Prática de Microbioma Humano PDF

Prática de Microbioma Humano **Esterilizar -- eliminar microog** **Desinfetar- reduzir nº de microorganimos** **Métodos de esterilização:** - [Autoclave:] é usada para esterilizar (não se pode meter plástico lá dentro). - Utiliza-se também a [estufa] para esteriliza...

Prática de Microbioma Humano **Esterilizar -- eliminar microog** **Desinfetar- reduzir nº de microorganimos** **Métodos de esterilização:** - [Autoclave:] é usada para esterilizar (não se pode meter plástico lá dentro). - Utiliza-se também a [estufa] para esterilizar, tornando a solução estéril. - Utiliza-se a [filtração com filtro] para esterilizar soluções que não resistem à esterilização na autoclave. - Para criar um ambiente estéril usamos uma [câmara de fluxo de ar laminar] com luz UV. Esta esteriliza a superfície e os filtros filtram todo o ar que entra na câmara. - Se não tivermos a câmara de fluxo de ar laminar usamos o [bico de bunsen]. - A [radiação gama] é amplamente usada para esterilizar materiais plásticos novos, especialmente aqueles que não suportam altas temperaturas (penetra superfícies e elimina microrganismos. - Já a [radiação ultravioleta] esteriliza apenas superfícies (não penetra). O álcool pode ser usado como **antisséptico** para feridas (tecidos vivos) e como **desinfetante** para superfícies (materiais). O antisséptico é menos agressivo, para não danificar as células, enquanto o desinfetante elimina microrganismos e pode ser prejudicial a tecidos vivos. Ambos reduzem a carga microbiana, mas o desinfetante não esteriliza totalmente. Os alimentos não são estéreis, mas usamos métodos de preservação para reduzir microrganismos, tais como: - **Pasteurização:** Criada por Pasteur, aquece o leite a temperaturas moderadas para reduzir microrganismos. Exposição ao ar, durante alguns dias, ou recipientes não estéreis podem voltar a ficar contaminados. [Fervura] - **Ultrapasteurização (UHT)**: Aquece o leite a altas temperaturas por segundos, eliminando todos os microrganismos e prolongando a validade. [Ciclo de fervura] - **Tindalização**: Alterna aquecimento e arrefecimento em ciclos (3 vezes) para eliminar microrganismos e esporos, usada em conservas. Os que resistiram ao 1º ciclo são depois eliminados no 2º ou no 3º ciclo. - **Altas pressões**: Esteriliza alimentos como sumos, preservando sabor e nutrientes, destruindo microrganismos sem calor. Existem diferentes tipos de meios de cultura (são utilizados para cultivar e multiplicar microrganismos em laboratório), entre eles existem: - **Meios sólidos:** Contêm agentes solidificantes, como [o ágar sangue], permitindo o [crescimento de colônias visíveis.] - **Meios líquidos:** Não possuem agentes solidificantes e são usados para o cultivo em suspensão. **TRANSFERÊNCIA DE MEIO SÓLIDO PARA MEIO LÍQUIDO** Com uma ansa esterilizada, recolher um pouco de cultura do meio sólido. Mergulhar a ansa no meio líquido, agitando-a para soltar o inóculo. **TRANSFERÊNCIA DE MEIO LÍQUIDO PARA MEIO LÍQUIDO** Recolher um pouco de cultura em meio líquido, utilizando uma pipeta de Pasteur esterilizada. Deitar algumas gotas num tubo com meio líquido. - **Meios gerais:** Ricos em nutrientes, permitem o crescimento de uma ampla variedade de microrganismos. - **Meios específicos**: Formados de acordo com as necessidades de microrganismos específicos. Podem ser subdivididos em: - **Meios seletivos**: Contêm substâncias que favorecem o crescimento de certos microrganismos enquanto inibem outros. Por exemplo, o meio [MacConkey] permite o crescimento de enterobactérias (Gram-negativas), mas inibe outras, como as Gram-positivas, devido à presença de sais biliares. - **Meios diferenciais**: Permitem distinguir entre microrganismos com base nas suas características metabólicas. No caso do meio [MacConkey,] é possível identificar bactérias fermentadoras de lactose (coliformes), que mudam a cor do meio devido à alteração do pH, e aquelas que não fermentam lactose O meio [ágar-sangue] é um meio geral, enriquecido com sangue, que fornece nutrientes adicionais para o cultivo de microrganismos, especialmente os que apresentam crescimento lento e são difíceis de cultivar. Esse tipo de meio também é **diferencial**, pois permite distinguir entre bactérias com diferentes capacidades de hemólise (quebra de glóbulos vermelhos): - **Sem hemólise**: Apenas a colônia é visível, sem alterações na cor ao redor. - **Hemólise parcial (alfa-hemólise)**: A área ao redor da colônia adquire uma coloração esverdeada. - **Hemólise completa (beta-hemólise)**: A área ao redor da colônia torna-se transparente, substituindo a coloração original da placa. Uma **cultura pura** é composta apenas por um tipo específico de microrganismo, todos originários de uma única célula (mesma célula), ou seja, geneticamente idênticos e com as mesmas características visíveis. Para obter uma cultura pura, fazemos o isolamento a partir de **uma colónia individualizada** (única colónia que cresceu em meio de cultura). O processo de isolar uma colónia é crucial para garantir que a cultura seja pura, sem contaminação de outros tipos de microrganismos. **1º Sementeira-** replicar de uma cultura para outra. Existem diferentes [métodos de sementeira] utilizados para isolar colónias de microrganismos e obter culturas puras. Métodos de sementeira: - **ESGOTAMENTO - Por estria**: Espalha-se a amostra em traços sucessivos para separar as células e formar colônias individuais (usa-se toda a cultura). - **ESGOTAMENTO- Com espalhador de vidro**: A amostra é espalhada uniformemente na superfície do meio de cultura, facilitando o crescimento de várias colônias. - **Em toalha (com zaragatoa)**: A zaragatoa é usada para cobrir toda a superfície do meio, criando um tapete de células. Recolher uma colónia e fazer uma suspensão em soro fisiológico. Inocular o meio sólido, passando a zaragatoa segundo várias direções, de forma a se obter uma cultura homogénea. - **Por incorporação**: A amostra é misturada com o meio líquido, depois solidificado para contar microrganismos na amostra. - **Com semeador de vidro (ou descartável)** -- com uma pipeta de Pasteur esterilizada, recolher uma gota de inóculo, deitar numa placa com meio sólido, espalhar com o semeador. Com o mesmo semeador, voltar a passar numa segunda placa, e depois, da mesma forma, numa terceira placa. **Inoculação em profundidade v Por picada** -- recolher uma colónia bem isolada e inocular em meio sólido contido num tubo de ensaio, espalhando a cultura na rampa e, por fim, espetando o fio no agar **2º** A **coloração de Gram** é um dos métodos mais importantes para identificar e classificar bactérias, baseado nas diferenças nas [paredes celulares] das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. -- **COLORAÇÃO DIFERENCIAL** Esta distingue as bactérias com base na [estrutura da parede celular:] - **Gram-positivas**: Têm uma camada espessa de peptidoglicano, que retém o corante violeta cristal e as deixa [roxas]. - **Gram-negativas**: Possuem uma camada de peptidoglicano mais fina e uma membrana externa. Durante o processo, o álcool ou acetona remove a camada de lipopolissacarídeo (LPS), fazendo com que essas bactérias percam a cor e fiquem incolores, mas ao aplicar o corante safranina ficam [rosas]. Processo de coloração de Gram: 1. **Preparação a fresco**: Organismos vivos são usados para observar características como [motilidade] (movimento), [morfologia] (forma) e [associação] das bactérias. 2. **Fixação e coloração**: Após preparar um esfregaço da cultura bacteriana: - **Violeta cristal** (primeiro corante) colora todas as bactérias de roxo. - **Lugol** (mordente) ajuda a fixar o violeta cristal nas células bacterianas. - **Álcool ou acetona** (diferenciador) remove a cor da camada externa das Gram-negativas, mas não afeta as Gram-positivas. tira a camada de lps das gram negativas - **Safranina** (segundo corante) colora as Gram-negativas de rosa, enquanto as Gram-positivas permanecem roxas. Resumo: **Coloração de gram- diferencial** \- violeta cristal \- mordente (lugol)- fixa o corante \- álcool acetona- tira a camada de lps das gram negativas \- safranina (coloração rosa às bactérias q tinham sido descoloradas)- gram negativas **(a partir do momento que as bactérias são coradas e fixadas, morrem)** **MAC CONKEY CRESCE SÓ GRAM NEGATIVAS !!!!!!!** **AGAR SANGUE CRESCE TUDO !!!!!!!** Variações da coloração: - **Coloraçao simples- azul de metileno** - **Para anaeróbias**: Utiliza-se uma versão modificada, chamada [coloração de Gram modificada por Burg]. - **Para micobactérias**: Como as micobactérias não podem ser bem coradas com a coloração de Gram devido à sua parede celular especial, utiliza-se a [coloração de Ziehl-Neelsen], que usa dois corantes para identificar essas bactérias resistentes. [bactérias álcool-ácido-resistentes -] *Mycobacterium* **Identificação bioquímica:** Ex: galerias epi **GRAM POSITIVO- TESTE CATALASE :** - Galerias api straph: catalse + - Galerias api strep: catalase -- Usa-se enzima catalase -\> desdobra o peroxido de hidrogénio em agua e hidrogénio. **GRAM NEGATIVO -- TESTE OXIDASE:** - Galeria api 20E: oxi -- - Galeria api 20NE: oxi + **DIFICULDADES DOS API:** \- o inoculo não estava em cultura pura (e então o conjunto de reações bioquímicas obtido não se referia a uma determinada bactéria, mas ao conjunto das reações das duas, ou mais, bactérias na mistura) \- o microrganismo isolado difere do perfil característico para a espécie e não consta do catálogo. \- contaminação **IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE BACTÉRIAS** O gene do RNA ribossomal 16S é a única sequência disponível para a maioria das espécies bacterianas, incluindo estirpes tipo e um grande número de bactérias não cultivadas -- primers de Escherichia coli. Pode fazer-se porque escolhemos, é o de rotina, a identificação bq Usa-se para identificar microorganismos e antimicrobianos. Queremos estudar o microbioma -\> sequenciação metagenomica- identificar tudo o que queremos ver RÁCIO -- para ver se é puro ou não 1. **ESTRAÇÃO DNA** 2. [Lise das células:] O primeiro passo é a rutura das células para liberar o DNA. Isso pode ser feito usando um detergente ou solução que destrua as membranas celulares. 3. [Separação de moléculas:] Depois, outras moléculas, como proteínas e RNA, são separadas do DNA. 4. [Tratamento com RNase:] A RNase é usada para degradar o RNA, garantindo que apenas o DNA fique na amostra. 5. [Purificação do DNA:] O DNA é então purificado através de um tratamento com protease, que quebra proteínas, e pode ser passado por uma coluna de purificação com uma membrana que prende o DNA, separando-o de impurezas. 6. Precipitação para ter um RNA puro 7. Centrifugar 8. Quantificação do DNA -- absorvância: nanodrop (quantidades pequenas) e eletroferese- aplicar corrente elétrica p separar de acordo com o peso e a carga -- gel agarosa, poliacrilamida, amido 9. **AMPLIFICAÇÃO DO DNA- PCR** Gene Rrna 16s -- SÓ BACTÉRIAS - todas as bactérias Gene Rrna 18s e ITS (região intergenica entre 2 RNA) -- EUCARIOTAS **Componentes para reações moleculares:** Durante a amplificação de DNA (como na [reação em cadeia da polimerase] ou [PCR]), alguns reagentes essenciais são usados para fazer cópias do DNA: 1. **Catiões divalentes (como MgCl2- tampão)**: Essenciais para a atividade da [DNA polimerase.] 2. **dNTPs** (desoxinucleotídeos): Fazem parte da estrutura do DNA: - **dATP** (adenina); - **dCTP** (citosina); - **dGTP** (guanina); - **dTTP** (timina). 3. **DNA polimerase termostável**: É a enzima que faz a replicação do DNA. Ela pode funcionar a altas temperaturas, essenciais para o processo de PCR. 4. **Primer forward e reverse**: São pequenos pedaços de DNA que servem como [pontos de partida para a replicação do DNA]. O primer [forward] vai para uma direção, enquanto o [reverse] vai para a direção oposta. 5. **DNA molde**: É o DNA que será copiado durante a reação. 6. **Termociclador** 230- proteínas 260- dna 280- rna FEZES Extração do dna Dirige-se para procariotas 16Rrna S -- informação do microbiota -- e.coli Existem vários **[métodos de teste de suscetibilidade aos] antimicrobianos** usados para determinar a [eficácia de antibióticos e outros agentes antimicrobianos] contra microrganismos, tais como: - **Método de Difusão em Disco (Kirby-Bauer)**: Discos com antimicrobianos são colocados na placa, e a [zona de inibição (onde as bactérias não crescem]) ao redor de cada disco indica se a bactéria [é sensível ou resistente.] -- método mais utilizado - **Microdiluições**: Diluições sucessivas do antibiótico feitas em placas de microtitulagem, e determinação da [CMI] ([concentração mínima inibitória])- menor quantidade de antimicrobioano necessária para inibir o crescimento da bactéria. - **Método das fitas (E-test):** Utiliza fitas com gradientes de antimicrobianos para determinar a [CMI] (concentração mínima inibitória) e, em alguns casos, a [CMB] (concentração mínima bactericida). **Antibióticos vs Antimicrobianos:** - **Antibióticos:** substâncias produzidas por organismos vivos (como bactérias) para matar ou inibir o crescimento de outros microrganismos. Não podem incluir antibióticos. - **Antimicrobianos:** substâncias sintéticas ou naturais que atuam contra uma variedade de microrganismos, como fungos e vírus, e não só contra bactérias. Podem incluir antibióticos **Bactericidas vs Bacteriostáticos:** - **Bactericidas:** antimicrobianos que matam as bactérias - **Bacteriostáticos:** antimicrobianos que inibem o crescimento das bactérias, mas não as matam diretamente - Escolhemos sempre antimicrobianos que sejam **sensíveis** à bactéria que estamos a tratar, para garantir a eficácia do tratamento