllare se effettivamente la proteina si è ripiegata in maniera corretta. Che cosa succede? Se la proteina è ripiegata in maniera corretta come fa questo sensore a capire se la proteina è ben ripiegata? Va a intercettare i residui idrofobici perché sappiamo che quando una proteina è ben ripiegata espone verso l'esterno residui idrofobici che normalmente quando una proteina è ben ripiegata porta verso l'interno. Quindi più sono i residui idrofobici , più questo sensore capisce che la proteina sembra mal ripiegata, che cosa fa? Essa stessa, perché questo sensore è una glicosil transferasi, aggiunge a questo punto un'altra unità di glucosio che permette il riconoscimento della calreticulina e quindi va avanti il processo. A questo punto, se la proteina attraverso questo ciclo di sensori e chaperoni molecolari riesce a raggiungere il ripiegamento corretto, continua il suo viaggio verso l'apparato del Golgi. Invece, se la proteina è troppo ripiegata male, comunque non riesce a raggiungere la sua conformazione, subisce un processo di degradazione. fi fi fi  Allora, no adesso abbiamo visto come il riconoscimento da parte della calreticulina, da parte di questi sensori, si gioca tutto su questi residui di glucosio. Quindi sono delle aggiunte oppure delle rimozioni che facilitano il riconoscimento da parte di questi sensori che sono presenti nel lume del reticolo endoplasmatico. Partiamo da qui, vedete questa è una proteina che ha subito un processo di glicosilazione, qua vediamo tutti i residui, quindi 3 di glucosio, 9 di mannosio e 2 di n-acetil glucosammina. Come abbiamo visto, il primo enzima che interviene, i primi due, sono delle glicosidasi che vanno a togliere i primi due residui di glucosio.Quindi quando c'è questo solo residuo di glucosio, che è questo più scuro che vedete qui, comincia il ciclo della calreticulina.A questo punto abbiamo detto che c'è il ciclo della calreticulina, c'è il ciclo dei sensori che capiscono effettivamente se questo ripiegamento è andato a buon ne. Che cosa succede? Se la proteina non è ripiegata deve essere retrotrasportata verso il citosol dove va incontro un processo di degradazione. Chi è che permette di sentire quando una proteina deve essere retrotrasportata al meccanismo erad? Il riconoscimento avviene grazie all'intervento di un altro enzima, la mannosidasi, che va a eliminare un residuo di mannosio. Quindi vedete in questo caso la proteina che senza questo residuo di mannosio che viene tolto dalla mannosidasi, viene intercettata come proteina destinata al sistema di degradazione. Partendo dall'inizio, modi cazioni post traduzionali sono fondamentali per in questo caso consentire innanzitutto un controllo di qualità, quindi qualità intendiamo un corretto ripiegamento delle proteine. Qual è il processo a livello del reticolo endoplasmatico che favorisce? Questo riconoscimento nel lume appunto del reticolo è un processo di n-glicosidazione, quindi l'aggiunta di una catena speci ca, perché sempre la stessa, che viene aggiunta alla proteina nascente che sta uscendo dal traslocone. Che cosa succede? Ci sono delle modi che che avvengono a questa catena durante il percorso della protein, durante la maturazione della proteina, in particolar modo le glicosidasi vanno a togliere a eliminare due residui di glucosio che consentono, e proprio questa eliminazione consente il riconoscimento da parte del sistema della calreticulina, che è uno dei sistemi principalmente operanti a livello del reticolo endoplasmatico, invece interviene un altro enzima, la mannosidasi, che va a eliminare un'unità di mannosio consentendo così il riconoscimento di una proteina mal ripiegata destinata al meccanismo erad , quindi di degradazione. Quindi quello che abbiamo capito effettivamente è come avviene questo riconoscimento. Avviene attraverso delle modi che rispetto a quello che troviamo normalmente. Quindi quando la proteina subisce delle modi che, in questo caso nella catena oligosaccaridica, viene percepito dalla cellula e da tutti i sistemi operanti all'interno della cellula che poi la indirizza verso una destinazione o l'una o l'altra, a seconda appunto di come la proteina sia ripiegata. Allora, una volta che, vedete, la proteina, questo lo chaperone, tutto questo ciclo che vi ho appena raccontato, la proteina è comunque ripiegata male, viene retrotrasportata, vedete, esce dal lume del reticolo endoplasmatico e di nuovo la troviamo nel citosol. A questo punto interviene un sistema di ubiquitinizzazione, sostanzialmente viene aggiunto un tag, anche in questo caso vedete il concetto è sempre lo stesso, come fa la proteina ad essere indirizzata verso il proteasoma? Viene marcata, quindi c'è qualcosa su questa proteina che favorisce il passaggio della stessa verso il sistema del proteasoma, quindi una proteina che deve essere degradata, viene aggiunto un tag o un riconoscimento che sono queste molecole di ubiquitina che consentono poi il riconoscimento della proteina stessa da parte di questo sistema che è il proteasoma che poi va a degradare la proteina, quindi rilascia amminoacidi che saranno poi rimessi in questo pool di amminoacidi a disposizione all'interno del citosol che saranno poi utilizzati per le varie funzioni all'interno della cellula e questa è una funzione. fi fi fi fi fi fi fi Abbiamo visto che all'interno del reticolo endoplasmatico è fondamentale perché a livello della membrana avviene la traduzione delle proteine che hanno determinate indirizzamenti, avviene la n-glicosilazione che consente questo controllo di qualità. LA PROTEINA DISOLFURO (PDI) Un'altra proteina importante che opera proprio all'interno del lume del reticolo endoplasmatico è questa qui, è la proteina disolfuro isomerasi, PDI. Che cosa fa questa proteina e perché è importante? è localizzata nel lume del reticolo endoplasmatico e ha la funzione di andare a catalizzare i legami di solfuro. Quindi importante all'interno del reticolo endoplasmatico troviamo questa proteina PDI che è appunto la proteina disolfuro isomerasi che ha il compito importante di andare a favorire la formazione dei ponti di solfuro. Guardiamola dall'immagine che la chiarisce molto bene. Qua abbiamo sempre la proteina che sta nendo il processo di traduzione, questo è il traslocone. Vedete cosa fa la PDI? Sostanzialmente va a accelerare la formazione dei legami disolfuro all'interno della proteina.Non è coinvolta nel processo di folding, perché questo legame tra queste due proteine, tra questi due residui amminoacidici, comunque sarebbe avvenuto, ma più lentamente. Quindi questa proteina sostanzialmente lo accelera, quindi la sua funzione è quella di accelerare la formazione dei legami disolfuro. Inoltre, quindi la funzione di base è quella di andare a determinare, di accelerare la formazione del legame di solfuro, del ponte di solfuro che sappiamo essere un importante legame nel processo di stabilizzazione della proteina, nella formazione poi del ripiegamento e della struttura terziaria. Non solo può capitare che durante il processo di ripiegamento si formino ad esempio dei legami fi disolfuro non corretti. Ad esempio qui abbiamo 3 residui di cisteina 1, 2 e 3 sul polipeptide nascente. Si forma questo legame non corretto che coinvolge questi due residui 2 e 3 ma in realtà il legame corretto sarebbe tra 1 e 2. Questo ovviamente è un punto importante perché come si formano i legami.Torniamo al punto di prima che la proteina deve essere ben ripiegata per essere funzionante, quindi anche in questo caso la formazione di questo legame disolfuro è fondamentale per permettere alla proteina di raggiungere poi la sua conformazione nale. In questo caso, ad esempio, durante il processo di ripiegamento che sta avvenendo, vedete che il legame non si è formato correttamente. In questo caso, che cosa fa? Interviene sempre la PDI, , che vedete sostanzialmente permette il ripristino del corretto legame tra i residui di cisteina. Quindi vedete che qui in questo caso abbiamo detto che questo era sbagliato perché veniva tra i residui 2 e 3, interviene la PDI e attraverso uno scambio di legami consente in ultimo la formazione del corretto legame disolfuro tra i residui di 1 e 2. Altra funzione importante che avviene nel reticolo endoplasmatico è la funzione di questa proteina, la proteina disolfuro isomerasi, che ha l'importante compito di andare a accelerare la formazione dei legami di soffuro che si formano durante il processo di maturazione e stabilizzazione della proteina verso la struttura terziare o quaternaria, a seconda del livello che deve raggiungere. Un'altra funzione importante della PDI è quella invece di andare a correggere eventuali errori che si sono generati durante il processo di formazione di questi legami di solfuro. Quindi se c'è stato un errore e si è formato un legame laddove non doveva esserci, la PDI che agisce in questa speci ca funzione di agire a livello del legame di solfuro, di andare a ripristinare il corretto legame tra i segui sistemi. Comunque quello che ci interessa a noi è ricordare che questa proteina agisce proprio nel corretto ripristino dei legami tra i residui che ci sono, cioè è proprio speci ca per questa funzione che avviene speci catamente nel reticolo endoplasmatico. Ricapitolando, Il reticolo endoplasmatico è un organello dove sono sintetizzate le proteine generalmente secretorie di membrane e questo l'abbiamo ben chiarito la scorsa volta con tutti i sistemi che, come sempre, vi ricordate, il passaggio delle proteine. Le proteine sono ripiegate in modo corretto grazie alla presenza di chaperoni molecolari e questo l'abbiamo anche abbastanza. Le proteine mal ripiegate sono traslocate nel citosol e degradate dal proteosoma. Allora, siamo all'interno di una cellula. Questi sono tutti i meccanismi che vi ho raccontato. La proteina entra, subisce il processo di riconoscimento, di folding proteico grazie agli chaperoni e nel caso non sia la proteina correttamente ripiegata viene degradata. LO STRESS DEL RETICOLO ENDOPLASMATICO Vi ricordate che nella prima lezione abbiamo parlato delle malattie di accumulo, ovvero quelle patologie ad esempio nelle neurodegenerative, ma in realtà comprendono una vasta gamma di patologie.Lo stesso diabete, può essere considerata una malattia di accumulo, ovvero patologie che sono legate a quello che viene de nito uno stress del reticolo endoplasmatico. Quando è che il reticolo endoplasmatico va incontro a uno stress? Quando all'interno del lume del reticolo si vanno ad accumulare delle proteine mal ripiegate.Secondo voi quali possono essere, in base a quello che vi ho raccontato ovviamente, questi meccanismi che una cellula può mettere in atto per evitare lo stress del reticolo? fi fi fi fi fi  1. Aumentare, quindi, sicuramente un meccanismo è quello di andare a aumentare l'ef cienza e comunque anche il numero di questi chaperoni molecolari, perché ne agiscono in grandi quantità, ovviamente non è che abbiamo solo uno chaperone. Quindi, una via sicuramente di fuga della cellula è quella di andare ad aumentare il numero di sciaperoni molecolari. 2. Rendere più ef ciente il sistema di degradazione, quindi se ho tante proteine si stanno accumulando, o aumento il numero e l'ef cienza degli chaperoni molecolari che mi consentono di andare a riconoscere e ripiegare. Nel caso questi comunque non ci riescano vado ad aumentare il sistema di degradazione. 3. Poi un meccanismo a monte a monte ridurre il processo di traduzione, quindi partendo a monte o riduco la velocità con cui vengono portate e poi vengono tradotte queste proteine all'interno del lume, che già a monte meno ce n'ho da ripiegare e meglio è.Nel caso ci stanno o aumento l'ef cienza di tutto il meccanismo che vi ho raccontato che ne consente di andare a capire, a veri care, a favorire il processo di ripiegamento, nel caso aumento il meccanismo di degradazione, quindi tutto il sistema di proteosoma, ubiquitina e così via. E sono proprio questi, infatti vedete la risposta allo stress del ridicolo endoplasmatico passa proprio attraverso questi tre meccanismi attenuazione del processo di traduzione, aumento degli chaperoni molecolari, aumento del sistema degradativo e ovviamente poi quando la cellula è sottoposta a uno stress troppo elevato, ovviamente abbiamo il processo di apoptosi, quindi la cellula direttamente muore. Infatti, vedete che ci sono tre meccanismi speci ci che vengono proprio attivati in caso di stress del reticolo endoplasmatico. Abbiamo l'attivazione di Perk è il recettore che è coinvolto nel processo di attenuazione e nel processo di traduzione. ATF6, è quello che invece induce una maggiore sintesi degli chaperoni molecolari. IRE1α è quello che permette la sintesi dei componenti del sistema di Herald, quindi di degradazione, retrotrasporto della proteina mal ripiegata. Adesso andiamo a vedere come funziona, brevemente ve lo spiego. Per attenuazione della traduzione, ATF6 sintetizza degli chaperoni molecolari, IRE1α, componenti random. Quindi abbiamo una segnalazione speci ca per ciascuno di queste risposte. Allora, vi spiego un pochino come funzionano, brevemente, giusto per farvi capire il sistema di funzionamento. Vedete questa proteina che è una chinasi. Vedete, è ovviamente con una parte rivolta verso il lume del reticolo endoplasmatico e poi abbiamo il citoplasma. Che cosa succede? Che in condizioni ovviamente non stressanti, in condizioni diciamo siologiche, vedete che questo enzima, questa chinasi non è attiva. Quando invece aumentano nel lume del reticolo endoplasmatico proteine mal ripiegate, vedete sono queste rosse, quindi siamo in una condizione di stress, subito si attiva attraverso processi di fosforilazione che consentono l'attivazione dell'enzima, si attiva Perk. Va a fosforilare questa proteina IF2α che sostanzialmente una volta che viene fosforilata diventa inattiva, l'inattivazione di questa proteina va ad aumentare invece l'attività di ATF4 che in sostanza poi vedete attiva una serie di segnalazioni all'interno della cellula che possono favorire la sopravvivenza quindi ad esempio vedete aumentano proprio il numero di chaperoni o nel caso in cui poi lo stress sia troppo elevato, vedete, determina poi l'attivazione di tutto questo meccanismo BIM, BAPS e BAC, questo lo faremo quando faremo il mitocondrio, vedete che determina la morte cellulare.Quindi, in sostanza, andando proprio alla cosa che mi dovete ricordare, che quando nel lume del reticolo endoplasmatico ci sono presenti delle proteine non ripiegate, il reticolo va incontro a un processo che chiamiamo di stress, che è causato proprio da un accumulo di queste proteine mal ripiegate. L'aumento di queste proteine moltiplicate viene sentito, viene riconosciuto da questa proteina che si attiva e attraverso una cascata di segnalazioni intracellulari che passa fi fi fi fi fi fi fi fi  dall'inibizione di IF2α e la conseguente sovrarregolazione di ATF4 induce una risposta all'interno della cellula che può determinare e favorire la sovravvivenza o, in caso di eccessivo stress, la morte della cellula. L'ultimo sistema, vedete anche questo è semplice semplice, ATF6, anche in questo caso unstressed quindi non ci sono proteine ripiegate male, nel caso in cui siano presenti viene attivato, agisce come fattore di trascrizione e quindi permette in questo caso l'attivazione del sistema OPR che è quello di degradazione. Quindi in questo caso c'è sempre a monte riconoscimento di proteine mal ripiegate che rappresentano lo stimolo iniziale, quindi quello che ci fa attivare questa risposta cellulare. Si attiva ATF6 che trasloca nel Golgi, viene tagliata e viene rilasciato questo fattore che agisce nel lume questi agiscono come fattori di trascrizione perché vanno poi a modi care la trascrizione genica e quindi poi la traduzione di tutte quelle proteine che sono coinvolte nelle fasi di adattamento della cellula a questa condizione di stress, quindi, ricapitolando la cellula mette in atto una serie di meccanismi che le consentono eventualmente di andare a riportare l'equilibrio inteso come una condizione di siologia non patologica rispetto a una condizione che de niamo stress del reticolo, ovvero un accumulo di proteine mal ripiegate. L’APPARATO DI GOLGI Oggi andiamo a vedere le funzioni che avvengono all'interno dell’apparato di Golgi Allora, prima di iniziare vi ho messo, come introduzione all'apparato di Golgi, vi ho messo questa review. La review è un particolare tipo di articolo che va poi a raccogliere tutte le informazioni della letteratura, le mette insieme e le discute. E in questo caso, vedete, è una review, un lavoro del 2009 che riguarda proprio come Camillo Golgi è diventato il Golgi. In sostanza, giusto per cultura, per saperlo, vengono ripercorsi un po' le fasi di questo processo. Praticamente siamo nel 1898 e Camillo Golgi ha comunicato che aveva scoperto un apparato reticolare interno. In realtà prima che venisse riconosciuto come una vera e propria struttura facente parte delle cellule, passò molto tempo perché la sostanza non venne creduta, la maggior parte allora si riteneva che quello che aveva scoperto Golgi era un artefatto, quindi quello che fi fi fi  vedeva lui sperimentalmente era un artefatto tecnico, un artefatto sperimentale, quindi qualcosa che in realtà non esistesse. Finché poi, andando avanti, grazie alle nuove tecniche, grazie all'avanzamento della tecnologia, è stato possibile vedere con certezza che quello che aveva visto Golgi era vero, non era un artefatto, Tant'è che poi venne riconosciuto e trovò un modo per diventare immortale proprio perché venne de nito quest'apparato, questo sistema reticolare interno, venne proprio de nito l'apparato di Golgi. Allora, che cos'è quest'apparato di Golgi? L'apparato di Golgi è costituito da una serie di cisterne che chiamiamo le pile golgiane. Qual è la caratteristica di queste pile golgiane? E' che ciascuna contiene un distintivo set di enzimi. Le cisterne sono slargate in periferia e sono impilate l'una sull'altra e non intercomunicanti tra di loro. Quindi che vuol dire? Che in realtà questa cisterna non è in comunicazione con quella successiva e così via. Quindi questa è la tipica struttura dell'apparato del Golgi, cisterne slargate in periferia non intercomunicanti tra di loro, caratteristicamente ciascuna di queste pile, di queste cisterne contiene un set speci co di enzimi che ha ovviamente una funzione speci ca. fi fi fi fi  Come tutti sappiamo, nelle pile del Golgi, possiamo distinguere tre facce. Quindi abbiamo una faccia cis o prossimale, che è quella più vicina al reticolo endoplasmatico, quindi quella che poi riceve tutte le proteine dal reticolo endoplasmatico. Poi abbiamo le cisterne mediane che sono quelle che si trovano tra il cis e il trans e poi abbiamo la faccia trans o distale che è quella che invece è più vicina alla membrana dalla quale poi si formano le vescicole che porteranno le proteine modi cate in questa via verso la membrana, verso l'esterno oppure ai lisosomi. N-GLICOSILAZIONE ED O-GLICOSILAZIONE Nell’N-glicosidazione vengono sempre aggiunte le stesse unità, cioè la catena ,che è l’acetil- glucosammina, mannosio e glucosio è proprio una catena che tecnicamente viene aggiunta durante il processo di N-glicosidazione. Nella O-glicosilazione vedete che invece le catene sono diverse, quindi è un processo speci co, non tutte le proteine sono taggate allo stesso modo, sono modi cate allo stesso modo con la catena, ma le catene possono essere diverse, inoltre sono anche più piccole rispetto a quella che viene aggiunta nell’O- glicosilazione. Distinguiamo questi due processi, il concetto è sempre lo stesso, perché stiamo parlando sempre di glicosilazione, quindi aggiunta di catene oligosaccaridiche a un amminoacido, ovviamente della proteina che sta nascendo, e l’N-glicosilazione avviene nel reticolo endoplasmatico, l'aggiunta avviene a livello di un atomo di azoto dell'amminoacido asparagina, mentre l’O- glicosidico, fra l’ossigeno di 2 amminoacidi serine e trionina. Altra di erenza è che l'aggiunta della catena di zuccheri nell'N-glicosidazione è sempre costante, cioè sempre la stessa, mentre nella O-glicosidazione l'aggiunta è variabile. Questo è quello che vi ho detto, è vedere aggiungere una catena glucidica, l'asparagina, la catena dell'asparagina, a inizio un reticolo endoplasmatico e poi la catena viene ovviamente modi cata nel corso del passaggio della proteina nel Golgi. Il peptide che sta nascendo, questo è il traslocone, questo è l'aminoacido asparagina, vedete che questa catena di zuccheri viene trasferita attraverso il meccanismo che vi ho detto prima sul lato umido azzurro, la catena del laterale della asparagina Questa è la catena completa, questa è il meccanismo, diciamo già la prima modi ca che abbiamo visto che avviene nel reticolo endoplasmatico ruvido perché, rispetto all'aggiunta di base, qua abbiamo la sempli cazione che prevede, la rimozione di 3 glucosi, di queste unità di glucosio che sono importanti per il riconoscimento da parte degli chaperoni. Quindi una prima modi ca già avviene all'interno del reticolo endoplasmatico. Quando poi la proteina va nel golgi, vedete che continua a subire una serie di modi che. fi fi fi ff fi fi fi fi fi  Quindi intervengono altri enzimi che possono essere ad esempio la mannosidasi. La mannosidasi va a tagliare i residui di mannosio. Può intervenire l’N- acetilglucosammina trasferasi che va ad aggiungere l’N-acetilglucosammina. Può intervenire un'altra mannosidasi che taglia un'altra unità di mannosio e così via n quando l'intervento di enzimi diversi permettono, la completa modi ca della catena. Quindi noi siamo partiti da questa catena, quindi questo processo di glicosilazione nel reticolo endoplasmatico Il passaggio nel Golgi consente la completa modi ca di questa catena in modo tale da dare una identità precisa alla proteina, perché poi ogni proteina ovviamente avrà proprio un pro lo, avrà delle caratteristiche proprie che sono necessarie per lo svolgimento delle numerose funzioni che possiamo associare alle proteine. La O-glicositazione è un processo speci co che non vede l'aggiunta seriale di carboidrati alla proteina in processazione. Si svolge completamente nell'apparato del Golgi, dove i pari zuccheri vengono legati al livello dell'atomo di ossigeno della catena laterale di serina e treonina. Nell'apparato del Golgi quindi avviene la modi ca delle proteine attraverso delle modi cazioni post tradizionali. La prima modi cazione importante, per questo processo di glicosilazione, è la modi ca delle catene già esistenti sulle proteine che provengono dal reticolo endoplasmatico. Distinguiamo i due processi di glicosilazione N ed O. L'N-glicosidazione che avviene a livello di ridicolo endoplasmatico sull'atomo di azoto del residuo della catena neutrale dell’ asparagina prevede l'aggiunta di una stessa catena che poi verrà modi cata ovviamente quando la proteina passerà nelle varie cisterne del Golgi e poi invece quella speci ca che avviene nell'apparato del Golgi che è la O-glicosidazione. APPARATO DEL GOLGI Ogni cisterna del Golgi presenta il suo set speci co di enzimi, quindi in ogni cisterna del Golgi avviene una modi ca precisa della proteina che vi ho fatto vedere, quindi l'intervento ad esempio delle mannosidasi, qui avviene di nuovo rimozione del mannosio e aggiunta di altre catene no a quando appunto la proteina è su cientemente modi cata in modo tale da consentire poi lo smistamento. Dalla faccia trans del Golgi, si gemmano delle vescicole che consentono il trasferimento delle proteine modi cate alle varie destinazioni. Un aspetto importante del Golgi è come avviene il movimento di queste proteine all'interno del Golgi stesso perché una delle ffi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi  prime cose che vi ho detto dal punto di vista strutturale è che queste cisterne non sono interconnesse cioè non troviamo dei canali che consentono il passaggio all'interno stesso delle proteine da una cisterna a un'altra. Inizialmente si riteneva che il trasporto delle proteine da una cisterna a un'altra, dalla parte cis alla parte trans, avvenisse attraverso delle vescicole e vanno a de nire quello che è chiamato modello di trasporto vescicolare. E ettivamente qui abbiamo il reticolo endoplasmatico, questo è un compartimento intermedio che si chiama ERGIC (Endoplasmic Reticulum Golgi Intermediate Compartment), un compartimento che si trova tra il reticolo endoplasmatico e il Golgi e rappresenta una sede di smistamento delle proteine che vengono dalle vescicole che partono dal reticolo endoplasmatico che vanno verso il Golgi. Che cosa dice questo modello di trasporto vescicolare? Sembrerebbe che le proteine che vengono poi modi cate all'interno di ciascuna di queste cisterne, passino da una cisterna ad un'altra per mezzo di vescicole che gemmano dall'estremità delle cisterne, vi ricordate all'inizio che ho detto che queste cisterne hanno le estremità solargate, proprio da queste estremità gemmano queste vescicole che germano da una cisterna e si fondono con quella successiva e così via. E secondo questo modello, in questo modo, le proteine vedete che vengono passate da una cisterna ad un'altra. Perché si è ipotizzato, diciamo, che questo potesse essere un meccanismo di trasporto? Perché facendo gli esperimenti c'è stato qualcuno che è andato ad osservare quello che avviene nell'apparato de Golgi e aveva notato la presenza di vescicole. In realtà, poi, facendo altri esperimenti, e soprattutto grazie a nuove tecniche si è capito che quelle vescicole che si vedevano erano in realtà le vescicole del trasporto retrogrado. Quindi in realtà le vescicole che si muovevano lungo il Golgi in realtà erano le vescicole che poi portano il materiale indietro attraverso questo trasporto retrogrado praticamente dalla faccia trans a quella cis, perché ovviamente poi tutti anche gli enzimi che mano a mano vengono trasportati ritornano indietro perché come vi ho detto sempre all'inizio ciascuna di queste pile ha il proprio set di enzimi, come vengono riportati in ciascuna cisterna attraverso questo trasposto retrogrado di vescicole. Ma quindi come si sposta il materiale e ettivamente da una cisterna ad un'altra del Golgi? Si sposta attraverso quello che viene diciamo descritto dal modello di maturazione delle cisterne, e ci dice che in realtà il passaggio non avviene attraverso delle vescicole che si spostano dalla faccia cis alla faccia trans, ma è l'intera l'intera cisterna che matura e si spostano avanti portando con sé tutto il proprio corredo di proteine ed enzimi speci ci, quindi in questo caso è questa stessa cisterna che matura e va avanti, nché arriva con tutto il set di proteine alla faccia trans, dalla quale poi gemmano le vescicole che porteranno le proteine diciamo a destinazione. Quindi, matura la cisterna alla sua interezza e si sposta in avanti dal cis-golgi al trans-golgi portando con sé ovviamente tutte le proteine che hanno subito la modi ca e questo consentirà ff ff fi fi fi fi fi  poi mano a mano che appunto la cisterna raggiunge dalla faccia cis quella trans e quindi poi la gemmazione della cisterna che porterà al rilascio delle proteine. Quando le vescicole retrograde trasportano indietro andranno ad arricchire il set di enzimi che si trova all'interno di ciascuna cisterna permettendo poi la modi ca graduale delle proteine perché comunque una parte va in avanti e una parte viene restituita alle cisterne attraverso il trasporto retrogrado. Questa parte del Golgi è molto complessa, anche tutta la parte di sperimentazione che è stata fatta anche per capire come avviene il trasporto verso il Golgi è molto complessa, anche perché prima si viaggiava tra modello vescicolare, modello delle cisterne, tra l'altro uno degli aspetti che più ha convinto che il trasporto avvenisse attraverso le vescicole era pensare, è stato fatto pensando alle proteine di grandi dimensioni, ci sono delle proteine pesanti, che sono molto grandi e che ovviamente il cui passaggio attraverso le cisterne dei Golgi non poteva essere assolutamente giusti cato da piccole vescicole. Quindi pensando anche a come avviene il passaggio di grandi proteine, che vengono appunto sempre modi cate e che devono essere portate all'esterno, ovviamente questo poi ha portato a ricercare, a scoprire che il trasporto che avviene dalla parte cis a quella trans e avviene proprio attraverso questo sistema di maturazione delle cisterne. Ci deve essere un meccanismo che consente, un processo che consente il trasporto, il trasferimento di queste proteine attraverso la via secretoria. Come avviene questo trasporto? Avviene attraverso delle vescicole, quindi ci sono delle vescicole che partono dal reticolo endoplasmatico e raggiungono il cis del Golgi. Ci sarà poi un sistema che consentirà il trasporto delle proteine alla faccia trans che saranno poi rilasciate all'esterno. Un punto fondamentale, quello su cui adesso ci concentriamo, è proprio come avviene il passaggio di proteine dal reticolo endoplasmatico al cis del Golgi. Avviene attraverso delle vescicole, infatti vedete c'è una parte che è dedicata al tra co vescicolare, quindi in che modo queste vescicole partono da un compartimento e raggiungono quello di destinazione. Le vescicole gemmano da una membrana e si fondono con un'altra, trasportando o recettori di membrana, perché abbiamo visto che molte proteine hanno come destinazione fi fi fi ffi  proprio la membrana plasmatica, oppure delle molecole solubili che chiamiamo cargo, quindi del carico fondamentalmente. Ogni vescicola deve essere altamente selettiva. quindi questa vescicola gemma nelle parti appropriate del compartimento di origine e si fonde con quelledel bersaglio. Quindi abbiamo il compartimento donatore, inizia a formarsi il rivestimento vescicolare che poi viene perso dopo la formazione della vesciocla, attraverso un sistema di tra co vescicolare, quindi si formano queste vescicole, gemmano in punti speci ci del compartimento donatore e vanno poi a fondersi con il compartimento target oppure ricevente. Un aspetto importante di questo trasporto vescicolare è ovviamente che abbiamo diversi tipi di vescicole. Perché abbiamo diversi tipi di vescicole? Perché, la comunicazione fra un compartimento e un'altra è complessa. Abbiamo le vescicole che devono andare dal reticolo al Golgi. Abbiamo le vescicole che devono raggiungere la membrana, abbiamo le vescicole che devono tornare indietro dal trans al cis, quindi insomma ovviamente queste vescicole hanno delle funzioni di erenti e avendo le funzioni di erenti hanno anche delle strutture di erenti, quindi hanno evidentemente qualcosa nella loro composizione tale da garantire una comunicazione che sia speci ca tra i vari compartimenti. In particolare esistono tre tipi di vescicole, abbiamo le: - Vescicole rivestite di clatrina, che mediano il trasporto dalla membrana al golgi. Quindi sostanzialmente le vescicole rivestite di clatrina sono quelle che portano il materiale dall'esterno della cellula verso l'interno attraverso un processo che chiamiamo di endocitosi. Quindi le vescicole rivestite di clatrina le troviamo principalmente nella via endocitica. ff fi ff fi ff ffi  - Poi abbiamo le vescicole rivestite di COP1 e COP2.COP sta per Coating Protein, quindi proteine di rivestimento di tipo 1 e di tipo 2 che qui sono segnate con questi colori che mi fanno capire la loro funzione. - Le vescicole COP2 gemmano dal reticolo endoplasmatico. Quindi quelle di COP2 sono quelle che portano il materiale e le proteine dal reticolo endoplasmatico al Golgi. - quelle di COP1 sono quelle che gemmano dal Golgi e principalmente sono coinvolte nel trasporto retrogrado. Come avviene la comunicazione tra un compartimento e l'altro di questo sistema di endomembrane Il rivestimento essendo la parte esterna è quella che poi orienta. La tappa che media il trasporto, quindi ad esempio cop 2 trasporta dal reticolo a cis del golgi e tutte le proteine che sono importanti a nché avvenga il processo di gemmazione, quello in rosso, avviene la formazione della vescicola e proprio facciamo l'esempio di cop2 quindi vediamo come le proteine vengono portate dal reticolo al golgi. Allora qui è diciamo è solo riassuntivo, adesso andiamo a vedere proprio tutti i passaggi e cosa succede. Allora, questo è il compartimento donatore. Vedete che si sta formando la vescicola che è rivestita e ettivamente da queste proteine verdi che sono le proteine di rivestimento. Perché è importante che si formi una vescicola rivestita? Ci sono sostanzialmente due motivi. - Il rivestimento è importante innanzitutto perché favorisce la formazione della vescicola stessa, quindi la membrana si deve modi care, si deve immaginare in modo tale da formare questa vescicola. Quindi prima di tutto il processo, il meccanismo di rivestimento di una vescicola è quello che favorisce il processo poi di formazione della vescicola stessa. - Inoltre la presenza, la formazione di una vescicola rivestita garantisce che ci sia, diciamo, l'indirizzamento del materiale in quella regione. Perché se io devo trasportare il materiale dal reticolo endoplasmatico al Golgi si forma una vescicola, e in quella regione non c'è niente, non trasporto niente. Invece il rivestimento, la formazione di questa vescicola, sostanzialmente va a indirizzare tutte le proteine che devono essere portate dal reticolo verso il Golgi in quella regione speci ca della membrana. Si formano nelle vescicole rivestite sostanzialmente perché il rivestimento facilita il processo di formazione della vescicola stessa e perché indirizza il materiale che deve essere trasportato in quella regione speci ca della membrana in modo tale che poi, formandosi questa vescicola, all'interno si ritrovi il materiale che deve essere trasportato. Che cosa può essere trasportato dal reticolo? Vedete qui abbiamo sia delle proteine di carico della membrana, che si trovano attraverso la membrana stessa e sono quelle che poi sono ritrasportate no alla membrana più un carico di proteine solubili. Notiamo come queste proteine solubili vengono trasportate attraverso un legame di recettori. ff fi ffi fi fi fi  Quindi queste proteine speci catamente vengono riconosciute da dei recettori che sono proprio per le proteine di carico e vengono legate, vanno a legare le proteine solubili permettendone il trasporto. Quindi quali sono le due fasi principali? Gemmazione della vescicola rivestita, quindi vedete si forma questa vescicola dalla membrana, tutto il materiale che deve essere trasportato viene indirizzato in questa regione della membrana e si forma la vescicola. Una volta che la vescicola sia formata, che la vescicola rivestita sia formata, il rivestimento si perde ed e ettivamente questo rivestimento ha soprattutto una funzione nelle fasi iniziali. Quindi il rivestimento consente sostanzialmente di andare a formare la vescicola Indirizzare il materiale e Fusione della vescicola. vedete che quando poi la vescicola arriva al compartimento donatore è priva del rivestimento quindi intervengono altri sistemi che consentono il riconoscimento di questa vescicola alla membrana bersaglio quindi al compartimento bersaglio. Quali sono queste proteine ? Sono le proteine SNER. detto brevemente, qui abbiamo il nostro compartimento donatore, vedete qui si stanno formando le proteine determinate in due vescicole, ovviamente vedete che le due vescicole hanno carichi di erenti, quindi abbiamo ad esempio questa vescicola che ha un carico A e questa vescicola che ha un carico B con il suo particolare set di proteine che devono essere smistate. La cosa importante che vi ho fatto vedere è che una volta che viene rilasciato, una volta che si forma la vescicola, viene eliminato, si perde il rivestimento, vedete che il compartimento viene raggiunto, viene riconosciuto attraverso questo sistema di riconoscimento tra due proteine, V-SNER dove V sta per vescicolare perché è il recettore che si trova sulla vescicola e T- SNARE è quello che invece si trova sul compartimento del donatore. Per la formazione della vescicola è importante tutto il meccanismo di rivestimento perché consente di indirizzare il contenuto, perché ovviamente le vescicole possono avere contenuti di erenti. E quando poi la vescicola si è formata perde il rivestimento, viene riconosciuta al compartimento donatore perché intervengono altri due ricettori che ff ff ff fi sono le proteine SNARE, V-SNARE che sta per quella vescicolare quindi che si trova sulla vescicola che viene riconosciuta dalla T-SNARE che praticamente quella che si trova sul compartimento donatore. ASSEMBLAGGIO DELLE VESCICOLE RIVESTITE DA COP2: Per prima cosa viene attivata la proteina SAR1, si tratta di una proteina solubile legata al GDP. La proteina SAR1, già legata al GDP, si va a legare al fattore di scambio SEC-12 in modo da attivarsi. Il fattore di scambio SEC-12 agisce permettendo lo scambio tra il GDP e il GTP. Solo dopo l’attivazione della proteina SAR1 può avvenire lo scambio tra GDP e GTP. Lo scambio del GDP a GTP permette l'estrusione di un’estremità che consente l'ancoraggio della SAR1 alla membrana del reticolo endoplasmatico (RE). Infatti quando SAR1 si trova legata al GDP è inattiva, legata a GTP si attiva. SAR1, ancorata alla membrana del RE, rappresenta il sito di ancoraggio per il rivestimento della vescicola, costituito dalle proteine SEC-23 e SEC-24. In ne tutte le proteine (possono essere proteine di membrana o solubili) che devono essere trasportate all’interno della vescicola sono convogliate a livello di queste proteine di rivestimento, ciascuna legata al suo recettore. Successivamente si veri ca l’idrolisi del GTP legato a SAR1. Grazie all’idrolisi SAR1 insieme all’intero rivestimento vengono rilasciati. Infatti ogni vota che la vescicola si è formata il rivestimento viene perduto in quanto esso è importante solo nella fase iniziale. Ricapitolando: per prima cosa si attiva SAR1 che rappresenta il sito di ancoraggio per le proteine di rivestimento della vescicola, SEC-23 e SEC-24. In questo modo si forma la vescicola rivestita, chiamata così proprio perché presenta un rivestimento sulla sua super cie. Successivamente la subunità SEC-23 favorisce l'idrolisi del GTP, quello che era legato a SAR1, a GDP che consente il rilascio di SAR1 e il disassemblaggio di tutto il rivestimento. Una volta che la vescicola si è formata, sulla membrana del compartimento donatore, questa deve fondersi con la membrana del compartimento del ricevente, che in questo caso è l’apparato di Golgi. Nel caso delle vescicole COP2, per permettere l’ancoraggio della vescicola sulla membrana del compartimento del ricevente intervengono le proteine V-snare che vengono riconosciute dalle proteine T- snare che si trovano sulla membrana e ettrice, ossia la membrana del ricevente. Le proteine V-snare sono proteine vescicolari che consentono l’attacco della vescicola sulla membrana del compartimento del ricevente. La proteina VAMP costituisce un esempio di V-snare. Sintaxina e SNAP25 sono un esempio di T-snare. fi fi ff fi Le proteine V-snare si legheranno alle T-snare e questo legame permette la formazione di un complesso che consente poi l'interazione e la fusione della vescicola che si è formata sulla membrana del RE, con la membrana del compartimento ricevente, ovvero dell’apparato di Golgi. A questo punto la membrana della vescicola si fonde con la membrana dell’apparato del Golgi in modo tale da riuscire a scaricare il carico contenuto nella vescicola nel lume dell’apparato del Golgi. Successivamente intervengono altri complessi che vanno a eliminare l’interazione tra V-snare e T-snare, in modo tale che queste due proteine possano essere nuovamente disponibili per la formazione di un nuovo legame. Le vescicole COP2 permettono un trasporto anterogrado delle proteine, ossia un trasporto in avanti, dal RE all’apparato del Golgi. SEC-12: SEC-12 è importante nella formazione delle vescicole perché permette innanzitutto questo processo di attivazione di SAR-1 che consente poi l'assemblaggio successivo della vescicola. Avevamo già parlato di SEC-12 quando avevamo discusso degli agenti mutanti. Se è presente la mutazione di SEC-12 non si possono formare le vescicole che permettono il trasporto delle proteine dal RE all’apparato di Golgi, quindi le proteine si accumulano nel RE. Proprio per questo motivo SEC-12 è un fattore di scambio di grande importanza. VESCICOLE RIVESTITE DA COP1: Le vescicole rivestite da COP1 sono quelle vescicole che mediano il trasporto retrogrado. Di conseguenza queste vescicole si formeranno a partire dalla membrana dell’apparato del Golgi e torneranno indietro verso il RE. La modalità di assemblaggio delle vescicole rivestite da COP1 è la stessa di quella delle vescicole rivestite da COP2, a cambiare è semplicemente il rivestimento e la GTPasi associata. Le vescicole rivestire da COP1 si occupano di portare indietro tutte quelle proteine che erroneamente lasciano il reticolo endoplasmatico. Infatti può darsi che durante il processo di smistamento, alcune proteine che risiedono nel RE e quindi hanno sede nel RE, possono essere erroneamente trasportate all’apparato del Golgi tramite le vescicole COP2. Queste proteine possiedono infatti un segnale di smistamento speci co, lo smistamento KDEL, costituito da 4 amminoacidi, che costituiscono un segnale di redenzione. Ovvero tutte le proteine che hanno questi 4 amminoacidi come segnale nella loro sequenza amminoacidica devono rimanere all’interno del RE. Le proteine che possiedono questo segnale speci co di smistamento KDEL sono le proteine che svolgono una determinata funzione all’interno del RE (ad esempio PDI, che accelera la produzione dei ponti disolfuro; PIP, che è uno chaperone molecolare). Inoltre questa sequenza di amminoacidi, anche tra le diverse specie, viene sempre conservata. Come avviene questo trasporto retrogrado mediato dalle vescicole rivestite da COP1? Sul Golgi sono presenti dei recettori che vanno a riconoscere queste proteine che presentano la segnalazione KDEL. Una volta riconosciute si forma la vescicola rivestita da COP1, sulla membrana del Golgi, che riporta le proteine nel RE. VESCICOLE RIVESTITE DI CLATRINA: La clatrina è uno dei rivestimenti proteici meglio conosciuti. Ciascuna molecola di clatrina è costituita da 3 catene leggere e 3 catene pesanti che si uniscono a formare un trischelio (una struttura formata da 3 catene leggere e 3 catene pesanti). Successivamente i trischeli si assemblano per formare una struttura a canestro fatta di esagoni e pentagoni. Come avviene l’assemblaggio di una vescicola rivestita da clatrina? In questo caso il processo di assemblaggio avviene nel citosol, in quanto le vescicole rivestite da clatrina si occupano del trasporto di proteine che si trovano nell’ambiente esterno e devono essere portate all’interno della cellula. Le vescicole rivestite da clatrina sono proprio quelle che principalmente mediano l’ingresso delle proteine dall’esterno all’interno della cellula. Sulla membrana plasmatica è presente un recettore per le molecole cargo, ossia per tutte quelle molecole che dall’esterno devono essere trasportate all’interno della cellula. I recettori hanno il compito di riconoscere e legare la molecola cargo. Le adattine poi sono delle molecole fi fi  che hanno il compito di attaccare su di esse, da un lato le molecole cargo e dall’altro le molecole di clatrina; si tratta quindi di molecole adattatrici che mediano il legame tra il recettore e la clatrina per la formazione del rivestimento della vescicola. Una volta che il recettore ha legato a sé la molecola cargo, l’adeattina si lega alla molecola cargo e lega sull’altro lato la clatrina. Le molecole di clatrina poi si assemblano a formare la struttura a canestro favorendo il processo di gemmazione. Il rivestimento si assembla a mano a mano andando poi a ricoprire interamente la vescicola, per poi staccarsi. Una volta che la vescicola si è staccata dalla membrana plasmatica e il rivestimento si è staccato dalla vescicola, quest’ultima è pronta per continuare il proprio percorso di endocitosi. Un esempio di proteine trasportate da vescicole rivestite da clatrina sono le idrolasi. LE IDROLASI: Le idrolasi sono enzimi che funzionano a un pH acido e che hanno come destinazione i lisosomi. Si tratta di enzimi importanti per provvedere alla funzione lisosomiale. Le idrolasi vengono selezionate, per essere trasportate ai lisosomi, in quanto presentano un marcatore speci co, il mannosio-6-fosfato che viene aggiunto alla catena oligosaccaridica. Quindi anche in questo caso è presente un segnale speci co (l’aggiunta del mannosio-6-fosfato) che consente a queste proteine di raggiungere la loro destinazione speci ca (ossia i lisosomi). Il mannosio-6-fosfato viene riconosciuto da speci ci recettori e allora si forma una vescicola rivestita da clatrina che consentirà il trasporto delle idrolasi a livello del lisosoma. ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORE: Si tratta di uno dei meccanismi di endocitosi meglio studiati. Il processo di endocitosi passa attraverso il meccanismo di formazione di vescicole rivestite da clatrina che consentono l’internalizzazione del materiale che deve essere trasportato dall’ambiente esterno all’interno della cellula. Dopo la formazione delle vescicole si ha la formazione sequenziale di altre strutture, che prendono il nome di endosomi (prima si formano quelli primari e poi quelli tardivi), che porteranno il materiale endocitato direttamente al lisosoma. Gli endosomi infatti smistano il materiale endocitato no a portarlo, in ultimo, ai lisosomi, per far avvenire la degradazione. Quindi attraverso la via secretoria si formano le idrolasi che hanno come destinazione il lisosoma, ma al lisosoma arriva anche, grazie agli endosomi, il materiale che viene endocitato, dunque il materiale che dall’esterno viene portato all’interno fi fi fi fi fi  della cellula per la degradazione. In questo modo abbiamo unito la via secretoria alla via endocitica. Dal punto di vista clinico, perché è importante il processo di endocitosi mediata da recettore? Questo meccanismo di endocitosi è importante, per esempio, per l’internalizzazione delle particelle di LDL. LDL per prima cosa si attacca al recettore che si trova sulla membrana plasmatica, si forma la vescicola rivestita da clatrina, successivamente la vescicola perde il rivestimento e in ne le vescicole contenenti LDL si vanno a fondere con il lisosoma e di conseguenza LDL può essere degradato. Un passaggio importante che avviene durante il processo di internalizzazione delle LDL è il riciclo del recettore necessario per riconoscere le molecole di LDL che circolano nell’ambiente esterno. Infatti, a mano a mano che questo recettore viene riciclato, viene ritrasportato in membrana e può essere utilizzato nuovamente per l’internalizzazione di altro LDL. PCSK9: Si tratta di una proteasi, prodotta principalmente nel fegato, che è coinvolta nel processo di regolazione del recettore delle LDL (RD-LDL = recettore per le LDL). Le proteasi hanno il compito di degradare le proteine. Cosa succede quando i livelli di PCSK9 sono elevati? Quando ci sono elevati livelli di PCSK9, questa si va a legare al recettore per le LDL e ne impedisce il riciclo. Questa causa una diminuzione dell’internalizzazione delle LDL e quindi un aumento delle LDL circolanti nell’ambiente esterno. Questo porta a un’alterazione del metabolismo delle LDL. Di conseguenza le mutazioni che causano una sovrapproduzione di PCSK9 sono legate alla patologia di ipercolesterolemia familiare. I soggetti che hanno una mutazione del gene che codi ca per PCSK9, e che ne determina una maggiore attività, sono soggetti a etti da ipercolesterolemia familiare. (ipercolesterolemia = si hanno elevati livelli di colesterolo, ovvero di LDL). Il PCSK9 può essere modulato attraverso, per esempio, il microRNA. In generale esistono diverse strategie che possono essere adottate per ridurre l’e etto del PCSK9 (i sirna, piccoli RNA che hanno come bersaglio l’mRNA che codi ca per PCSK9 e lo degradano). La ricerca riguardo il PCSK9 è recente, ma è particolarmente attiva. Infatti esistono numerose strategie terapeutiche che vengono messe in atto per ridurre l’e etto del PCSK9. Attraverso i nucleotidi antisenso abbiamo una riduzione dell’e etto del PCSK9 che arriva anche al 73%. LISOSOMI fi ff fi ff ff fi ff Qual è il compito dei lisosomi? Il compito dei lisosomi è quello di andare a degradare il materiale che viene internalizzato attraverso il processo di endocitosi. Allora, I lisosomi sono organuli delimitati da membrana che contengono una serie di enzimi in grado di degradare i polimeri biologici. Cosa contengono? Le proteasi che vanno ad attaccare le proteine, le nucleasi, le lipasi e così via. Quindi svolgono fondamentalmente la funzione di sistema digestivo. Deve essere degradato, viene portato a livello dell'isosoma che contiene questi enzimi di idrolasi che lavorano un pH acido e che vanno a degradare i polimeri biologici. Il pH acido a livello del lisosoma, che solitamente siamo intorno a 5, è garantito dalla presenza di una pompa che trasporta attivamente, quindi sappiamo attraverso l'idrolisi di ATP, i protoni dal citosol all'interno del lisosoma. Quindi abbiamo questa pompa, un trasporto attivo, quindi c'è un consumo diretto di ATP porta gli ioni, i protoni, dal citosol verso ovviamente l'interno del lisosoma garantendo l'acidità del compartimento tale da consentire la funzione dell’idrolasi. Vedete, ne ho detto alcune, però sono tantissime, fosfolipasi, lipasi, glicosidasi, proteasi, nucleasi, insomma tutte le proteine che vanno a degradare le principali macromolevole biologiche. Quali sono a questo punto i principali compartimenti che troviamo invece nella via endocitosi? Nella via segretoria abbiamo detto che fanno parte il reiticolo endoplasmatico, l’apparato del Golgi e poi le vescicole che vanno verso l'esterno. Nel viaggio opposto? quindi delle proteine o del materiale che entra dall'esterno verso l'interno della cellula? Successivamente, partiamo da qui, siamo dall'esterno quindi dobbiamo partire da fuori, questa è una piccola vescicola che si sta formando. Vedete, è una vescicola rivestita da clatrina che entra all'interno della cellula. Questa vescicola che contiene il materiale si fonde con gli endosomi e si va a formare l'endosoma primario o precoce. Mano a mano questo endosoma matura, va incontro un processo di maturazione e diventa un endosoma tardivo. Quando è che diventa un endosoma tardivo? Quando va ad accumulare più vescicole, infatti diventa un corpo multivescicolare perché contiene più vescicole e vedete che mano a mano che passiamo da un endosoma primario ad un endosoma tardivo quello che cambia è bianca. Il pH, se ci fate caso, si va man mano abbassando perché partiamo da un pH neutro che è quello appunto della cellula che è 7, l'endosoma primario ha un pH di 6,5, vedete che l'endosoma tardivo ha un pH di 5,5 e poi abbiamo l'isosoma che invece nisce con un pH di 4,5 quindi vedete mano a mano quello che cambia nel processo di maturazione è proprio il pH. fi Ma perché è importante questo processo di acidi cazione? È importante perché l'abbassamento del pH consente innanzitutto la dissociazione del ligando dal recettore. Come entra questo ligando? Attraverso il recettore, si lega e viene fatta la vescicola. A questo punto l'abbassamento del pH permette la dissociazione del ligando dal proprio recettore, in modo tale che il ligando che deve essere degradato continua no al lisosoma e il recettore viene riciclato. Lo stesso concetto di prima, quindi prima entrano insieme anche perché il recettore veicola il ligando. entrano insieme, si comincia ad abbassare il PH, l'abbassamento del PH consente la dissociazione del ligando dal recettore, il ligando continua no al lisosoma e il recettore viene riciclato. Le vescicole si fondono con gli endosomi. Gli endosomi si formano dall’apparato del golgi e si vanno a posizionare a livello della membrana. Quindi sono queste strutture con cui si fondono le vescicole che entrano attraverso, che si formano dalla membrana. Entrano più vescicole, si formano questi corpi multivescicolari e poi comincia lo smistamento. Poi a questi endosomi si uniscono gli idrolasi, questo matura e si ha l'ultimo compartimento che è quello del lisosoma. Il Lisosoma si può generare o come maturazione, quindi come uno step successivo di maturazione dell'endosoma primario, oppure si forma come per un intervento di diffusione con l'endosoma tardivo. Quello che otteniamo alla ne è la formazione di questo organulo con pH acido che consente la degradazione del materiale. Quindi separiamo le due vie, mi raccomando. Via secretoria, no ad arrivare alla membrana. Via endocitica Partiamo dalla membrana. Partiamo dalla membrana vescicole rivestite di clatrina. Fusione con gli endosomi primari, quello che cambia il processo di maturazione, che porta ad un abbassamento del pH, che sarà poi necessario, soprattutto a livello del lisosoma, per consentire il corretto funzionamento del lisosoma stesso. Perché avevo detto che le idrolasi acidi lavorano a pH acido 4,5. Un altro aspetto importante è che il fatto che le idrolasi lavorino a pH 4.5 rappresenta una garanzia perché se ci dovesse essere un problema a livello del lisosoma e queste idrolasi vengono rilasciati in circolo, la differenza di PH tra il lisosoma e il citosol, che ha il PH7, è inattiva. Quindi sostanzialmente non abbiamo mine vaganti che vanno ad attaccare i lipidi, le proteine e quant'altro. Quindi l'ambiente acido garantisce sicuramente l'attività dell'idrolasi all'interno del lisosoma e garantisce anche una compartimentalizzazione. Quindi quella funzione avviene solamente all'interno del lisosoma evitando che poi vadano, nel caso ci sia qualche problema a livello del lisosoma, che queste idrolasi vadano poi ad attaccare le altre componenti cellulari. L'endosoma, è presente l'endosoma come organello, diventa precoce quando si fa affondere con le vescicole provenienti dalla membrana, diventa precoce perché comincia ad assumere una funzione, quindi riceve questo carico dalla membrana e poi va incontro un processo di maturazione. fi fi fi fi fi Quindi abbiamo detto che questo materiale arriva dall'esterno al lisosoma, ma come ci arriva effettivamente? Vedete che le vie per arrivare al lisosoma sono sostanzialmente tre: 1. Una è l'endocitosi, che è il meccanismo che vi ho appena spiegato, vedete abbiamo endosomi primari, endosoma tardivo e lisosoma. 2. Fagocitosi, che è una funzione speci ca di alcune cellule del nostro organismo, in particolare i neutro li Vedete che vanno a internalizzare i patogeni, ad esempio i batteri, nella loro complessità, nella loro totalità, vengono internalizzati con questo processo di fagocitosi, che allo stesso modo porta alla formazione di un fagolisosoma, quindi si va a fondere il fagosoma con il lisosoma e quindi verrà degradato. 3. Autofagia. è un meccanismo che porta alla degradazione delle componenti stesse della cellula, ovvero quando ad esempio si ha un organello che è invecchiato oppure bisogna sostituirlo, la cellula attiva questo processo di autofagia. Quindi vedete in questo caso c'è un mitocondrio, ad esempio danneggiato, che deve essere sostituito Il processo autofagico permette la formazione di un'autofagosoma, quindi vedete si forma sempre una membrana che va a circondare il mitocondrio, fusione di condivisosoma, degradazione del mitocondrio. Quali sono le vie che consentono al materiale dall'esterno di raggiungere lisosoma? Sono tre. Endocitosi, esempio che abbiamo fatto, lipoproteine e ldl colestero. Abbiamo poi un processo di fagocitosi con una funzione speci ca di alcune cellule del nostro organismo che vanno a internalizzare ad esempio batteri e attraverso poi la fusione del fagosoma con il lisosoma ne consente la degradazione. Un'ultima funzione importante è quella dell'autofagia. Per l'autofagia c'è una zona da parte, questo meccanismo consente proprio di andare a degradare proteine denaturate oppure organelli senescenti, che sono insomma troppo vecchi. Vedete, vengono tutte internalizzate all'interno dell'autofagosoma che si va poi a fondere con lisosoma e quindi sostanzialmente a degradare il materiale. E qui invece abbiamo l'altra via, l'endofagia, perché vedete in questo caso endocitosi o fagocitosi, si ha l'internalizzazione, la degradazione di materiale proveniente dall'esterno, invece l'autofaggia è il materiale stesso della cellula che viene degradato.. fi fi fi Abbiamo parlato dei lisosomi e abbiamo visto l'importante funzione che questi svolgono nella degradazione dei vari materiali e delle altre molecole biologiche. Ci sono alcune patologie che sono proprio associate a un'alterazione della funzione dei lisosomi: Inattivazione delle idrolasi dovuto alla variazione del PH Mal funzionamento dell’idrolasi Non si sviluppa il lisosoma e quindi ce ne sono di meno Riduzione delle capacità lisosomiali Mal funzionamento della pompa protonica Gli enzimi non funzionano Presenza di materiale incongruente o presenza eccessiva di materiale Infatti vedete che le tre cause sono: l'inibizione degli enzimi digestibili lisosomiali, incongruità dei substrati che possono essere poco digeribili, magari per un'alterazione del substrato questo non può essere degradato dall'idrolasi, oppure c'è un eccesso di materiale rispetto alla capacità digestiva della cellula. Due parole sul reticolo endoplasmatico liscio (REL) Differentemente dal reticolo endoplasmatico rugoso, il liscio non c'ha ribosomi, svolge pertanto delle funzioni diverse rispetto al rugoso. In particolare, sul REL avviene: metabolismo del glicogeno; immagazzinamento degli ioni calcio, in particolar modo nel tessuto muscolare, cioè una porzione speciale del REL; e poi modi ca la chimica di piccole molecole come farmaci e pesticidi, in particolar modo negli epatociti. Queste particolari cellule che hanno queste funzioni speci che in cui è coinvolto il REL ovviamente si sono adattate in modo tale che il REL sia più sviluppato rispetto al RER. Quindi come abbiamo visto l'altra volta che gli acidi pancreatici avevano un ottimo sistema per lo studio del sistema di endomembrane perché hanno come funzione principale quella di attrazione. Quindi lì il reticolo del plasmatico rugoso è molto sviluppato. Per dirvi ad esempio, questa è una cellula muscolare, vedete come il reticolo endoplasmatico è molto sviluppato proprio perché la funzione principale è quella di andare a immagazzinare il calcio per consentire la contrazione. Quindi in questo caso il reticolo endoplasmatico, che si chiama proprio reticolo sarcoplasmatico, è speci co ad esempio delle cellule muscolari proprio perché la funzione principale è quella di andare a immagazzinare il calcio necessario per la contrazione. PEROSSISOMI I perossisomi, la loro scoperta è diciamo non recente ma nemmeno troppo in là, siamo nel 1967. Perché ce li ricordiamo questi perossisomi? Perché è importante valutare la loro funzione? Allora, diciamo che sono coinvolte in tutte queste funzioni e in particolare vi vorrei far vedere due di fi fi fi  queste funzioni importanti, ovvero l'ossidazione degli acidi grassi a catena lunga e il metabolismo del perossido di idrogeno, che sarebbe la famosa acqua ossigenata. E vediamo perché è importante questa funzione di detossi cazione. Allora, prima funzione associata ai perossisomi: 1. ossidazione degli acidi grassi. Perché è una funzione importante? Perché gli enzimi dei perossisomi consentono proprio l'ossidazione, alfa e beta ossidazione, degli acidi grassi a catena lunga, molto lunga e rami cata. Una volta che questi acidi grassi sono ossidati a livello dei perossisomi, continuano poi il loro viaggio andando nei mitocondri per terminare appunto il processo. Dato che i mitocondri non sono in grado di degradare gli acidi grassi a catena lunga, molto lunga e rami cata, i perossisomi svolgono un ruolo importante perché vanno sostanzialmente a linearizzarli ed accorciarli. Quindi tutto quello che avviene nei perossisomi rappresenta una fase pre di quello che avviene poi del metabolismo degli acidi grassi che avviene in mitocondrio.Quindi sostanzialmente questi ferrossitomi che cosa fanno? Vanno a spezzettare o a linearizzare gli acidi grassi a catena lunga, molto lunga e rami cata in modo tale che poi siano accessibili al mitocondrio. Quindi è una funzione importantissima. 2. Durante questo processo di ossidazione, di alfa e beta ossidazione, si genera un sottoprodotto che è il perossido di idrogeno, ovvero l'acqua ossigenata. I perossisomi però contengono un enzima che è la catalasi che è in grado proprio di andare a detossi care dagli eccessi del perossio d'idrogeno. Perché vi dico questo? Perché è importante questa funzione? Perché come dicevo prima, facciamo l'esempio dell'omeostasi, Il perossido di idrogeno, non è un radicale reattivo perché non ha elettroni spaiati, ma è una molecola molto importante perché è un importante segnalatore cellulare, ma se ci sono elevati eccessi di iperossido di idrogeno, la cellula va in sofferenza e questi elevati livelli di perossido di idrogeno possono portare a conseguenze molto dannose per l'organismo, tant'è che ad esempio gli elevati livelli di iperossido di idrogeno sono associati a trombosi, patologie cardiovascolari e malattie neurodegenerative ad esempio. Il discorso che facevamo prima, lo squilibrio, l'alterazione dell'omeostasi, dei normali equilibri anche di radicali liberi dell'ossigeno è importante perché tutte queste alterazioni possono avere un impatto poi a livello generale dell'organismo. Meno male che i perossisomi possiedono questi enzimi che prendono il numero di catalasi che hanno proprio il compito speci co di andare a degradare il perossido d'idrogeno. L'ultima cosa che volevo dirvi è legato sempre alle patologia, infatti abbiamo visto come tutte le alterazioni nei vari organelli, nei vari organi che abbiamo incontrato durante le lezioni, tutte le alterazioni a partire da degli effetti che si trovano per il tipo di endoplasmato che possono essere associati ad esempio a proteine in eccesso mal ripiegate che portano alle neurodegenerative, abbiamo visto come in realtà tutte le modi che, le alterazioni che abbiamo a livello di questi compatti cellulari di ciascuno abbiamo visto l'associazione con una malattia. Esistono tante patologie che sono proprio associate a un'alterazione nella funzione dei perossisomi. Ad esempio, questa adrenoleucodristro a è una malattia metabolica rara dei perossisomi, è un de cit che sostanzialmente impedisce agli acidi grassi a catena molto lunga, come ricordate prima la catena molto lunga, di subire il processo di beta-ossidazione nei perossisomi, con la conseguenza di un loro accumulo nel plasma e nei tessuti. fi fi fi fi fi fi fi fi fi Perché abbiamo visto che questi a catena molto lunga non hanno accesso al mitocontro, quindi per questa fase di decomposizione è fondamentale quella che avviene nei perossisomi. Quindi in questa malattia cosa succede? Succede che effettivamente c'è un'alterazione del trasportatore. Dunque questi acidi grassi non vengono spacchettati e internalizzati; se questi non vengono internalizzati vanno poi ad accumularsi nel plasma causando poi una serie di reazioni che può essere: una disfunzione del mitocondrio, uno stress di nuovo del reticolo endoplasmatico e un processo di in ammazione generale che porta poi alla manifestazione patologica. fi