Biologia Molecolare - DNA PDF

BIOLOGIA MOLECOLARE DNA è il depositario dell’informazione genetica NUCLEOTIDI ➔ monomeri degli acidi nucleici; ➔ sono formati da tre componenti: ◆ zucch...

BIOLOGIA MOLECOLARE DNA è il depositario dell’informazione genetica NUCLEOTIDI ➔ monomeri degli acidi nucleici; ➔ sono formati da tre componenti: ◆ zucchero pentoso ribosio nell'RNA deossiribosio nel DNA = ◆ gruppo fosfato, che conferisce una carica negativa che terremo in considerazione ogni volta che una proteina interagisce con il DNA + grazie a questa carica ci aiuta a separare il DNA se sottoposto ad un campo elettrico. Aiuta, inoltre, alla realizzazione del legame fosfodiesterico. si lega al 5’ dello zucchero pentoso ◆ base azotata, che si dividono in purine e pirimidine e si legano al 1’ dello zucchero; ➔ numerazione: useremo il segno ‘ per indicare gli atomi dello zucchero ◆ il gruppo fosfato si lega al carbonio in 5’ dello zucchero. ➔ sono uniti tra di loro da un​ p ​ onte fosfodiesterico​ che si forma tra il gruppo fosfato in posizione 5’ di un nucleotide con gruppo ossidrilico in 3 ’ del nucleotide vicino. ➔ la sequenza nucleotidica si scrive in ​direzione 5’ -> 3’ ; RIBOSO ➔ aldopentoso ➔ in acqua va incontro ad una reazione intramolecolare non catalizzata (spontanea) e assume una forma eterociclica; forma un anello furanosinico. ➔ in soluzione acquosa, l’anello eterociclico del ribosio pone nello stesso momento solo 4 dei 5 atomi che ha sullo stesso piano = forma “raggrinzita” , non planare come viene rappresentato solitamente. Esistono due di queste forme. ➔ A seconda della conformazione dello zucchero, potremo ottenere localmente una conformazione locale della doppia elica più o meno distorta (sono molecole dinamiche e qualsiasi legame può ruotare e avere gradi di libertà che permettono il raggiungimento di conformazioni differenti) Definizioni da ricordare: ➔ conformazione = ​rotazione ma non avviene una rottura del legame covalente; ➔ configurazione =​ per passare da una configurazione all’altra dobbiamo rompere un rompere un doppio legame, in quanto non ha la capacità di ruotare di per sé; in biologia spesso serve una reazione catalizzata da un enzima perché ciò avvenga. DEOSSIRIBOSIO ➔ manca del -OH in 2’ che nel ribosio è alla base della stabilità della molecola. BASI AZOTATE ➔ sono anelli eterociclici, composti da carbonio e azoto ➔ leggermente basiche ➔ hanno la caratteristica di decollocare gli elettroni e per natura chimica sono tendenzialmente idrofobiche (cosa che capita anche per le proteine). ◆ Ma come mai? per queste loro caratteristiche si trovano all’interno della molecola di DNA (più lontano possibile dalla superficie acquosa) e trovandosi vicine tra di loro formano i legami idrogeno). ◆ il fatto che possano delocalizzare gli elettroni permette alle basi di assorbire la luce ultravioletta => in laboratorio per misurare la concentrazione degli acidi nucleici si misura quanto l’acido nucleico in soluzione assorbe la luce ultravioletta; ➔ APPAIAMENTI CANONICI o APPAIAMENTI DI WATSON E CRICK=​ avvengono appaiamenti solo tra una purina e una pirimidina e viceversa, cioè tra basi complementari ➡ C-G/ / A-T ◆ ciò che cambia è il numero dei legami idrogeno che si formano tra citosina e guanina // adenina e timina. ○ tra C-G si formano 3 legami idrogeno. ○ tra A-T si formano 2 legami idrogeno. ◆ si dividono in purine​, struttura formata da due anelli uniti formati da 9 atomi, dove si intervallano carbonio e azoto ○ adenina e guanina; pirimidine​, più piccole con anello formato da sei atomi ○ citosina, timina e uracile; ◆ DNA e RNA hanno in comune la citosina, mentre la timina si trova solo la timina, che viene sostituita dall’uracile nel RNA; queste due differenziano solo per il gruppo metilico della timina in C3. ◆ da cosa sono differenziate? ingombro spaziale = purine più grandi; posizione dei gruppi funzionali, capaci di accettare o donare legami idrogeno, essenziali per la stabilità degli acidi nucleici; ◆ che senso ha avere la timina nel DNA e l’uracile sul RNA? uno dei danni più frequenti negli acidi nucleici è quello causato dall’acqua = danno idrolitico, che porta alla rottura e alla rimozione del gruppo amminico. Molto spesso ciò capita alla citosina. (​La ​deaminazione ossidativa​ è un tipo di reazione di chimica organica in cui vengono rimossi gruppi amminici da un substrato molecolare con rottura del legame C-N.) ↪ quando ciò accade, la citosina va incontro a deaminazione ossidativa e viene convertita in uracile. ↪ se capita un evento di questo genere sul DNA esistono dei sistemi di riparazione che sono dedicati al riconoscimento dell’uracile (visto che non è un base naturale del DNA) che deriva dalla citosina e a riparare questo danno;  ↪ se avessimo avuto l’uracile da entrambe le parti, non avremmo più potuto distinguere se l’uracile era lì perchè era la sequenza giusta o se era lì perché era la deaminazione della citosina; saremmo stati, quindi, incapaci di riconoscere il danno. ↪ ciò potrebbe succedere anche sulla citosina dell’RNA ma mentre nel DNA non posso permettere di avere mutazioni non riconoscibili, sull’RNA che viene sintetizzato de novo ogni volta, se c’è una variante alterata, istaile, degradata, non è così importante in quanto subito dopo l’RNA polimerasi produrrà una nuova RNA non alterata (nella maggior parte dei casi) ➔ gruppi funzionali delle base azotate = base della struttura doppia elica e complementarietà ➔ in soluzione acquosa, le basi azotate possono andare incontro a conversioni che vengono chiamate ​conversione tautomeriche = ​ le basi azotate possono esistere in più forme, le forme tautomeriche. La forma che viene rappresentata normalmente è quella più frequente e più stabile; ciò non toglie però il fatto che possano oscillare tra una forma e l'altra. ◆ le forme tautomeriche possono trarre in errore la DNA polimerasi; tuttavia, gli orrori di lettura vengono in seguito riparati. ➔ le basi azotate sia sul DNA che sull’RNA in tante occasioni possono subire modificazioni, che per esempio avranno ripercussioni sull’informazione genetica. ◆ ex. sul DNA possiamo trovare la metilcitosina al posto della citosina; se questa molecola va incontro a deaminazione ossidativa, tuttavia, viene convertita in timina che è una base propria del DNA = ergo questa modificazione è difficile da riconoscere (che provoca in seguito danni) ➔ la base azotata si lega al 1’ dello zucchero ribosio attraverso un​ ​legame β-N-glicosidico​ che unisce l’azoto in posizione 9 delle purine o l’azoto in posizione 1 delle pirimidine con il carbonio in 1’ del ribosio. ◆ enzima glicosidasi = si occupa della rottura di questo legame. Lezione 30 settembre ➔ All’interno della doppia elica troviamo le basi, questo perchè sono tendenzialmente idrofobiche e si legano tra di loro attraverso l'appaiamento complementare scoperto da Watson e Crick. ➔ All’esterno troviamo i fosfati carichi e gli zuccheri; ➔ Le due catene si affacciano l’una con l’altra, con i due scheletri fosfodiesterici avvolti a spirale, come una s​ cala a chiocciola destrorsa​; inoltre, le basi sono sono impilate in modo tale che il piano della base sia perpendicolare all’asse della doppia elica. ➔ Le basi sono impilate e tra di loro ci sono interazioni idrofobiche che rendono stabile questa struttura. ❓Domanda ❓​=​ quali sono le forze che tengono unite la doppia elica? ​ (p ​ ossibile domanda all’esame) 1. forme di impilamento idrofobiche delle basi al centro della doppia elica; 2. i legami idrogeno che uniscono le basi complementari; ➔ Ma come mai si avvolge come una scala a chiocciola? = tutto deriva da come sono orientati i legami fosfodiesterici. ◆ la doppia elica del DNA è fatta così solo se solo le due catene polinucleotidiche sono​ antiparallele; una scorre in direzione 5’- 3’ la seconda catena è antiparallela alla prima, quindi scorre in direzione 3’-5’ ◆ le basi sono sfasate tra di loro di circa 36° => ci da l’idea di quale sia il “passo dell’elica” cioè la distanza tra un nucleotide e il successivo che si trova nella stessa posizione => ogni 10 nucleotide si trova un nucleotide orientato nello stesso modo = per fare un giro completo ci servono 10 nucleotidi. periodicità = 10 paia di base per giro d’elica distanza tra base e base 3,4 A passo dell’elica 3A (armstrong) ◆ quindi qual è la lunghezza del genoma umano aploide? circa 3.3 x 10^9 nucleotidi. se moltiplico questo dato x 34 A = 10 x 10^9 A = 1 metro. il genoma umano diploide = 2 metri. ◆ lo scheletro fosfodiesterico non riesce a coprire completamente le basi azotate dall’acqua guardando la doppia elica possiamo definire due solchi dove le basi sono esposte all’acqua; questi solchi sono sfruttati dalle proteine per interagire con il DNA ( proteine con funzione, ad esempio, di impacchettamento, per riconoscere sequenze specifiche etc.) ↪ il DNA è sempre impacchettato con proteine; solco maggiore e solco minore. Come mai hanno grandezze diverse? questo lo si capisce dall’angolo che viene formati dai legami N-glicosidici che legano le basi con lo scheletro fosfodiesterico. Un angolo è di 120° e qui si forma il solco minore, mentre l’altro è di 240°e da origine al solco maggiore; ➔ La struttura della doppia elica è omogenea e ha un diametro di ​circa 20 A. ◆ questo perché le purine si legano sempre con le pirimidine e viceversa, quindi la lunghezza del legame non cambia mai. ◆ ma cosa succede se una base subisce una modificazione? ex. l’adenina viene convertita in una timina = appaiamento sbagliato = pirimidina + pirimidina => il diametro dell’elica diventa distorto, più stretto. ↪ Uno dei modi attraverso cui i macchinari di riparazione del DNA si accorgono della presenza di anomalie, ovvio di basi alterate, è il presenza di distorsioni della doppia elica. ➔ tutte queste caratteristiche danno la​ FORMA B DEL DEL DNA A DOPPIA ELICA​ ed è la forma più comune, descritta anche da Watson e Crick per cui hanno preso il premio nobel; ➔ Questa struttura della doppia elica spiega il meccanismo della duplicazione del DNA => quando la doppia elica deve essere duplicata, le due catene si aprono e ognuna viene sfruttata dalla DNA polimerasi per produrre una copia complementare => alla fine ottengo due doppie eliche formate da una catena vecchia e una catena di nuova sintesi => duplicazione semiconservativa. ➔ ricorda = tutte le volte le leggo una sequenza devo leggerla dal 5’ al 3​’!! ➔ come fanno le proteine a riconoscere le sequenze specifiche per un determinato gene all’interno del DNA? 1. Può la proteina riconoscere la sequenza specifica andando ad interagire con lo scheletro fosfodiesterico? NO! ↪ ingaggia legami con le basi azotate. A​ questo punto le proteine hanno due opzioni: 1. interagiscono con il solco maggiore 2. interagiscono con il solco minore ↪ è indifferente? NO! => quello che è più informativo e permette alla proteina di riconoscere le sequenze specifiche è il​ SOLCO MAGGIORE. ↪ take away message = quando una proteina deve riconoscere una sequenza specifica lo fa interagendo con i suoi aminoacidi con gli scheletri delle basi azotate che sono esposti a livello del solco maggiore. Solo quando ci saranno interazioni non sequenza specifica allora le proteine potranno interagire anche con il solco minore (ex. dna-polimerasi) FORMA B DEL DNA Lezione 06/10/2010 ➔ Le proteine che interagiscono in maniera sequenza-specifica con il dna accedono al solco maggiore interagendo con una​ struttura ad alfa-elica​; ➔ Esiste una sola conformazione della doppia elica? -> è possibile che a livello locale il DNA possa avere forme e conformazioni diverse dalla forma B. ↪ E perchè può avere conformazioni diverse? perchè le varie conformazioni dipendono solo dalle rotazioni attorno ai singoli legami, non serve energia per spezzarli e ricrearli. ↪ a seconda del sequenza del DNA, a seconda di come sta interagendo a livello spaziale con altri attori (ex. proteine),​ si possono trovare localmente distorsioni della doppia elica che sfuggono alla perfetta canonica B sopra descritta; ➔ Esiste solo la forma B? no! esiste anche la forma A. ◆ in quest’ultima il passo dell’elica include più basi, circa 11 nucleotidi; ◆ più tozza, più larga come diametro e i solchi sono meno definiti; ◆ quando la troviamo nel DNA? in alcune condizioni particolari tipo: quando il dna è legato a proteine enzimi); tutte le volte in cui troviamo forme ibride tra DNA E RNA; doppie eliche a RNA; ➔ Esiste anche una forma Z più rara, di cui non si conosce molto; la otteniamo quando l’alternanza tra purine e pirimidine è regolare;  IBRIDAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI ➔ Prima dobbiamo capire la denaturazione del DNA ◆ = si intende quel processo che porta alla separazione delle due catene ◆ possiamo farlo in laboratorio ma può avvenire anche fisiologicamente all’interno della cellula (esempio: durante la trascrizione) ◆ sull’asse delle ordinate abbiamo l’assorbimento della luce ultravioletta a 280 nm (ricorda, le basi azotate sono in grado di assorbire la luce ultravioletta e il picco massimo facendo la media tra le quattro basi è attorno ai 260 nm) ◆ sull’asse delle x, invece, si trova un agente denaturante, sia chimico che fisico ◆ grafico che ci mostra dell’andamento dell’assorbimento della luce ultravioletta all’aumentare della temperatura ↪ partiamo da una temperatura bassa in cui la doppia elica è intatta, fino ad arrivare i due singoli filamenti singoli denaturati. ↪ ma perchè la doppia catena assorbe di meno rispetto al singolo filamento? ↪​ = tanto più le basi azotate sono accessibili ed esposte alla luce ultravioletta, tanto più sarà elevato l'assorbimento. ↪ le basi sono più esposte quando le due catene sono separate ↪ questo ci spiega perché l’assorbimento aumenta al denaturarsi del DNA ↪ EFFETTO IPERCROMICO ➔ Si osserva un andamento sigmoidale ➔ La temperatura alla quale il 50 % del doppio filamento è denaturato si dice t​ emperatura di fusione = temperatura di melting​, e dipende da alcune caratteristiche del doppio filamento: ◆ dipende dall'appaiamento delle basi => tanto più un'elica è in percentuale ricca di appaiamenti C-G, tanto più resistente sarà la denaturazione; ◆ tanto più lunga sarà la catena, tanto più alta sarà questa temperatura; ◆ è influenzata anche dalla concentrazione salina => lo scheletro fosfodiesterico è un susseguirsi di fosfati = cariche negative, quindi è presente una repulsione tra queste cariche => il DNA viene sempre messo in una soluzione tampone che contiene cationi, i quali schermano le cariche negative della doppia elica e la rende stabile, in quanto tenderebbe ad aprirsi otherwise; tanto più è elevata la concentrazione salina, tanto più ci sono cationi che schermerano le repulsioni tra le cariche negative e tanto più l’elica è stabile; ➔ ibridazioni tra acidi nucleici =​> processo opposto alla denaturazione  = tale tecnica sfrutta la capacità di acidi nucleici a singolo filamento che presentino complementarietà parziale o totale tra loro di formare molecole a doppio filamento mediante l’appaiamento delle basi; 1. denaturazione del DNA 2. abbasso la temperatura gradualmente 3. aggiungo un oligo a mio piacimento e ciò che capita è che può avvenire l’appaiamento degli acidi nucleici, più nello specifico tra il mio oligo sintetico aggiunto e la regione che ho bersagliato; 4. se si formano regioni complementare le due eliche si appaiono completamente; 5. se non c’è perfetta complementarietà e alcune regioni non sono complementari, gli acidi nucleici si possono ibridare lasciando delle regioni che sporgono; STRUTTURA DELL’RNA ➔ Presenta uno zucchero diverso = ribosio; (1° differenza) ◆ presenta un gruppo -OH che manca in 2’. Esso conferisce proprietà che il DNA non ha; allo stesso tempo, lo rende instabile in soluzione acquosa. In acqua, infatti, l’RNA può andare in contro ad una reazione spontanea (non catalizzata quindi) intramolecolare =​ idrolisi alcalina. ​ L’OH in 2’ può fare un attacco nucleofilo al fosfato del legame fosfodiesterico; se così avviene, il fosfato non può avere più di cinque legame e si rompe lo scheletro fosfodiesterico. Ne deriva la rottura della catena di DNA. Questo -OH è anche quello che permette alla DNA POLIMERASI di discriminare, quando catalizza la reazione, i deossiribonucleotidi che deve usare per la duplicazione dai ribonucleotidi che sono presenti nel nucleo ma non devono essere usati per la sintesi del DNA. ➔ Presenza dell’URACIlE (“° differenza) al posto della TIMINA (questa ha un gruppo metilico in più); ➔ Singolo filamento (3° differenza) ➡ non vuol dire che non possa andare incontro alla formazione di strutture secondarie e terziarie in virtù del fatto che all’interno di questo singolo filamento ci siano regioni che hanno tra di loro complementarietà di basi; le strutture createsi sono a tutte gli effetti una doppia elica (di tipo A) ➔ Quando parliamo di RNA possiamo avere molte strutture che differiscono anche per la funzione che assumeranno in seguito; ◆ forcina (stem-loop) ◆ gemma ◆ ansa ➔ a differenza del dna in cui invochiamo sempre la complementarietà di Watson e Crick, sull’RNA in cui non siamo vincolati ad ottenere una doppia elica canonica come quella della scala a chiocciola, sull’RNA troviamo anche delle interazioni  che non sono canoniche; ◆ ex. pseudonodi => interazioni non convenzionali ◆ interazioni U-G => non accadrebbe mai nell’RNA!! ➔ Tutte le volte che l’rna forma degli appaiamenti e quindi una doppia elica, essa non sarà mai di tipo B come quella del DNA, ma avrà piuttosto la forma A; TOPOLOGIA DEL DNA (chiede solo quello che dice, il libro è più complicato) ➔ concetto da cui si parte :​ IL DNA CIRCOLARE COME ANCHE QUELLO EUCARIOTICO è UNA STRUTTURA TOPOLOGICAMENTE DEFINITA ◆ DNA batterico = circolare, non ha estremità. Per questo motivo il numero di volta che un filamento gira attorno all’altro non può cambiare; ◆ anche quello eucariotico, sebbene sia lineare (basta pensare ai cromosomi umani), essendo legato a proteine, non può permettersi di ruotare liberamente => anche le molecole di DNA lineari presenti nei cromosomi eucariotici sono sottoposte a vincoli topologici per via dell'estrema lunghezza della molecola che viene ridotta attraverso la formazione della cromatina e l’interazione con altri componenti cellulari ➔ Il DNA è una struttura topologicamente definita​, non ha le estremità libere di ruotare ➔ Nel momento della duplicazione//trascrizione, la doppia elica deve essere aperta a livello dell’origine di replicazione//replicazione. ↪ se prendiamo in considerazione un DNA nudo (non associato a proteine) e lo denaturo localmente, nel momento dell’apertura, avendo le estremità libere, gli estremi​ tendono a ruotare; m ​ a se gli estremi al contrario non sono liberi (situazione fisiologica, in natura infatti il DNA non è mai nudo) perché ci sono proteine complessate in quei determinati punti, e quindi non sono libere di ruotare => topologicamente definita => si formano dei superavvolgimenti. ➔ Se non ci sono superavvolgimenti, si dice che la struttura del DNA è rilassata; ➔ per definire la topologia del DNA, i ricercatori invocano questa regola = noi possiamo definire quello che si chiama​ ​numero di legame, o linking number​, il quale è la somma di due parametri =>​ LK = Tw + Wr ◆ Lk ​= numero di volta che un filamento passa attorno all’altro (solitamente 25) (nella struttura rilassata del DNA) ◆ Wr​ = numero di volte che il doppio filamento passa attorno al doppio filamento in un altro punto (nella figura a sx = 3); se i superavvolgimenti sono zero, allora si parla di DNA rilassato. ➔ fisiologicamente il DNA, ogni volta che viene aperto, è​ superavvolto negativamente​, cosicché sia più facile aprirlo localmente ↪ se apro localmente la doppia elica, ciò che tendo a fare è di spingere la doppia elica a formare dei superavvolgimenti negativi; se ho il DNA superavvolto negativo, allora il DNA è prono a denaturarsi localmente => siccome le due forme sono in equilibrio, se lo apro tende a formare superavvolgimenti negativi allo stesso tempo se ho superavvolgimenti negativi, allora il DNA tende a convertirsi ad una forma denaturata localmente; sono due topoisomeri, non cambia il linking number. ➔ Il DNA è tenuto in condizioni in cui sia prono per aprirsi, così da facilitare gli enzimi che hanno come compito quello di aprire la doppia elica => fisiologicamente, infatti, è superavvolto negativamente. ➔ I nucleosomi impongono superavvolgimenti negativi; ➔ Quali possono essere gli organismi dove si trovano superavvolgimenti positivi che rendono la denaturazione più difficile? => gli estremofili, batteri che vivono in condizioni estreme, come batteri che vivono a temperature assai elevate (dove la sola temperatura condizionerebbe l’apertura dell’elica) ➔ Il DNA superavvolto negativamente tende a denaturarsi localmente ➔ Il linking number può essere cambiato solo attraverso il taglio della doppia elica => ci sono enzimi con tale funzione ↪ TOPOISOMERASI (​quando inizio ad aprile la doppia elica in un determinato punto, i superavvolgimenti alle estremità iniziano a diventare sempre più “folti” non essendo liberi di ruotare; ciò potrebbe essere un problema per la forca replicativa se non ci fossero degli enzimi deputati a “rilassare” il DNA). Come lavorano? essi sono in grado di far ciò introducendo una rottura del singolo o del doppio filamento (e facendoli passare uno attorno all’altro) del DNA in modo temporaneo = è in grado di rimuovere i superavvolgimenti positivi e rilassare il DNA. Sono vitali per la vita. Conosciamo due tipi di topoisomerasi: 1. TOPOISOMERASI I​ , tagliano solo uno dei due filamenti e lo fanno passare attorno all’altro; cambiano il linking number di uno. 2. TOPOISOMERASI II,​ tagliano entrambi i filamenti, cambiano il linking number di due unità; ➔ Come fa la topoisomerasi a rompere il legame fosfodiesterico e a far passare un filamento dietro l’altro? per svolgere la loro funzione, le topoisomerasi devono tagliare uno o tutti e due i filamenti e poi risaldare il filamento o i filamenti tagliati. Le topoisomerasi sono in grado di promuovere entrambe le reazioni senza che debbano intervenire altre proteine o cofattori a elevate energia poiché usano un meccanismo che prevede la formazione di un legame intermedio covalente. 1. il taglio della molecola di DNA avviene quando un residuo di tirosina presente nel sito catalitico dell’enzima attacca un legame fosfodiesterico dell’impalcatura della molecola di DNA bersaglio 2. questo attacco causa una rottura del DNA e la topoisomerasi rimane legata covalentemente a una delle estremità rotte mediante un​ legame fosfotirosinico 3. l’altra estremità del DNA, che termina con un gruppo OH, è tenuta molto saldamente dall’enzima; 4. il legame fosfotirosinico conserva l’energia che viene liberata dall’idrolisi del legame fosfodiesterico. 5. di conseguenza, il DNA può essere risaldato semplicemente invertendo la reazione: il gruppo OH esistente all’estremità del nick attacca il legame fosfotirosinico, riformando il legame fosfodiesterico del DNA 6. questa reazione ripristina l’integrità del filamento del DNA e rilascia la topoisomerasi, che torna a essere disponibile per un altro ciclo. ➔ ELETTROFORESI DEL DNA = il poter separare molecole all’interno di una matrice porosa a seconda del loro peso molecole/dimensioni, facendole passare attraverso questa matrice porosa trainate da un campo elettrico; Il DNA è carico negativamente (a causa dello scheletro fosfodiesterico), quindi quando lo metto all’interno di un matrice porosa e applico un campo elettrico, il DNA viene attratto dal polo positivo; questa matrice è di norma fatta da un reticolo di polisaccaridi = “gel di agarosio”. Il DNA migrerà con velocità proporzionale al campo elettrico, ma soprattutto, a parità di campo elettrico, i frammenti più piccoli saranno quelli che migreranno più velocemente, quelli un po’ più grandi saranno invece rallentati dal reticolo del gel e quelli più grandi in assoluto migreranno ancora più lentamente. Il DNA isolato può trovarsi in tre casi (se usiamo DNA circolare) 1. tutto superavvolto 2. DNA lineare (si è rotto) 3. DNA circolare rilassato ↪ Migrano in modo uguale? o, passando per i pori del gel, qualcuno di questi tende a migrare più velocemente? = tanto più è superavvolto, tanto più correrà velocemente; tanto più rilassato e circolare è, tanto più è lento (DNA circolare rilassato) (quello lineare è quello che viaggia con velocità intermedia) ↪ come riesco a vedere il DNA quando lo metto all’interno del gel? in laboratorio il DNA sarebbe invisibile, non è possibile vederlo ad occhio nudo;allora si metto il bromuro di etidio, il quale è una molecola planare capace di intercalarsi nella doppia elica del DNA; questo è capace di assorbire la luce ultravioletta e di emettere nel visibile. Il ricercatore prende il gel dove il DNA non è visibile, lo mette su una sorgente di raggi ultravioletti (che di solito bombarda il gel da sotto); facendo questo, il bromuro di etidio, intercalato nella doppia elica, viene eccitato dai raggi UV ed emette nel visibile (proprietà che ha solo quando fa parte della doppia elica) e quindi rende il DNA visibile. ➡TAKE AWAY MESSAGE = i​ l DNA è superavvolto, a volte a causa delle torsioni che si formano dall’apertura della doppia elica oppure a causa del fatto che è complessato con proteine (vedi cromatina). Nella maggior parte degli organismi questi avvolgimenti sono negativi, i quali rendono il DNA in equilibrio con un suo topoisomero che sia localmente denaturato, fattore che aiuta gli enzimi ad aprire l’elica per formare la bolla di replicazione. Queste due forme sono dei topoisomeri e le sue caratteristiche sono date dal linking number, che è dato dalla somma dei giri dell’elica e il numero di volte che la struttura della doppia elica si incrocia con la doppia elica in un altro punto. L’unico modo per rimuovere i superavvolgimenti è quello di tagliare uno o due filamenti, compito che è svolto da un gruppo di enzimi chiamato topoisomerasi. INTERAZIONE DNA-PROTEINE Prendiamo in considerazione un esempio specifico = interazione tra DNA ed enzimi di restrizione, ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE Premessa​ = il DNA ha un solco maggiore e minore; Il primo è quello altamente informativo e permette alla proteina di ingaggiare delle interazioni con esso che riescono a capire dalla firma di accettori o donatori qual’è la sequenza di base contenuto in tal loco; nella maggior parte dei casi la struttura della proteina che interagisce con il solco è unas struttura ad alfa elica, la quale sfrutta i gruppi laterali per interagire con le basi. Se la proteina che arriva ha la sequenza amminoacidica corretta per essere compatibile con le basi presenti nel solco, avremo un’interazione specifica tra proteina e DNA; nel caso non sia così, l’interazione sarà aspecifica e probabilmente debole. = ENZIMI DI RESTRIZIONE ➔ endonucleasi (sotto cat.enzimi di restrizione) ≠ esonucleasi => le esonucleasi ◆ = endonucleasi, sono enzimi in grado di rompere lo scheletro fosfodiesterico tagliando il DNA dall’interno, riconoscendo sequenze specifiche ◆ esonucleasi = data la stessa sequenza, le esonucleasi sono in grado di digerire un legame fosfodiesterico alla volta partendo dalle estremità; ➔ hanno origine batterica, sono stati isolati in essi; ogni batterio contiene un preciso enzima di restrizione che serve per difendersi dal DNA esogeno => proteggono il batterio da DNA esogeno, come ad esempio quello di batteriofagi. PRIMA DOMANDA: qual è il meccanismo attraverso cui l’enzima riconosce la sequenza specifica di tagliare? Ci sono tre grandi categorie di enzimi di restrizione: tipo I, II e III. Ai ricercatori interessano soprattutto quelli di tipo II, in quanto tagliano entrambi i filamenti all’interno (endonucleasi) di una particolare sequenza riconosciuta dall’enzima. Nella maggior parte dei casi la sequenza riconosciuta è simmetrica, cioè è identica se la leggiamo da 5’-3’ o da 3’-5’ dell’altro filamento = ​sequenze palindromiche. L’enzima di restrizione taglia entrambi i filamenti e nel tagliarli li tagli sempre e solo in una maniera specifica. In questo caso taglia tra la prima G e la A sia in un filamento che nell’altro (ha tagliato in maniera sfalsata, producendo un’estremità che presentano un regione a singolo filamento). C ​ reano tagli sfasati nella doppia elica, dando luogo a polinucleotidi con estremità ‘coesive’​ (​sticky ends​), in cui uno dei due filamenti di DNA presenta nucleotidi non appaiati e sporgenti​,​ mentre altri creano tagli netti e ne risultano estremità piatte, prive di estensione (​ ​blunt ends​). SECONDA DOMANDA: qual è il meccanismo attraverso cui l’enzima rompe il legame fosfodiesterico? = ATTACCO NUCLEOFILO = meccanismo idrolitico​ = nel sito attivo dell’enzima una molecola d’acqua fa l’attacco nucleofilo sul legame fosfodiesterico da rompere, in particolare l’atomo di ossigeno sul fosfato, che a questo punto non può avere sei legami con conseguente rottura del legame fosfodiesterico che porta alla rottura dello scheletro fosfodiesterico. Nel sito attivo dell’enzima ci sono dei cationi bivalenti (ione di magnesio) che si coordinano con l’acqua, tendono a deprotonare l’ossigeno e rendono quest'ultimo più prono ad attuare l’attacco nucleofilo. L’enzima riconosce la sequenza palindromica produce una simmetria rotazionale binaria. L’enzima, che agisce come dimero, abbraccia la sequenza palindromica, ed interagisce con essa attraverso il solco maggiore e si formano legame con gli aa dell’enzima => interazione specifica tra basi azotate presenti nel solco e aa dell’enzima. L’enzima tuttavia lega con affinità simile sia le sequenze corrette che quelle non...perchè allora taglia solo quelle corrette?​ nel caso dell’enzima EcoRV succede una cosa inusuale: se andassimo a vedere l'affinità (forza con cui la proteina lega il DNA) della proteina con il DNA, lega più o meno con la stessa forza la sequenza giusta sia quella da non tagliare. = la risposta sta nelle capacità dell’enzima di cambiare la conformazione dell’elica => la risposta sta nelle interazioni specifiche dell’enzima con la sequenza specifica => il dimero abbraccia la doppia catena al centro con i suoi dimeri, visto che il DNA ha una simmetria rotazionale binaria. Cosa capita se la sequenza è quella giusta? si formano interazioni, legami idrogeno tra gli amminoacidi e lo scheletro del DNA. Queste forti interazioni producono una curvatura, una distorsione del sito di riconoscimento e ​questa distorsione fa in modo che il legame fosfodiesterico,che riceverà l’attacco nucleofilo ,si trovi nel sito attivo di ogni monomero​. Se ci fosse una sequenza sbagliata, la distorsione non avverrebbe, in quanto il legame da tagliare sarebbe troppo distante dal sito attivo. Abbiamo detto che esistono tre tipi di enzimi di restrizione: I tipo = riconoscono una sequenza specifica MA tagliano fuori da questa sequenza , alcuni tagliano in prossimità,altri anche distanti. Non possiamo predire dove tagliano, quindi non ci sono utili. Si creano estremità che non possiamo predire. II tipo = endonucleasi, che vengono usati nel 99.9 % dei casi in biologia molecolare; tagliano all’interno della sequenza che viene riconosciuta. Ci è utile perché sappiamo che quando taglia una molecola di DNA, otteniamo un’estremità coesiva. III tipo = come enzimi di tipo I. TERZA DOMANDA: perché l’enzima di registrazione non taglia il genoma del batterio di cui fa parte? L'escherichia coli contiene sia l’enzima di restrizione sia una metilasi che metila la sequenza GGATCC del genoma batterico, a differenza della sequenza nel DNA esogeno. = la protezione sta nella metilazione => se la sequenza non è metilata allora viene tagliata, mentre se è metilata no. Il gruppo metilico, infatti, interferisce con la rete proteina-DNA che porterebbe alla distorsione e questa sequenza non viene più digerita. Per prevenire la digestione del DNA endogeno, accanto all'end nucleasi il batterio ha una metilasi, che mantiene metilata la sequenza che sarebbe riconosciuta dell’enzima dei restrizione e in questo modo la difende dalla digestione. LA CROMATINA ➔ Prendiamo in considerazione i​l genoma di eucarioti superiori​ = il DNA è sempre organizzato con proteine in una struttura chiamata​ cromatina c​ he porta alla condensazione del DNA all’interno del nucleo; ◆ necessità di impacchettare il DNA,che negli eucarioti è lungo fino a due metri, in una struttura, il nucleo, che si aggira attorno i 10 micrometri. ◆ il DNA è organizzato in modo tale che possa essere letto, riparato, duplicato durante le varie fasi della vita della cellula, ➔ anche per i batteri vale la stessa cosa; tuttavia nei batteria il DNA è circolare ma complessato sempre con proteine. ➔ Il DNA impacchettato nella cromatina rende le sequenze che devono essere riconosciute da proteine specifiche meno accessibili; il problema dell'accessibilità (più la cromatina è condensata, tanto meno è accessibile) delle sequenze del DNA della cromatina è uno dei meccanismi principali con i quali si risolve il problema della regolazione genica. ➔ Importante ricordare che nelle cellule eucariotiche la​ condensazione della cromatina dipende dalla fase del ciclo cellulare in cui ci troviamo​; in condizioni normali, quella che viene chiamata interfase, la cromatina è rilassata mentre quando la cellula entra in mitosi, la cromatina viene condensata al massimo con la formazione dei cromosomi. ➔ Excursus​ = il genoma diventa sempre più complesso a mano a mano che passiamo dai procarioti agli eucarioti, e dagli eucarioti inferiori (ex. lievito) gli eucarioti superiori (uomo)  ◆ le dimensioni del genoma umano è di circa 3200 Mb => aumento delle dimensioni rispetto a quello batterico ma non avviene un aumento della densità genica (come ci si potrebbe aspettare) => rispetto ai batteri, infatti, non aumentano i geni ma aumentano piuttosto le sequenze regolatrici, cioè regioni intergeniche che renderanno conto di una maggiore complessità di regolazione. ➔ Durante la vita della cellula (interfase), momento in cui svolge le proprie funzioni e processi vitali, la cromatina si trova decondensata; 1. Struttura più elementare della cromatina = struttura a “collana di perle” a. diametro = 10 nm. b. struttura più semplice che caratterizza​ la EUCROMATINA = poco condensata e funzionalmente contraddistinta da un’intensa attività trascrizionale. c. molto più accessibile all’interazione con proteine che devono riconoscere sequenze specifiche; d. presenza di​ nucleosomi​, unità di base di questa struttura e. nucleosom​a = struttura formata da un’unità centrale proteica, chiamato core proteico​, formato da ​proteine istoniche​; attorno al core, il DNA si avvolge facendo 1,65 giri. Nel DNA umano questi 1,65 giri corrispondono a 147 paia di basi. A seconda delle specie prese in considerazione il nucleosoma può essere più o meno grande, ovvero il core può essere più o meno grande perchè dipende dalla proteine istoniche presenti e dal DNA che stiamo considerando. f. il core istonico è un​ ottamero, cioè è formato da otto subunità proteiche =​ ovvero otto proteine distinte che interagiscono tra di loro mediante interazioni deboli => queste subunità possono in qualsiasi momento disassemblarsi, come avviene durante la duplicazione g. gli istoni sono di cinque tipi: i. H2A ii. H2B iii. H3 iv. H4 v. H1 1. sono proteine piccole, al massimo un paio di centinaia di aa 2. grande percentuale di aa carichi positivamente, lisina e arginina. Come mai? questo perché il DNA è carico negativamente, quindi se voglio che rimanga unito ad un core proteico, ho bisogno di cariche positive che diano una forza di coesione. a. core istonico =​ H2A,H2B,H3, H4 x2  b. queste proteine istoniche sono tra quelle più conservate a livello evolutivo; c. struttura proteine istoniche = presenza di una regione centrale (histone-fold) da cui partono delle ​code ammino-terminale ​cariche positivamente; ↪ ma come si assembla il core istonico per produrre l'ottamero attorno al quale si avvolge al DNA? = al tempo zero il DNA è nudo e quindi le proteine istoniche devono interagire con la doppia elica del DNA per fare in modo che essa si avvolga attorno a sé. Quando le proteine istoniche intervengono, le subunità istoniche non intervengono in maniera indipendente e singola, ma si pre-formano dei complessi tra le subunità istoniche, in particolare questi complessi che si pre-formano sono di due tipi: attraverso l’interazione proteina-proteina si generano degli eterodimeri H2A-H2B e eterotrimeri H3-H4 => quindi, per formare l’ottamero avremo bisogno di un eterotetramero H3-H4 e di due eterodimeri H2A-H2B Take away message = quando il nucleosoma, e quindi la struttura dell’ottamero istonico si genere, che interviene non sono le subunità distinte, ma sono degli eterodimeri + eterotetrameri preformati. Il primo che interviene è tetramero che per primo interagisce con il DNA lineare, nudo, e attraverso queste interazioni il tetramero comincia a piegare ed a avvolgere su di sé la doppia elica del dna; solo successivamente, interverranno i due eterodimeri a formare il core istonico. Da notare che il tetramero è collocato nella parte alta, mentre nella parte bassa si trovano i due dimeri. Da notare che in questo momento non sono essenziali le code ammino-terminali. Ma come fa il tetramero H3-H4 che interviene per primo a cominciare a distorcere la doppia elica per fare in modo che si avvolga attorno a sé? => l’interazione s​ equenza-aspecifica​ del tetramero con il DNA lo curva, perchè le proteine istoniche H3.H4 ingaggiano numerose interazioni con il DNA, sia con lo scheletro fosfodiesterico sia ingaggiando numerosi legami ad H a livello del solco minore (​ interazione aspecifica!); ​solo dopo che il tetramero ha curvato la catena del DNA entrano in gioco anche i due eterodimeri. Che cosa fanno le code istoniche in tutto questo? ​=> hanno due principali funzioni: la prima è che protrudendo, fanno in modo che il DN​A sia vincolato al nucleosoma​ e non possa scivolare via + impongono al DNA che si avvolge attorno al disco istonico s​ uperavvolgimenti negativi ​in maniera tale che esso sia prono all’apertura locale della doppia catena.  h. Tra un nucleosoma e l’altro c’è un filamento a doppia catena di DNA che viene chiamato D ​ NA linker;​ ha una sequenza variabile, alcune decine di nucleotidi. Lunghezza media nell’uomo 38-53 bp = base pair i. L’avvolgimento del DNA attorno al core istonico porta ad un DNA compattato di circa 6 volte rispetto a filamento decondensato => 2 metri : 6. Il filamento a 10 nm è la forma meno condensata del DNA e la chiameremo ​EUCROMATINA ​( qui i geni sono espressi in quanto possono interagire con le proteine regolatrici, che a loro volta riconoscono sequenze segnale, aprono l’elica e trascrive i geni). La versione dalla “collana di perle” che inizia ad essere più condensata ci porta a parlare di ETEROCROMATINA =​ > tutte le volte che un gene sarà in una zona eterocromatinica, sarà un gene difficilmente esprimibile; per renderlo esprimibile, in primis, bisognerà rendere quella zona meno condensata per fare in modo che possa interagire con le proteine. ↪ ci sono meccanismi, alla base dell’espressione genica, che sono in grado di shiftare da regioni condensate a regioni meno condensate e viceversa; sciftare da una parte all’altra influenza di gran lunga l’accessibilità del DNA e al contempo che fattori specifici attivino l’espressione di un gene o che la disattivino. Nel passaggio dalla collana di perle al filamento che sta andando verso l’eterocromatina, a 30nm, in questo passaggio interviene il quinto istone =​ l’istone H1.​ Questo interviene in maniera singola, non è parte di un complesso pre-formato, e interviene andando ad interagire con il DNA nella regione centrale del nucleosoma e interagendo con una dei due tratti del DNA-linker che esce dal nucleosoma => prende uno dei due linker e lo avvicina all’altro =​ in altre parole avvicina i nucleosomi. Ricorda​: queste strutture sono dinamiche. = la condensazione della cromatina è un processo talmente dinamico che sulla cromatina intervengono delle macchine molecolari chiamate​ “complessi di rimodellamento dei nucleosomi” c​ he sono in grado, spesso guidate da altre proteine, di riarrangiare la disposizione dei nucleosomi => possono srotolare, rimuovere nucleosomi o rimescolare le componenti istoniche. Tanto più le sequenze sono in prossimità del DNA linker, tanto più un piccolo scivolamento del nucleosoma renderà accessibile tale sequenza ; tanto più le sequenze, invece,sono al centro del DNA avvolto nel nucleosoma, tanto più sono inaccessibili e per renderle accessibili saranno necessari rimodellamenti più massicci. = la struttura della cromatina può essere localmente modificata.  2. Fibra a 30 nm (40x) a. diametro = 30 nm. b. le sequenze del DNA sono meno accessibili rispetto alla struttura a “collana di perle”. ↪ ma cosa rende stabile l’eterocromatina nella sua condensazione a 30 nm, a parte l’istone H1? ​le code istoniche!! => e ​ sse fanno in moda che un nucleosoma interagisca con i nucleosomi vicini = tutte le volte che noi favoriremo l’interazione tra un nucleosoma e quelli vicini, noi condensermo la cromatina mentre tutte le volte che interferiremo con le interazione delle code terminali, noi andremo a decondensare la cromatina. Ci sono due modelli che spiegano com’è fatto questo filamento a 30 nm: 1. a solenoide 2. a zig zag In seguito intervengono altre proteine che impacchettano la cromatina in livelli di condensazione maggiori, fino ad arrivare alla formazione dei cromosomi laterali 3. terzo livello di condensazione​ = ulteriore ripiegamento della fibra di 30 nm a formare dei domini a ansa (lunghe fino a 100.000 cb), diametro 300 nm. ➥ La struttura è stabilizzata dall’ancoraggio allo s​ caffold (“impalcatura”)​ = questa organizzazione ad anse superavvolte è stabilizzata dall’ancoraggio periodico del DNA ad una rete di proteine non istoniche insolubili, dette ​proteine di impalcatura​, che contribuiscono al mantenimento della struttura del cromosoma e fanno parte di una impalcatura nucleare organizzata, detta matrice nucleare. + i domini ad ansa aderiscono anche alla lamina nucleare a livello del versante interno. 4. quarto livello di condensazione =​ ripiegamento dei domini ad ansa, diametro 700 nm. 5. quinto livello di condensazione ​= le anse infine si compattano e ripiegano ulteriormente per dare il c​romosoma mitotico​, o metafisico, in cui il DNA è condensato circa 10.000 volte. Sono coinvolte le proteine coesine e condensine. CODE ISTONICHE- MODULAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA = s​ ono regioni esposte degli istoni quindi al fuori del nucleosoma che ingaggiano interazioni con i nucleosomi vicini e a seconda di come è configurata la coda istonica, ovvero a seconda di come sono le catene laterali di quegli aa di cui sono composte (modificazioni subite // cariche poitive o negative), sono in grado di, favorendo/sfavorendo alcuni tipi di interazione, influenzare come un nucleosoma sia o meno compattato con i nucleosomi vicini. Le code istoniche, come già detto, hanno due funzioni principali: 1. vincolare il DNA, imponendo superavvolgimenti negativi che rendono la doppia elica prona all’apertura locale 2. protrudono dal core per far interagire i nucleosomi l’uno con l’altro; in questo modo stabilizzano l’eterocromatina e la struttura a 30 nm, la quale rende le sequenze meno disponibili. Ma come avviene ciò? le code istoniche protrudono e hanno aa carichi positivamente; come posso modulare la condensazione della cromatina agendo sulle code istoniche? le catene laterali degli aa che compongono le code istoniche possono andare incontro a modificazioni covalenti reversibili, le quali si riflettono in una coda istonica che può essere più prona ad interagire con i nucleosomi vicini (stabilizzazione dell fibra a 30 nm) oppure tali modificazioni possono rendere le code meno prone ad interagire ed in questo caso avrò uno sfavorimento della fibra a 30 nm e sarà favorita maggiormente quella a 10 nm, formando quindi la cromatina decondensata. Ma quali modificazione possono avvenire a livello degli aa che compongono le code istoniche? ci sono almeno tre tipi di modificazioni covalenti possibili: 1. esempio: la lisina in condizioni normali è carica positivamente => esistono a livello del DNA enzimi che riescono ad aggiungere alla lisina un gruppo acetilazione = ACETILAZIONE DELLE CATENA LATERALI DEGLI AA DELLE CODE ISTONICHE.​ Questi enzimi fanno parte della famiglia delle ​acetiltransferasi​. Ma qual è l’effetto dell’acetilazione della lisina? essa passa da avere una carica positiva, la quale ingaggiava un legame ionico con cariche negative che stabilizzava la catena a 30 nm; nel momento in cui una istone acetiltransferasi acetila la lisina, si genera l'acetil-lisina la quale non ha più la carica, senza la quale non può più ingaggiare quel legame ionico che prima stabilizzava la catena a 30 nm e in questo caso viene favorita la decondensazione della cromatina in quel sito. Al contrario, esiste un enzima che riesce a rimuovere il gruppo acetile durante un processo di deacetilazione => in questo caso favorisco la condensazione della cromatina. ↪ take away message = noi possiamo regolare l’espressione genetica regolando la condensazione della cromatina attraverso la modificazione covalente reversibile degli aa delle code istoniche 2. processi di metilazione 3. processi di fosforilazione Le code istoniche hanno diversi punti in cui possono essere modificate (non solo un aa in particolare) = le code istoniche presentano aa che possono andare incontro a modificazioni covalenti reversibili (acetilazione,metilazione,fosforilazione); a seconda di qual è il profilo/la firma di modificazione degli aa sulle code istoniche, noi abbiamo un network di interazioni che può favorire o sfavorire la condensazione in quel punto. Presenza di enzimi specifici (chinasi-fosfatasi // metiltransferasi-demetilasi // acetil-transferasi o deacetilasi ). = giocando sulle code istoniche possiamo regolare l’espressione genica in quel punto, rendendo accessibili sequenze che prima non lo erano o rendendo inaccessibili sequenze che prima lo erano. ↪ questo meccanismo attraverso il quale modificando le code istoniche vado ad influenzare la condensazione della cromatina è un​ ​meccanismo di modulazione diretto. Come possono le modificazioni degli istoni influenzare la funzione dei nucleosomi? = ​le modificazioni delle code istoniche possono agire sulla condensazione della cromatina attraverso due meccanismi che sono strettamente interlacciati in molti casi: meccanismo diretto => ​sono processi guidati a livello della regione genica particolare da ​proteine sequenza-specifica responsabili della regolazione di quel gene. Ex. acetilazione della lisina. Tuttavia molte  volte questi processi non sono sufficiente a decondensare la cromatina e corrispondono a passaggi intermedi. meccanismo indiretto => p ​ artiamo sempre dell’esempio dell’acetilazione della lisina => esistono delle proteine, o meglio dei complessi macromolecolari che contengono proteine con regioni che sono in grado di riconoscere le code acetilate delle lisine; quelle regioni che riconosce le regioni acetilate si chiamano bromodomini ed in seguito rimodellano ulteriormente la cromatina = m ​ eccanismo indiretto​, in quanto la proteina con il bromodominio interviene dopo che è intervenuta la acetiltransferasi. Questo sul versante dell’acetilazione. Alla pari avviene un meccanismo indiretto in seguito alle metilazione delle code. Nel caso in cui la metilazione non sia sufficiente a decondensare la cromatina, le code metilate possono essere riconosciute da proteine che hanno​ cromodomini. Q ​ ueste subunità fanno parte molte volte di complessi di rimodellamento della cromatina. ↪ L’azione di tutti questi attori che modificano le code istoniche sono in grado di generare una firma di modificazione sugli aa delle code istoniche che rendono conto poi dei una propensione di quella coda a far parte di una regione condensata o meno. = posso agire sulle code istoniche per regolare la condensazione o meno della cromatina. ➡ ricorda = subunità ≠ dominio ( =​regioni strutturalmente ben organizzate di una proteina che rende conto di una funzione) NUCLEOSOMI E DUPLICAZIONE DEL DNA ➔ Cosa capita alla cromatina quando avviene la duplicazione? a. nel punto in cui c’è la sequenza di origine della replicazione, il doppio filamento inizia ad aprirsi (vengono denaturati i legami) per formare la forca replicativa b. a questo livello si assembla il replisoma che è capace di copiare il DNA per formare una nuova catena e ciò avviene sia verso sinistra che dx. c. mano a mano che la DNA polimerasi avanza (la quale fa parte del replisoma), gli istoni devono essere rimossi => a valle della forca replicativa c’è la rimozione del core istonico. A monte della stessa forca al contrario, nella regione dove è appena ❓ venuta la replicazione, i nucleosomi vengono riassemblati. ​ Quando rimuovo il nucleosoma vecchio, come viene disassemblato? 1. si scompone negli otto monomeri ? 2. rimane ottamero intero? 3. si scompone in eterodimeri H2A-H2B e eterotetrameri H3-H4? = la risposta è 3! (come per la formazione) Se inizialmente ho 3 core istonici che corrispondono a 3 eterotetrameri e 6 eterodimeri , una volta che una regione è stata duplicata è ovvio che dovrò avere il doppio dei core istonici iniziali => avrò bisogno che la duplicazione del DNA sia preceduta da sintesi di nuovi istoni. Quando si riassemblano i cori istonici sui due nuovi filamenti appena sintetizzati, osserviamo che c’è un rimescolamento casuale tra tutti gli eterodimeri ed eterotetrameri che abbiamo a disposizione. Gli istoni vecchi hanno code ovviamente le code istoniche modificate. Ma gli istoni nuovi hanno le code istoniche? si, ma sono modificate o no?​ non modificate! Se una regione con le code istoniche rendeva conto di una cromatina condensata, come fa la cellula, una volta che l’ha duplicata, sapere che in quella regione deve tornare condensata? sarebbe un dramma se non avessimo memoria delle modificazioni delle code istoniche e quindi del livello di condensazione => ebbene rimescolando gli istoni vecchi con quelli nuovi,la cellula si portiamo dietro, mantenendo le modificazioni delle code istoniche vecche, la memoria di com’erano modificate le code istoniche in quella regione e quindi di com’era condensata la cromatina => grazie alla presenza di code vecchio, ripristino il livello di condensazione. ↪ processo di imprinting​ = una volta che la cromatina è stata modificata e condensata con opportune modificazione, quando questa viene duplicata, da memoria alle doppie eliche figlie di com’era prima; in questo modo la cellula avrà le stesse regione dove la cromatina (e quindi i geni espressi) era condensata e non =>​ i geni espressi prima sono gli stessi espressi dopo la duplicazione = la cellula adulta produce due cellule uguali a sé, che comporta anche avere le stesse regione condensate e non. REPLICAZIONE DEL DNA: PART 1 ➔ La replicazione deve: ◆ avvenire velocemente => la DNA polimerasi copia mille nucleotidi al secondo ◆ avvenire correttamente => la DNA polimerasi è un enzima che sbaglia molto raramente, circa 1 volta ogni 10 milioni di nucleotidi ➔ Com’è fatta la DNA polimerasi? di cosa ha bisogno la DNA polimerasi? (ricorda che ce n’è sono più di una) ◆ il primo substrato di cui ha bisogno per la sintesi di DNA è un particolare complesso formato da DNA a singolo filamento e a doppio filamento chiamato​ giunzione innesco-stampo​. Come suggerisce il nome stesso, la giunzione è formata da due componenti: lo stampo (= templato) è costituito da DNA a singolo filamento che dirige l’aggiunta, alla catena neosintetizzata, dei dei deossinucleotidi complementari; l’innesco o primer​ è ​ complementare allo stampo e deve presentare alla ❗❗ sua estremità un gruppo 3’-OH La DNA pol ha bisogno di questo innesco perché non può sintetizzare ex novo​, a differenza della famiglia delle RNA polimerasi. ◆ la DNA polimerasi ha bisogno dei​ quattro deossiribonucleotidi trifosfato, complementari a quelli del filamento stampo che sta copiando. ➔ La DNA polimerasi avanza sempre in​ direzione 5’-3​’ copiando un filamento antiparallelo 3’-5’;  ➔ Avviene un​ attacco nucleofilo t​ ra l’ossigeno in 3’ dell’innesco sul fosfato in alfa, quello più vicino; nel momento in cui succede ciò, si rompe il legame tra il fosfato alfa e beta = si genera così il ponte fosfodiesterico e viene liberata una molecola con due fosfati legati tra di loro =​ pirofosfato​. Quest’ultimo viene idrolizzato dalla ​pirofosfatasi inorganica​ che lo idrolizza in due fosfati inorganici => reazione irreversibile e favorita dal punto di vista termodinamico. ↪ ma qual è la forza che guida la polimerizzazione di un nucleotidi nel DNA ? l’energia libera in più è fornita dalla rapidità della rapida idrolisi del pirofosfato. Questa è una reazione altamente favorita. ➡ cos’è che favorisce questa reazione? perché avviene solo nel sito attivo dell’enzima e non avviene in soluzione? perchè nel sito attivo dell’enzima il meccanismo catalitico prevede il coinvolgimento di due cationi bivalenti; nella maggior parte questi sono cationi magnesio. Essi agiscono in due modi: 1. il primo si coordina con l’OH del 3’ del ribosio e rende l’ossigeno pono a compiere l’attacco nucleofilo. 2. Il secondo magnesio interagisce con le sue cariche positive con le cariche negative degli ossigeni del nucleotide entrante e compie due azioni: da una parte scherma le cariche negative del nucleotide entrante che altrimenti si spingerebbero con le cariche negative del DNA + stabilizza il nucleotide stesso: = in questa maniera solo nel sito attivo della DNA polimerasi può avvenire questa reazione di polimerizzazione del DNA in cui un innesco in 3’ viene allungato ad una velocità di 1000 nucleotidi al secondo. ➔ DNA elicasi =​ apre la doppia elica prima che sia duplicato; ➔ Quando la doppia elica viene aperto, il DNA si trova a singolo filamento e quindi potrebbe andare incontro ad appaiamenti interni che potrebbero complicare il funzione della DNA polimerasi; i​l DNA single strand ​verrà,quindi, protetto e ricoperto da proteine chiamate single-strand binding proteins. ➔ Mano a mano che il DNA si srotola a valle si generano dei superavvolgimenti e lì dovranno intervenire degli ​enzimi della famiglia delle topoisomeras​i; ➔ La DNA pol. dovrà rimanere attaccata alla giunzione innesco stampo per estendere velocemente il DNA e per questo avrò bisogno di qualcuno che la tenga in asse, e per questo entrerà in gioco anche un​a pinza scorrevole​ che dovrà essere spostata di volta in volta a seconda del filamento che stiamo considerando, che sia continuo o in ritardo;  ◆ tutti questi elementi dovranno agire in simultanea per copiare contemporaneamente i due DNA templati; ➔ La sintesi del DNA avviene in vari momenti della vita della cellula; può esserci una sintesi durante la replicazione ma avremmo bisogno anche di sintesi nei processi riparativi, durante le ricombinazione omologa etc. Per tutti questi eventi, a seconda del filamento, a seconda del momento in cui i trova la cellula, esistono diversi tipi di DNA polimerasi. DNA POLIMERASI ➔ Forma a mano semichiusa in cui si differenziano tre zone (dita,pollice, palmo) diverse che svolgono altrettante funzioni diverse; ◆ palmo = dove risiede il sito attivo dell’enzima e luogo in cui avviene la polimerizzazione; ha la struttura proteica a beta foglietto. ➔ La DNA polimerasi deve estendere l’innesco e per far ciò deve rispettare la regola dell’appaiamento delle basi tra il filamento della nuova sintesi e il templato =>​ fedeltà della DNA polimerasi. ➔ Nel nucleo, però, sono presenti molti elementi: c’è l’atp, l’utp, il citp, il gtp, i deossiribonucleotidi e i ribonucleotidi (che servono per la sintesi di RNA). Come fa la DNA polimerasi, quindi, ad incorporare nel filamento di sintesi correttamente il giusto desossiribonucleotide in mezzo a tutti questi elementi? => la soluzione è nel sito attivo della DNA polimerasi, in particolare sta proprio nelle​ interazioni che vengono ingaggiate nel sito attivo dell’enzima. ex. se entra la timina, che in questo caso è quella giusta, è in grado di ingaggiare le interazioni di Watson e Crick; se si ingaggiano le opportune interazioni, allora il nucleotide è correttamente posizionato all'interno del sito attivo. Se ciò accade il fosfato in alfa, che è quello che riceve l’attacco nucleofilo, sarà vicino al -OH nel 3’ e la reazione potrà avvenire. Al contrario, se entra un nucleotide che non è complementare alla base del templato, l’ingombro sterico è elevato e il fosfato che dovrebbe ricevere l’attacco nucleofilo non è abbastanza vicino all’ossigeno da far avvenire la reazione.  = questo spiega perché le basi che non formano appaiamenti corretti non vengano incorporate ➔ Ma se per esempio dobbiamo aggiungere l’adenina, abbiamo sia la deossiadenina trifosfato che la adenina trifosfato, e in entrambi i casi potrebbe venire la complementarietà​; il deossiribonucleotide giusto non ha l’OH in 2’. =​ nel sito attivo della DNA polimerasi, affinchè il nucleotide possa essere orientato in maniera corretta, ha bisogno di non avere l’OH in 2’. Nel caso entrasse un ribonucleotide la presenza dell’OH fa in modo che il ribonucleotide, anche se complementare, non riceva l’attacco nucleofilo. Proprio per come è configurato il sito attivo della polimerasi, questa riesce ad essere fedele e di discriminare tra deossiribonucleotide e ribonucleotidi. = con questo meccanismo la fedeltà della DNA POL è intorno a 10^-5, ovvero c’è un errore ogni 10^5 nucleotidi aggiunti; ➔ Nel palmo​ sono presenti aa che costituiscono il sito attivo + è appoggiata la giunzione innesco stampo => il palmo ha un’ulteriore compito, quello di mantenere legato la DNA polimerasi con l’innesco stampo e per farlo​ ingaggia delle interazioni proteina-DNA. Queste interazioni sono interazioni che avvengono all’interno del solco minore,​ in quanto le interazioni non devono essere specifiche, in quanto la DNA polimerasi deve duplicare tutto il filamento. ➔ Appaiamenti errati a livello della giunzione innesco-stampo introducono delle distorsioni nella doppia elica​ e ciò comporta un rallentamento della DNA pol e il rilascio della doppia elica; ➔ Importanza delle dita = l​ a struttura delle dita della DNA polimerasi è una struttura ad alfa-elica. L’alfa elica ( =le dita) della DNA pol. è la prima che interagisce con il nucleotide entrante => il nucleotide entrante è carico negativo per cui andrebbe incontro a repulsione con le cariche negative del DNA; ciò non avviene perché i nucleotidi sono sempre complessati con cationi + le cariche negative rimanenti vanno ad ingaggiare legami con arginina, lisina (catene laterali della alfa elica// dita) + c’è un aa aromatico, la tirosina, che interagisce con la base azotata del nucleotide entrante attraverso legami idrofobici => tutte queste interazioni “accolgono” il nucleotide entrante =>​ le dita quindi sono quindi il primo punto di accesso ed interazione con il nucleotide entrante a livello del sito attivo. ↪ Se l'appaiamento è corretto, avviene un cambiamento conformazionale della DNA polimerasi e la chiusura successiva delle dita. Altra funzione delle dita = sul temperato, impone un ripiegamento di 90° (nell’immagine “stampo curvato”) tra il nucleotide che dovrebbe fungere da stampo e quello subito dopo => impedisce e sfavorisce appaiamenti scorretti  Take away message =​ le dita servono ad interagire con il nucleotide entrante, a schermare le cariche, a chiudersi e cambiare conformazione per favorire la giusta conformazione del sito attivo; infine piegano le basi del templato per impedire appaiamenti corretti. ➔ Il pollice h ​ a un ruolo di stabilizzazione del complesso => interagisce con l’elica neosintetizzata e stabilizza il complesso mantenendo in posizione corretta la giunzione innesco-stampo, e lo fa attraverso interazioni tra lo scheletro fosfodiesterico e il solco minore. Questa stabilizzazione a cui contribuisce fa in modo che la DNA polimerasi sia un enzima processivo ◆ PROCESSIVITÀ​’ = capacità della DNA polimerasi di rimanere attaccata alla giunzione innesco-stampo e di estendere, aggiungendo un nucleotide alla volta il filamento di nuova sintesi senza staccarsi mai ◆ contrario DNA non processiva = non esiste!! ◆ aiutante = pinza scorrevole; ➔ La fedeltà della DNA polimerasi non è abbastanza, l’indice di errore è troppo alto ➔ La maggior parte delle DNA polimerasi vicino al sito attivo hanno anche un sito che viene chiamato “​PROOFREADING ACTIVITY”, e grazie ad un’attività di riparazione l’indice di errore passa da 10^-5 a 10^-7; =n ​ el caso di un missed match il palmo della DNA pol non è più affine alla giunzione innesco-stampo; ciò che capita è che questa giunzione perde affinità per il sito attivo ma l'estremità a singolo filamento con il missed match acquisisce affinità per il​ sito esonucleasico,​ laddove avviene l’attività di correzione delle bozze. A questo livello, c’è un’attività nucleasica 3’-5’ (torna indietro), che rimuove dal filamento neosintetizzato alcuni nucleotidi fino a quando non troverà la corretta struttura della doppia elica. Nel momento in cui ha rimosso alcuni nucleotidi, tra cui quello sbagliato, si rigenera una nuova giunzione innesco-stampo corretta che ha un’opportuna affinità per il palmo. A questo punto questa giunzione ritorna nel sito attivo e la replicazione continua.  LA REPLICAZIONE DEL DNA: PARTE 2 ➔ Keep in mind​ = quando la DNA polimerasi deve copiare ed estendere per generare il filamento di nuova sintesi, non può che farlo in maniera da generare un filamento antiparallelo a quello che c’era prima. Per duplicare i due filamenti parentali antiparalleli la DNA polimerasi dovrà agire su un filamento su un filamento in una direzione, mentre sull’altro in direzione opposta ma sempre in direzione 5’-3’. a. due forche replicative = una di dx e una di sx b. a livello della forcella di replicazione dovremmo considerare la sintesi dei due filamenti nuovi che vengono estesi in direzioni opposte ➔ replisoma = ​ complesso di enzimi e proteine, ognuno con un compito ben preciso che favorisce la replicazione del DNA. ➔ concetti di partenza a. le due catene parentali sono antiparallele; b. DNA pol. estende dal 5’-3’; c. DNA pol. richiede una giunzione innesco-stampo; ➔ L’enzima che genera la prima giunzione innesco-stampo è una​ RNA polimerasi (che non richiede un innesco), chiamata PRIMASI, che sintetizza piccoli frammenti di RNA all’inizio della replicazione = primer, con un -OH al 3’ libero ➔ A questo punto,è presente una giunzione innesco-stampo e al tempo T-0 si assembla la DNA polimerasi che estende l’innesco. a. sintesi continua sul filamento parentale guida o leader; b. sull’altro filamento, detto filamento in ritardo, l​a replicazione avviene attraverso la​ sintesi ad intervalli intermittenti di primer​ da parte della primasi; la primasi sintetizza questi piccoli frammenti sempre a monte di quelli già sintetizzati, così da poter permettere alla DNA polimerasi di lavorare in direzione 5’-3’ => la sintesi in questo caso è detto DISCONTINUA. = L’inizio di un nuovo filamento dei frammenti di Okazaki richiede un innesco di RNA I vari frammenti generati da primer diversi sono chiamati FRAMMENTI DI OKAZAKI e ​ hanno dimensioni differenti a seconda che parliamo di batteri o eucarioti ➔ Se prendiamo in considerazione la forca di replicazione di sinistra, il filamento che in quella di dx era quello leading, ora è quello lagging e viceversa;  ➔ Problema = la catena di nuova sintesi deve essere riparata, cioè i primer devono venire rimossi, sennò avremmo un ibrido => p ​ rocessamento dei frammenti di Okazaki. Bisogna: a. rimuovere i primer b. rimpiazzare con deossiribonucleoti​di c. riformare il legame fosfodiesterico ↳ per queste attività intervengono attività enzimatiche differenti; In primis interviene un’attività​ RNAsica (ribonucleasi)​, enzima che riesce a digerire e rimuovere i primer attraverso attività idrolitica; partendo dal 5’ dell’RNA rimuove tutti i ribonucleotidi. Non è in grado di digerire, però, il legame tra un ribonucleotide e un deossiribonucleotide, cioè l’ultimo. Ora abbiamo​ un gap ​= è a tutti gli effetti una giunzione innesco-stampo su cui può agire la DNA polimerasi. Nell’istante successivo, infatti, arriva una DNA pol che trova il suo 3’, estende la catena + riesce a rimuovere l’ultimo ribonucleotide attraverso la sua attività esonucleasica. Infine, a saldare i frammenti di okazaki interviene un enzima che si chiama​ LIGASI La DNA polimerasi che interviene in questo caso è una DNA​ poco processiva ➔ Chi interviene a livello della forca replicativa per aprire la doppia elica, denaturando il DNA? = ​DNA ELICASI =​ complesso omo-esamerico, formato quindi da sei subunità, che “abbraccia” il singolo filamento. ◆ mano a mano che avanza, visto che il foro è compatibile solo con il singolo filamento, se vuole avanzare deve aprire le due catene tenute insieme dai legami idrogeno attraverso un meccanismo ATP-dipendente. ◆ l​’elicasi è solo una per forca replicativa; ◆ si posiziona avvolgendosi attorno al singolo filamento; ◆ avanzando apre la doppia elica. ◆ ciascuna elicasi si sposta lungo il DNA in una direzione definita =​ caratteristica indicata come polarità della DNA elicasi;  ◆ questi enzimi si legano e si spostano lungo il singolo filamento di DNA utilizzando l’energia fornita dall’idrolisi di ATP. = l’elicasi è è formata da sei subunità che abbracciano il ssDNA; ciascuna subunità ha un’ansa a forcina che lega un fosfato dello scheletro del DNA e i due ribosiadicenti. E’ interessante che queste due anse di legame al DNA si trovino in una “scala a chiocciola” destrorsa, in cui ciascuna ansa lega il fosfato successivo presente nel ssDNA. Ciascuna delle sei subunità si trova in uno stadio diverso nel processo di traslocazione del DNA. Nell’insieme le interazioni tra le diverse subunità e il DNA e l’ATP/ADP rivelano come il movimento coordinato di queste anse proteiche possa tirare l’ssDNA facendolo passare attraverso il poro centrale dell’elicasi. Una subunità inizia a legare l’ssDNA in cima alla struttura, quindi l’ansa di legame al DNA con successivi cambiamenti di conformazione si muove verso il basso portando con sé il DNA legato. E’ importante osservare che ciascuna i queste conformazioni è associata a uno stato legato a un diverso nucleoide; la conformazione più in alto è legata all’ATP, quella centrale all’ADP e quella più in basso non è legata a nessun nucleotide. Quindi, mano a mano che una singola subunità lega, idrolizza e rilascia l’ATP, passa dalla conformazione in alto a quella mediana e a quella in basso. = nell’insieme possiamo immaginare che l’elicasi abbia sei mani che tirano una fune spostandosi di volta in volta. ➔ Una volta aperta la doppia elica abbiamo i singoli filamenti; non possiamo permetterci di avere singoli filamenti di DNA libero nudo in quanto potrebbe rischiare di andare incontro ad appaiamenti interni con formazione di strutture secondarie, situazione che non permetterebbe alla DNA polimerasi che compiere al meglio la sua funzione. ◆ il singolo filamento di DNA viene legato dalle ​single strand binding proteins, piccole proteine che hanno un’alta affinità per il DNA a singolo filamento e che si legano in modo cooperativo per evitare che si formino strutture secondarie => mantiene il DNA lineare; ➔ TOPOISOMERASI = c​ on l’apertura della doppia elica si formerebbero dei superavvolgimenti positivi che si accumulerebbe se non fosse per l’azione delle topoisomerasi; ➔ PINZA SCORREVOLE​ = proteina esamerica che ha un foro centrale di poco più di 20 A e che viene caricato attorno alla doppia elica a​ livello della giunzione innesco-stampo​; in questa maniera, essendo un anello attorno ad un filo, non può staccarsi e attraverso interazioni proteina-proteina​ tiene la DNA pol. attaccata per renderla estremamente processiva; ❗❗Tutte le componenti nel replisoma appena nominate sono sequenza-indipendente ❗❗ ➔ Ci sono tanti tipi diversi di DNA polimerasi, in base alla funzione che svolgono; a noi interessano: ◆ DNA pol III = implicato nella replicazione del DNA batterico ◆ DNA pol I = riempie il gap lasciato dopo la rimozione del primer Negli eucarioti importante ricordare: ◆ DNA pol alfa = include l’attività di primasi ◆ DNA pol. epsilon = filamento guida ◆ DNA pol. delta = filamento in ritardo ➔ La DNA polimerasi tende a staccarsi ad ogni ciclo e promuovere la polimerizzazione di 20-100 bp alla volta. ➔ Nel momento in cui il complesso pinza-DNA pol. arriva alla fine e non c’è più la giunzione innesco-stampo la DNA pol. perde affinità per la pinza scorrevole e si stacca così da poter migrare verso una nuova giunzione. ➔ Ma chi carica la pinza? un complesso multiproteico chiamato​ “caricatore della pizza scorrevole” o sliding clamp loader; è ​ in grado attraverso un processo ATP-dipendente di aprire la pinza e caricarla a livello della giunzione. MODELLO della replicazione a TROMBONE ➔ CONCETTO DI BASE = a livello della forca di replicazione i filamenti leading e lagging sono sintetizzati simultaneamente; ➔ DNA POL III HOLOENZYME => ​include tre copie dell’enzima DNA polimerasi III “core” e una coppia del caricatore della sliding clamp; sebbene sia presente una sola coppia, il caricatore della pinza scorrevole comprende tre proteine t, ognuna delle quali lega un’unità del core della DNA POL III. =è​ un complesso multiproteico in cui una proteina che possiede attività catalitica (core) è associata a ulteriori componenti che incrementano e regolano la sua funzione. ◆ una di queste DNA pol insiste e duplica il filamento guida, mentre le altre due si alternano nella replicazione del filamento in ritardo; Si chiama m ​ odello a trombone => s​ i genera un laccio che si allunga e accorcia a seconda che l’attività nel filamento in ritardo avanza. 1. Non appena l’elicasi apre la doppia elica in corrispondenza della forca replicativa, lo stampo dell’elica guida viene esposto e diventa oggetto dell’attività di uno dei core della DNA POL III, che sintetizza un filamento continuo di DNA complementare. 2. Viceversa, il filamento discontinuo non viene subito copiato della DNA polimerasi, ma viene svolto come ssDNA che è velocemente legato dalle SSB. 3. A momenti alterni la primasi interagisce con la DNA elicasi e viene attività per sintetizzare un nuovo primer a RNA sullo stampo del filamento discontinuo 4. L’ibrido RNA:DNA viene riconosciuto come giunzione innesco-stampo dal caricatore della sliding e​ sul sito viene assemblata una pinza scorrevole; quindi un secondo core di DNA POL III inizia la sintesi del filamento discontinuo. 5. Non appena una DNA polimerasi ha terminato di sintetizzare un frammento di Okazaki, l’elicasi rende disponibile nuovo ssDNA e un nuovo primer a RNA è sintetizzato su questo stampo. 6. Così come visto per il precedente primer sul filamento discontinuo, il nuovo primer a RNA è riconosciuto dal caricatore della pinza scorrevole 7. La terza copia della DNA pol II inizia la sintesi di un nuovo frammento di Okazaki non appena la pinza scorrevole viene posizionata sul primer a RNA, probabilmente prima del completamento della sintesi del precedente frammento di Okazaki; = s​ i pensa, cioè, che la formazione del secondo frammento di Okazaki inizi prima del rilascio della polimerasi che sta completando la sintesi del frammento di Okazaki precedente. La DNA polimerasi viene rilasciata dallo stampo a DNA solo quando il frammento di Okazaki che sta sintetizzando è completo. 8. Poiché il rilascio della DNA polimerasi dalla pinza scorrevolo è un processo più lento della sintesi di DNA, la presenza di una seconda DNA polimerasi assicura la continuità della  sintesi del filamento discontinuo anche durante il lento evento di rilascio della DNA polimerasi. 9. L’enzima DNA POL III core appena rilasciato rimanere però collegato fisicamente all’elicasi grazie alla subunità t del caricatore dell’elica e si trova quindi nella posizione ideale per legarsi alla successiva giunzione innesco-stampo, subito dopo l’aggiunta della pinza scorrevole => ​ l’interazione tra DNA polimerasi ed elicasi (mediata da posizionatore) stimola fortemente l’attività di quest’ultima. 10. L’interazione tra primasi ed elicasi è debole, ed è per questo che la primasi si lega, aggiunge un primer, si stacca e così fa ogni secondo; =q​ uesto sistema di sintesi viene chiamato “modello a trombone”, con riferimento al fatto che l’ansa di ssDNA che si viene a formare tra la DNA polimerasi e la DNA elicasi sul filamento discontinuo cambia di dimensioni man mano che la sintesi procede. INIZIO DELLA REPLICAZIONE ➔ La replicazione parte da punti ben precisi, chiamat​i “ORIGINE DELLA REPLICAZIONE” ➔ Ne​i​ procarioti​ ​con DNA circolare, l’origine di replicazion​e è singola; ◆ inizialmente si genera il punto in cui il DNA si apre e sulle due forcelle di replicazione interviene il replisoma che sintetizza il nuovo filamento duplicando e andando da sx verso dx da una parte e da dx verso sx dall’altra => due forcelle di replicazione. ◆ la duplicazione finirà nella parte opposta, dove le due forche di replicazione si incrociano; ◆ ci sarà una topoisomerasi che le slega; EVENTI CHE PORTANO ALL’INIZIO DELLA REPLICAZIONE nei batteri è presente u ​ n’origine di replicazione​ ​singola c​ hiamata​ oriC (e.coli), caratterizzata da una sequenza ben specifica; viene chiamata più in generale REPLICATORE (=​sequenza presente nel punto d’inizio della replicazione) ↪ la DNA POL e l’ELICASI sono enzimi sequenza-indipendente, quindi avremo bisogno di una proteina che agisca riconoscendo la sequenza specifica del replicatore; la proteina che riconosce la sequenza specifica si chiama I​ NIZIATORE e nel E.colo è la DNA A => l’unica proteina sequenza-specifica​ che partecipa alla replicazione. = l’interazione tra iniziatore e replicatore (nel e.coli tra oriC + DNA A) è l’evento che da il via alla replicazione del genoma. C ​ he tipi di eventi scatena? 1. il DNA deve essere denaturato => ​l’interazione della proteina iniziatore e il replicatore (​ che presenta un sito di legame per l’iniziatore ​= prima caratteristica del replicatore​)​ si traduce in una distorsione del DNA e nell’apertura locale della doppia catena​. Siccome a livello del replicatore ci sono sequenze ricche di appaiamenti A-T ​( seconda caratteristica peculiare del replicatore)​, questa distorsione si traduce nell’apertura locale della doppia elica, facilitata dal fatto che il genoma sia procariotico che euariotico è superavvolto negativamente e quindi prono all’apertura. Una volta che il DNA è stato aperto, la doppia elica deve reclutare tutti gli elementi del replisoma. 2. la proteina DNA A ha la funzione di reclutamento dei componenti del replisoma a. in primis​ l’elicasi​, che apre la doppia elica; essa recluta anche la​ primasi, che deposita un primer, cosicché si generi una giunzione innesco-stampo a livello della