Resumen del Sistema CRISPR-Cas y Diseño de sgRNAs para Edición en Levaduras PDF

Descripción del sistema CRISPR-Cas y diseño de sgRNAs (single guide RNAs) para edición de ADN genómico en levaduras CRISPR-Cas y sistema CRISPR-Cas9: Permite editar cualquier región del genoma de cualquier organismo de manera altamente eficaz, precisa y económica. El docume...

Descripción del sistema CRISPR-Cas y diseño de sgRNAs (single guide RNAs) para edición de ADN genómico en levaduras CRISPR-Cas y sistema CRISPR-Cas9: Permite editar cualquier región del genoma de cualquier organismo de manera altamente eficaz, precisa y económica. El documento habla sobre un proceso de amplificación y modificación genética utilizando la técnica de PCR y el sistema CRISPR-Cas9 en la levadura Saccharomyces cerevisiae. - Se amplifica el gen gfp junto con un promotor y un terminador específico, utilizando primers químicos que facilitan la recombinación homóloga. - Se diseñan mega cebadores para introducir el casete gfp-delta en el genoma de la levadura. - Manejo de la herramienta CRISPy-Web para diseñar un sgRNA que guiará a la endonucleasa Cas9 hacia la región deseada del ADN. - También se discuten las implicaciones éticas y la efectividad del sistema CRISPR-Cas9, así como la necesidad de evaluar sus efectos a largo plazo en la modificación genética. Glosario: - bp: par de bases (base pair) - Cas: genes o proteínas asociados a CRISPR (CRISPR-associated) - CRISPR: agrupación de repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) - CRISPR-Cas: agrupación de repeticiones cortas palindrómicas regularmente interespaciadas asociadas a nucleasas Cas. - CRISPR-Cpf1:agrupación de repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas de Prevotella y Francisella 1) - crRNA: RNA transcrito de CRISPR (CRISPR RNA) - dCas: Cas9 defectiva para la actividad nucleasa - Di-CRISPR: CRISPR-Cas de integración en delta (delta integration CRISPR-Cas) - DSB: doble corte en la cadena (double-stranded break) - GFP: proteína verde fluorescente (green fluorescent protein) - HDR: reparación directa por homología (homology directed repeat) - Indel: inserción o deleción - nCas: Cas9 nicasa - NHEJ: reparación de unión de extremos no homólogos (nonhomologous end joining) - nt: nucleótido - NUC: lóbulo con actividad nucleasa de Cas9 - HNH: dominio nucleasa de Cas9 - ORF: pauta abierta de lectura (open reading frame) - PAM: motivo adyacente al protoespaciador (protospacer adjacent motif) - PI: dominio de reconocimiento de la secuencia PAM - REC: lóbulo de reconocimiento de Cas9  - SRSR: repeticiones cortas regularmente interespaciadas (short regularly spaced repeats) - tracrRNA: noncoding trans-activating CRISPR-RNA - TALENs: nucleasas tipo activadores de transcripción (transcription activator-like effector nucleases) - Tm: temperatura de fusión de oligonucleótidos (melting temperature) - ZFNs: nucleasas de dedos de zinc (zinc-finger nucleases) Introducción - En 1953, Watson y Crick publicaron la estructura tridimensional del ADN, despertando interés científico por entender esta molécula como origen de la vida. - En los años 70, surge la biotecnología e ingeniería genómica, buscando comprender y modificar la información genética para fines específicos. - Se avanzó en técnicas para modificar el ADN y en el estudio del material genético de organismos procariotas, presentes en la Tierra desde hace 4 millones de años. - En los 90, nuevas técnicas de secuenciación permitieron conocer genomas completos; en 1995 se publicó el primer genoma bacteriano. - Se descubrieron herramientas de edición genómica, como ZFNs y TALENs, mediante mecanismos de recombinación homóloga (HDR) o reparación de roturas (NHEJ). - El sistema CRISPR-Cas, basado en el sistema inmune de procariotas, destacó como herramienta eficaz, accesible y económica para edición genómica, revolucionando la genética moderna. Objetivos - Analizar el sistema CRISPR-Cas9, su estructura y modo de acción en situaciones naturales, y los avances que lo convierten en una herramienta clave para la edición genómica, mediante una revisión bibliográfica gestionada con Mendeley. - Diseñar un sgRNA para editar el gen gfp en Saccharomyces cerevisiae , utilizando programas informáticos, seleccionando el sistema adecuado para expresar gfp y diseñando un método para discriminar organismos modificados. - Redactar una memoria que incluya la revisión teórica y el diseño experimental teórico para la modificación genética y selección de candidatos. Materiales y metodos 1. Búsquedas bibliográficas - Se utilizaron bases de datos como PubMed y Google Scholar. - Algunas figuras fueron extraídas de sitios web comerciales, con las URL citadas en el texto. 2. Gestor bibliográfico - Se empleó Mendeley con el formato Harvard Reference Format 1 para citas y bibliografía. 3. Diseño experimental - Análisis y manipulación de secuencias : - Se usaron las secuencias de Saccharomyces cerevisiae S288C de GenBank y la secuencia de GFP de Addgene. - Para reconocimiento de secuencias diana: BLASTn (NCBI).  - Para análisis de cadenas complementarias: Complemento inverso (Bioinformatics.org). - Diseño de cebadores : - Se utilizó CRISPy-web para el diseño del sgRNA. - Los cebadores para el casete GFP del vector pCYC1m_yeGFP (Addgene) se diseñan considerando temperaturas de hibridación calculadas con Tm Calculator (New England Biolabs). Resultados 1. Revisión bibliográfica - En 1993, Francis Mojica estudió Haloferax mediterranei , descubriendo un sistema de inmunidad adaptativa en procariotas que posteriormente sería utilizado en ingeniería genética. - Mojica identificó secuencias repetidas de 30 pb en el genoma de H. mediterranei , observadas también en otras bacterias y arqueas, denominadas SRSR (Short Regularly Spaced Repeticiones). - En 2002, estas secuencias fueron renombradas como CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeticiones) y se identifican genes asociados (genes cas), cuyas proteínas, como nucleasas y helicasas, están relacionadas funcionalmente con CRISPR. - En 2005, se confirmó la homología entre secuencias espaciadoras de CRISPR y elementos extracromosomales, como fagos y plásmidos, sugiriendo una función inmune. - En 2007, se demostró la inmunidad adaptativa de CRISPR en Streptococcus thermophilus , confirmando su papel en la defensa contra infecciones. - En 2012, Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier adaptaron CRISPR como herramienta para ingeniería genética, consolidando su eficacia en la modificación genética de organismos vivos. 2. Biologia del sistema CRISPR-Cas en la naturaleza - ¿Qué es el sistema CRISPR-Cas? CRISPR-Cas : Es un sistema de inmunidad adaptativa en procariotas, presente en muchas bacterias y la mayoría de las arqueas, que funciona como memoria molecular hereditaria. Función : Recopila y almacena fragmentos genéticos de bacteriófagos y plásmidos invasores, transcribiéndolos como crRNAs. Estos crRNAs guían a las endonucleasas Cas para degradar ADN o ARN invasor en futuras infecciones, siempre que haya complementariedad de secuencias. Estructura : El lugar CRISPR tiene dos componentes principales: - Operón cas : Codifica endonucleasas y proteínas de unión al ADN. - Región CRISPR : Contiene secuencias repetidas intercaladas con secuencias espaciadoras de origen exógeno. - Clasificación de los sistemas CRISPR Se divide en 2 clases, 5 tipos y 16 subtipos, según la arquitectura de sus componentes y sus mecanismos de acción.  - Clases : - Clase 1 : Requiere un complejo de proteínas efectoras guiadas por ARN para escindir el ADN o ARN invasor. - Clase 2 : Utiliza una única proteína endonucleasa efectora, guiada por ARN, como Cas9 y Cpf1, para neutralizar el genoma invasivo. - Tipos de sistemas CRISPR : - Clase 1 : Tipos I, III y IV. - Clase 2 : Tipos II, V y VI. - Subtipos : Se diferencian según los mecanismos de generación o biogénesis de los crRNAs. - Etapas del funcionamiento del sistema CRISPR-Cas 1. Etapa de Adquisición : En esta etapa, el sistema CRISPR captura fragmentos de ADN o ARN de material genético invasor (como de plásmidos o bacteriófagos), que son insertados en el locus CRISPR de la célula hospedadora como protoespaciadores. Estos protoespaciadores se transforman en "espaciadores" tras ser integrados entre las secuencias repetidas del locus CRISPR. En el sistema CRISPR-Cas9 de tipo II, las proteínas Cas1 y Cas2 son las encargadas de este proceso de escisión e incorporación de los protoespaciadores (Sapranauskas et al., 2011). 2. Etapa de Expresión : El locus CRISPR se transcribe y genera un transcrito primario llamado pre-crRNA, que contiene todas las secuencias espaciadoras adquiridas, junto con secuencias repetidoras. Este pre-crRNA es procesado por la endonucleasa RNAasa III, dando lugar a crRNAs, que son secuencias de ARN que guiarán la endonucleasa Cas9 en la etapa de interferencia. 3. Etapa de Interferencia : Cuando un material genético invasivo intenta infectar la célula nuevamente, el crRNA maduro se une a la secuencia tracrRNA mediante complementariedad de bases. Este complejo tracrRNA :crRNA guía a la nucleasa Cas9 hacia la secuencia diana del material genético invasor. Cas9 genera un corte de doble cadena (DSB) en esa secuencia específica, neutralizando al agente invasivo (Tang et al., 2002; Jinek et al., 2012). 4. Importante El tracrRNA es un pequeño ARN no codificante que tiene dos funciones clave en el sistema CRISPR-Cas: - Activación del procesamiento del pre-crRNA : El tracrRNA es esencial para iniciar la escisión del pre-crRNA por parte de la enzima RNAasa III , lo que da lugar a la formación de crRNAs maduros.  - Guía del crRNA para la escisión del ADN : El tracrRNA se une con el crRNA para formar un complejo que facilita la activación de la nucleasa Cas9 , dirigiéndola hacia la secuencia diana del ADN que debe ser cortada. En los procesos de edición genética , este sistema se simplifica. En lugar de utilizar tracrRNA y crRNA por separado, se fusionan en una sola molécula llamada sgRNA (single-guide RNA). Este sgRNA mantiene la capacidad de guiar a Cas9 hacia una secuencia específica en el ADN. Al cambiar simplemente los primeros 20 nucleótidos del sgRNA, se puede dirigir Cas9 a cualquier región específica del genoma para modificarla. La transcripción del locus CRISPR es fundamental para el mecanismo de defensa inmunitaria que lleva a cabo el sistema CRISPR-Cas, permitiendo la defensa contra material genético exógeno. Un elemento clave en este proceso es la secuencia PAM (Protospacer Adjacent Motif), que es una secuencia específica en el ADN invasor reconocido por Cas9, permitiendo la identificación y corte preciso del ADN foráneo. - Estructura y modo de acción de la proteína Cas9 La proteína Cas9 es una endonucleasa clave en el sistema CRISPR-Cas, responsable de realizar la escisión del ADN invasor. Su estructura es bilobular , compuesta por dos dominios principales: el lóbulo NUC (nucleasa) y el lóbulo REC (reconocimiento). Estos lóbulos están separados por un canal central, donde se inserta el complejo de ARN (tracrRNA :crRNA ) y ADN en la etapa de interferencia. Estructura y dominios: - Lóbulo NUC : Contiene varios dominios críticos para la actividad de Cas9: - HNH y RuvC : Son los dominios nucleasas responsables de crear la DSB (rotura de doble cadena) en el ADN diana. - PI : Interactúa con la secuencia PAM en la cadena no complementaria del ADN objetivo. - WED : Involucrado en la estabilización de la estructura. - Lóbulo REC : Está involucrado en el reconocimiento del complejo de ARN (tracrRNA:crRNA :ADN ). Contiene los dominios: - REC1 y REC2 : Reconocen el complejo ARN-ADN. - BH (hélice puente) : Ayuda en la interacción entre Cas9 y el ARN guía. Modo de acción: La acción de Cas9 es fundamental para la defensa del organismo huésped contra material genético exógeno, como el ADN plasmídico o viral, mediante la creación de roturas en el ADN diana, lo que inhibe su funcionamiento. 1. Reconocimiento de PAM : El dominio PI de Cas9 reconoce la secuencia PAM en el ADN diana, crucial para la identificación de la secuencia objetivo.  2. Formación del complejo : El crRNA se empareja con la secuencia diana de ADN, formando un heterodúplex (tracrRNA:crRNA :ADN ), que se inserta en el surco entre los lóbulos REC y NUC de Cas9. 3. Escisión del ADN : El dominio HNH corta la cadena complementaria al crRNA, mientras que el dominio RuvC corta la cadena no complementaria, generando una DSB que destruye el ADN invasor. 3. El Sistema CRISPR-Cas9 como Herramienta de Edición Genómica - Patrones de reparación tras la escisión de Cas9 El Sistema CRISPR-Cas9 es una herramienta poderosa para la edición genómica, y su funcionamiento depende de los mecanismos de reparación de cadena de las roturas de doble (DSB) que Cas9 provoca en el ADN diana. Estos mecanismos de reparación naturales son aprovechados para inducir modificaciones genéticas específicas. Los dos principales patrones de reparación tras la escisión de Cas9 son NHEJ (unión de extremos no homólogos) y HDR (reparación dirigida por homología), que permiten distintos tipos de modificaciones. 1. NHEJ (Unión de extremos no homólogos) : - Es un proceso de reparación "propenso a errores". - En este mecanismo, los extremos rotos del ADN se unen sin la necesidad de una plantilla homologada, lo que frecuentemente lleva a indels (inserciones o eliminaciones de nucleótidos). - Estos indels pueden provocar mutaciones en el código genético (como codones de parada prematuros), que en muchos casos alteran la función del gen, lo que puede llevar al silenciamiento génico o desactivación del elemento genómico. - Es útil para generar mutaciones inactivadoras de genes, pero el proceso es menos preciso que HDR. 2. HDR (reparación dirigida por homología) : - Este mecanismo es más preciso y permite modificaciones específicas. - La reparación HDR ocurre cuando está presente una secuencia nucleotídica exógena que es homóloga a las regiones flanqueantes de la rotura de ADN. - Esta secuencia externa sirve como plantilla para la reparación y permite introducir modificaciones dirigidas (como sustituciones de bases o inserciones de secuencias específicas). - Es el mecanismo preferido para introducir cambios precisos , como la corrección de mutaciones o la inserción de nuevas secuencias, y es clave en la ingeniería genética avanzada. Comparación de los mecanismos de reparación : - NHEJ : Propenso a errores, genera indels y potencialmente puede interrumpir la función génica. - HDR : Preciso, permite modificaciones específicas cuando se proporciona una plantilla externa. - nCas y dCas - nCas9 : - Se muta uno de los dos dominios nucleasa (HNH o RuvC). - Solo escinde una cadena de ADN. - Si se usan dos nCas9, cada una con una mutación en un dominio distinto, se genera un corte en ambas hebras sin causar mutaciones indeseadas. - Permite la reparación HDR utilizando una secuencia exógena para introducir modificaciones necesarias. - Las mutaciones comunes son D10A (RuvC) y H840A (HNH). - dCas9 : - Ambos dominios nucleares (HNH y RuvC) están mutados, inhabilitando la capacidad de cortar ADN. - Conserva la capacidad de reconocer la secuencia diana de ADN. - Se utiliza para regulación génica (CRISPRi y CRISPRa) y marcaje fluorescente (fusionado a proteínas como GFP). - No causa cortes en el ADN, solo interacciones específicas de unión - Cpf1 como enzima nucleasa y sus ventajas en el Sistema CRISPR-Cpf1 Cpf1 es una endonucleasa guiada por ARN de 1.200 a 1.500 aminoácidos, parte del sistema CRISPR-Cpf1 del tipo V de la clase 2 de CRISPR-Cas. Sus ventajas son: - A diferencia de Cas9, Cpf1 no requiere tracrRNA ni para la maduración de crRNA ni para la interferencia, facilitando su uso y reduciendo costos. - El crRNA de Cpf1 es más corto (aproximadamente 42 nt) que el de Cas9 (100 nt). - Cpf1 genera un corte escalonado en el ADN, produciendo extremos protuberantes de 4-5 nt en la posición 5', lo que impide el NHEJ. - Cpf1 escinde el ADN en el extremo distal del protoespaciador, evitando la creación de indeles en la secuencia diana, lo que facilita las inserciones necesarias de ADN. - Cpf1 reconoce PAM ricos en timina, lo que permite editar genomas de organismos ricos en adenina y timina, donde Cas9 no podría actuar. - CRISPR-Cpf1 se utiliza en la ingeniería genética de organismos como ratones, humanos y bacterias industriales como Corynebacterium glutamicum para la síntesis de aminoácidos y biocombustibles. - ¿Por qué CRISPR-Cas ha resultado ser una herramienta biotecnológica revolucionaria? - Simplicidad : CRISPR-Cas permite modificar el ADN mediante la personalización del sgRNA de solo 20 nt, mientras que ZFNs y TALENs requieren diseñar nuevos genes para cada modificación. - Eficiencia : CRISPR-Cas permite editar múltiples loci simultáneamente al incluir varios sgRNAs correspondientes a distintas secuencias diana.  - Costo y tiempo : CRISPR-Cas es más barato y rápido, ya que no necesita la modificación de proteínas como ZFNs o TALENs. - Comparación con ZFNs y TALENs : CRISPR-Cas solo requiere diseñar un sgRNA para cada secuencia diana, mientras que ZFNs y TALENs requieren modificar los ORFs de las endonucleasas. - Revolución biotecnológica : Estas ventajas han hecho que CRISPR-Cas se convierta en una herramienta biotecnológica altamente eficaz, prometiendo avances en campos como la medicina y la alimentación. 4. Diseño teórico de un sgRNA para edición del genoma de un organismo eucariota Para ello es necesario el diseño de un sgRNA que conduzca a la nucleasa Cas9 hasta dichas secuencias, donde generará un DSB gracias al cual se puede llevar a cabo la introducción del gen gfp por recombinación homóloga. 1. Microorganismo : Se utiliza Saccharomyces cerevisiae , un modelo biológico eucariota con un genoma completamente conocido, robusto y útil para ingeniería genética en diversas aplicaciones. Su genoma consta de 6.000 genes repartidos en 16 cromosomas. 2. Localización de la inserción : Se seleccionan las secuencias delta (secuencias de aproximadamente 330 bp ampliamente distribuidas por todo el genoma, en el cromosoma XIV de la cepa S288C) además permiten la inserción de genes mediante recombinación homóloga.(YNLCdelta2) 3. Selección del marcador molecular : El gen que codifica para la proteína GFP (Green Fluorescent Protein - 230 aminoácidos) se elige como marcador para visualizar la inserción, ya que emite bioluminiscencia verde. 4. Diseño de cebadores y amplificación del casete GFP-delta : Se amplifica el gen GFP junto con su promotor CYC1 y terminador ADH1 utilizando cebadores químicos. La amplificación se realiza por PCR y se introduce en las secuencias delta mediante recombinación homóloga. En estas secuencias flanqueantes, se seleccionan 19 nucleótidos para el diseño del cebador forward y 21 nucleótidos para el cebador reverse. Secuencia de delta se toma 30 nt de longitud. 5. Diseño del sgRNA y construcción del plásmido DiDelta-Marta : Se utiliza la herramienta CRISPy-Web para diseñar un sgRNA que guía a la nucleasa Cas9 hacia el sitio delta2 en el cromosoma XIV de S. cerevisiae. Luego, se inserta este sgRNA en un plásmido pDi-CRISPR para la expresión en la levadura. 6. Transformación de S. cerevisiae : La cepa S288C se co-transforma con el plásmido que codifica el sgRNA y el fragmento amplificado por PCR del casete GFP-delta mediante acetato de litio o electroporación. 7. Función del plásmido Di-Marta-CRISPR : Se expresa la endonucleasa iCas9 , tracrRNA y el sgRNA.El complejo Cas9-sgRNA dirige Cas9 al sitio delta2 en el genoma de S. cerevisiae y géneros nicks. La recombinación homóloga repara estos nicks e inserta el casete gfp-delta 8. Comprobación de la inserción : Se confirma la inserción observando la fluorescencia verde bajo un microscopio y realizando PCR para verificar la inserción en el sitio correcto. Además, se mide la intensidad de fluorescencia para comprobar la inserción exitosa del gen GFP.