Resum del Processament de Teixits RA4-RA5 PDF

Processament de teixits RA4 - RA5 RA4 - TINCIONS DESPARAFINACIÓ I HIDRATACIÓ DELS TALLS: 1. Secció de teixit en parafina. − La parafina és hidròfoba. 2. Desparafinació i hidratació. 3. Coloració i/o hibridació d’anticossos, sondes...

Processament de teixits RA4 - RA5 RA4 - TINCIONS DESPARAFINACIÓ I HIDRATACIÓ DELS TALLS: 1. Secció de teixit en parafina. − La parafina és hidròfoba. 2. Desparafinació i hidratació. 3. Coloració i/o hibridació d’anticossos, sondes de RNa, etc. − Colorants, anticossos, sondes, etc són tot solucions aquoses. GENERALITATS DE LA DESHIDRATACIÓ: La graduació dels alcohols ha de ser creixent. La relació mostra:volum ha de ser 1:20 (1:10 o inferior si + agitació). El temps d’incubació és en funció de la mida de la mostra. Es fan banys múltiples d’una mateixa concentració d’alcohol perquè al incorporar aigua de la mostra, la concentració d’alcohol (sobretot del primer bany de cada graduació) va disminuint. GENERALITATS DE LA REHIDRATACIÓ: La graduació dels alcohols ha de ser decreixent. La relació mostra:volum és 1:20 (secció dintre d’un bany). El temps d’incubació és un funció de la mida de la mostra. Temps curts (2-10min) perquè la mostra és una secció fina de teixit. Es fan banys múltiples d’una mateixa concentració d’alcohol perquè el primer bany de cada incorpora líquid del bany anterior.  Processament de teixits RA4 - RA5 PROTOCOL: 1. Desparafinar. 2. Hidratar. 3. Tenyir. 4. Deshidratar. 5. Muntar. Un cop acabada la tinció s’han de muntar les preparacions amb un medi de muntatge. Aquest medi de muntatge és hidròfob. Per tant, les mostres s’hauran de deshidratar abans de muntar. TALLS DE CRIOSTAT: 1. Secció de teixit en OCT (secció hidratada). 2. Coloració i/o hibridació d’anticossos, sondes de RNA etc directament després de descongelar. − Colorants, anticossos, sondes etc són tot solucions aquoses.  Processament de teixits RA4 - RA5 FONAMENTS GENERALS DE LA COLORACIÓ: Per què necessitem dels colorants? -> Per creat contrast. → Colorant: substància colorejada que s’uneix als teixits per afinitat electro-química. COMPONENTS DELS COLORANTS: 1. Esquelet incolor (anell acromàtic de benzè). 2. Cromòfor: organització molecular que donarà lloc al color característic del colorant (acostumen a ser dobles enllaços alternats amb enllaços senzills). 3. Auxocrom: possibilita la unió del colorant a elements del teixit. Ex. Vermell congo (afinitat per la cel·lulosa i les fibres amiloides). CLASSIFICACIÓ DELS COLORANTS: Segons el seu origen. Segons la natura química del cromòfor. Segons l’estructura química del radical auxocrom. Segons el tipus de coloració. 1. Segons el seu origen: Naturals. − Animal (Ex. Carmí (insectes: quermes, cotxinilles)). − Vegetal (Ex. Beta-Carotè (pastanaga), safrà, hematoxilina). Sintètics. − Derivats de l’anilina. S'obtenen per síntesi química. 2. Segons la natura química del cromòfor:  Processament de teixits RA4 - RA5 3. Segons estructura química: Àcids. − Sals amb l’anió coloretjat i la base incolora. − S'uneixen a substàncies bàsiques com proteïnes citoplasmàtiques i el col·lagen de la matriu extracel·lular. − Ex. Eosina, fuscina àcids, taronja G, verd llum. Bàsics. − Sals amb l’anió incolor i la base aporta el color. − S'uneixen a substàncies àcides com el DNA o components de la matriu extracel·lular com els glicosaminoglicans. − Ex. Hematoxilina, Tionina, Safranina, Blau de toluidina, blau de metilè. Anfòters. − No tenen càrrega i no s’uneixen als elements presents en els teixits per afinitat química, sinó perquè es dissolen en els lípids presents en els teixits. − Són colorants de lípids (adipòcits). − Ex. Vermell Sudan, Sudan black, Oil red. Neutres. − Sals que tant la part àcida com la bàsica tenen capacitat de donar color. − Tenyeixen substàncies àcides i bàsiques. − Ex. Eosinat de blau de metilè. 4. Segons tipus de coloració: Ortocromàtics. − El teixit queda tenyit del mateix color que el de la solució. Metacromàtics. − El teixit queda tenyit d’un altre color que el que té la solució colorant degut a que les propietats d’absorció de la llum del colorant canvien a l’unir-se als components cel·lulars. − Ex. Blau de toluidina vira a rosa a l’unir-se al teixit cartilaginós o el citoplasma dels mastocits. Fluorescents. − Emeten llum visible quan se’ls il·lumina amb llum UV. − Ex. Fluoresceïna, Rodamina. − Per estudiar autofluorescència (mostres vegetals, alguns neurotransmissors) normalment s’utilitzen acoplats a anticossos per fer estudis d’immunidetecció.  Processament de teixits RA4 - RA5 Per tant, com a resumen: TIPUS DE TINCIONS: Segons afinitat del colorant pel teixit: − Directes: els colorants s’uneixen directament al teixit. − Indirectes: els colorants no tenen afinitat pel teixit i necessiten d’una atra substància (mordent) per facilitar la seva unió. *Els mordents són sals d’alumini o substàncies oxidants. Indirectes en un temps: el colorant i el mordent s’apliquen a l’hora. Colorant + mordent = laca. Indirectes en dos temps: primer s’aplica el mordent i després el colorant. El mordent pot fer part de la solució fixadora. Mescles fixadores amb efecte mordent: ZENKER: clorur de mercuri, àcid sòdic, àcid acètic. Avantatges: − Bona preservació dels nuclis. − Té efecte mordent per determinades tincions. BOUIN: àcid pícric, formaldehid, àcid acètic. Avantatges: − Preserva bé proteïnes, glucogen i nuclis. − Potencia la unió de colorants (efecte mordent). − Bon fixador per a teixits tous. Segons el temps d’actuació: − Terminals: la coloració és independent del temps. − Progressives: la coloració augmenta a mida que passa el temps. Normalment es va controlant sota un microscopi. − Regressives: es tenyeix en excés i després s’elimina l’excés de colorant. L'eliminació de l’excés de colorant és el procés de diferenciació.  Processament de teixits RA4 - RA5 Per tant: TINCIONS NUCLEARS I CITOPLASMÀTIQUES: Tincions citoplasmàtiques - Generalitats: − Es basen en l’afinitat del citoplasma pels colorants àcids que s’uneixen a les parts bàsiques de les proteïnes citoplasmàtiques. − No són tincions selectives de citoplasma, també tenyeixen teixit connectiu i espais intercel·lulars. − Quasi mai s'utilitzen soles. Sinó amb altres tincions nuclears, tricròmiques, etc. Per això s’anomenen tincions de fons. Els colorants citoplasmàtics més utilitzats són: Eosina (hematoxilina-eosina). Orange G (tinció de Papanicolau, tricròmic de Mallory). Fucsina àcida (tricròmics de Masson, Van-Gierson). Blau anilina (tricròmics de Masson, Mallory-Azan). Verd llum (tricròmic de Masson). Processament de teixits RA4 - RA5  Processament de teixits RA4 - RA5 Tincions nuclears: HEMATOXILINA: L’hematoxilina necessita mordents que li proporcionen càrrega positiva per poder unir-se als teixits. Normalment els mordents estan incorporats a la solució d’hematoxilina formant laques. Excepció: Hematoxilina fèrrica de Heidenhain (necessitarà nu bany de mordent previ). Les hematoxilines es classifiquen segons el tipus de mordent: Alumíniques. Fèrriques. Fosfotúngstiques. Cròmiques (s’utilitzen molt poc). Laques alumíniques d’hematoxilina: Harris. Mayer. − Tenyeixen nuclis. − Resultat: nuclis blaus-morat fosc i citoplasmes incolors. − S'utilitzen sobretot per a la tinció H/E. L’hematoxilina de Harris o de Mayer s’utilitza després de les IHQ per donar contrast. (utilitzem el protocol que he adjuntat a la pagina 2). Hematoxilines fèrriques: Mordent: sals de ferro (clorur fèrric, alum fèrric...) S’utilitzen com a colorant nuclears en coloracions tricròmiques.  Processament de teixits RA4 - RA5 TINCIONS PER A LA DETECCIÓ ESPECÍFICA DE SUBSTÀNCIES I TINCIONS HISTOQUÍMIQUES: TINCIONS DE LÍPIDS: Colorants anfòters: Vermell sudan. Sudan black. Oil red. No tenen càrrega i no s’uneixen als elements presents en els teixits per afinitat química sinó perquè es dissolen en els lípids presents en els teixits: Són colorants de lípids (adipòcits). TINCIONS HISTOQUÍMIQUES PER A GLÚCIDS: Una tinció histoquímica implica una reacció química on intervenen molècules del propi teixit. La unitat bàsica dels glúcids són els monosacàrids. Els monosacàrids són polihidroxialdehids o polihidroxicetones. Les tincions per a glúcids detecten la presència d’aquests grups aldehid i cetona.  Processament de teixits RA4 - RA5 Detecció: Primer pas d’oxidació amb àcid periòdic per crear més grups aldehid. Segon pas d’incubació amb el reactiu de Shiff que reacciona amb els grups aldehid i dona un color porpra. Tinció de PAS (Periodic Acid Shiff): Particularitats del glucogen: − El glucogen és PAS positiu, però deixa de ser-ho si el digerim prèviament amb amilasa o diastasa -> Per tant, és diastasa sensible. Processament de teixits RA4 - RA5  Processament de teixits RA4 - RA5 Tincions PAS (Periodic Acid Shiff): Diastasa sensibles: tinció de glucogen. Diastasa resistent: tinció proteoglicans i mucines (principalment neutres). Blau de Perls (Tècnica de Hale): Es basa en l’afinitat dels mucopolisacàrids àcids per les solucions de ferro col·loidal. El ferro col·loidal es detecta amb la reacció de Perls: − S’utilitza ferrocianur potàssic que reaccionarà amb el ferro col·loidal i donarà lloc a ferrocianur fèrric també anomenat blau de Prússia. TINCIONS HISTOQUÍMIQUES PER A GLÚCIDS (no hi ha reacció química): Tinció de Blau Alcià: − Tenyeix mucoplisacàrids àcids per unió electrostàtica.  Processament de teixits RA4 - RA5 Per tant, com a resum de les tincions per glúcids: TINCIONS TEIXIT CONJUNTIU - TINCIONS TRICRÒMIQUES: Tres colorant per tenyir: Nuclis. Citoplasmes. Estructures de sosteniment (principalment col·lagen). Què és el col·lagen? − El col·lagen no és una proteïna única sinó una família de proteïnes estretament relacionades. − Hi ha més de 20 col·làgens diferents. − Les fibres de col·lagen són sensibles però resisteixen les forces de tracció. − El diàmetre de les fibres de col·lagen i la forma d’organitzar aquestes fibres és diferent en els diferents teixits.  Processament de teixits RA4 - RA5 Aquestes tincions depenen de: 1. La permeabilitat del teixit i la mida de la molècula de colorant. Les molècules petites penetren més ràpidament i en totes les estructures. Les molècules grans penetren més lentament i només entre les estructures més poroses com les fibres de col·lagen. La reacció s’ha d’aturar quan el colorant petit ha tingut temps de penetrar en totes les estructures i el gran a les més poroses. Això fa que en funció de la combinació dels colorants utilitzats, un mateix colorant pot tenyir unes estructures o unes altres. 2. La temperatura. La temperatura intensifica la tinció. 3. El pH. Aquestes solucions colorants es caracteritzen per estar a un pH àcid (1,5 a 3,5). Per aquesta raó algun dels seus components és un àcid: acètic, nítric, oxàlic o pícric. 4. La utilització dels àcids fosfomolíbdic (PMA) i/o fosfotúngstic (PTA). La utilització d’aquests com a “mordents negatius”: serveixen per a destenyir el col·lagen que hagi pogut quedar tenyit per un colorant de molècula petita.  Processament de teixits RA4 - RA5 TINCIONS TEIXIT CONJUNTIU – IMPREGNACIONS ARGÈNTIQUES (teixit nerviós): Metodologia general: 1. Oxidació prèvia dels teixits per fer aparèixer grups aldehids que afavoreixin la tinció. 2. Actuació d’una sal de plata i posterior reducció a plata metàl·lica, la qual precipita. 3. Fixació ràpida dels dipòsits de plata amb tiosulfat sòdic. 4. Només en alguns mètodes: Viratge per obtenir tincions d’un blau-negre brillant en lloc de marró fosc sobre fons grogós. Es poden utilitzar per analitzar: Membranes basals. Reticulina (col·lagen tipus III). Melanina. Grànuls argentafins. Fongs. Neurones. IMPREGNACIÓ ARGÈNTICA PEL SISTEMA NERVIÓS: Basades en mètodes de Golgi aplicats després per Ramón i Cajal sobre seccions i sobre blocs sencers. Es basen en la detecció del citoesquelet de neurones i cèl·lules de la neuroglia de manera que marquen els cossos neuronals, els axons i les prolongacions de les cèl·lules de la neuroglia. Són mètodes que requereixen molta cura i qualsevol variació en les condicions de fixació, temps, temperatura, pH, concentració poden afectar en els resultats.  Processament de teixits RA4 - RA5 TINCIONS ENZIMS – TINCIONS ENZIMOHISTOQUÍMIQUES: Posen en manifest activitats enzimàtiques presents en els teixits. Les activitats enzimàtiques són pròpies dels enzims. El enzims són proteïnes capaces de transformar una molècula específica (substrat) en una altra (producte). Generalitats dels enzims: Actuen com a catalitzadors de reaccions metabòliques. Són molt específics del substrat. Alguns actuen només en presència d’altres molècules (coenzims). Existeixen inhibidors i activadors d’enzims. La seva funció depèn de la temperatura i del pH. Preparació de les mostres: Molts fixadors desnaturalitzen els enzims. La majoria es desnaturalitzen a temperatures de 50-55ºC. -> La millor manera és fixar per congelació i criopreservar. Els enzims més comuns que es poden posar en evidència en histologia enzimàtica: Fosfatases. Fosforilases o kinases. Deshidrogenases. Peroxidases. Deshidrogenases (NADH deshidrogenasa i succinat deshidrogenasa): catalitzen reaccions d’oxidació i reducció. Es posen en evidència utilitzant compostos que al reduïr-se donen compostos acolorits. Ex. NitroBlue Tetrazolium i NBT.  Processament de teixits RA4 - RA5 RA5 - IMMUNOHISTOQUÍMICA (IHQ) És la detecció específica de molècules en talls histològics utilitzant anticossos. Si en lloc d’un tall histològic tenim una preparació cel·lular, llavors parlem d’immunocitoquímica (ICQ). Què són els anticossos? Els anticossos són secretats pels limfòcits B com a resposta a la interacció d’aquests amb una molècula aliena. Aquesta molècula aliena capaç d’induir la producció d’anticossos pels limfòcits B rep el nom d’antigen. La porció de l’antigen (solen ser regions de 6-7 aa) que reconeix específicament l’anticòs rep el nom d’epítop. Un antigen pot contenir diferents epítops. Les immunoglobulines (Ig) o Ac són glucoproteïnes present en el sèrum produïts pels limfòcits B en resposta a una estimulació antigènica.  Processament de teixits RA4 - RA5 Existeixen 5 isotips diferents d’immunoglobulines (Ig) segons la seva part constant. Ig M: molècula pentamèrica (5 Ig unides). Responsable de la primera resposta de l’organisme. Ig G: és la més abundant en el plasma (segona resposta immunitària). Ig A: dimérica, 2 unitats. Secretades en teixit limfoide de mucoses: secrecions, saliva... Ig E: media reaccions d’al·lèrgia i hipersensibilitat. Ig D: es troba a la superfície de les cèl·lules B. Es desconeix la seva funció. La unió Ag-Ac és altament específica i d’elevada afinitat. − Especificitat: capacitat d’un Ac per reconèixer només el seu Ag. − Reacció creuada: quan un Ac reconeix un Ag diferent del que ha estat utilitzat per generar l’Ac. − Afinitat: força d’unió entre Ac-Ag. Com s’obtenen els anticossos que s’utilitzen al laboratori? Immunització en animals -> obtenció del sèrum que conté els anticossos (antisèrum). Procés de generació d’anticossos policlonals (diferents anticossos contra els diferents epítops que pugui tenir un antigen). Inconvenients dels anticossos policlonals: -Falsos positius, soroll de fons: Barreja de diferents anticossos contra els diferents epítops que pugui tenir un antigen: cada Ac té les seves reaccions creuades. L'antisèrum està enriquit amb anticossos contra l’antigen utilitzat per immunitzar l’animal però també en contindrà d’altres. -Cada antisèrum és únic i irreproduïble: Cada individu reacciona de manera diferent a cada Ag i generarà diferents Ac. La solució és generar Ac monoclonals.  Processament de teixits RA4 - RA5 Generació d’Ac monoclonals: Immunització en animals -> Obtenció de la melsa del ratolí (reservori de limfòcits B). → Si aïllem els limfòcits B i els posem en una placa de cultiu, al cap de poc temps es moren. Què podem fer? ANTICOSSOS MONOCLONALS ANTICOSSOS POLICLONALS -Major espectre de reactivitat que els -Són una font il·limitada d’Ac. Ac monoclonals. Avantatges: -Alta especificitat. -Producció més senzilla, més ràpida i més barata que els Ac monoclonals. -Major probabilitat de reaccions -El procés d’obtenció és més car creuades. Inconvenients: que en els Ac policlonals. -Impossibilitat de reproduir els mateixos lots d’anticossos.  Processament de teixits RA4 - RA5 Què necessitem per fer una IHQ? Crear les condicions òptimes per tal que es produeixi unió específica Ag-Ac. Detectar la unió Ag-Ac mitjançant algun sistema de visualització. Visualitzem aquesta unió Ag-Ac amb Ac marcats. Marcatge directe: L’Ac anti-Ag està marcat. Marcatge indirecte: L’Ac anti-Ag no està marcat. El que està marcat és un Ac secundari que reconeixerà el nostre Ac primari anti-Ag. Els anticossos secundaris reconeixen les cadenes constants dels anticossos primaris les quals són característiques de tipus d’Ig i d’espècie. Ac secundaris anti-diferents espècies i marcats de manera diferent ens permeten fer dobles i/o triples IHQ. Com visualitzem aquesta unió? MÈTODES DIRECTES MÈTODES INDIRECTES -Tècniques més sensibles. -Un únic pas (tècnica més ràpida, Avantatges: -Es poden usar per identificar menys unions inespecífiques). qualsevol Ac primari obtingut en la mateixa espècie. -Possibilitat d’alteracions de l’Ac -Tècniques més laborioses. primari. Inconvenients: -Major probabilitat d’unions -Necessitat de disposar tants Ac inespecífiques. marcats com Ag es volen detectar.  Processament de teixits RA4 - RA5 Amb què marquem els anticossos? Enzims: tècniques immunoenzimàtiques. Fluorocroms: tècniques d’immunofluorescència. Metalls electrodensos: per microscòpia electrònica (or col·loidal). Com visualitzem aquesta unió Ag-Ac? PROTOCOL GENERAL D’UNA IHQ: 1. Fixació i inclusió. 2. Tallat. 3. (Desparafinació i hidratació). 4. (Desenmascarament antigènic). 5. Bloqueig d’unions inespecífiques (i permeabilització). 6. Bloqueig d’enzims endògens (AP, peroxidasa). 7. Incubació amb l’Ac primari. 8. Incubació amb l’Ac secundari. 9. Sistema de visualització (revelat). 10. (Contratinció amb hematoxilina). 11. (Deshidratació). 12. Muntatge  Processament de teixits RA4 - RA5 1. Fixació i inclusió: Un bon fixador per IHQ ens ha de garantir: Preservar la integritat de l’antigen. Preservar la morfologia cel·lular i tissular. Impedir l’extracció, difusió o desplaçament de l’antigen. No ha d’interferir en la reacció antigen-anticòs. No hi ha un fixador universal per IHQ. Formació de ponts d’unió encreuats entre els components proteics tissulars -> caldrà desemmascarar. A part del fixador hi ha altres factors que influencien en la preservació de l’Ag: − Fixació immediata. − Temperatura de fixació. − Temps de fixació. 2. Tall: Utilització de portes tractats que ens garanteixin l’adhesió del teixit durant tot el procés. 3. (Desparafinació i hidratació): 1. Xilol 3x 10 min. 2. Alcohol 100% 2x 5 min. 3. Alcohol 96% 2x 5 min. 4. Alcohol 70% 1x 5 min. 5. Aigua destil·lada 1x 5 min. 4. (Desenmascarament antigènic): Trencar les unions entrecreuades produïdes pel formol. Enzims proteolítics: (Proteinasa K, pepsina, tripsina, etc). Inconvenients: destrucció d’epítops i alteració de la morfologia cel·lular. Calor: Microones. Calor i pressió: olla a pressió o autoclau. Pels dos desenmascarament antigènics amb calor s’utilitza: − Tampó citrat pH 6. − Tampó EDTA pH 9.  Processament de teixits RA4 - RA5 5. Permeabilització i bloqueig d’unions inespecífiques: Incubació amb BSA, sèrum, gelatina, llet en pols, etc. Solucions comercials + detergent que faci porus a les membranes (plasmàtica i/o nuclear): tritó X-100, tween 20, saponina, etc. Es pot fer per separat. Llavors, primer permeabilitzar! *Els anticossos només s’uneixen als llocs específics amb afinitat, els altres estaran ocupats per proteïnes, etc. 6. Bloqueig dels enzims endògens: Bloqueig de la peroxidasa amb H2O2. Bloqueig de la fosfatasa alcalina amb Levamisol. 7. Incubació amb l'anticòs primari: Dilució: La millor dilució és la més alta (= concentració més baixa d’anticòs) que ens doni un bon senyal específic. Així es redueix el soroll de fons i es gasta el mínim d’anticòs possible (car i/o escàs). Normalment les cases comercials donen una idea de la dilució òptima però SEMPRE cal testar- lo en les nostres mans provant diferents dilucions. Temps: Temperatura: L’Ac primari es pot incubar entre 30 minuts fins a tota la nit. Per minimitzar unions inespecífiques normalment s’incuba tota la nit (o/n) a 4ºC. Tampó d’incubació: L’Ac primari s’acostuma a incubar en el mateix tampó que hem utilitat per bloquejar les unions inespecífiques. També existeixen solucions comercials per incubar els Ac primaris. Els anticossos són cars i/o escassos i s’utilitzen en el mínim volum possible. Ex. 150ul/porta. Per que no s’assequi un volum tant petit -> necessari incubació en una cambra humida.  Processament de teixits RA4 - RA5 8. Incubació amb un anticòs secundari marcat: Aquest anticòs secundari està generat contra la regió constant de l’Ac primari. No caldrà Ac secundari marcat si el que tenim marcat és l’Ac primari (mètode directe), però no és un mètode comú. Dilució: Màxima dilució possible (minimitza soroll de fons). Temps i temperatura: Acostumen a ser incubacions de 30-60 min RT (temperatura ambient). Tampó: Acostuma a ser PBS amb una mica de detergent per afavorir l’especificitat. El detergent augmenta l’estringència. Ex PBS-0,1%Tritó-X100.  Processament de teixits RA4 - RA5 9. Visualització: Revelat de l’activitat enzimàtica: El compost que es modifica i és responsable del color observat rep el nom de cromogen. Per tant, es necessita un cromogen i un substrat. El cromogen es el que donarà el color. Per amplificar el senyal si es necessita podem utilitzar biotina/avidina (streptavidina). L’Ac secundari estarà biotinilat. -> Mètode del complexe ABC. 10. (Contratinció amb hematoxilina). 11. Deshidratació. 12. Muntatge. IMMUNOFLUORESCÈNCIA: Comparació entre IHQ i IF:  Processament de teixits RA4 - RA5 Fluorocroms: − Hi ha diferents colors de cada gama (poden ser alexas, cianinas...). − Podem visualitzar entre 4 i 5 colors diferents al microscopi utilitzant càmeres (per que hi ha colors que els nostres ulls no poden diferenciar d’altres). Protocol general d’una IF en comparació amb el d’una IHQ: Avantatges de les IF respecte a les IHQ: Dobles, triples i quàdruples marcatges en una sola secció de molècules que no tenen perquè estar localitzades en espais subcel·lulars diferents (Estudis de col·localització). El protocol és més curt. Desavantatges de les IF respecte a les IHQ: Existeixen teixits amb autofluorescència que donen molt soroll de fons. Necessitat de tenir microscopis de fluorescència i sales adaptades (necessitem observar-les en la foscor). Les preparacions no són permanents perquè el medi de muntatge és aquós i la fluorescència es perd amb el temps. Controls per IF i per IHQ: Positius: en paral·lel farem una IHQ en un teixit que sabem que expressa la proteïna que volem determinar en la secció a estudiar. Negatius: en paral·lel farem: − Una IHQ utilitzant només l’Ac secundari. − Si són dobles, les IHQ simples per separat.