Extraction of Pseudomonas from Natural Sources PDF

# Extraction of Pseudomonas from Natural Sources Extracting Pseudomonas species, particularly Pseudomonas aeruginosa, from natural environments involves several steps that can be adapted based on the specific source, such as water or soil. Below is a detailed methodology based on current research...

# Extraction of Pseudomonas from Natural Sources Extracting Pseudomonas species, particularly Pseudomonas aeruginosa, from natural environments involves several steps that can be adapted based on the specific source, such as water or soil. Below is a detailed methodology based on current research practices. ## 1. Sample Collection * **Water Samples:** Collect water samples from natural sources like rivers, lakes, or ponds. * **Soil Samples:** Gather soil from various locations, ensuring to sample different depths and types of soil. ## 2. Preparation of Samples * **For water samples,** dilute 1.0 mL of the sample in 9 mL of sterile water to create a ten-fold dilution. * **For soil samples,** suspend 1.0 g of soil in 9 mL sterile water and perform a five-fold dilution. ## 3. Culturing * Spread 100 µL of each diluted sample onto solidified nutrient agar plates (120 mL per plate). * Incubate the plates at 37°C for 72 hours to allow for microbial growth. ## 4. Isolation of Pseudomonas Colonies * After incubation, observe the culture plates for colonies with clear zones of inhibition, indicating potential antimicrobial activity. * Isolate these colonies by streaking them on fresh nutrient agar plates and incubating again at 37°C for 24 hours. ## 5. Identification and Characterization * Perform Gram staining to confirm the morphology of the isolates. Pseudomonas aeruginosa is typically Gram-negative and rod-shaped. * Utilize selective media such as cetrimide agar to further confirm the presence of Pseudomonas species. ## 6. Extraction of Metabolites * Grow a selected isolate (e.g., isolate DO5) in a sterile glucose fermentation medium for optimal metabolite production (typically around 11 days at 37°C). * Centrifuge the culture at 700 rpm for 15 minutes to separate the supernatant from the microbial pellet. * Extract metabolites using ethyl acetate in a 1:1 ratio using a separating funnel, collect the organic layer, and evaporate it using a rotary evaporator to obtain concentrated extracts. ## 7. Storage * Store the dried extracts at 4°C in a suitable container to maintain stability until further analysis or application. ## 8. Applications The extracted compounds can be tested for their antimicrobial properties against various pathogens, including their effectiveness against biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa, which is critical in managing infections associated with this bacterium. This methodology highlights the importance of proper sampling, culturing techniques, and extraction methods in isolating and studying Pseudomonas species from natural environments. # 1. البحث الطبي والعلاجي ## التأثير المثبط للمناعة: * الجليوتوكسين يمكنه تثبيط نشاط الخلايا المناعية مثل الخلايا البلعمية وتقليل الالتهابات المفرطة. يُمكن استغلال هذا التأثير في علاج أمراض المناعة الذاتية أو تقليل رفض الأعضاء المزروعة. ## كمضاد للسرطان: * أظهرت بعض الدراسات أن الجليوتوكسين يمتلك خصائص مضادة للخلايا السرطانية، حيث يمكنه تحفيز الموت المبرمج (apoptosis) في الخلايا السرطانية. ## كمضاد للفطريات: * يمكن استخدام الجليوتوكسين في تطوير مضادات فطرية تُستهدف الفطريات الأخرى التي تسبب العدوى. # الأنماط المختلفة لإنتاج الجليوتوكسين 1. تم تحديد سلالتين من Aspergillus fumigatus بخصائص مختلفة لإنتاج الجليوتوكسين. إحداهما تنتج المركب مبكرًا (early producer) ، بينما الأخرى تنتجه في مراحل متأخرة (late producer). ومع ذلك، لم يتم تفسير السبب الجزيئي الدقيق لهذه الاختلافات بشكل كامل. 2. الدراسة ركزت على بعض الجينات (مثل gliP و gli) لكنها لم تستكمل تحليل تأثير باقي الجينات في المجموعة الجينية المسؤولة عن إنتاج الجليوتوكسين. 3. البحث أجري في ظروف مختبرية ( in vitro) ، ولم يتم استكشاف كيفية تأثير الظروف البيئية الطبيعية (مثل نقص الأكسجين أو وجود الجهاز المناعي للمضيف ) على إنتاج الجليوتوكسين. 4. الدراسة ركزت على الجليوتوكسين ومشتقه فقط (bmGT)، بينما أغفلت المركبات الثانوية الأخرى التي قد تؤثر على عدوى الفطر. # الفرص لمواصلة البحث * تحليل المزيد من الجينات في المجموعة الجينية المسؤولة عن الجليوتوكسين . * دراسة التأثير البيئي أو التفاعلات مع الجهاز المناعي. * تطوير استراتيجيات تعطيل إنتاج الجليوتوكسين كتقنية علاجية جديدة . # تم تحديد عدد من الجزيئات المهمة المرتبطة بإنتاج السموم الفطرية، مثل .Pseudouridine و ،SPF-32629 A و Anacine-(SS( و ،Asenjonamide C * الدراسة ركزت على تأثير الظروف البيئية (مثل مستوى الرطوبة النسبية ووسط النمو على . إنتاج السموم. * أظهرت النتائج إمكانية استخدام هذه المؤشرات الحيوية لتوقع إنتاج السموم في مراحل النضج الصناعي للحوم المجففة. # 2. النقاط التي وقفوا عندها: * الدراسة لم تؤكد بشكل نهائي دور هذه الجزيئات كعوامل تنبؤية لإنتاج السموم. * لم يتم التحقيق بشكل شامل في تأثير هذه المؤشرات في بيئة صناعية كاملة. * ينقصهم مكتبات متخصصة لجينات وبروتينات ومنتجات استقلابية لـ P. nordicum لدعم التحليل. # 3. كيفية البناء على هذه الدراسة: * يمكن العمل على تطوير أدوات تعديل وراثي لتغيير مسارات إنتاج السموم في الفطر، عبر استهداف الجينات المسؤولة عن السموم مثل ochratoxin biosynthesis genes. * دراسة أثر الطفرات على مسارات الاستقلاب المرتبطة بإنتاج السموم باستخدام تقنيات مثل . CRISPR-Cas9 * تطبيق نتائج الميتابولوميك على بيئات صناعية أكثر تعقيدًا مثل مصانع اللحوم المجففة). # الجليوتوكسين (Gliotoxin) هو مركب ثانوي تنتجه بعض الفطريات مثل Aspergillus fumigatus. ورغم أنه يلعب دورًا كبيرًا في تعزيز الفوعة الفطرية (pathogenicity) والتسبب بالأمراض، إلا أن له تطبيقات وفوائد محتملة في مجالات عدة: ## 1. البحث الطبي والعلاجي ### التأثير المثبط للمناعة: * الجليوتوكسين يمكنه تثبيط نشاط الخلايا المناعية (مثل الخلايا البلعمية وتقليل الالتهابات المفرطة. يمكن استغلال هذا التأثير في علاج أمراض المناعة الذاتية أو تقليل رفض الأعضاء المزروعة. ### كمضاد للسرطان: * أظهرت بعض الدراسات أن الجليوتوكسين يمتلك خصائص مضادة للخلايا السرطانية، حيث يمكنه تحفيز الموت المبرمج (apoptosis) في الخلايا السرطانية. ### كمضاد للفطريات: * يمكن استخدام الجليوتوكسين في تطوير مضادات فطرية تُستهدف الفطريات الأخرى التي تسبب العدوى. ## 2 في الأبحاث البيولوجية ### دراسة التفاعلات الفطرية - المضيف * يستخدم لفهم كيفية تفاعل الفطريات الممرضة مع الجهاز المناعي للمضيف، مما يساعد في تطوير تقنيات علاجية. ### نموذج للتعرف على السموم الفطرية الأخرى: * الجليوتوكسين يُعد نموذجًا لفهم كيفية إنتاج السموم في الفطريات وكيفية تنظيمها جينيا. ## 3 التطبيقات الصناعية ### تطوير أدوية جديدة: * يمكن أن يكون الجليوتوكسين نموذجا لتصميم مركبات مشابهة صناعية بخصائص علاجية. ### الاستخدام البيئي * نظريًا، قد تستخدم الفطريات المنتجة للجليوتوكسين في السيطرة على بعض الآفات أو الكائنات الحية الممرضة بيئيا. ### المخاطر والحذر * الجليوتوكسين سام في الجرعات العالية، خصوصًا للبشر والحيوانات، لذلك أي استخدام له يتطلب معالجة دقيقة وتقليل سميته. # Genetic modification of Bacillus subtilis SCK6 to enhance BA production SCK6 has been demonstrated to be an ideal host due to its excellent protein expression and transformation capabilities. Based on whole genome sequencing data, there is only one BA biosynthetic pathway in B. subtilis, the BA kinase pathway. In recent years, a new BA synthetic pathway, the butyryl CoA: acetic acid CoA transferase (BCOAT) pathway, has been identified in most BA-producing microbiota in the intestine. To improve BA production, we inserted the gene encoding of BCOAT into the genome of SCK6 to express the new BA synthesis pathway. Considering that bacterial biomass may also be an enhancement factor for BA production, the gene skfA, encoding sporulation killing factor, was disrupted to increase the growth rate. Compared to SCK6, BSS-RS06550 produced a significantly greater amount of BA, approximately 3.80-fold higher (Fig. 1a, 0.238 ± 0.014 g/L vs 0.984 ± 0.027 g/L, p < 0.001). In addition, the growth rate of BsS-RS06550 was higher compared to that observed for SCK6 (Fig. 1b). The carrying capacity (k) (1.35 ± 0.007 vs 1.49 ± 0.021, p < 0.001) and a doubling time (t-gen) (0.451 ± 0.010 vs 0.630 ± 0.022, p < 0.001) of BSS-RS06550 were higher than that of SCK6, and a lower intrinsic growth rate (r) (1.54 ± 0.035 vs 1.10 ± 0.039, p < 0.001) was observed for BSS-RS06550. Furthermore, we simulated the intestinal environment in vitro to evaluate the BA productivity of BSS-RS06550 cultured with the gut microbial community. In the microbial community inoculated with BSS-RS06550, higher BA accumulation occurred compared to that observed for SCK6 (Fig. 1c, 0.095 ± 0.004 g/L vs 0.111 ± 0.009 g/L, p < 0.01). Acetic acid (AA) production in microbial community inoculated BsS-RS06550 was significantly decreased (0.165 ± 0.006 g/L vs 0.130 ± 0.011 g/L, p < 0.001), indicating that AA is a substrate for BA synthesis. # Fig. 1 (a) BA production of SCK6 and BSS-RS06550; (b) Growth curves of B. subtilis SCK6 and BSS-RS06550 at OD₆₀₀; (c) SCFAs production (g/L) in microbial community co-culture with SCK6 and BSS-RS06550, respectively, including acetic acid (AA), propanoic acid (PA), and butyric acid (BA). Data are represented as mean ± SD, n = 5 repeats for (a, c). *p value < 0.05, **p < 0.01 and ***p<0.001 # ما يُمكنك إضافته كباحثة: * تحليل الظروف البيئية : دراسة كيفية تأثير عوامل مثل درجة الحرارة، الحموضة، أو وجود مثبطات خارجية على تنظيم الجينات المسؤولة عن إنتاج الجليوتوكسين. * العلاج والتشخيص: استكشاف كيفية تعطيل الجينات المسؤولة عن إنتاج الجليوتوكسين الإضعاف الفطر كإستراتيجية علاجية. * دراسة مقارنة : إجراء مقارنة بين Aspergillus fumigatus وفطريات أخرى لإيجاد أوجه التشابه أو الاختلاف في إنتاج الجليوتوكسين.